In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

Abstract

מנגנוני השליטה פלסטיות פנוטיפי שנגרם עקב מתח בבעלי חיים הם לעתים קרובות מורכבים וקשים ללמוד in vivo. דוגמא קלאסית של פלסטיות שנגרם עקב מתח היא שלב dauer של ג elegans. Dauers הוא שלב זחל התפתחותית חלופי נוצר בתנאים של ריכוזים נמוכים של חיידקים שבמזון וריכוזים גבוהים של פרומון dauer. Dauers להציג פלסטיות התפתחות והתנהגות נרחבת. לדוגמא, קבוצה של ארבעה רביע פנימי labial הנוירונים (IL2Q) עוברים שיפוץ הפיך נרחב במהלך היווצרות dauer. ניצול הכניסה הידועה dauer ויסות מסלולים סביבתיים, שיטה הוקמה בעבר לייצור פרומון dauer הגולמי מתרבויות נמטודות נוזל בקנה מידה גדולה הוא הוכיח. בשיטה זו, ריכוז של 50,000 - 75,000 / נמטודות מ"ל של תרבות הנוזלית הוא מספיק כדי לייצר פרומון dauer הגולמי חזק מאוד. עצמת פרומון הגולמי היא determined ידי המבדק מנת תגובה. לבסוף, השיטות המשמשות בזמן לשגות הדמיה vivo של IL2Qs במהלך היווצרות dauer מתוארות.

Introduction

פלסטיות פנוטיפי, כוללים פלסטיות התפתחות והתנהגות, חשובה להסתגלות לתנאי סביבה שליליות ולנחשב לכוח מניע בהתפתחות ^1. ג elegans הוא אורגניזם מודל המשמש לעתים קרובות ללימודים בפיתוח ונוירוביולוגיה. בתנאים אידיאליים, ג elegans מתפתח דרך ארבעה שלבי זחל לפני כניסת שלב הרבייה הבוגרת. עם זאת, בתנאים של זמינות נמוכה מזון וצפיפות אוכלוסייה גבוהה, ג elegans יכול לעבור מתג התפתחותיים ולהיכנס לשלב dauer חיים ארוך ועמידות לעקות ^2. Dauers להציג כמה הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים מאינם dauers אשר צפוי לתווך התנגדות ללחץ הזה. הרמזים הסביבתיים ומסלולים גנטיים המסדירים כניסת dauer היו תיארו בהרחבה ^{3, 4, 5, 6, 7.} עם זאת, המנגנונים המולקולריים שליטה שינויי פנוטיפי בודדים המתרחשים דהיווצרות dauer uring הם הבינו פחות טוב.

הבדיקה של פנוטיפים dauer ספציפי דורשת הייצור של בעלי החיים dauer. זה יכול להיות מושלם בשלוש דרכים: 1) בחירה מתרבות מורעבת של ג elegans, 2) שימוש בהיווצרות dauer (daf-c המכונן) מוטציות, 3) אינדוקציה של היווצרות dauer באמצעות פרומון מטוהר. זה פשוט יחסית כדי לאסוף dauers מצלחת NGM סטנדרטית עם ג אוכלוסיית elegans שמיצתה את מזון אספקת החיידקים שלה. בידיים שלנו, צלחת NGM סטנדרטית במקור זרע עם 50 μl של Escherichia coli OP50, מותר לגדול במשך 3 ימים ולאחר מכן מחוסן עם 3 - הרמפרודיטים 4 מבוגרים המשיך ב25 ° C יתיש אספקת מזון בתוך שבוע אחד ולייצר כמה אלף dauers בתוך 3 ימים נוספים (בנוסף למים שאינם dauers מורעב רב). עם זאת, שיטה זו אינה מניחה את הדעת לתהליכי בחינה המתרחשים במהלך הנשירה לדאאואר. קשה לקבוע איזו מכמה אלף בעלי חיים על צלחת מורעבת טיפוסית נכנסים לdauer. יתר על כן, שימוש בצלחת מורעבת מציעה שום אפשרות לסנכרון. השימוש במוטציות daf-c מאפשרים סנכרון והדור אמין של dauers. עם זאת, אין ערובה לכך שמוטצית daf-c בפרט לא תשפיע פנוטיפים dauer ספציפי אחרים לבד או בשילוב עם מוטציות נוספות.

הנוכחות של פרומון dauer נרמזה לראשונה על ידי Cassada וראסל ומאוחר יותר לידי הביטוי בזהב וחידה. פרומון dauer מאז מאופיין כימי ^{2, 8, 9, 10.} פרומון המטוהר מורכב מתערובת מורכבת של ascarosides, אשר בצורות שונות להסדיר שני תהליכים התנהגותיים והתפתחותיים ^{9, 11.} שימוש בתמצית פרומון dauer הגולמי מאפשרים אינדוקציה אמינה מבוקרת של dauers המסונכרן ברקע wild-type. מערכת העצבים ותאי גליה הקשורים לעבור שיפוץ במהלך זחל dauer היווצרות ^{12, 13, 14.} חלק משינויים אלה הם בלתי הפיכים, כגון שיפוץ של תאי גליה במהלך dauer ^{13, 14.} עם זאת אירועי שיפוץ אחרים הם הפיכים על שיבה לחיובית תנאים סביבתיים. לדוגמא, קבוצה של ארבעה נוירונים IL2Q לעבור שיפוץ עצבי מהיר והפיך במהלך היווצרות dauer כולל: arborization דנדריט, מתג מהדנדריטים יחידים לתאי עצב והאקסון multidendritic שיפוץ ^12. השיטות בזאת לאפשר להדמית in vivo אמינה של neuroplasticity מתח מושרה באורגניזם מודל. השיטות שהוצגו לייצור והבדיקה של פרומון dauer גולמי שתוארו קודם לכן, ונאספו מכמה מקורות ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

.1 גולמי דאואר פרומון הפקה

1. לגדול OP50 E. coli מO מושבה אחת / N על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד בשל מרק LB 100 מ"ל ב 200 סל"ד. הערה: O / תרבות N זה יכול להתבצע מראש ולאחסן ב 4 ° C..
2. לגדול N2 ג elegans על 15-20 יוני סנטימטר צלחות פטרי עם אגר NGM (ראה מתכון בטבלה 1) שנזרע עם 50 μl של OP50 E. coli עד החיידקים קרוב למיצוי ^19.
3. הפוך 250 מ"ל 5x של תקשורת S (ראה מתכון בטבלה 1) ב1 L Erlenmeyer צלוחיות ^19. הערה: פתרון זה יכול להתבצע מראש.
4. לגדול תרבות של OP50 E. coli ב4 L של O מרק LB / N על ידי יחסינו עם 1 מ"ל של OP50 בE. coli ורועד ב37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
5. שטוף את נמטודות מצלחות (שלב 1.2) עם 1 מ"ל של תמיסת S הבסיסית (ראה מתכון בטבלה 1) ונמטודות העברת 4-5 צלחות לכל אחד מ4 1 צלוחיות L Erlenmeyer עם תקשורת S מוכנה בשלב 1.3 (4 5 צלחותלכל בקבוק) ^19.
6. צנטריפוגה OP50 משלב 1.4 ב650 XG עבור 10 דקות ולהסיר supernatant. Resuspend כל גלולה חיידקים ב10 מ"ל של תמיסה בסיסית S. העבר את הכמויות שווה של חיידקי resuspended בקבוק אחד של נמטודות.
7. מניחים את צלוחיות על שייקר מסלולית בטמפרטורת חדר (20 - C ° 25) ו100 - סל"ד 150 ל4 - 5 ימים עד הפתרון מתחיל לנקות, מה שמעיד על דלדול של מזון.
8. ברגע שהמזון יאזל, לגדול עוד תרבות O / N של OP50 E. coli ב4x 1 ליטר מרק LB. צנטריפוגה החיידקים ב650 XG עבור 10 דקות ולהוסיף גלולה מבקבוק אחד לכל אחד מצלוחיות תקשורת S עם נמטודות. החזר את צלוחיות תקשורת S לייקר מסלולית, כמו בשלב 1.7, ל3-4 ימים נוספים עד שהאוכל יגמר שוב.
9. קח 1 מ"ל aliquot ~ של פתרון מכל בקבוק ולהעריך את ריכוז נמטודות על ידי תת דגימת μl 1 מכל aliquot 1 מ"ל ולספור את המספר של נמטודות. הערה:אוכלוסיית נמטודות צריכה להיות 50,000 - 75,000 מ"ל / נמטודות. בריכוז זה רוב נמטודות הוא dauers.
10. לבטל את כל צלוחיות מזוהמות. הערה: זיהום לעתים קרובות בא לידי ביטוי כקורי פטרייה ראו במהלך צעד 1.9.
11. נמטודות צנטריפוגה ב 4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. זורק את כדור נמטודות ולשמר את supernatant. לחלופין, ראה דיון על שימוש בבעלי חיים אלה כדי להפוך את פרומון נמוך עוצמה.
12. סנן את supernatant דרך נייר סינון Whatman # 1. הערה: בקבוק ריק יהיה לזרז את התהליך הזה.
13. יתר על כן לסנן את supernatant באמצעות יחידות סינון ואקום סטרילי 0.45 מיקרומטר. הערה: אפשר לשמור התסנין O / N ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ל1.14.
14. הוסף את התסנין לכוס 2 L עם בר ומערבב. מניחים במנדף על צלחת ומערבבים חימום. מביא לרתיחה תוך כדי ערבוב ולהתאדות כ 200 מ"ל. מעבירים את הפתרון לכוס 500 מ"ל. המשך הרותח עד כ 50 מ"ל הוא le. Ft הערה: יש להקפיד במהלך שלב זה כפי שהוא אפשרי לפתרון לרתוח. הצבע של 50 מ"ל הסופי הוא חום כהה. בכל עת במהלך תהליך הבישול, החום יכול להיות כבוי והתסנין מאוחסן O / N ב RT או 4 ° C..
15. בואו מגניב ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב1,000 x גרם. יוצקים את supernatant לתוך מבחנה מ"ל 100 וזורקים את הכדור.
16. מרתיחים את supernatant לקרום חום. מסירים מאש ולשבור את הקרום עם מרית. הוספת אתנול 200 הוכחה מספק כדי לכסות את הקרום. כסה את הכוס עם Parafilm ולתת לו לשבת O / N ב RT. יוצקים את אתנול לתוך מבחנה נקייה ולשים בצד. הוספת אתנול טרי כדי לכסות את הקרום. חזור על עקירות O / N 3 פעמים. בריכת התמציות.
17. השתמש במשאבת ואקום לייבוש תמציות אתנול. אם משאבת ואקום אינה זמינה, להוסיף את תמצית אתנול לכוס וחמה נקיים ל50 ° C תוך ערבוב במנדף. הערה: לאחר אתנול התאדה שאריות דביקות של ליטרצבע חום ight צריך להישאר. אם נעשה שימוש בחימום, יש להיזהר לא לשרוף את הפתרון על ידי חימום במשך זמן רב מדי.
18. לפזר שאריות ב10 מ"ל של מים סטריליים מזוקקים. סנן לעקר את הפתרון הזה עם מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב1 aliquots מ"ל. הערה: 1 מ"ל של מים המשמש להמסת השאריות לתרבות נמטודות נוזל המקורית כל 100 מ"ל. לדוגמא, אם אחד מצלוחיות התרבות הנוזלית נמחקת עקב זיהום, ואז להתאים את כמות מים המשמשת להמסת השאריות.

.2 קביעת פרומון מנה התגובה

1. הכן פרומון dauer על ידי ביצוע 6x 5 מ"ל של תקשורת NGM עם אגר נובל, ללא peptone, ותוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט ומגוון של פרומון dauer (ראה מתכון בטבלה 1) ^{4, 19.} מערבבים את המרכיבים ב13x100 מ"מ צינור תרבות זכוכית, לרתוח מבער בונזן, ולאחר מכן שופך לתוך 3 סנטימטר צלחות פטרי.
2. לשקול בבוקרצינור icrocentrifuge. הוסף 1 מ"ל של תרבות O / N של E. coli OP50 לצינור ו צנטריפוגות ב XG 17,000 ~ בצינור microcentrifuge. הסר את כל supernatant. לשקול את הצינור שוב ולקבוע את המשקל של גלולה החיידקים. Resuspend גלולה עם חיץ M9 (ראה מתכון בטבלה 1) לריכוז סופי של 4% ^(w / _v). Aliquot 10 μl של ההשעיה חיידקים על גבי במרכז כל צלחת פרומון ^4. O צלחות חנות / N ב RT.
3. פיק 10-15 הרמפרודיטים wild-type הרה להולדת N2 יום אחד לאחר הנשירה לבגרות לצלחות פרומון ^4. אחסן את הצלחות ב25 מעלות צלזיוס במשך 3 - 4 שעות.
4. בחר את כל הרמפרודיטים המבוגרים. רשום את מספר הביצים שהוטלו על כל צלחת. חותם את הצלחות עם Parafilm ולחזור ל25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים ^17.
5. לספור את אחוז dauers (איור 2). הערה: בשתי השיטות חשוב לציין כי dauers (ולשעבר פחותיםאוהל שאינו dauers) יטפס על הקירות ועל המכסה של צלחות פטרי. לכן חשוב לבחון את כל המשטחים של המנה לנמטודות.
6. להתאים את הנתונים לעקומת מנת תגובה ולהעריך את ריכוז EC ₉₀ של פרומון (פרומון מספיק כדי לגרום 90% מבעלי החיים ליצירת dauers) כפי שמוצג באיור 3 הערה:. אנחנו בדרך כלל להשתמש במודל רגרסיה לוגיסטי כדי לאמוד את EC ₉₀ , אבל ייתכן שיש לי חבילות תוכנה סטטיסטיות שונות שיטות חלופיות שמייצרות הערכות דומות.

.3 הדמיה חיה של נוירונים IL2 דאואר

1. הכן צלחות פרומון dauer כמו בפרוטוקול 2 באמצעות ערך EC ₉₀ קבע בשלב 2.6.
2. לגרום dauers באמצעות השיטות בפרוטוקול 2 עם זן שנשא transgene כתב IL2 משולב (myIs13 _[KLP-6 P :: GFP], myIs14 _[KLP-6 P :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] או qIs56 [P _{פיגור 2} :: GFP]) ^{12, 20, 21} הערה:. אם q Is56 משמש, הביטוי של GFP לא יהיה גלוי בIL2Qs עד כמה שעות לתוך נשירת dauer וחלק מאירועי שיפוץ הראשוניים לא יהיה גלוי. בנוסף, בעוד שאות הניאון מtransgene _{הפיגור 2} :: GFP P סופו של דבר בהיר בIL2s במהלך dauer מאשר _KLP-6 כתבי ניאון P, P _{הפיגור 2} :: transgene GFP מבטא גם חולשה בשרירי הראש ש יכול להסוות את סניפי IL2 בסדר.
3. בעקבות הטלת ביצים, להסיר את הרמפרודיטים המבוגרים, לאטום את הצלחות עם Parafilm ודגירה של 34 שעות ב25 ° C ^17. הערה: משך הזמן לנשירת dauer משתנה מעט בין יחידים. תקופה המהירה ביותר של arborization דנדריט מתחילה 4 - 5 שעות הבאות תחילת נשירת dauer (39-44ההודעה hr 25 מעלות צלזיוס) ¹² נחת ביצה.
4. היום לפני ההדמיה, מרכיבים את פתרון של 10% ^(w / _v) agarose במאגר M9 עם פרומון dauer בריכוז EC _90. Aliquot כ 100 μl של agarose לשקופית מיקרוסקופ ובמהירות, אך בעדינות, מקום שקופית אחרת על גבי כדי ליצור משטח agarose שטוח. לאחר agarose יש הקרושה, לעטוף את השקופיות בניילון נצמד וחנות בתא לחות (קופסא קצה פיפטה עם מגבות נייר רטובות).
5. לאחר תקופת הדגירה 34 שעה, לבחון צלחות פרומון לנמטודות שהפסיקה שאיבת בלוע. שקופיות נפרדות כזה שרק אחד פני השטח של שקופית אחת יש agarose על זה. פיק נמטודות אחד או יותר על 10% משטח agarose ו1 μ l של 0.1 מיקרון חרוזי פוליסטירן ^22. הערה: עם אוכלוסייה מסונכרנת היטב, רוב נמטודות על הצלחת תהיה להיכנס לנשירה מL2d לdauer. עם זאת, ייתכן שיש הבדלים בין individuals. לכן חשוב לציין תכונות נוספות (חסימת סטומה, שיפוץ בלוע) כדי להעריך את כמות הזמן שבעלי החיים היו בתוך נשירת dauer (ראה תוצאות נציג לדוגמא).
6. לקבוע את הכיוון (ימין / שמאל, גב / הגחון) של נמטודות. צלמו תמונות Z-ערימה של דנדריט IL2Q בהגדלה 100x עם עוצמת הקרינה הנמוכה ביותר האפשרית כל 15 דקות או לפי צורך לניסוי הספציפי. המשך לכידת תמונות עד נמטודות הפרידה מציפורן L2d והקיבוע הוא בלתי אפשרי או אם בעל החיים מתאושש מdauer (לוע מתחיל שאיבה). כאשר לא באופן פעיל הדמיה, במקום להחליק בתא לחות. הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ epifluorescent עם ניגוד התערבות במה והפרש ממונע (DIC) אופטיקה.

Representative Results

הייצור של תוצאות פרומון dauer הגולמי בנוזל צהוב (איור 1) שהוא גם חום ויציב קר. Aliquots של פרומון גולמי מאוחסנים ב -20 ° C ללא הגבלת זמן ללא הפסד ברור בפעילות. בעקבות הייצור של פרומון, המבדק מנת תגובה אחת מספיק להערכה גסה של עוצמה. עם זאת, עבור רוב הניסויים יש צורך לחזור על המבדק 2 - 3 פעמים ולקחת את ממוצע מכל ניסוי. נציג תוצאות משני bioassays פרומון ניתנות באיור 3. מתוך נתונים אלה ניתן לחשב EC ₅₀ וEC _90.

בנוסף להתנגדות לdodecyl נתרן גופרתי ^2, יכול להיות מוכר dauers על ידי מספר תכונות מורפולוגיות כוללים סטומה חסומה, alae לרוחב, גופי refractile בבהיפודרמיס הקדמית ולוע מצומק (איור 2 ואיור 4 א for L2 זחלים). Dauers יש גם כמה מאפיינים התנהגותיים ייחודיים ובם:. נטייה להישאר התנהגותית שקטה, הנוכחות של אסטרטגית פיזור מזדמנת נקראת nictation, דיכוי של תנועות ראש הליקוט, דיכוי של שאיבת בלוע והאינדוקציה של צינור הפרשה פועמת ^{2, 5, 23} מאפיינים התנהגותיים מראים השתנות בין יחידים.

הנשירה לdauer לוקחת כ 12 שעה מסיום השלב טרום dauer L2 (L2d) ^4. תקופה זו תואמת את צמיחה סטריאוטיפית של סוכות IL2Q. האירוע הבולט הראשון של הנשירה לdauer הוא הדיכוי של שאיבת בלוע. הדיכוי של שאיבה הוא משותף לכל molts בג elegans. עם זאת, דיכוי של שאיבת בלוע ממשיך לאורך שלב dauer ומסתיים כ 4 שעות הבאות תשואה של בעלי החיים לתנאי סביבה נוחים. בתקופה הראשונה של שאיבת בלועדיכוי, שכבה של צורות ציפורן על סטומה. שינויים אלה מתרחשים במהלך השעה הראשונה שלאחר תחילתה של הנשירה לdauer. בתקופה ראשונית זו יש לעתים קרובות להיווצרות תהליך neurite נוסף המשתרע מהגופים תא IL2Q. עם זאת, תהליך נוסף ראשוני זה בדרך כלל חוזר בתוך שעה 2 הבאים תחילת הנשירה לdauer ^12.

בשעות 2 - 5 לאחר תחילתה של הנשירה לdauer הלוע מתחיל לשפץ מראה ירידה הדרגתית בגודל (איור 4). במקביל, צורת puncta קצרה ולחזור בו לאורך דנדריט IL2Q העיקרי (איור 5). בשעות 4 - 8 הבאים תחילת הנשירה, הגוף עובר הצטמקות רדיאלי הדרגתית וכתוצאה מכך מתרחק מנמטודות מציפורן L2d (איור 4C). תקופה זו מתואמת עם תוצאה של 2 מעלות דנדריטים מדנדריטים הראשוניים והקמה שלדנדריטים dditional מהגופים תא IL2Q (° דנדריטים-1D העיקרי dauer הספציפי). צמיחת הדנדריטים אינה קבועה, אלא מתאפיין בשתי היווצרות והכחשה של תהליכים הדינמיים כפי שמודגם באיור 5. 2 ° ו1D ° דנדריטים בדרך כלל להאריך את הגחון (לIL2Vs) או גב (לIL2Ds) קווי אמצע. ברגע שציפורן dauer מופרדת לחלוטין מציפורן L2d, היישום של אור הניאון גורם לבעלי החיים להסתובב במהירות על ציר האורך שלה, מה שהופך את ההדמיה הבאה מאתגרת. מנסה להסיר את החיה פיתוח מהשקופיות, מכאני להסיר את העור המת L2D, והר בעלי החיים בשקופית חדשה, תוך שמירה על פיתוח dauer לא היו מוצלחת.

פרומון dauer .1 גולמי איור הואנוזל צהוב שניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב -20 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 micrographs דסק"ש של ג elegans dauers עם תכונות מורפולוגיות dauer הטיפוסי. תצוגת () הגבי אמצע הגוף של dauer מפגין סטומה חסומה (חץ) ולוע מצומק עם הנורה מסוף מלבנית (שתואר באדום, להשוות עם זחל L2 שמוצג באיור 4 א). dauers שהוקם זה עתה בתדירות גבוהה ישמור חלק מציפורן L2d (ראש החץ). תצוגה הגבי (B) של בהיפודרמיס מראה גופי refractile מאוד (חץ) אופייניים לdauers. שוב ציפורן L2d ניכר (ראש חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור assay .3 מנה התגובה לפרומון dauer הגולמי. החיות L1 החשופות לעלייה ברמות של פרומון dauer שולבו תקשורת NGM שונה נוטה יותר ליצירת dauers. הנתונים נאספו ונקוו משני ניסויים נפרדים פרט לריכוזים הבאים, שנבדקו רק פעם אחת: 0.05%, 2%, ו -4%. הנתונים שיתאימו לעקומת תגובת מנת sigmoidal. ערכי R ² וEC חושבו באמצעות רגרסיה לוגיסטית. Nחום אדמדם של בעלי חיים שנבדקו עבור כל ריכוז הוא כדלקמן: 0% n = 299, 0.05% n = 81, 0.1% n = 352, 0.5% n = 368, 1% n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. ברים שגיאה מייצגים 95 מרווחי ביטחון%.

איור 4 דסק"ש לרוחב micrographs השקפה הנכון של ג elegans במהלך שלבים שונים של הנשירה לdauer. () בעלי החיים L2 עם הנורה טיפוסית מעוגלת מסוף לוע (שתוארה באדום). (ב ') כ 3 שעות הבאות הנשירה לdauer, הנורה המסוף מתכווצת וציפורן L2d מתחילה להתנתק מהציפורן החדשה שנוצרה dauer (ראש החץ). (C) כ 10 שעות הבאות תחילת נשירת dauer, בעלי החיים עברו הצטמקות רדיאלי נרחבת וניתוק מציפורן L2d (ראש החץ). מדי פעם, ציפורן בשורה צינור הפרשה של שלב L2d (חץ) ניתן לראות עדיין מחובר לdauer הפיתוח. סולם ברים, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 micrographs epifluorescent תצוגה לרוחב של חיה אחת המבטאת את IL2 P כתב _KLP-6 :: tdTomato. למעלה, תמונה באורך מלא של נוירונים IL2 כ 3 שעות הבאות תחילת הנשירה לdauer. הבלעה מראה חלק של דנדריט IL2Q בזמן נקודות שונות הבאים תחילת הנשירה לdauer. הארכה מהירה של ענפי IL2Q מתרחשת מתחילה כ 5 שעות הבאות תחילת הנשירה לdauer. סולם ברים, 10 מיקרומטר."Target =" ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בדיקה של neuroplasticity dauer ספציפי ושינויים מורפולוגיים הקשורים dauer אחרים דורשת מבוקרת והיווצרות אמינה של dauers או באמצעות מוטציה גנטית (מוטציות כלומר, daf-ג) או על ידי חשיפה של חיות בר מהסוג לפרומון. בעוד שהשימוש במוטציה גנטית כדי לגרום dauers הוא נוח, הוא עשוי לבלבל את התוצאות. לכן הנתונים שנאספו עם מוטציות daf-c צריכים להיות מאושרים על לאחר מכן עם חיות בר מהסוג המושרה להיכנס לשלב dauer על ידי חשיפה לפרומון dauer.

הייצור של פרומון dauer הגולמי הוא יחסית פשוט ווריאציות של פרוטוקול זה מתפרסמות ^18. עם החריגה האפשרית של זיהום, השיטה המוצגת כאן היא מאוד אמינה. כדי לייצר את התמצית, אנו משתמשים בשיטה סטנדרטית של culturing צפיפות גדולה של נמטודות בתרבות הנוזלית תקשורת S ^19. יש כמות גדולה של גמישות בכמות initiaהבידוד נמטודות l הוסיף לתרבות הנוזלית. מתחיל עם מספר גדול יותר של נמטודות יזרז את ההליך. עם זאת, חשוב לוודא שכל הבידוד נמטודות הראשוני הוא נקי מזיהום. שני פטריות וזיהום חיידקים שעלולות להתעורר במהלך צמיחה בתקשורת הנוזלית. זיהום פטרייתי ניתן לאתר בקלות על ידי הנוכחות של העובש. זיהום חיידקים קשה יותר להעריך. בדרך כלל זיהום חיידקים אפשר לראות אם התרבות הנוזלית אינה מוחקת מייד לאחר תקופות דגירה הרשומות. יש גמישות בצפיפות אוכלוסיית נמטודות הכוללת הדרושה כדי לייצר פרומון מספיק. לדוגמא, ריכוז של 25,000 מ"ל / נמטודות הוא מספיק כדי לייצר פרומון יעיל בגרימת dauers. שיטה חלופית מורכבת של העברת נמטודות מתרבות נוזל לנפח קטן של חיץ M9 (~ 50 מ"ל) ואחריו O דגירה / N ב RT על שייקר מסלולית והטיהור הבאה של pheromone על ידי השיטות שתואר במסמך זה. חלופה זו היא יעילה, אבל מייצרת פרומון עם EC גבוה יותר ₅₀ (כלומר, פחות חזק).

ככל אצווה של פרומון גולמי עשויה להיות שונה בעצמה, זה חשוב לבדוק subsample ליעילות בגרימת dauer. עבור יישומים רבים המבדק יחיד עם לשכפל אחד לכל ריכוז פרומון הוא מספיק כדי לספק הערכה כללית של עוצמה. עם זאת, לא יכולה להיות וריאציה משמעותית בין bioassays מנת התגובה ביצע באופן עצמאי. לכן, אם ניסויים דורשים איזון עדין בין היווצרות dauer ופיתוח שאינו dauer, יהיה צורך לבצע 2 - 3 bioassays לשכפל כדי לקבוע מינון אפקטיבי מדויק. בעתיד, את החשיבות של ascarosides בביולוגיה נמטודות מוכרת באופן נרחב יותר, זה עשוי להיות אפשרי לרכישת פרומון dauer מסונתז בעלות סבירה.

הממצא של Neu dauer הספציפישיפוץ ronal בIL2s מספק פלטפורמה לחקר המנגנונים המולקולריים של neuroplasticity שנגרם עקב המתח. כדי לזהות את המנגנון שבאמצעותו גנים ספציפיים להסדיר neuroplasticity, ייתכן שיהיה צורך לבצע את תהליך שיפוץ בזמן אמת. השיטה של IL2 בתחום ההדמיה vivo בונה על ג הקודם שיטות elegans ^{22, 24, 25.} מכשול אחד להדמיה במהלך היווצרות dauer היא האפשרות של התאוששות dauer. הפתרון הקל ביותר הוא בהתחלה להשתמש מוטציה daf-c. אישור של כל תוצאות אז יכול להתבצע ברקע daf-c שאינו משתמש בשיטות שתוארו במסמך זה.

סינג וSulston ציינו כמה מכשולים להדמית in vivo של היווצרות dauer ^25. dauers הכלול אלה שהוקמו זה עתה נמלט משקופית מיקרוסקופ ותנועה בלתי מבוקרת הבאה הצטמקות רדיאלי. השימוש בחרוזי microsphere יש לחסל את האפשרות של בריחה ^22. האוver הצטמקות רדיאלי המתרחשת כ 10 שעה לנשירת dauer עדיין יוצר קשיים להדמיה הבאה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving