Medicine

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Published: November 17, 2014 doi: 10.3791/51830

Xiao-Tang Yin¹, Deena A. Tajfirouz¹, Patrick M. Stuart¹

¹Department of Ophthalmology, Saint Louis University

Introduction

השתלת קרנית היא אחד מהסוגים המוצלחים והנפוצים ביותר של השתלה שבוצעו בבני אדם. הסיבות לכך שניתוח זה מבוצע הן תוצאה של פציעה, מחלה זיהומית ^1, או צורות אחרות של מחלה בקרנית שאינה מדבקת ^2. דמויות מעין הבנק האגודה של אמריקה עולות כי מעל 46,000 בוצעו בשנת 2011 (ראה באתר אינטרנט בכתובת: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). אינדיקציה להצלחתו היא ששיעורי כישלון שנה אחת עבור שתלי קרנית אלוגנאית נעים 10-15% ולאחר 5 שנים של ההצלחה היא בעודף של 70% ^3-8. מחקרים רבים הראו, ההצלחה של allografts קרנית קשורה באופן ישיר לעובדה כי העין היא אתר מועדף אימונולוגית. גורמים אחראים למצב הקרניות כאתר זכות חיסוני כוללים חוסר של שני כלי הדם והלימפה בקרנית, היעדר יחסי של תאי הצגת אנטיגן, גורמים המיוצר על ידי הקרנית שsuppresזה funtions מפעיל חיסוני ^9-15, ביטוי נמוך של MHC אנטיגנים ^16, ואת הביטוי של מקאל ^17-20.

עם זאת, למרות גורמים אלה, גורם שתלים אלה להצלחה, הם עוברים דחייה ^3-7. כתוצאה מכך, הבנת מנגנונים אלה שמתווכים דחייה זו, כמו גם בדיקת טיפולים שונים למניעת דחייה היא בעל חשיבות קריטית. לצורך כך, אנו מתארים כאן מודל עכברי של השתלת קרנית שכבר בשימוש במשך 20 שנים כדי ללמוד השתלת קרנית בסביבה ניסויית מבוקרת. מאז תגובות השתלה כרוכות בגורמים רבים ושונים הפועלים בקונצרט שאולטימטיבי לקבוע אם הרקמה המושתלת נכשלת או מצליחה, שלא ניתן להבין את החשיבות של גורמים אלה בכל דגם במבחנה. כתוצאה מכך, מחקרים שנערך בבעלי חיים שלמים נדרשים כדי לקבוע מה גורמים חשובים להצלחה או או failuמחדש של רקמה מושתלת.

בעוד מינים אחרים של בעלי חיים שימשו במחקר השתלה קרנית, יש במודל העכברי מספר יתרונות בהשוואה לשימוש במינים אחרים. הראשון הוא קיומה של זנים רבים של עכברים המבטאים את גנים מושתלים מסוימים או היו ממוקד-גן לחוסר ביטוי של גורמים חיסוניים ספציפיים שתפקידה בהשתלה ניתן ללמוד טוב יותר. בנוסף, יש חומרים כימיים רבים (שני גורמים רקומביננטי ונוגדנים המנטרלים את הגורמים) שהם ספציפיים לעכברים ושאינם קיימים למינים רבים אחרים של בעלי חיים. בגלל קיומם של גורמים אלה, מודל זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לזהות גורמים רלוונטיים מעורבים בתגובה החריפה של קרנית שתל ^{15, 17,18,20 -29.} יתר על כן, רבים מן הגורמים המעורבים בהשתלת קרנית ידוע גם להיות פונקציונלי בהשתלה של רקמות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: מטופלים כל בעלי החיים המשמשים בהליך זה בהתאם לאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש בבעלי החיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, כמו גם את ההנחיות שנקבעו על ידי הוועדה לפיקוח על בעלי החיים באוניברסיטת סנט לואיס.
הערה: כל המכשירים ופתרונות כירורגיים הם מעוקרים לפני ניתוח, כדי לצמצם את זיהום חיידקים של העין. יש לציין, כי בעוד שבעלי החיים עושים לחוות קצת כאב מהליך זה, אנחנו לא מעסיקים משככי כאבים. הסיבה לכך היא כי כל משככי הכאבים אנטי דלקתיים ומאז תגובות השתלה הקרנית כרוכות דלקת, השימוש בתרופות אנטי-דלקתיות יפגע ביכולת שלנו כדי לקבוע אילו גורמים מעורבים בכישלון שתל קרני.

1. הרדמה

הנח עכברי תורם למקבל בהרדמה כללית על ידי זריקות IP של קטמין (86.98 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (13.04 מ"ג / קילוגרם).
שמור את עכבר הנמען בהרדמה לאורך כל ההליך אשר בדרך כלל לוקח 30 דקות לשעה. כתוצאה מכך, כל הזמן לפקח על העכבר עבור כל סימנים של חזרה להכרה.
החל המשחה puralube לעין עד שלא תעבור ניתוח אחרי בעל החיים הוא מורדם כדי למנוע יובש.

2. הארכת קרנית

קבלתן של קרנית התורם.
1. ברגע שבעלי החיים הוא בהרדמה מלאה, להשיג mydriasis ההולם מצד ממשל של כמה טיפות עיניים של tropicamide 1% ו -2.5% hydrochloride phenylephrine.
2. מקם את הראש של החיה התורמת בצורה אופקית על לוח מונח על תמיכת מטלטלין חסון. תקן את הראש עם רצועה של סרט על פני הצוואר, כדי להבטיח כי העין היא במצב אופקי לאורך כל הפעולה.
3. שימוש במקדחה בקוטר 2 מ"מ, שקצה שלו היה צבוע עם מתיל הכחול, החוצהמרפד את האתר שתל קרנית המרכזית.
4. בסכין חד, לחדור הקרנית ולהזריק healon ללשכה הקדמית להעמיק אותו כדי להפחית את הסיכוי לניזק לאנדותל התורם והעדשה בסיסית.
5. בלו שתל התורם במספריים Vannas ומקום לצלחת המכילה תמיסת מלח מאוזנת "הנקס ועד שימוש.
6. אחרי שתל התורם כבר הוסר, להרדים את העכבר התורם באמצעות CO ₂ שאיפה.
הכנת מיטת השוחד.
1. חזור על אותם השלבים כפי שמתואר ב2.1.1 דרך 2.1.2 לנמען.
2. שימוש במקדחה בקוטר 1.5 מ"מ, מתאר את אתר שתל נמען.
3. בסכין חד, לחדור הקרנית ולהזריק healon ללשכה הקדמית להעמיק אותו כדי להפחית את הסיכוי לניזק לעדשה הבסיסית.
4. הסר את הכפתור קרני המרכזי שהותווה מהנמען באמצעות מספריים Vannas וזורקים.
תפירתשתל
1. הנח את קרנית התורם מעל שתל המיטה בקרנית של הנמען. הקפד שhealon נאות הוא תחת קרנית התורם להגנה על תאי האנדותל תורם מנזק על ידי מגע ישיר עם עדשה.
2. באמצעות microforceps היטה Super Fine, למקם את הנגיסה הראשונה של 11-0 תפר ניילון לצד התורם, דרך התורם עם עומק 90% מעובי מלא לצד של הנמען, ואז לקשור את.
3. ברגע שהקרנית מעוגנת במקום, לבצע תפרי midcardinal קטע כזה שיש לו את הקרנית 8 עד 10 תפרים כולל וקרנית התורם היא בשורה בצורה מאובטחת עם ומחוברת למיטת השתל הקרנית הנמען.
העמקת הלשכה הקדמית
1. להעמיק את הלשכה הקדמית על ידי הזרקת HBSS או בועת אוויר ללשכה הקדמית ובעדינות לבדוק את התקינות של השתל קרני לדליפה עם ספוג.
  הערה: אם לא ניתן רפורמה הלשכה הקדמית אז יש הסתברות גבוהה של גataract אשר יהפוך את ההערכות עתידיות של הקרנית המושתלת קשות מאוד וגם להוביל לבעיות בתפקוד תורם קרנית האנדותל וכישלון ובכך שתל.
הערכה סופית
1. שים לב לעין לקבוע כי התלמיד הוא עגול ועומק הלשכה הקדמית הוא נורמלי.
  הערה: אם התלמיד אינו עגול זה עולה כי בתפירת איריס נפגעה וכך השתל נחשב לכישלון טכני.
2. החל משחה אנטיביוטית לעין. אופציונאלי: סגור את המכסה עין עם תפר 7-0 משי.
3. שים לב עכברים עד שהם התעוררו לגמרי ולאחר מכן בנפרד לשכן אותם למינימום של שני ימים שלאחר ניתוח.

הסרת 3. תפר

במקרים בם תפר מכסה משמש, להרדים עכברים כפי שתואר לעיל ולהסיר את תפר המכסה ב 48 שעות.
הרדימי עכברים ביום 7 לאחר הניתוח. הסר את sutures אבטחת השתל קרני. ברגע שהתפרים יוסרו ובעלי החיים התעוררו באופן מלא, להחזיר אותו לכלוב שלה.

4. הערכה קלינית

בדוק את העין לאינדיקציות של סיבוכים פרוצדורליים הכוללים, קטרקט (ערפול של העדשות), hyphema (דם בלשכה הקדמית), לשכה קדמית שאינה של העומק הנכון, או אטימות משמעותיות של הקרנית. שקול אלה המדגימים סיבוכים אלה כ" התפשר "ולהרדים אותם משאיפת CO _2.
1. לבצע את כל הבדיקות על עכברי unanesthetized. החזק את העכבר ביד אחת ובכך מרסן את העכבר, כך ששני יכול proptose עין כדי לאפשר תצפית טובה יותר של העין. ברגע שהתצפיות הושלמו, להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה.
האם צופה שאינו מכיר את קבוצות הטיפול העריך את השווי מושתל קרניות 2 עד 3 פעמים בשבוע לסימנים של שתל קרניפרקי דחייה או כישלון שתל קרני. להשתמש במיקרוסקופ הניתוחי או biomicroscope מנורת סדק אופקי לתצפיות אלה.
1. להעריך כל קרנית לאטימות באמצעות סולם של 0 עד 5. קנה המידה מוגדרת באופן הבא:
  1. הקצאת ציון של 0 עד אלה קרניות שאין להם סימנים של אטימות.
  2. הקצאת ציון של 1 לאלה קרניות שמראות אטימות שטחיות מינימליות.
  3. הקצאת ציון של 2 עד קרניות המציגות אטימות קלות ועמוקות יותר, אבל התלמיד ואיריס שהבסיס עדיין ניתן להבחין.
  4. הקצאת ציון של 3 עד קרנית המציגות אטימות סטרומה בי לא ניתן לראות את איריס בפירוט למעט השוליים התלמיד.
  5. הקצאת ציון של 4 לקרנית, המציגות אטימות סטרומה צפופות ואם ניתן לראות אין מבנים שבבסיס.
  6. הקצאת ציון של 5 עד קרנית המציגות אטימות מלאים ובצקת סטרומה אינטנסיבית, עם תלמיד ואיריס טשטש לחלוטין.
2. גם להעריך כל קרנית למידת חדירה של כלי דם (ניאו-וסקולריזציה) משתמש בסולם דירוג של 1 עד 8. לשם כך, להציג את הקרנית כמורכבת של 4 רביעים שווים ולקבוע את הסכום של כלי דם בכל אחד מרביעים עם ציון שטווח הרצון בין 0 (ללא כלי) 2 לכלי דם נרחבים של הרבע הזה. הוסף את הציונים הבודדים מכל רבע כדי לחשב את הציון הסופי ניאו-וסקולריזציה.
3. לסווג קרניות בחריפות כזאת בדחו אם יש להם ציון של 3 לשתי תצפיות רצופות במשך זמן מצביע עד 5 שבועות.
4. לסווג עכברים שהקרניות היו ברורים בשעה 5 שבועות, אבל לפתח עננות בזמנים> 45 ימי הודעה קליטתם, עם ציון של 3 לשתי נקודות זמן ברציפות, כבעל דחיית שתל קרני לטווח מאוחר עבר. השתמש בעקומות הישרדות קפלן-מאייר לנתח הישרדות שתל.

5. מניפולציה של הדגם

בשמאל: 40px; ">

הכנה של תאים בודדים מהטחול.

כדי להכין תאים בודדים, להרדים את עכבר התורם ראשון. לאחר מכן, להסיר את הטחול.
הנח את הטחול במסננת תא ולשבש אותה עם בוכנת מזרק ממזרק 3 מיליליטר.
שטוף תאים וגלולים ב 10 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת הנקס.
הסר 10 μl של השעיה תא ולהוסיף עד 10 μl של trypan 0.4% כחולים ולערבב. תוסיף את זה לhemocytometer ולספור את התאים ברשת המרכזית. מספר התאים בצינור הוא ספירת התאים 10 ⁴ x 2 (גורם לדילול בtrypan הכחול) X X 10 (נפח בצינור).

הזרקה ללשכה הקדמית.

הרדימי עכברים כפי שתואר לעיל.
לבצע זריקות באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לכל הזרקה intracameral, להשתמש ⁶ 10 תאי טחול ב0.005 מיליליטר נפח ומצויד במחט 33 G מזרק microliter 0.25 מיליליטר.
הערה: מניפולציות אחרותשל המודל יכול להתבצע על ידי טיפול בבעלי חיים עם חומרים כימיים הפועלים כשני יריבים או אגוניסטים כדי לקבוע את התפקיד שגורם מסוים עשוי לשחק לאחר ניתוח שתל קרני orthotopic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המודל העכברי של השתלת קרנית היה בשימוש כבר למעלה מ -20 שנים לאפיין בהצלחה מנגנונים של שני דחיית קרנית שתל ^19-23 וקבלת קרנית שתל ^{13, 15,16,18, 24-27.} מודל זה שימש להקמת חשיבות ביטוי מקאל בקבלת שתל קרנית, שבבעלי חיים שאין לי מקאל לא היו מסוגל לקבל allografts קרני ^15. כמו כן, נעשה שימוש על מנת להוכיח כי הטיפול בכלי דם צמיחת אנדותל גורם קולטן 1 morpholino מגביר את הישרדות שתל הקרנית ²⁸ באופן משמעותי. בדו"ח האחרון מאוד מודל זה שימש כדי לבדוק אם טיפול מקדים של עכברים לפני קליטת שתל קרנית עם סטרואידים שנערכו כל תועלת טיפולית ^29. המחברים הראו כי טיפול מקדים כגון עשה לשפר את שיעור ההישרדות של allografts קרני ^29. דוחות אלה מציגים בבירור שהיתרון העיקרי של מודל זה הוא שאחד יכול ללמוד בחי אותם דברים שהם האמינו להיות חשובים להצלחה של השתלות קרני בבני אדם.

מחקרים קודמים ממעבדה זו דיווחו כי אחד מהמנגנונים העיקריים האחראים לדחיית שתל קרנית היא הקמתה של רגישות יתר המערכתי מתעכב סוג (DTH) לalloantigens הספציפי בא לידי ביטוי בשתל קרני ^{19, 20.} יש לנו בשימוש מאז מודל זה כדי לבדוק אם הקמתה של סובלנות DTH alloantigen המערכתי לalloantigens בא לידי ביטוי בשתל קרני התורם משפרת את סיכויי הישרדות של שתלים מסוג זה. כפי שניתן לראות בתרשים 1, עכברי BALB / ג tolerized לalloantigens C57BL / 10 (B10) לא ישפרו את קליטת שתל קרני, כפי שנמדד על ידי זמן ממוצע הישרדות לallografts הקרנית אלה. כך זמן ההישרדות הממוצע לקרניות נדחו היה זהה בין אם עכברים tolerized או לא. אנחנו גם ביצענו מחקרים דומים באמצעות תגובות השתלת עור כאמצעיבדיקה האפקטיבית של tolerization DTH המערכתי. מחקרים אלה הראו, כי כאשר סובלנות DTH הוקמה בעכברים / ג BALB לקראת B10 alloantigens, עור שתלי נושאים מסוימים (B10.D2 וC.B10-H-2 ^ב) או כל B10 alloantigens לא להציג כל מוגבר מתכוונים זמן הישרדות ( איור 2). הגענו למסקנה ממחקרים אלה כי עכברי BALB / ג שהוקמו תגובות DTH אנטיגן ספציפי לא נבעו כל הטבה הניתנת למדידה מסובלנות כזה לאף allografts קרנית או עור. נתונים אלה מצביעים על כך שהמידע נוצר לומד מודל עכברי של השתלת קרנית יהיה, לעתים, להיות ישים ישירות לצורות אחרות של השתלת רקמה מוצקה.

איור 1
עכברים / ג 1. BALB איור הוזרקו ללשכה הקדמית עם 10 ⁶ תאי טחול מ/ 10 עכברי C57BL (B10). (p> 0.05).

איור 2
הזרקת 2. איור של תאי טחול ללשכה הקדמית אינה משפיעה הישרדות של שתלי עור אלוגנאית. עכברי BALB / ג הוזרקו ללשכה הקדמית עם 10 ⁶ תאי טחול מC57BL / 10 עכברים. לאחר שבוע עכברים אלה engrafted בנפרד עם עור מC57BL / 10, n = 10, B10.D2, n = 7, C.B10-H-2 ^ב, n = 7 עכברים ובהשוואה לעכברים שלא הוזרקו וengrafted עם C57BL / 10 עור, n = 10. תוצאות מבוטאות כזמן מתכוון לשרוד + SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל העכברי של השתלת קרנית המתוארת כאן מאפשר לחוקר ללמוד דחיית שתל קרנית אדם במודל שהוא ניבוי של מה גורמים הקשורים הטובים ביותר עם שתי הדחייה ^{15,17,18,20, 26-30} וקבלת ^21-25 של קרנית allografts. בשונה השתלת קרנית אנושית, שבו מטופלים מקבלים גם טיפול בסטרואידים מקומי או מערכתי לדחייה או לטפל או למנוע ^31, מודל זה משמש בדרך כלל כדי לקבוע מי גורמים שרלוונטיים לדחייה של שתל, בהעדר טיפול כזה. בנוסף למודל לדחיית שתל חמור של קרנית, אשר מתרחש בדרך כלל בתוך 30 עד 40 ימים של השתלה, אנחנו גם להציג מודל מאוחר טווח של דחייה כזו שמתרחשת 45 ימים שלאחר קליטתם בעכברים ומחקה רבים מהתכונות של המנוח דחיית -term וכרוני ^32,33 שעד כה לא היה מודל בבעלי חיים.

Tהוא החוזק של המודל הוא כי ניתן לנתח מנגנונים שונים שאחראים לשיעור הגבוה היחסי של קבלת שתל קרנית, כמו גם קביעה שהמנגנונים אחראים לכישלון של שתל קרנית. מודל זה גם מאפשר לבחון אסטרטגיות טיפוליות שונות בחיה שבו בעל מערכת חיסונית שדומה מאוד למערכת החיסון האנושית. לשם כך, קיומו של ריאגנטים רבים המגיבים לגורמים עכבריים כמו גם עכברים הטרנסגניים וממוקד גן, יאפשר להערכה של כל כך הרבה יותר גורמים מאשר היה המקרה עם מינים אחרים. זו יכולת להעריך גורמים שונים כל כך הרבה שהם חשובים לשתי ההצלחה והכישלון של allografts קרנית היא משמעותי חיובית לטובת שימוש במודל עכברי זה לעומת מודלים של בעלי חיים אחרים שבניתוח הוא קל יותר לביצוע בשל הגודל המוגבר של העיניים של מינים אלה.

אמנם יש כמה חולשות של מודל זה,אנו מאמינים החוזק עולה בהרבה עליהם. אחד המשמעותי ביותר, שהוזכר לעיל, הוא המומחיות הטכנית הכרוכה בביצוע השתלת קרנית בעכברים. בשל הגודל הקטן של העין העכברית, זה דורש מישהו שהוא מיומן בהמיקרו-כירורגיה, שניהם בביצוע ההשתלה וכן סילוק התפרים. כתוצאה מכך, נדרש לחזור על תרגילים כדי לשלוט ולשמור על מיומנות בטכניקה זו. החולשה השנייה היא שבעוד עכברים דומים מאוד לבני אדם, הם לא זהים. בעלי חיים אלה להציג נטייה גדולה יותר לכיוון ניאו-וסקולריזציה, מאשר לעשות קרניות אנושיות. כמו כן, מודל זה לא לחקות את הניתוחים שנועדו לטיפול בבעיות תא האנדותל כמו ניוון של Fuch ^2. לפני השתלות בעובי המלאה של השנה האחרונה כמו אלה המשמשים בפרוטוקול המתואר הועסקו. נכון להיום, השתלת אנדותל מעורבת רק את חלק האנדותל של הקרנית להיות מועסקת 34, 35. שתלים כאלו לא היו מודל עד כה בעכברים בשל הקושי של ביצוע ניתוח זה בבעלי חיים קטנים כמו.

לדחייה מאוחרת טווח (> 45 ימים) שני גורמים ייחודיים לגרסה זו של המודל להתבלט. החולשה תחילה עם סוג זה של להיות עכברי שהמודל חייבת להישמר לתקופה מינימאלית של חודשים עד שלושה חודשים כדי ללמוד דחייה בשלב מתקדם. ושנית, הקרניות תחילה לשרוד תגובות דחייה חריפות פוטנציאליות. דחיות חריפות כאלה מתרחשות ב50-70% ממקבלים ^{17, 20 -24.} כך ללמוד דחייה מאוחרת טווח אחד נקלט עכברים שהשתלות יידחו בחריפות ולא ישרוד עד 45 ימים לאחר קליטתם. כדי למתן את זה מצאנו כי שיעור הדחייה בעכברי זכרים הוא פחות מזה שנצפה לנקבות עכברים (כתב יד בהכנה) ובכך ללמוד דחיית טווח מאוחר מומלץ כי רק עכברי זכריםלשמש. אנחנו גם ניסינו להאריך את ההישרדות של שתל קרני עם טיפול בסטרואידים, אבל זה לא הוכיח להיות (תצפיות אישיות) שימושיות במיוחד ולכן אינו ממליץ להשתמש בי טיפול בסטרואידים. למרות סיבוכים אלה והאזהרה כי צפוי כמחצית או קצת יותר מאלה engrafted קרניות אלוגנאית תישאר ברורה עד לאחר 45 ימים, זה עדיין מודל שימושי מאוד ללמוד אותם גורמים שרלוונטיים לדחייה מאוחרת טווח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154