Introduction
Il trapianto corneale è uno dei tipi più comuni di successo e trapianti eseguiti negli esseri umani. Le ragioni per cui si esegue questa chirurgia sono il risultato di lesioni, malattie infettive 1, o di altre forme di malattie della cornea non infettive 2. I dati della Eye Bank Association of America indicano che più di 46.000 sono stati eseguiti nel 2011 (si veda il sito Web all'indirizzo: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). L'indicazione del suo successo è che i tassi di fallimento di un anno per gli innesti corneali allogenici vanno dal 10 al 15% a 5 anni e il successo è superiore al 70% 3-8. Come molti studi hanno dimostrato, il successo di alloinnesti corneali è direttamente legato al fatto che l'occhio è un sito immunologicamente privilegiato. I fattori responsabili dello stato cornee come sito privilegio immunitario comprendono la mancanza di entrambi i vasi sanguigni e linfatici nella cornea, una relativa assenza di cellule presentanti l'antigene, fattori prodotta dalla cornea che Abbateres funtions effettrici del sistema immunitario 9-15, bassa espressione di MHC antigeni 16, e l'espressione di FasL 17-20.
Tuttavia, nonostante questi fattori predisponenti questi innesti di successo, essi vanno incontro a rigetto 3-7. Di conseguenza, la comprensione quei meccanismi che mediano questo rifiuto e testare varie terapie per prevenire il rigetto è di importanza critica. A tal fine, si descrive qui un modello murino di trapianto di cornea, che è stato in uso per oltre 20 anni per studiare il trapianto di cornea in un ambiente controllato sperimentale. Poiché risposte trapianto coinvolgono diversi fattori che lavorano in concerto che sarà definitiva determinare se il tessuto trapiantato riesce o riesce, non è possibile comprendere l'importanza di tali elementi in qualsiasi modello in vitro. Di conseguenza, gli studi su animali intatti sono necessari per determinare quali sono i fattori importanti per il successo o il failure del tessuto trapiantato.
Mentre altre specie di animali sono stati utilizzati per studiare trapianto di cornea, il modello murino ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di altre specie. Il primo è l'esistenza di molti ceppi di topi che esprimono alcuni transgeni o sono stati dei geni-bersaglio a non avere l'espressione di specifici fattori immunologici la cui funzione nel trapianto può essere meglio studiata. In aggiunta, ci sono molti reagenti (entrambi i fattori ricombinanti e anticorpi che neutralizzano i fattori) che sono specifici per i topi e che non esistono per molte altre specie di animali. A causa dell'esistenza di questi fattori, questo modello è stato ampiamente utilizzato per identificare i fattori rilevanti che partecipano acute risposte trapianto allogenico corneali 15, 17,18,20 -29. Inoltre, molti dei fattori coinvolti nel trapianto di cornea sono anche noti per essere funzionale nel trapianto di altri tessuti.
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Protocol
NOTA: Tutti gli animali utilizzati in questa procedura sono trattati in conformità con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e la dichiarazione di Oftalmologia per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, nonché le linee guida stabilite dalla commissione di sorveglianza degli animali a Saint Louis University.
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici e le soluzioni sono sterilizzate prima di un intervento chirurgico per limitare l'infezione microbica degli occhi. Va notato che, mentre gli animali fanno vivere il dolore da questa procedura, non impieghiamo analgesici. La ragione di questo è perché tutti gli analgesici sono anti-infiammatori e da risposte trapianto di cornea coinvolgono l'infiammazione, l'uso di farmaci anti-infiammatori potrebbero compromettere la nostra capacità di determinare quali fattori sono coinvolti nel fallimento del trapianto di cornea.
1. Anestesia
- Mettere i topi donatori e beneficiari in anestesia generale con iniezioni IP di ketamina (86.98 mg / kg) e xilazina (13,04 mg / kg).
- Tenere il mouse recipiente sotto anestesia durante tutta la procedura che richiede in genere 30 minuti a un ora. Di conseguenza, monitorare costantemente il mouse per eventuali segni di riprendere conoscenza.
- Applicare puralube pomata per l'occhio che non sottoporsi ad intervento chirurgico dopo che l'animale è anestetizzato per prevenire la secchezza.
2. innesto corneale
- Ottenere il bottone corneale del donatore.
- Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, conseguire un'adeguata midriasi mediante somministrazione di un paio di gocce oculari di 1% e 2,5% tropicamide fenilefrina cloridrato.
- Posizionare la testa dell'animale donatore orizzontalmente su una tavola posta su un robusto supporto mobile. Fissare la testa con una striscia di nastro sul collo per assicurare che l'occhio è in posizione orizzontale durante l'intera operazione.
- Utilizzando un trapano 2 mm di diametro, la cui punta è stato tinto con blu metile, fuorilinea il sito del trapianto della cornea centrale.
- Con una lama affilata, penetrare nella cornea e Healon iniettare nella camera anteriore di approfondire per ridurre la possibilità di danni all'endotelio donatore e lente sottostante.
- Accise l'innesto del donatore con Vännäs forbici e riporre in un piatto contenente soluzione salina bilanciata Hanks 'fino al momento dell'uso.
- Dopo l'innesto del donatore è stato il rimosso, eutanasia il mouse donatore tramite CO 2 inalazione.
- Preparare il letto trapianto.
- Ripetere la stessa procedura descritta al punto 2.1.1 tramite 2.1.2 per il destinatario.
- L'utilizzo di un trapano di diametro 1,5 mm delineare il sito ricevente del trapianto.
- Con una lama affilata, penetrare nella cornea e Healon iniettare nella camera anteriore di approfondire per ridurre la possibilità di danni alla lente sottostante.
- Rimuovere il pulsante corneale centrale delineato dal destinatario utilizzando Vännäs forbici e scartare.
- Sutura deltrapianto
- Posizionare la cornea del donatore nel trapianto letto nella cornea del ricevente. Assicurarsi che un'adeguata Healon è sotto la cornea del donatore per proteggere le cellule endoteliali del donatore venga danneggiato da contatto diretto con lente.
- Utilizzando Super Fine microforceps a punta, posizionare il primo morso di 11-0 in nylon sutura nel lato dei donatori, attraverso il donatore con il 90% della profondità del tutto spessore a lato del destinatario, quindi legare.
- Una volta che la cornea è ancorato al suo posto, eseguire punti staccati midcardinal tale che la cornea ha da 8 a 10 punti di sutura totale e la cornea del donatore è rivestito in modo sicuro con e allegato al destinatario letto trapianto di cornea.
- Approfondire la camera anteriore
- Approfondire la camera anteriore iniettando HBSS o bolla d'aria nella camera anteriore e controllare delicatamente l'integrità del trapianto di cornea per perdite con una spugna di cellulosa.
NOTA: Se la camera anteriore non può essere riformato allora c'è un'alta probabilità di cataract che renderà le future valutazioni della cornea trapiantata molto difficile e anche potenzialmente portare ad una disfunzione dell'endotelio corneale del donatore e quindi il fallimento del trapianto.
- Approfondire la camera anteriore iniettando HBSS o bolla d'aria nella camera anteriore e controllare delicatamente l'integrità del trapianto di cornea per perdite con una spugna di cellulosa.
- Valutazione finale
- Osservare l'occhio per determinare che la pupilla è rotonda e la profondità della camera anteriore è normale.
NOTA: Se l'alunno non è tutto ciò indica che durante la sutura l'iride è stato danneggiato e, quindi, l'innesto è considerato un guasto tecnico. - Applicare una pomata antibiotica per gli occhi. Opzionale: Chiudere il coperchio occhio con una sutura di seta 7-0.
- Osservare i topi fino a quando sono completamente sveglio e poi individualmente li ospitano per un minimo di due giorni post-operatorie.
- Osservare l'occhio per determinare che la pupilla è rotonda e la profondità della camera anteriore è normale.
3. Sutura di rimozione
- Nei casi in cui viene utilizzato coperchio sutura, anestetizzare topi come descritto sopra e rimuovere la sutura coperchio a 48 ore.
- Anestetizzare topi il giorno 7 dopo l'intervento. Rimuovere il sutures garantire il trapianto di cornea. Una volta che i punti di sutura vengono rimossi e l'animale si è completamente risvegliato, restituirlo alla sua gabbia.
4. Valutazione clinica
- Controllare l'occhio per indicazioni di complicazioni procedurali che comprendono, cataratta (opacità del cristallino), ifema (sangue nella camera anteriore), una camera anteriore che non è di profondità adeguata, o significativo l'opacità della cornea. Prendere in considerazione quelli che dimostrano queste complicazioni come "compromesso" e l'eutanasia da CO 2 inalazione.
- Eseguire tutti gli esami sui topi non anestetizzati. Tenere il mouse con una mano trattenendo così il mouse in modo che l'altra parte può proptose l'occhio per consentire una migliore vista dell'occhio. Una volta che le osservazioni sono stati completati, rispedire l'animale verso la sua gabbia.
- Avere un osservatore non hanno familiarità con i gruppi di trattamento valutare cornee trapiantate 2 o 3 volte a settimana per i segni di trapianto di corneaepisodi di rigetto o di fallimento del trapianto di cornea. Utilizzare il microscopio operatorio o un biomicroscopio con lampada a fessura orizzontale per queste osservazioni.
- Valutare ogni cornea opacità usando una scala da 0 a 5. La scala è definito come segue:
- Assegnare un punteggio da 0 a quelle cornee che non hanno segni di opacità.
- Assegnare un punteggio di 1 a quelle cornee che mostrano il minimo l'opacità superficiale.
- Assegnare un punteggio di 2 a cornee che visualizzano l'opacità mite e più in profondità, ma la pupilla e l'iride sottostante sono ancora distinguibile.
- Assegnare un punteggio di 3 cornea da visualizzare stromale opacità in cui il diaframma non possono essere viste in dettaglio con l'eccezione dei margini pupilla.
- Assegnare un punteggio di 4 a cornea da visualizzare densa opacità stromale e se non strutture sottostanti possono essere visualizzati.
- Assegnare un punteggio di 5 a cornea da visualizzare per l'opacità completa ed intensa edema stromale, con la pupilla e l'iride completamente oscurata.
- Inoltre valuta ogni cornea per il grado di infiltrazione dei vasi sanguigni (neovascolarizzazione) utilizzando una scala di valutazione da 1 a 8. Per eseguire ciò, visualizzare la cornea come costituito da 4 quadranti uguali e determinare la quantità di vasi sanguigni in ciascuno di questi quadranti con punteggio che spaziano volontà da 0 (nessun vasi) a 2 per esteso vascolarizzazione di quel quadrante. Aggiungere i singoli punteggi di ogni quadrante per calcolare il punteggio finale neovascolarizzazione.
- Classificare cornee come acutamente rifiutati se hanno un punteggio di 3 per due osservazioni consecutive per tempo i punti fino a 5 settimane.
- Classificare i topi le cui cornee erano chiari a 5 settimane, ma sviluppare opacizzazione a volte> 45 giorni dopo l'attecchimento, con un punteggio di 3 per due momenti consecutivi, ad avere subito in ritardo termine rigetto corneale. Utilizzare le curve di Kaplan-Meier di sopravvivenza per analizzare la sopravvivenza del trapianto.
- Valutare ogni cornea opacità usando una scala da 0 a 5. La scala è definito come segue:
5. Manipolazione del Modello
in-left: 40px; ">- Per preparare singole cellule, prima eutanasia il mouse donatore. Quindi, rimuovere la milza.
- Posizionare la milza in un colino cellulare e interrompere con un pistone della siringa da una siringa da 3 ml.
- Lavare le cellule e risospendere in 10 ml di soluzione salina bilanciata Hanks.
- Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare e aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu e mescolare. Aggiungere che emocitometro e contare le cellule nella griglia centrale. Il numero di cellule nel tubo è il numero di celle 10 x 4 x 2 (fattore di diluizione in blu tripan) x 10 (volume nel tubo).
- Anestetizzare topi come precedentemente descritto.
- Eseguire iniezioni usando un microscopio da dissezione. Per ogni iniezione intracameral, utilizzare 10 6 cellule della milza di un volume di 0,005 ml e una siringa microlitro 0,25 ml con ago 33 G.
NOTA: altre manipolazionidel modello può essere effettuata trattando gli animali con reagenti che agiscono sia come antagonisti o agonisti per determinare il ruolo che un determinato fattore può giocare dopo l'intervento chirurgico ortotopico allogenico corneale.
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Representative Results
Il modello murino di trapianto di cornea è stato utilizzato da oltre 20 anni con successo per caratterizzare i meccanismi di entrambi corneale rigetto del trapianto corneale 19-23 e accettazione 13, 15,16,18, 24-27. Questo modello è stato utilizzato per stabilire l'importanza di FasL nella cornea del trapianto di accettazione, in quanto gli animali che non hanno FasL non erano in grado di accettare trapianti corneali 15. E 'stato anche utilizzato per dimostrare che la crescita endoteliale recettore del fattore di 1 trattamento morpholino vascolare aumenta in modo significativo la sopravvivenza del trapianto di cornea 28. In un recente rapporto questo modello è stato utilizzato per verificare se il pretrattamento dei topi prima di attecchimento della cornea con corticosteroidi svolgono alcun beneficio terapeutico 29. Gli autori hanno dimostrato che tale pretrattamento ha migliorato il tasso di sopravvivenza dei trapianti corneali 29. Queste relazioni dimostrano chiaramente che il vantaggio principale di questo modello è chesi può studiare in un animale vivo quelle cose che si ritiene essere importante per il successo del trapianto di cornea nell'uomo.
Precedenti studi di questo laboratorio hanno riferito che uno dei meccanismi principali responsabili del rigetto della cornea è la creazione di sistemica di tipo ritardato (DTH) per alloantigeni specifiche espresse dal allotrapianto corneale 19, 20. Da allora abbiamo usato questo modello per verificare se la costituzione di alloantigene sistemica tolleranza DTH a alloantigeni espresse dal allotrapianto corneale del donatore migliora la sopravvivenza di tali innesti. Come mostrato in Figura 1, topi BALB / c tolleranti a / 10 (B10) alloantigeni C57BL non ha migliorato corneale allotrapianto accettazione misurata dal tempo medio di sopravvivenza per questi trapianti corneali. Così il tempo di sopravvivenza medio di cornee respinti era lo stesso se i topi sono stati tolleranti o meno. Abbiamo anche effettuato studi simili con risposte innesto pelle come mezzodi verificare l'efficacia di DTH Tollerizzazione sistemica. Questi studi hanno dimostrato che, quando la tolleranza DTH è stata fondata nel topi BALB / c verso B10 alloantigeni, pelle innesti cuscinetto alcuni (B10.D2 e C.B10-H-2 b) o tutti B10 alloantigeni non mostrare alcun aumentato il tempo medio di sopravvivenza ( Figura 2). Abbiamo concluso da questi studi che i topi BALB / c che avevano stabilito le risposte DTH antigene-specifiche non traggono alcun beneficio misurabile da tale tolleranza sia per trapianti corneali o pelle. Questi dati indicano anche che le informazioni generate studiare un modello murino di trapianto di cornea viene, a volte, direttamente applicabili alle altre forme di trapianto di tessuto solido.
Figura 1. topi BALB / c sono stati iniettati nella camera anteriore con 10 6 cellule spleniche di C57BL / 10 (B10) topi. (p> 0,05).
Figura 2. L'iniezione di cellule di milza nella camera anteriore non influisce sopravvivenza di innesti cutanei allogenici. Topi BALB / c sono stati iniettati nella camera anteriore con 10 6 cellule spleniche di C57BL / 10 topi. Dopo una settimana questi topi sono state innestate separatamente con la pelle da topi C57BL / 10, n = 10, B10.D2, n = 7, C.B10-H-2 b, n = 7 topi e confrontatii topi che non sono stati iniettati e innestate con C57BL / 10 pelle, n = 10. I risultati sono espressi come il tempo medio di sopravvivenza + SEM.
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Discussion
Il modello murino di trapianto di cornea qui descritta consente al ricercatore di studiare rigetto corneale umano in un modello che è predittivo di quali fattori sono più associati sia con il rifiuto 15,17,18,20, 26-30 e 21-25 accettazione di cornea trapianti. A differenza di trapianto di cornea umana, in cui i pazienti sono indicati sia per il trattamento steroideo topico o sistemico sia per trattare o prevenire il rigetto 31, questo modello è in genere utilizzato per determinare quei fattori che sono rilevanti per allotrapianto rifiuto in assenza di tale terapia. Oltre a un modello di acuta rigetto corneale, che avviene tipicamente entro 30 a 40 giorni di trapianti, si presentano anche un modello tardivo termine di tale rifiuto che si verifica 45 giorni post-attecchimento nei topi e imita molte delle caratteristiche di ritardo -term e cronica rifiuto 32,33 che finora non sono stati modellati in animali.
Tha punti di forza del modello è che si può sezionare i vari meccanismi che sono responsabili per il relativamente alto tasso di accettazione del trapianto corneale e determinare quali meccanismi sono più responsabili per il fallimento del trapianto corneale. Questo modello permette anche di testare diverse strategie terapeutiche in un animale che possiede un sistema immunitario che è molto simile al sistema immunitario umano. A tal fine, l'esistenza di molti reagenti che reagiscono con fattori murine e topi transgenici e gene targeting, consente la valutazione di tanti altri fattori che sarebbe il caso con altre specie. Questa capacità di valutare tanti fattori diversi che sono importanti sia per il successo e il fallimento dei trapianti corneali è un positivo e significativo a favore di utilizzare questo modello murino rispetto ad altri modelli animali in cui la chirurgia è più facile da eseguire a causa della maggiore dimensione degli occhi di queste specie.
Mentre ci sono diversi punti deboli di questo modello,crediamo che i punti di forza di gran lunga li superano. Uno dei più significativi, che è stato accennato in precedenza, è la competenza tecnica nell'effettuare il trapianto di cornea nei topi. A causa delle piccole dimensioni dell'occhio murino, questo richiede qualcuno che è abile a microchirurgia, sia nell'esecuzione del trapianto e la rimozione delle suture. Di conseguenza, la pratica ripetuta è necessario per padroneggiare e mantenere la competenza in questa tecnica. Il secondo punto debole è che, mentre i topi sono molto simili agli esseri umani, non sono gli stessi. Questi animali mostrano una maggiore tendenza alla neovascolarizzazione, di quanto non facciano cornee umane. Inoltre, questo modello non imitare le procedure chirurgiche destinate a trattare la disfunzione delle cellule endoteliali come la distrofia di Fuchs 2. Prima di trapianti tutto spessore recente anno come quelli utilizzati nel protocollo descritto sono stati impiegati. Attualmente, trapianti endoteliali coinvolgono solo la parte endoteliale della cornea sono stati impiegati
Per il rifiuto tardo-termine (> 45 giorni) due fattori unici per questa versione del modello spiccano. La prima debolezza con questa forma del modello è che i topi deve essere mantenuta per un minimo di due a tre mesi per studiare rigetto tardivo termine. E in secondo luogo, le cornee devono prima sopravvivere potenziali reazioni di rigetto acuto. Tali rigetti acuti si verificano in 50 al 70% dei destinatari 17, 20 -24. Così, per studiare il rifiuto in ritardo termine uno si innestare topi cui i trapianti saranno respinti acutamente e non sopravvivere fino a 45 giorni dopo l'attecchimento. Per attenuare questo abbiamo trovato che il tasso di rigetto nei topi maschi è inferiore a quello osservato per i topi femmina (manoscritto in preparazione) e quindi di studiare rigetto ritardo termine è consigliabile che solo topi maschiessere utilizzato. Abbiamo anche cercato di prolungare la sopravvivenza del trapianto di cornea con il trattamento con steroidi, ma questo non ha dimostrato di essere particolarmente utili (osservazioni personali) e quindi non raccomandiamo di usare il trattamento steroideo. Nonostante queste complicazioni e l'avvertenza che probabilmente circa la metà o un po 'più di quelli innestati con cornee allogenici rimarranno chiaro fino a quando dopo 45 giorni, questo è ancora un modello molto utile per studiare i fattori che sono rilevanti per il rifiuto di fine periodo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Surgical Microscope | Zeiss | Rebuilt | |
| 1 ml Syringe | BD | 305122 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| Vannus Scissors | Stortz | E-3387 | |
| 11-0 Sutures | Alcon | 717939M | |
| Trephine 2.0 mm | Katena | K 2-7520 | |
| Trephine 1.5 mm | Katena | K 2-7510 | |
| Tricaine Hydrochloride 0.5% | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| Healon | Abbott | Healon OVD | |
| Forceps | FST | 11251-20 | |
| 7-0 Sutures | Alcon | 8065 | |
| 2.5% Phenylephrine HCl | Alcon | NDC 61314-342-02 | |
| 1% Tropicamide | Bausch & Lomb | NDC-24208-585-59 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| 33 gauge needle | Hamilton | 90033 | |
| Cell Strainer (100 μm nylon) | BD Falcon | 352360 | |
| Hemocytometer | Cardinal Health | B3175 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 |
References
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