Introduction
El trasplante de córnea es uno de los tipos más comunes de éxito y el trasplante realizados en seres humanos. Las razones por las que se realiza esta cirugía son resultado de una lesión, enfermedad infecciosa 1, u otras formas de enfermedad de la córnea no infecciosa 2. Las cifras de la Asociación de Bancos de Ojos de América indican que más de 46.000 se realizaron en 2011 (véase el sitio web en: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Una indicación de su éxito es que las tasas de fracaso durante un año por injertos corneales alogénicas van desde 10 a 15% a los 5 años y el éxito es superior al 70% 3-8. Como muchos estudios han demostrado, el éxito de los aloinjertos de córnea está directamente relacionado con el hecho de que el ojo es un sitio inmunológicamente privilegiado. Los factores responsables de la situación córneas como un sitio de privilegio inmune incluyen la falta de ambos vasos sanguíneos y linfáticos en la córnea, una relativa ausencia de las células presentadoras de antígenos, factores producidos por la córnea que una supresión ens funtions de efectoras inmunes 9-15, baja expresión de antígenos de MHC de 16, y la expresión de FasL 17-20.
Sin embargo, a pesar de estos factores predisponentes estos injertos para el éxito, que no se someten a rechazo 3-7. En consecuencia, la comprensión de los mecanismos que median este rechazo, así como probar distintas terapias para prevenir el rechazo es de importancia crítica. Para ello, se describe aquí un modelo murino de trasplante de córnea, que ha estado en uso durante más de 20 años para estudiar el trasplante de córnea en un entorno experimental controlado. Desde respuestas trasplante implican muchos factores diferentes que trabajan en concierto que será definitiva determinar si el tejido trasplantado falla o tiene éxito, no es posible entender la importancia de estos factores en cualquier modelo in vitro. En consecuencia, se requieren estudios que utilizan animales intactos para determinar qué factores son importantes para el éxito o failure de tejido trasplantado.
Mientras que otras especies de animales se han utilizado para estudiar el trasplante de córnea, el modelo murino tiene varias ventajas cuando se compara con el uso de otras especies. La primera es la existencia de muchas cepas de ratones que expresan ciertos transgenes o han sido dirigidos-gen a carecer de la expresión de factores inmunológicos específicos cuya función en el trasplante puede ser mejor estudiado. Además, hay muchos reactivos (ambos factores recombinantes y anticuerpos que neutralizan factores) que son específicos para los ratones y que no existen para muchas otras especies de animales. Debido a la existencia de estos factores, este modelo ha sido utilizado ampliamente para identificar los factores relevantes implicados en las respuestas de aloinjertos corneales agudas 15, 17,18,20 -29. Además, muchos de los factores que intervienen en el trasplante corneal también son conocidos por ser funcional en el trasplante de otros tejidos.
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Protocol
NOTA: Todos los animales utilizados en este procedimiento son tratados de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaración para el uso de animales en Oftálmica y Visión de Investigación, así como las directrices establecidas por el comité de supervisión de los animales en la Universidad de Saint Louis.
NOTA: Todos los instrumentos y soluciones quirúrgicas se esterilizan antes de la cirugía para limitar la infección microbiana del ojo. Cabe señalar que, si bien los animales experimentan un poco de dolor de este procedimiento, no nos empleamos a los analgésicos. La razón de esto se debe a que todos los analgésicos son antiinflamatorios y desde las respuestas de trasplante de córnea involucran la inflamación, el uso de medicamentos anti-inflamatorios podrían comprometer nuestra capacidad para determinar qué factores están implicados en el fracaso del injerto corneal.
1. Anestesia
- Coloque donantes y receptores ratones bajo anestesia general por inyecciones IP de ketamina (86.98 mg / kg) y xilazina (13,04 mg / kg).
- Mantenga el ratón receptor bajo anestesia durante todo el procedimiento que suele durar de 30 minutos a una hora. En consecuencia, monitorear constantemente el ratón para detectar cualquier signo de recuperar la conciencia.
- Aplicar ungüento puralube al ojo que no se someterá a la cirugía después de que el animal está anestesiado para evitar la sequedad.
2. El injerto de córnea
- Obtención del botón corneal donante.
- Una vez que el animal esté totalmente anestesiado, midriasis adecuada lograr mediante la administración de un par de gotas oculares de tropicamida al 1% y 2,5% de hidrocloruro de fenilefrina.
- Coloque la cabeza del animal donante en posición horizontal sobre un tablero colocado sobre un soporte móvil robusto. Fijar la cabeza con una tira de cinta a través del cuello para asegurar que el ojo está en una posición horizontal a lo largo de toda la operación.
- El uso de un trépano 2 mm de diámetro, cuya punta estaba teñido con azul de metilo, fueraalinear el sitio central del injerto de córnea.
- Con una cuchilla afilada, penetrar en la córnea y Healon inyectar en la cámara anterior para profundizar en ella para reducir la posibilidad de daños en el endotelio del donante y la lente subyacente.
- Escindir el injerto de donante con Vannas tijeras y colocar en un plato que contiene solución salina equilibrada de Hanks hasta su uso.
- Después de que el injerto de donantes ha sido la retirada, la eutanasia del ratón donante mediante inhalación de CO2.
- Preparación del lecho del injerto.
- Repita los mismos pasos como se describe en 2.1.1 al 2.1.2 para el destinatario.
- El uso de un trépano de diámetro 1,5 mm, esbozar el sitio del injerto destinatario.
- Con una cuchilla afilada, penetrar en la córnea y Healon inyectar en la cámara anterior para profundizar en ella para reducir la posibilidad de daño a la lente subyacente.
- Quite el botón corneal central esbozado por el destinatario utilizando Vannas tijeras y deseche.
- La sutura de lainjerto
- Coloque la córnea del donante sobre el injerto cama en la córnea del receptor. Asegúrese de que Healon adecuada está bajo la córnea del donante para proteger las células endoteliales de los donantes de los daños por el contacto directo con la lente.
- Usando microforceps reciben propinas súper finas, colocar el primer bocado de sutura de nylon 11-0 en el lado de los donantes, a través de la donante con el 90% de profundidad de todo el espesor de lado del destinatario, luego atar.
- Una vez que la córnea está anclado en su lugar, realizar suturas interrumpidas midcardinal de tal manera que la córnea tiene de 8 a 10 el total de puntos de sutura y la córnea donante esté bien alineado con y unido al receptor cama injerto corneal.
- La profundización de la cámara anterior
- Profundizar en la cámara anterior mediante la inyección de HBSS o burbuja de aire en la cámara anterior y comprobar con cuidado la integridad del injerto corneal de fugas con una esponja de celulosa.
NOTA: Si la cámara anterior no puede ser reformado, entonces hay una alta probabilidad de cataract lo que hará que las futuras evaluaciones de la córnea trasplantada muy difícil y será también potencialmente conducir a la disfunción del endotelio corneal donante y el fracaso de este modo de injerto.
- Profundizar en la cámara anterior mediante la inyección de HBSS o burbuja de aire en la cámara anterior y comprobar con cuidado la integridad del injerto corneal de fugas con una esponja de celulosa.
- Evaluación final
- Observe el ojo para determinar si el alumno es redondo y la profundidad de la cámara anterior es normal.
NOTA: Si el alumno no es redonda, esto indica que durante la sutura de iris fue dañado y por lo tanto el injerto se considera un fallo técnico. - Aplique ungüento antibiótico en el ojo. Opcional: Cierre la tapa del ojo con una sutura de seda 7-0.
- Observar los ratones hasta que estén completamente despierto y luego individualmente alojarlos durante un mínimo de dos días después de la cirugía.
- Observe el ojo para determinar si el alumno es redondo y la profundidad de la cámara anterior es normal.
3. La eliminación de la sutura
- En los casos en que se utiliza la sutura tapa, anestesiar a los ratones como se describió anteriormente y retire la tapa de sutura en 48 hr.
- Anestesiar ratones en el día 7 después de la operación. Retire la Sutures asegurar el injerto corneal. Una vez que las suturas se retiran y el animal ha despertado completamente, devolverlo a su jaula.
4. Evaluación clínica
- Examine el ojo para las indicaciones de complicaciones de procedimientos que incluyen, cataratas (opacidad del cristalino), hifema (sangre en la cámara anterior), una cámara anterior que no es de la profundidad adecuada, o la opacidad significativa de la córnea. Considere los que demuestran estas complicaciones como "en peligro" y la eutanasia por inhalación de CO2.
- Lleve a cabo todos los exámenes en los ratones no anestesiados. Mantenga el ratón con una parte de restricción de este modo el ratón de manera que la otra parte puede proptose el ojo para permitir una mejor visión del ojo. Una vez que las observaciones se han completado, devolver el animal a su jaula.
- Haga que un observador familiarizado con los grupos de tratamiento valorar las córneas trasplantadas de 2 a 3 veces a la semana para detectar signos de injerto de córneaepisodios de rechazo o fracaso del injerto corneal. Use el microscopio quirúrgico o una horizontal lámpara de hendidura para estas observaciones.
- Evaluar cada córnea para la opacidad usando una escala de 0 a 5. La escala se define como sigue:
- Asigne una puntuación de 0 a esos córneas que no tienen signos de opacidad.
- Asigne una puntuación de 1 a esas córneas que muestran opacidad superficial mínima.
- Asigne una puntuación de 2 a córneas que muestran opacidad leve y profunda pero la pupila y el iris subyacentes son todavía discernible.
- Asignar una puntuación de 3 a la córnea que deben mostrarse opacidad estromal en el que el iris no pueden verse en detalle con la excepción de los márgenes de la pupila.
- Asigne una puntuación de 4 a córnea que deben mostrarse densa opacidad estromal y si no hay estructuras subyacentes se pueden ver.
- Asigne una puntuación de 5 a córnea que deben mostrarse opacidad completa y edema estromal intensiva, con la pupila y el iris totalmente oscurecido.
- También evaluar cada córnea para el grado de infiltración de los vasos sanguíneos (neovascularización) utilizando una escala de calificación de 1 a 8. Para lograr esto, ver la córnea como un conjunto de 4 cuadrantes iguales y determinar la cantidad de vasos sanguíneos en cada uno de estos cuadrantes con una anotar ese rango voluntad de 0 (no hay vasos) a 2 para una amplia vascularización de ese cuadrante. Añadir las puntuaciones individuales de cada cuadrante para calcular la puntuación neovascularización final.
- Clasifica las córneas como agudamente rechazados si tienen una puntuación de 3 para dos observaciones consecutivas por tiempo señala hasta 5 semanas.
- Clasificar los ratones cuyas córneas eran claras a las 5 semanas, pero el desarrollo de la opacificación a veces> 45 días después del injerto, con una puntuación de 3 para dos puntos de tiempo consecutivos, como haber sufrido tardío rechazo del aloinjerto corneal. Utilice las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para analizar la supervivencia del injerto.
- Evaluar cada córnea para la opacidad usando una escala de 0 a 5. La escala se define como sigue:
5. La manipulación de la Modelo
en-left: 40px; ">- Para preparar las células individuales, primero la eutanasia del ratón donante. Entonces, extirpar el bazo.
- Coloque el bazo en un filtro de células y alterar con un émbolo de jeringa de una jeringa de 3 ml.
- Lavar las células y resuspender en 10 ml de solución salina equilibrada de Hanks.
- Retire 10 l de suspensión celular y añadir a 10 l de 0,4% azul de tripano y mezclar. Añadir que a hemocitómetro y contar las células en el Sistema Interconectado Central. El número de células en el tubo es el recuento de células x 10 4 x 2 (factor de dilución en azul de tripano) x 10 (volumen en el tubo).
- Anestesiar a los ratones como se describió anteriormente.
- Realizar inyecciones utilizando un microscopio de disección. Para cada inyección intracameral, utilizar 10 6 células de bazo en un volumen de 0.005 ml y una jeringa de microlitro 0,25 ml equipada con una aguja 33 G.
NOTA: Otras manipulacionesdel modelo se puede realizar mediante el tratamiento de los animales con reactivos que actúan ya sea como antagonistas o agonistas para determinar el papel que un factor determinado puede desempeñar siguiente ortotópico cirugía aloinjerto corneal.
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Representative Results
El modelo murino de trasplante de córnea ha sido utilizado durante más de 20 años con éxito para caracterizar los mecanismos tanto de rechazo del aloinjerto corneal 19-23 y la aceptación del aloinjerto de la córnea 13, 15,16,18, 24-27. Este modelo se utilizó para establecer la importancia de la expresión de FasL en la aceptación del aloinjerto corneal, en que los animales que carecen de FasL no fueron capaces de aceptar aloinjertos de córnea 15. También se ha utilizado para demostrar que el crecimiento endotelial receptor 1 del factor tratamiento morfolino vascular aumenta significativamente la supervivencia del injerto corneal 28. En un informe reciente se utilizó este modelo para probar si el pretratamiento de ratones antes de injerto corneal con corticosteroides a cabo ningún beneficio terapéutico 29. Los autores mostraron que tal tratamiento previo mejoró la tasa de supervivencia de los aloinjertos de córnea 29. Estos informes demuestran claramente que la principal ventaja de este modelo es queuno puede estudiar en un animal vivo aquellas cosas que se cree que son importantes para el éxito de los trasplantes de córnea en humanos.
Estudios anteriores de este laboratorio han informado de que uno de los principales mecanismos responsables de rechazo del aloinjerto corneal es el establecimiento de sistémica hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a aloantígenos específicos expresados por el aloinjerto de córnea 19, 20. Hemos utilizado ya que este modelo para probar si el establecimiento de aloantígeno sistémica tolerancia DTH a aloantígenos expresadas por el donante del injerto corneal mejora la supervivencia de este tipo de injertos. Como se muestra en la Figura 1, los ratones BALB / c tolerantes a / 10 (B10) aloantígenos C57BL no mejorar la aceptación del aloinjerto de la córnea medida por el tiempo medio de supervivencia para estos aloinjertos de córnea. Así, el tiempo medio de supervivencia para las córneas rechazados era el mismo si los ratones fueron tolerantes o no. También se realizó estudios similares utilizando las respuestas de injerto de la piel como mediode poner a prueba la eficacia de la inducción de tolerancia DTH sistémica. Estos estudios demostraron que cuando la tolerancia de DTH fue establecido en ratones Balb / c B10 hacia aloantígenos, injertos de piel que lleva algunos (B10.D2 y C.B10-H-2 b) o la totalidad de B10 aloantıgenos no mostrar ninguna aumentaron el tiempo medio de supervivencia ( la Figura 2). Llegamos a la conclusión de estos estudios que los ratones BALB / c que habían establecido las respuestas DTH de antígenos específicos no derivan ningún beneficio mensurable de esa tolerancia, ya sea para los aloinjertos de la córnea o de la piel. Estos datos también indican que la información generada estudio de un modelo murino de trasplante de córnea se, a veces, ser directamente aplicable a otras formas de trasplante de tejido sólido.
Figura 1. ratones BALB / c fueron inyectados en la cámara anterior con 10 células de bazo de 6/10 (B10) ratones C57BL. (p> 0,05).
Figura 2. La inyección de células de bazo en la cámara anterior no afecta a la supervivencia de injertos de piel alogénicos. Ratones BALB / c fueron inyectados en la cámara anterior con 10 6 células de bazo de ratones C57BL / 10 ratones. Después de una semana estos ratones fueron injertados por separado con la piel de ratones C57BL / 10, n = 10, B10.D2, n = 7, C.B10-H-2 b, n = 7 y se comparan con los ratonesratones que no fueron inyectados y injertados con C57BL / 10 de la piel, n = 10. Los resultados se expresan como el tiempo de supervivencia media + SEM.
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Discussion
El modelo murino de trasplante de córnea aquí descrito permite al investigador estudiar el rechazo del aloinjerto corneal humano en un modelo que es predictivo de los factores que se asocian tanto con mejor rechazo 15,17,18,20, 26-30 y 21-25 de la aceptación de la córnea aloinjertos. A diferencia de trasplante de córnea humana, en el que los pacientes reciben tratamiento con esteroides, ya sea tópica o sistémica para tratar o prevenir el rechazo 31, este modelo se utiliza típicamente para determinar los factores que son relevantes para el rechazo del aloinjerto en ausencia de dicha terapia. Además de un modelo para el rechazo del aloinjerto corneal aguda, que ocurre típicamente dentro de 30 a 40 días del trasplante, también presentamos un modelo tardío de tal rechazo que se produce 45 días post-injerto en ratones y imita muchas de las características de tarde -término y crónica rechazo 32,33 que hasta el momento no se han modelado en animales.
Tque los puntos fuertes del modelo son que se puede diseccionar diversos mecanismos que son responsables de la relativamente alta tasa de aceptación del injerto de córnea, así como determinar qué mecanismos son los más responsables de fracaso del injerto corneal. Este modelo también permite a uno probar diversas estrategias terapéuticas en un animal que posee un sistema inmunitario que es muy similar al sistema inmunológico humano. Para ello, la existencia de muchos reactivos que reaccionan con factores murinos, así como ratones transgénicos y de genes específica, permite la evaluación de muchos más factores de lo que sería el caso con otras especies. Esta capacidad de evaluar muchos factores diferentes que son importantes para el éxito y el fracaso de los aloinjertos de córnea es una significativa positiva en favor de la utilización de este modelo murino frente a otros modelos animales en los que la cirugía es más fácil de realizar debido al aumento del tamaño de los ojos de estas especies.
Si bien hay varias debilidades de este modelo,creemos que los puntos fuertes ahora les superan. Uno de los más significativos, que se aludió anteriormente, es la experiencia técnica que participan en la realización de un trasplante de córnea en ratones. Debido al pequeño tamaño del ojo murino, esto requiere alguien que es experto en la microcirugía, tanto en la realización del trasplante así como la eliminación de las suturas. En consecuencia, se requiere una práctica repetida de dominar y mantener la competencia en esta técnica. La segunda debilidad es que mientras que los ratones son muy similares a los seres humanos, no son el mismo. Estos animales muestran una mayor tendencia a la neovascularización, que lo hacen las córneas humanas. Además, este modelo no imitar los procedimientos quirúrgicos destinados a tratar la disfunción de las células endoteliales, como la distrofia de Fuch 2. Antes de trasplantes de espesor total de años recientes, como los utilizados en el protocolo descrito fueron empleados. En la actualidad, se han empleado los trasplantes endoteliales que sólo afecten a la porción endotelial de la córnea
Para el rechazo tardío (> 45 días) dos factores únicos para esta versión del modelo se destacan. La primera debilidad con esta forma de la modelo es que los ratones se debe mantener durante un mínimo de dos a tres meses con el fin de estudiar el rechazo tardío. Y en segundo lugar, las córneas deben primero sobrevivir posibles reacciones de rechazo agudo. Tales rechazos agudos ocurren en 50 a 70% de los receptores 17, 20 -24. Así, para estudiar el rechazo tardío uno se injertan ratones cuyos trasplantes serán rechazadas de forma aguda y no sobrevivir hasta los 45 días post-injerto. Con el fin de mitigar este hemos encontrado que la tasa de rechazo en los ratones macho es menor que la observada para los ratones hembra (manuscrito en preparación) y por lo tanto para estudiar rechazo tardío término se aconseja que sólo los ratones machoser utilizado. También trató de prolongar la supervivencia del injerto corneal con el tratamiento con esteroides, pero esto no resultó ser particularmente útiles (observaciones personales) y por lo tanto no recomendamos usar el tratamiento con esteroides. A pesar de estas complicaciones y la advertencia de que probablemente aproximadamente la mitad o un poco más de los injertados con córneas alogénicos permanecerán clara hasta después de 45 días, esto sigue siendo un modelo muy útil para estudiar los factores que son relevantes para el rechazo tardío.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Surgical Microscope | Zeiss | Rebuilt | |
| 1 ml Syringe | BD | 305122 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| Vannus Scissors | Stortz | E-3387 | |
| 11-0 Sutures | Alcon | 717939M | |
| Trephine 2.0 mm | Katena | K 2-7520 | |
| Trephine 1.5 mm | Katena | K 2-7510 | |
| Tricaine Hydrochloride 0.5% | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| Healon | Abbott | Healon OVD | |
| Forceps | FST | 11251-20 | |
| 7-0 Sutures | Alcon | 8065 | |
| 2.5% Phenylephrine HCl | Alcon | NDC 61314-342-02 | |
| 1% Tropicamide | Bausch & Lomb | NDC-24208-585-59 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| 33 gauge needle | Hamilton | 90033 | |
| Cell Strainer (100 μm nylon) | BD Falcon | 352360 | |
| Hemocytometer | Cardinal Health | B3175 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 |
References
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