在永久性幼虫特有的神经重构的C语言活体成像线虫

Abstract

控制应激诱导的表型可塑性在动物的机制是频繁复杂和困难的体内研究。应力诱发塑性的一个典型的例子是C的持久期线虫 。 Dauers是低浓度的细菌性食物和高浓度永久性幼虫信息素的条件下形成的一种替代发育的幼虫期。 Dauers显示广泛的发育和行为的可塑性。例如，一套四内唇象限（IL2Q）神经元中持久形成进行了广泛可逆的重塑。利用众所周知的环境途径调节永久性幼虫条目，先前建立的方法，用于生产由大型液体线虫培养物粗永久性幼虫信息素被证实。用这种方法，对50000的浓​​度 - 液体培养物75000线虫/ ml的是足以产生一种高效的粗永久性幼虫信息素。粗素效价对射探测器由剂量 - 反应的生物测定rmined。最后，在持久形成用于体内的时间推移的IL2Qs的成像方法进行描述。

Introduction

表型可塑性，包括发育和行为的可塑性，可以适应恶劣的环境条件很重要，被认为是动力，发展^1。℃。线虫是一种模式生物经常使用的开发和神经生物学研究。在理想情况下，C。在进入成年繁殖期通过四个幼虫阶段线虫的发展。然而，低粮食供应和人口密度高，长的条件下， 线虫可以接受的发育开关，进入一个长寿命和抗逆持久期^2。 Dauers显示非dauers几个形态和行为上的差异而可能介导这一抗逆性。的环境线索和遗传途径调节永久性幼虫条目已经广泛地描述^{3，4，5，6，7，}但控制个体的表型变化的分子机制发生ðuring持久形成是不太容易理解。

永久性幼虫特定表型的检测要求生产的永久性幼虫动物。这可以通过以下三种方式：1）从C的饥饿文化采摘线虫 ，2）使用的持久形成组成（DAF-C）突变体，3）诱导持久形成经过纯化信息素。这是比较简单的，从一个标准的NGM板有三挑dauers 线虫的人口已经耗尽了它的细菌的食物供应。在我们手中，一个标准的NGM板最初接种用50μlOP50 大肠杆菌 ，使其生长3天，随后接种3 - 4成人雌雄同体保 ​​持在25℃，将用尽的一个星期内的食物供应和产生几千内的3天dauers（除了众多饥饿非dauers）。然而，这种方法是不令人满意的蜕皮到d中期间出现的审查过程奥尔。因此很难确定哪个几千动物在一个典型的饥饿板的正进入永久性幼虫。此外，使用饿死板提供了可能性进行同步。采用DAF-C突变允许同步和可靠的代dauers的。然而，没有保证特定的daf-C突变不会影响其他永久性幼虫特异性表型单独或与其他突变组合。

à永久性幼虫信息素的存在，最初是由Cassada和罗素暗示，后来被黄金和里德尔证实。该持久性信息素已被化学特点^{2，8，9，10，}纯化信息素是由一个复杂的混合ascarosides，它以不同的形式规范双方的行为和发育过程^9,11。使用粗永久性幼虫信息素的提取物可以用于可靠的控制异步同步dauers在野生型背景。 对神经系统和相关的神经胶质细胞在永久性幼虫幼体形成^12，13，14进行改造，其中一些变化是不可逆的，如神经胶质细胞的永久性幼虫^13，14在重塑，但其他的重塑事件后，恢复到良好的可逆性环境条件。枝晶树枝状，从单一的树突切换到multidendritic神经元和轴突重塑^12：例如，一组4 IL2Q神经元中持久形成包括经过快速，可逆的神经重构。本文的方法允许可靠的体内成像应激诱导的神经可塑性的模式生物。提出了生产和粗永久性幼虫信息素的检测方法被先前描述和编译从几个来源^{4，8，15，16，17，18。}

Protocol

1，原油永久性幼虫信息素产生

1. 成长OP50 大肠杆菌从大肠杆菌单菌落O 2 / N在37°C，而在100毫升的LB肉汤200rpm振荡。注：此O / N培养可事先保存在4℃。
2. 成长氮气C.线虫于6月15日至20日毫米培养皿中以NGM琼脂（见配方在表1）接种50μl的OP50 大肠杆菌的大肠杆菌 ，直到细菌几乎耗尽^19。
3. 请在1升锥形5X250毫升的媒体中（见配方见表1）烧瓶^19。注意：此溶液可预先制成。
4. 成长OP50 E.文化大肠杆菌在4升的LB培养基的O / N以1毫升OP50的大肠杆菌接种大肠杆菌 ，并在37℃下振荡16小时。
5. 从平板（步骤1.2）与1ml为S基础溶液（见配方见表1）和从4-5板成每4 1升锥形烧瓶中，在步骤1.3中制备的在S媒体转移线虫洗线虫（4- 5板每个瓶^）19。
6. 离心从步骤1.4的OP50，在650×g离心10分钟，除去上清液。悬浮每个细菌沉淀在10ml为S基础的解决方案。悬浮细菌的等量转移到线虫的每个烧瓶。
7. 将培养瓶在定轨摇床上，在室温（20 - 25℃）和100 - 150转4 - 5天，直到溶液开始清除，表明食物的消耗。
8. 一旦食物被消耗殆尽，增长OP50 大肠杆菌的另一个O / N培养大肠杆菌在4X 1升LB培养基中。离心细菌，在650×g离心10分钟，并从一个烧瓶中加入沉淀到每一S介质瓶与线虫。返回在S媒体瓶中的轨道摇床中，如在步骤1.7中，额外3-4天，直至食物被再次耗尽。
9. 取约1毫升一份的从每个烧瓶中的溶液，并估计线虫浓度由子采样从每1ml等份1微升和计数线虫的数目。注意：线虫种群应该是50,000 - 75,000线虫/毫升。在此浓度下的大多数线虫是dauers。
10. 放弃任何污染瓶中。注：污染经常表现为菌丝在步骤1.9所示。
11. 线虫离心机在4000 XG在4℃下10分钟。丢弃线虫沉淀，并保留上清液。可选地，看到讨论了使用这些动物做一个低效力的信息素。
12. 筛选通过＃1 Whatman过滤纸上清液。注意：保温瓶将加速这一进程。
13. 此外，通过过滤0.45微米的无菌真空过滤单元上清。注：滤液可以保持在o / n 4°C或进入1.14。
14. 滤液中加入2L烧杯中搅拌棒。放置在加热搅拌台通风柜。煮沸边搅拌，蒸发至约200毫升将溶液转移到500ml烧杯中。继续煮，直到约50ml的乐英尺注：应在该步骤中被视为是可能的解决方案，以沸腾。最后将50ml颜色为黑褐色。在烹调过程中的任何时间，该热可以被关闭，并且将滤液存储的O / N在室温或4℃。
15. 放凉后，离心5分钟以1000×克倒出上清液的100毫升的烧杯中，并弃去沉淀。
16. 熬上清下降到棕色外壳。从火上移开，并打破了锅铲地壳。添加足够200标准乙醇以覆盖外壳。用封口膜封住烧杯中，并让它坐在O 2 / N在室温。倒掉乙醇到一个干净的烧杯中，并放置到一边。加入新鲜的乙醇覆盖地壳。重复O 2 / N提取3次。池中提取物。
17. 使用真空泵干的乙醇提取物。如果真空泵不可用，乙醇提取物添加到一个干净的烧杯和温暖至50°C，而在通风橱中搅拌。注意：一旦乙醇蒸发升渣的粘飞行棕色应该保持。如果加热的情况下，应当小心以不燃烧的溶液，加热时间过长。
18. 在10ml的蒸馏水的无菌水溶解残余物。过滤灭菌该溶液用1毫升等分0.22μm的注射器过滤器，并储存在-20℃。注：1ml水来溶解残余物，每100毫升原液体线虫培养物。例如，如果该液体培养烧瓶中的一个由于丢弃污染，则调整所用的水以溶解残余物的量。

2，确定信息素剂量反应

1. 准备永久性幼虫信息素通过使6X5毫升NGM媒体与高贵的琼脂，蛋白胨没有，并补充50微克/毫升硫酸链霉素和一系列永久性幼虫信息素（见配方见表^{1）4，19，}在13×毫米混合成分玻璃培养管，沸腾本生灯，然后倒入切成3厘米的培养皿。
2. 称取分icrocentrifuge管。加入1 ml 大肠杆菌的O / N培养的大肠杆菌 OP50到管和离心〜17000 XG的离心管。删除所有的上清液。再次称重该管和确定将细菌沉淀的重量。悬浮用M9缓冲液（见配方在表1）的粒料为4％的最终浓度（ ^重量_/体积）。等分试样将10μl细菌悬液到每一信息素板⁴的中心。商店板在o / n RT。
3. 蜕皮到成年到信息素板⁴后接10-15妊娠N2野生型雌雄同体的一天。存储该板在25℃下进行3 - 4小时。
4. 摘掉所有的成人雌雄同体的。记录产卵的各板的数量。用封口膜密封板，并恢复至25℃，3天^17。
5. 算dauers的百分比（ 图2）。注意：对于这两种方法是要注意，重要的是dauers（和较小的前10吨非dauers）会爬上墙壁和到培养皿的盖子。因此重要的是要检查的培养皿为线虫的所有表面。
6. 适合数据的剂量-反应曲线并估计欧盟₉₀浓度信息素（足够的信息素诱导90％的动物形成dauers）， 如图3注：我们通常使用逻辑回归模型来估计欧盟₉₀ ，但不同的统计软件包可能会产生类似的估计可供选择的方法。

3，现场永久性幼虫IL2神经影像学

1. 作为协议2使用步骤2.6确定欧盟₉₀值准备永久性幼虫信息素板。
2. 诱导使用方法dauers在协议2与应变携带一个综合IL2记者转基因（myIs13 [P _KLP-6 :: GFP]，myIs14 [P _KLP-6 :: GFP]，myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato]或qIs56 [P _滞后2 :: ^{GFP]）12，20，21}注意：当Q Is56时，GFP的表达不会在IL2Qs可见，直到几个小时后永久性幼虫蜕皮和一些初始重塑事件将不可见。另外，虽然从P _滞后2 :: GFP转基因的荧光信号是在IL2s最终明亮永久性幼虫比P _KLP-6荧光报告期间，在P _滞后-2 :: GFP转基因也表示弱的头部肌肉的可掩盖细IL2分支机构。
3. 下面产卵，取出成人雌雄同体，用封口膜密封板孵育34小时，在^25℃17。注：时间为永久性幼虫蜕皮的长度略有不同个体之间。树突树枝状最迅速的时期始于4 - 5小时以下的永久性幼虫蜕皮的发生（39 - 44小时后产蛋在^{25°C）12。}
4. 成像的前一天，弥补了10％的溶液^（W / _V）琼脂糖M9的缓冲区与永久性幼虫信息素在欧盟₉₀浓度。分装约100μl琼脂糖迈上了一个显微镜载玻片和快速，但轻轻地，在上面放置另一张幻灯片创建一个平坦的表面琼脂糖。经过琼脂糖凝固，包裹在保鲜膜和储存的幻灯片在湿度室（用湿纸巾枪头箱）。
5. 在34小时的潜伏期后，检查信息素板对已停止抽水咽线虫。单独的幻灯片，使得一个滑动的仅一个表面具有琼脂糖上。选择一个或多个线虫到10％的琼脂糖凝胶垫和1μ升0.1微米的聚苯乙烯珠^22。注：使用一个良好的同步人口，多数平板上的线虫会进入蜕皮从L2d的到永久性幼虫。不过，也有可能是其中í变化ndividuals。因此重要的是要注意的附加功能（造口闭塞，咽重构）来估计时间的动物已经在永久性幼虫蜕皮内（见代表性结果为例）的量。
6. 确定线虫的方向（左/右，背/腹）。捕获IL2Q树突Z堆叠图像在放大100倍以尽可能低的荧光强度，每15分钟或视需要为特定的实验。继续拍摄图像，直到线虫已经从L2d的角质层分离，固定化是不可能的，或者动物从永久性幼虫恢复（咽开始抽水）。如果不积极成像，放置在一个恒温恒湿试验箱的幻灯片。注：我们使用啶显微镜机动阶段，微分干涉对比（DIC）的光学元件。

Representative Results

生产的粗永久性幼虫信息素产生一种黄色液体（ 图1）即热和冷的稳定。的粗素等分试样储存在-20℃下无限期地与活性无明显损失。下列生产信息素，单剂量 - 反应的生物测定是足够的效力的一个粗略的估计。然而，对于大多数实验是必要的，以重复的生物测定2 - 3次，取平均值，从每个试验。从两个信息素生物试验的代表性结果列于图3中 ，从这些数据的EC ₅₀和EC ₉₀可以计算出来。

除了 ​​耐十二烷基硫酸钠^2，dauers可以通过几种形态特征包括闭塞气孔，横向鼻翼，折射体中的前皮下组织和缩咽（ 图2和图4A FO被识别řL2幼虫）。 Dauers也有一些独特的行为特征包括：倾向保持行为上的静态，偶尔分散策略存在所谓nictation，抑制头觅食的动作，抑制咽部抽吸和排泄管搏动^2，5，23的诱导行为特征表现出个体间的差异。

蜕皮成永久性幼虫需要大约12小时从预永久性幼虫L2阶段（L2d的^）4的端部。这一时期对应的IL2Q乔木的刻板增长。蜕皮变成永久性幼虫的第一个引人注目的事件是咽抽水的抑制。抑制抽水是共同在C的所有蜕皮线虫 。然而，抑制咽部抽继续在持久期结束约4小时以下的动物的回归有利的环境条件。在咽抽水初期抑制，一层角质层形成了造口。继发病的蜕皮成永久性幼虫的第一个小时期间，发生这些变化。在实施初期有频繁的IL2Q细胞体延伸的附加突起的形成过程。然而，这种初步的附加 ​​过程通常缩回在2小时以下的发作的蜕皮成永久性幼虫^12。

在时间2 - 5以下的蜕皮变成永久性幼虫的咽开始改造呈现出逐渐减少的大小（ 图4B）的发作。伴随地，短泪点的形式，并沿着IL2Q初级枝晶（ 图5）缩回。期间小时4 -以下的蜕皮发病8，主体经历致使拉离L2d透过角质层（ 图4C）的线虫的逐渐径向收缩。这一时期与相关从主树突生长的2°树突和建立从IL2Q胞体树突dditional（永久性幼虫特有的主树突-1D°）。如示于图5中的枝晶生长是不恒定的，而是其特征在于，所述动态生成和过程回缩两者都有，2°和1d°树突通常延伸到腹侧（用于IL2Vs）或背侧（用于IL2Ds）中线。一旦该持久角质层完全从L2d透过角质层分离，荧光的应用程序会导致动物迅速旋转在它的纵向轴线，使得后续的成像具有挑战性。尝试从幻灯片中删除发展中国家的动物，机械取下L2D角质层，并装入动物在新的幻灯片，同时仍保持永久性幼虫发育均没有成功。

图1：原油永久性幼虫信息素是可以无限期地在-20℃存放的黄色液体。 请点击这里查看该图的放大版本。

C的图2的DIC显微镜照片线虫 dauers具有典型的永久性幼虫形态特征，一个永久性幼虫展示闭塞造口（箭头）和缩咽矩形终端灯泡（A）背中体视图（用红色标出，比较与图4A所示的L2幼虫）。新成立的dauers经常会保留L2d的角质层（箭头）的一部分。皮下组织呈现高折射体（箭头）典型dauers的（B）背视图。同样，L2d的角质层是显而易见的（箭头）。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3的剂量反应试验，以粗永久性幼虫信息素。暴露于增加永久性幼虫信息素的掺入改性NGM媒体水平L1动物更有可能形成dauers。数据收集和从除下列浓度，其中只考一次两个独立实验汇集：0.05％，2％和4％。数据拟合到S形剂量反应曲线。采用Logistic回归分析计算的R ²和EC值。在n动物研究对于每个浓度的赭如下：0％N = 299，0.05％N = 81，0.1％N = 352，0.5％N = 368，1％N = 241，2％N = 125，4％正= 155。误差棒表示95％置信区间。

图4 DIC的外侧C的右视图显微照片在蜕皮变成永久性幼虫的不同阶段线虫 （一）二级动物有典型的圆形端子咽球（用红色标出），（B）约3小时后的蜕皮变成永久性幼虫，终端灯泡萎缩，L2d的角质层开始由新形成的永久性幼虫角质层（箭头）分离（C）约10小时以下的永久性幼虫蜕皮的发病，该动物已经历了广泛的径向收缩并脱离从L2d透过角质层（箭头）。偶尔，在角质层林立L2d的阶段（箭头）的排泄管仍然可以看到连接到显影永久性幼虫。比例尺为10微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

图单个动物表达IL2记者P _KLP-6 :: tdTomato。返回5侧面观落射荧光显微镜 ，IL2神经全长图像大约3小时以下的发病蜕皮变成永久性幼虫。插图显示IL2Q枝晶在继发病的蜕皮成永久性幼虫不同时间点的部分。在IL2Q分支机构的快速扩展的原因出发约5小时以下的发病蜕皮变成永久性幼虫。比例尺，10μm以下。ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

Discussion

永久性幼虫特异性神经可塑性和其他永久性幼虫相关的形态学变化的检查需要控制和可靠的形成dauers要么通过基因突变（ 即，DAF-C突变体）或由野生型动物的接触信息素。而使用的基因突变的诱发dauers方便，它可能会混淆的结果。因此，与DAF-C突变收集的数据应该被随后确认与诱导暴露于永久性幼虫信息素进入持久期野生型动物。

的粗永久性幼虫信息素的生产相对简单，这种协议的变化被发表^18。用污染的可能的例外，这里介绍的方法是非常可靠的。以产生的提取物中，我们使用培养中的媒体液体培养¹⁹线虫大密度的标准方法。有大量的灵活性初始量升线虫接种物加入到液体培养。较大的线虫数起将加快程序。然而，重要的是确保所有的初始线虫接种物是无污染的是很重要的。两个真菌和细菌污染生长在液体培养基中可能出现。真菌污染可以通过菌丝的存在下可容易地检测。细菌污染是更难以评估。通常情况下细菌污染，可以观察到，如果液体培养基不上市的潜伏期后很快清除。有在生产所需的足够信息素的总线虫种群密度的灵活性。例如，25000线虫/ ml的浓度足以产生信息素在诱导dauers有效。一种替代的方法包括将所述线虫从液体培养至小体积的M9缓冲液（〜50毫升）随后的O / N培养在RT上的苯丙氨酸的轨道摇床和随后的纯化的romone通过本文所述的方法。此方法是有效的，但产生了较高的EC _50（ 即，如此强大）信息素。

作为每批粗素可能不同的效力，在诱导永久性幼虫测试一个子样本的效力是很重要的。对于许多应用来说具有一个复制的每个信息素浓度的单一的生物测定是足够的，以提供效力的总体估计。然而，可以独立地进行剂量 - 反应的生物测定之间显著变化。因此，如果试验需要持久形成和非永久性幼虫发展之间的微妙平衡，这将是必要进行2 - 3复制生物测定法来确定一个精确的有效剂量。在未来，随着在线虫生物学ascarosides的重要性得到了更广泛的认可，它可能以合理的成本来购买合成永久性幼虫信息素。

永久性幼虫特有的东北大学的调查结果在IL2s RONAL重塑为研究应激诱导神经可塑性的分子机制的一个平台。以确定由该特定基因调节神经可塑性的机制，它可能有必要按照在实时的重塑过程。 IL2的体内成像的方法是建立在以前的C。线虫的方法^{22，24，25。}在持久形成一种障碍成像是永久性幼虫恢复的可能性。最简单的解决方法是首先使用DAF-C突变。然后，可以在使用本文描述的方法的非DAF-C后台执行的任何结果的确认。

辛格和苏尔斯顿指出的体内成像的持久形成²⁵多个障碍。其中包括新成立的dauers逃脱掉显微镜载玻片和不受控制的运动下的径向收缩。使用微球珠已经消除逃逸²²的可能性。豪版本发生约10小时到永久性幼虫蜕皮的径向收缩率仍然会为后续的成像困难。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving