Neuroscience

सी में Dauer-विशिष्ट neuronal remodeling के vivo इमेजिंग में एलिगेंस

Published: September 4, 2014 doi: 10.3791/51834

¹Department of Crop Sciences, University of Illinois Urbana-Champaign

Abstract

पशुओं में तनाव प्रेरित प्ररूपी plasticity नियंत्रित तंत्र विवो में अध्ययन करने के लिए अक्सर जटिल और मुश्किल है. तनाव प्रेरित plasticity की एक क्लासिक उदाहरण सी के Dauer चरण है एलिगेंस. Dauers बैक्टीरिया भोजन और एक Dauer फेरोमोन की उच्च सांद्रता की कम मात्रा की शर्तों के तहत गठित एक वैकल्पिक विकास लार्वा चरण हैं. Dauers व्यापक विकास और व्यवहार प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं. उदाहरण के लिए, चार भीतरी ओष्ठ वृत्त का चतुर्थ भाग के एक सेट (IL2Q) न्यूरॉन्स Dauer गठन के दौरान व्यापक प्रतिवर्ती remodeling गुजरना. बड़े पैमाने पर तरल निमेटोड संस्कृतियों से कच्चे तेल Dauer फेरोमोन के उत्पादन के लिए प्रसिद्ध पर्यावरण रास्ते विनियमन Dauer प्रविष्टि, एक पहले से स्थापित विधि का उपयोग प्रदर्शन किया है. इस विधि के साथ 50,000 के एक एकाग्रता - तरल संस्कृति के 75,000 नेमाटोड / एमएल एक अत्यंत शक्तिशाली कच्चे Dauer फेरोमोन निर्माण करने के लिए पर्याप्त है. कच्चे तेल फेरोमोन शक्ति देते हैएक खुराक पर प्रतिक्रिया bioassay द्वारा rmined. अंत में, Dauer गठन के दौरान IL2Qs के vivo समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया तरीकों से वर्णित हैं.

Introduction

विकास और व्यवहार प्लास्टिसिटी सहित प्ररूपी plasticity, पर्यावरण पर प्रतिकूल परिस्थितियों के रूपांतरों के लिए महत्वपूर्ण है और विकास ¹ में एक प्रेरणा शक्ति माना जाता है. सी एलिगेंस अक्सर विकास और तंत्रिका जीव विज्ञान में अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक मॉडल जीव है. आदर्श परिस्थितियों में, सी एलिगेंस वयस्क प्रजनन चरण में प्रवेश करने से पहले चार लार्वा चरणों के माध्यम से विकसित करता है. हालांकि, कम भोजन की उपलब्धता और उच्च जनसंख्या घनत्व, सी की शर्तों के तहत एलिगेंस एक विकासात्मक स्विच गुजरना और एक लंबे समय से रहते थे और तनाव प्रतिरोधी Dauer चरण ² में प्रवेश कर सकते हैं. Dauers संभव है कि यह तनाव प्रतिरोध मध्यस्थता जो गैर dauers से कई रूपात्मक और व्यवहार मतभेद प्रदर्शित करते हैं. Dauer प्रवेश का विनियमन पर्यावरण cues और आनुवंशिक रास्ते बड़े पैमाने पर किया ^{गया, 5, 4, 3, 6, 7} का वर्णन किया है. हालांकि, व्यक्तिगत प्ररूपी परिवर्तन को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र घ होती है किuring Dauer गठन कम अच्छी तरह से समझ रहे हैं.

Dauer विशेष phenotypes की परीक्षा Dauer जानवरों के उत्पादन की आवश्यकता है. यह तीन तरह से पूरा किया जा सकता है: 1) सी के भूखे संस्कृति से उठा एलिगेंस, 2) Dauer गठन विधान (DAF-C) म्यूटेंट, शुद्ध फेरोमोन के माध्यम से Dauer गठन के 3) प्रेरण का प्रयोग करें. यह एक सी के साथ एक मानक एन जी एम थाली से dauers लेने के लिए अपेक्षाकृत आसान है इसके जीवाणु खाद्य आपूर्ति समाप्त हो गया है कि एलिगेंस आबादी. हमारे हाथ में, एक मानक एन जी एम थाली मूल रूप से 3 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दी और बाद में 3 के साथ टीका OP50 Escherichia कोलाई के 50 μl, साथ वरीयता प्राप्त - 4 वयस्क hermaphrodites एक सप्ताह के भीतर खाद्य आपूर्ति निकास और कई हजार का उत्पादन होगा 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा एक अतिरिक्त 3 दिनों के भीतर dauers (कई भूखे गैर dauers के अलावा). हालांकि, इस पद्धति डी में गिरना दौरान होने वाली की जांच प्रक्रियाओं के लिए असंतोषजनक हैAuer. यह Dauer में प्रवेश कर रहे हैं एक ठेठ भूखे प्लेट पर कई हजार पशुओं का जो तय कर पाना मुश्किल है. इसके अलावा, एक भूखे प्लेट का उपयोग तुल्यकालन के लिए कोई संभावना प्रदान करता है. DAF-C म्यूटेंट का उपयोग तुल्यकालन और dauers की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. हालांकि, एक विशेष DAF-C उत्परिवर्तन अकेले या अतिरिक्त परिवर्तन के साथ संयोजन में अन्य Dauer विशेष phenotypes को प्रभावित नहीं करेगा कि कोई गारंटी नहीं है.

एक Dauer फेरोमोन की उपस्थिति पहले Cassada और रसेल द्वारा गर्भित और बाद में गोल्डन और पहेली के द्वारा प्रदर्शन किया गया. Dauer फेरोमोन के बाद से ^{रासायनिक, 10 9, 8, 2} की विशेषता किया गया है. शुद्ध फेरोमोन विभिन्न रूपों में ^9, एक कच्चे Dauer फेरोमोन निकालने के ^11. उपयोग के लिए अनुमति देता है दोनों व्यवहार और विकास की प्रक्रिया को विनियमित जो ascarosides का एक जटिल मिश्रण के होते हैं, एक जंगली प्रकार पृष्ठभूमि में सिंक्रनाइज़ dauers की विश्वसनीय नियंत्रित प्रेरण. तंत्रिका तंत्र और जुड़े glial कोशिकाओं Dauer लार्वा गठन ^{12, 13, 14} के दौरान remodeling गुजरना. इन परिवर्तनों से कुछ ऐसे Dauer ^{13, 14} के दौरान glia कोशिकाओं के पुनर्गठन के रूप में, अपरिवर्तनीय हैं. हालांकि अन्य remodeling घटनाओं अनुकूल करने के लिए एक वापसी पर प्रतिवर्ती हैं पर्यावरण की स्थिति. डेन्ड्राइट द्रुमायण, multidendritic न्यूरॉन्स और अक्षतंतु ¹² remodeling के लिए एक वृक्ष के समान से एक स्विच: उदाहरण के लिए, चार IL2Q न्यूरॉन्स का एक सेट सहित Dauer गठन के दौरान तेजी से और प्रतिवर्ती न्यूरोनल remodeling गुजरना. तरीकों के साथ साथ एक मॉडल जीव में तनाव प्रेरित neuroplasticity की विश्वसनीय vivo इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं. उत्पादन और कच्चे Dauer फेरोमोन के परीक्षण के लिए प्रस्तुत तरीकों पहले कई स्रोतों ^{4, 8, 15, 16, 17, 18} से वर्णित और संकलित कर रहे हैं.

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Protocol

1 क्रूड Dauer Pheromone उत्पादन

OP50 ई बढ़ो एक ही कॉलोनी ओ से / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलाई 200 rpm पर लेग शोरबा के 100 मिलीलीटर में मिलाते हुए. नोट: इस हे / एन संस्कृति के आगे बना और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
एन 2 सी बढ़ो एलिगेंस पर 15 - 20 OP50 ई के 50 μl के साथ वरीयता प्राप्त एन जी एम अगर (तालिका 1 में नुस्खा देखें) के साथ 6 सेमी पेट्री डिश कोलाई बैक्टीरिया जब तक लगभग ¹⁹ समाप्त हो गया है.
1 एल Erlenmeyer में मीडिया की 5x 250 मिलीलीटर (तालिका 1 में नुस्खा देखें) बनाओ ¹⁹ बोतल. नोट: इस समाधान अग्रिम में किया जा सकता है.
OP50 ई की एक संस्कृति विकसित ई में OP50 के 1 मिलीलीटर के साथ inoculating द्वारा लेग शोरबा ओ के 4 एल / एन में कोलाई कोलाई और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए.
(एस बेसल समाधान (तालिका 1 में नुस्खा देखें) और 1.3 चरण में तैयार मीडिया के साथ 4 1 एल Erlenmeyer बोतल में से प्रत्येक में 4-5 प्लेटों से स्थानांतरण नेमाटोड के 1 मिलीलीटर के साथ प्लेट (1.2 चरण) से 4 नेमाटोड धोएं 5 प्लेटेंप्रत्येक कुप्पी के लिए) ^19.
10 मिनट के लिए 650 XG पर 1.4 कदम से OP50 अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें. एस बेसल समाधान के 10 एमएल में प्रत्येक जीवाणु गोली Resuspend. नेमाटोड के प्रत्येक फ्लास्क को resuspended बैक्टीरिया के बराबर राशि का स्थानांतरण.
समाधान भोजन की कमी का संकेत है, खाली करने के लिए शुरू होता है जब तक 5 दिन - (- 25 डिग्री सेल्सियस 20) और 100 - 4 के लिए 150 आरपीएम कमरे के तापमान पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर बोतल रखें.
भोजन समाप्त हो गया है एक बार, OP50 ई की एक और हे / एन संस्कृति विकसित लेग शोरबा के 4x 1 एल में कोलाई. 10 मिनट के लिए 650 XG पर बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र और नेमाटोड साथ मीडिया बोतल से प्रत्येक के लिए एक कुप्पी से एक गोली जोड़ें. भोजन फिर से समाप्त हो गया है जब तक एक अतिरिक्त 3-4 दिनों के लिए, 1.7 कदम के रूप में, कक्षीय प्रकार के बरतन को मीडिया बोतल लौटें.
प्रत्येक कुप्पी से समाधान की एक ~ 1 मिलीलीटर विभाज्य लो और प्रत्येक 1 मिलीलीटर विभाज्य से 1 μl उप नमूने और नेमाटोड की संख्या की गणना के द्वारा निमेटोड एकाग्रता का अनुमान है. नोट:75,000 नेमाटोड / एमएल - निमेटोड आबादी 50,000 होना चाहिए. इस एकाग्रता में नेमाटोड के बहुमत dauers हैं.
किसी भी दूषित बोतल त्यागें. नोट: संदूषण अक्सर कदम 1.9 के दौरान देखा फंगल hyphae के रूप में प्रकट होता है.
4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र नेमाटोड. निमेटोड गोली त्यागें और सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है. वैकल्पिक रूप से, एक कम शक्ति फेरोमोन बनाने के लिए इन जानवरों को प्रयोग करने के लिए चर्चा देखें.
# 1 वाटमान फिल्टर पेपर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर. ध्यान दें: एक वैक्यूम फ्लास्क इस प्रक्रिया को तेज करेगा.
इसके अलावा 0.45 माइक्रोन बाँझ वैक्यूम निस्पंदन इकाइयों के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर. नोट: छानना 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन रखा या 1.14 के लिए आगे बढ़ना जा सकता है.
एक हलचल पट्टी के साथ एक 2 एल बीकर को छानना जोड़ें. एक हीटिंग हलचल प्लेट पर एक धूआं हुड में रखें. क्रियाशीलता जबकि एक उबाल लाने और लगभग 200 मिलीलीटर के लिए लुप्त हो जाना. एक 500 मिलीलीटर बीकर का हल स्थानांतरण. लगभग 50 मिलीलीटर ले रहे हैं जब तक उबलते जारी रखें. फुट नोट: समाधान पर फोड़ा करने के लिए यह संभव है के रूप में की देखभाल इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए. अंतिम 50 मिलीलीटर की रंग एक गहरे भूरे रंग का है. खाना पकाने की प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय, गर्मी बंद किया जा सकता है और छानना आर टी या 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन संग्रहीत.
जी शांत करते हैं और एक्स 1000 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. एक 100 मिलीलीटर बीकर में सतह पर तैरनेवाला डालो और गोली त्यागें.
एक भूरे रंग की परत सतह पर तैरनेवाला नीचे फोड़ा. गर्मी से निकालें और एक रंग के साथ परत टूट गया. परत को कवर करने के लिए पर्याप्त 200 प्रमाण इथेनॉल जोड़ें. Parafilm के साथ बीकर कवर और यह आरटी पर ओ / एन बैठते हैं. एक साफ बीकर में इथेनॉल डालो और टीम के लिए डाल दिया. परत को कवर करने के लिए नए सिरे से इथेनॉल जोड़ें. ओ / एन एक्सट्रैक्शन 3 बार दोहराएँ. अर्क पूल.
इथेनॉल अर्क सुखाने के लिए एक वैक्यूम पंप का प्रयोग करें. एक वैक्यूम पंप उपलब्ध नहीं है, तो एक धूआं हुड में सरगर्मी है, जबकि 50 डिग्री सेल्सियस के लिए एक साफ बीकर और गर्म करने के लिए इथेनॉल निकालने जोड़ने. नोट: इथेनॉल एल के एक चिपचिपा छाछ हवा हो गया है एक बारight भूरे रंग रहना चाहिए. ताप प्रयोग किया जाता है, तो देखभाल भी लंबे समय के लिए हीटिंग द्वारा समाधान जला नहीं लिया जाना चाहिए.
आसुत बाँझ पानी के 10 एमएल में छाछ भंग. फिल्टर 1 मिलीलीटर aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर और दुकान के साथ इस समाधान बाँझ. नोट: पानी की 1 मिलीलीटर मूल तरल निमेटोड संस्कृति के हर 100 मिलीलीटर के लिए छाछ भंग के लिए प्रयोग किया जाता है. तरल संस्कृति बोतल में से एक संदूषण की वजह से खारिज कर दिया है अगर उदाहरण के लिए, तो अवशेषों को भंग करने के लिए उपयोग किए गए पानी की मात्रा समायोजित करें.

Pheromone खुराक प्रतिक्रिया के 2 निर्धारण

Peptone बिना, नोबल अगर साथ एन जी एम मीडिया की 6x 5 मिलीलीटर बनाकर Dauer फेरोमोन तैयार है, और 50 / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट माइक्रोग्राम और Dauer फेरोमोन की एक सीमा के साथ पूरक. ^{4, 19} (1 टेबल में नुस्खा देखें) एक 13x100 मिमी में घटकों मिक्स कांच संस्कृति ट्यूब, एक लैम्प बर्नर पर फोड़ा, और फिर 3 सेमी पेट्री डिश में डाल देना.
AM वजनicrocentrifuge ट्यूब. ई हे / एन संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें एक microcentrifuge ट्यूब में ~ 17,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र कोलाई OP50. सतह पर तैरनेवाला के सभी निकालें. फिर ट्यूब वजन और बैक्टीरियल गोली का वजन निर्धारित करते हैं. 4% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए M9 बफर (तालिका 1 में नुस्खा देखें) के साथ गोली Resuspend ^(w / _वी). विभाज्य प्रत्येक फेरोमोन प्लेट ⁴ के केन्द्र पर बैक्टीरियल निलंबन के 10 μl. स्टोर प्लेटें हे / आरटी पर एन.
फेरोमोन प्लेटें ⁴ पर वयस्कता में गिरना के बाद 10-15 गर्भवती एन 2 जंगली प्रकार hermaphrodites एक दिन उठाओ. 4 घंटा - 3 के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर.
वयस्क hermaphrodites के सभी बंद उठाओ. प्रत्येक थाली के लिए रखी अंडे की संख्या रिकॉर्ड. Parafilm साथ प्लेटों सील और 3 दिन ^{में 17} के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर लौटें.
Dauers का प्रतिशत गणना (चित्रा 2). नोट: दोनों विधियों के लिए यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि dauers (और करने के लिए एक कम पूर्वतम्बू गैर dauers) दीवारों पर चढ़ने और पेट्री डिश के ढक्कन पर होगा. यह नेमाटोड के लिए पकवान की सभी सतहों की जांच करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है.
एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र के लिए डेटा फिट और चित्रा 3 में दिखाया गया है (dauers फार्म के लिए जानवरों के 90% के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त फेरोमोन) फेरोमोन के चुनाव आयोग ₉₀ एकाग्रता का अनुमान नोट:. हम आम तौर पर चुनाव आयोग ₉₀ आकलन करने के लिए एक रसद प्रतिगमन मॉडल का उपयोग , लेकिन विभिन्न सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर संकुल इसी तरह का अनुमान है कि उत्पादन वैकल्पिक तरीकों पड़ सकता है.

Dauer IL2 न्यूरॉन्स की 3 लाइव इमेजिंग

कदम 2.6 में निर्धारित चुनाव आयोग ₉₀ मूल्य का उपयोग प्रोटोकॉल 2 के रूप में Dauer फेरोमोन प्लेटें तैयार करें.
एक एकीकृत IL2 संवाददाता transgene लेकर तनाव (myIs13 [पी _{KLP -6} :: GFP], myIs14 [पी _{KLP -6} :: GFP], myIs16 [पी के साथ प्रोटोकॉल 2 में तरीकों का उपयोग कर dauers प्रेरित KLP -6 :: tdTomato] या qIs56 [पी _{अंतराल-2} :: GFP]) ^{12, 20, 21} नोट:. क्यू Is56 प्रयोग किया जाता है, GFP की अभिव्यक्ति में कई घंटे तक IL2Qs में दिखाई नहीं देगा Dauer गिरना और प्रारंभिक remodeling घटनाओं में से कुछ दिखाई नहीं देगा. पी _{अंतराल-2} :: GFP transgene से फ्लोरोसेंट संकेत पी _{KLP -6} फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से Dauer दौरान IL2s में अंततः उज्जवल है, जबकि इसके साथ ही, पी _{अंतराल-2} :: GFP transgene भी सिर की मांसपेशियों में दुर्बलता से व्यक्त करता है जो ठीक IL2 शाखाओं मुखौटा कर सकते हैं.
अंडे बिछाने के बाद, वयस्क hermaphrodites हटाने Parafilm साथ प्लेटों सील और 25 डिग्री सेल्सियस ¹⁷ पर 34 घंटे के लिए सेते हैं. नोट: Dauer गिरना करने के लिए समय की लंबाई व्यक्तियों के बीच थोड़ा भिन्न होता है. Dauer गिरना की शुरुआत के बाद 5 घंटा (39 - - डेन्ड्राइट द्रुमायण के सबसे तेजी अवधि 4 शुरू होता है 44घंटा पद अंडे बिछाने 25 डिग्री सेल्सियस) ^12.
इमेजिंग से पहले दिन, चुनाव आयोग ₉₀ एकाग्रता में Dauer फेरोमोन साथ M9 बफर में 10% की एक समाधान ^(w / _v) agarose बनाते हैं. विभाज्य agarose के लगभग 100 μl एक खुर्दबीन स्लाइड पर और जल्दी से, लेकिन धीरे, एक फ्लैट agarose सतह बनाने के लिए शीर्ष पर एक और स्लाइड जगह. Agarose जम जाने के बाद, एक आर्द्रता चैम्बर (गीला कागज तौलिये के साथ विंदुक टिप बॉक्स) में सरन लपेटो और दुकान में स्लाइड लपेटो.
34 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, ग्रसनी पंप बंद कर दिया है कि नेमाटोड के लिए फेरोमोन प्लेटों की जांच. अलग स्लाइड एक स्लाइड के केवल एक ही सतह उस पर agarose है कि इस तरह के. एक 10% agarose पैड और 0.1 माइक्रोन polystyrene मोती ²² से 1 μ एल पर एक या एक से अधिक नेमाटोड उठाओ. नोट: एक अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ जनसंख्या के साथ, थाली पर नेमाटोड के बहुमत L2d से Dauer को गिरना में प्रवेश किया जाएगा. हालांकि, मैं बीच में भिन्नता हो सकती हैndividuals. यह जानवरों Dauer गिरना के भीतर किया गया है समय (उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें) की राशि का अनुमान लगाने के अतिरिक्त विशेषताएं (रंध्र रोड़ा, ग्रसनी remodeling) नोट करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है.
निमेटोड का अभिविन्यास (वाम / अधिकार, पृष्ठीय / उदर) निर्धारित करते हैं. संभव प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ 100x बढ़ाई हर 15 मिनट पर एक IL2Q डेन्ड्राइट के Z ढेर छवियों पर कब्जा या विशिष्ट प्रयोग के लिए जरूरत के रूप में. (ग्रसनी पम्पिंग शुरू होता है) निमेटोड L2d छल्ली से अलग किया है जब तक पर कब्जा छवियों जारी रखें और पशु Dauer से ठीक हो जाए तो स्थिरीकरण असंभव है या. सक्रिय रूप से इमेजिंग नहीं करते हैं, तो एक आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड जगह. नोट: हम एक मोटर चालित मंच और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.

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Representative Results

गर्मी और ठंड स्थिर है कि दोनों एक पीला तरल में कच्चे तेल Dauer फेरोमोन परिणाम (चित्रा 1) के उत्पादन. कच्चे तेल फेरोमोन के aliquots गतिविधि में कोई स्पष्ट हानि के साथ अनिश्चित काल -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है. फेरोमोन के उत्पादन के बाद, एक खुराक प्रतिक्रिया bioassay शक्ति का एक मोटा अनुमान के लिए पर्याप्त है. 3 बार और प्रत्येक प्रयोग से एक औसत ले - हालांकि, ज्यादातर प्रयोगों के लिए यह bioassay 2 दोहराने के लिए आवश्यक है. दो फेरोमोन bioassays से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिए गए हैं. एक चुनाव आयोग ₅₀ और चुनाव आयोग ₉₀ गणना की जा सकती इन आंकड़ों से.

सोडियम dodecyl सल्फेट ² के लिए प्रतिरोध के अलावा, dauers एक अवरोधित रंध्र, पार्श्व alae, refractile निकायों पूर्वकाल हाइपोडर्मिस में और एक सिकुड़ा हुआ ग्रसनी (चित्रा 2 और चित्रा -4 ए के लिए सहित कई रूपात्मक सुविधाओं से मान्यता प्राप्त किया जा सकता हैआर एल 2 लार्वा). Dauers भी सहित कई विशिष्ट व्यवहार विशेषताएं हैं:. एक प्रवृत्ति behaviorally मौन रहने के लिए, nictation बुलाया एक सामयिक प्रसार की रणनीति की उपस्थिति, सिर foraging आंदोलनों का दमन, ग्रसनी पंप के दमन और मल त्यागने वाहिनी ^{23, 5, 2} स्पंदन की प्रेरण व्यवहार विशेषताओं व्यक्तियों के बीच परिवर्तनशीलता दिखा.

Dauer में गिरना पूर्व Dauer एल 2 चरण (L2d) ⁴ के अंत से लगभग 12 घंटे लगते हैं. इस अवधि IL2Q arbors के टकसाली विकास के साथ मेल खाती है. Dauer में गिरना के पहले ध्यान देने योग्य घटना ग्रसनी पंप का दमन है. पम्पिंग के दमन सी में सभी molts आम है एलिगेंस. हालांकि, ग्रसनी पंप के दमन Dauer मंच भर में जारी है और अनुकूल पर्यावरण की स्थिति को जानवर की वापसी के बाद लगभग 4 घंटा समाप्त होता है. ग्रसनी पंप की प्रारंभिक अवधि के दौरानदमन, रंध्र से अधिक छल्ली रूपों की एक परत. ये परिवर्तन Dauer में गिरना की शुरुआत के बाद पहले घंटे के दौरान होते हैं. इस प्रारंभिक अवधि के दौरान अक्सर IL2Q सेल शरीर से विस्तार एक अतिरिक्त neurite प्रक्रिया के गठन है. हालांकि, इस प्रारंभिक अतिरिक्त प्रक्रिया आमतौर पर Dauer ¹² में गिरना की शुरुआत निम्नलिखित 2 घंटा के भीतर से पलटा.

ग्रसनी आकार में एक क्रमिक कमी (चित्रा 4 बी) दिखा फिर से तैयार करने के लिए शुरू होता है Dauer में गिरना की शुरुआत के बाद 5 - घंटे 2 के दौरान. समन्वित रूप से, कम puncta फार्म और IL2Q प्राथमिक डेन्ड्राइट (चित्रा 5) के साथ वापस लेना. घंटे 4 के दौरान - गिरना की शुरुआत निम्नलिखित 8, शरीर दूर L2d छल्ली (चित्रा 4C) से निमेटोड का खींच जिसके परिणामस्वरूप में एक क्रमिक रेडियल संकोचन आए. इस अवधि में प्राथमिक डेन्ड्राइट से 2 डिग्री डेन्ड्राइट के परिणाम और एक की स्थापना के साथ जोड़ा जाता हैIL2Q सेल शरीर से dditional डेन्ड्राइट (Dauer विशिष्ट प्राथमिक डेन्ड्राइट -1 डी °). चित्रा 5 में सचित्र के रूप में वृक्ष के समान विकास के लिए निरंतर, बल्कि गतिशील गठन और प्रक्रियाओं का त्याग दोनों द्वारा विशेषता नहीं है. डेन्ड्राइट ° 2 ° और 1 दिन आम तौर पर midlines (IL2Ds के लिए) (IL2Vs के लिए) उदर या पृष्ठीय लिए करता हूं. Dauer छल्ली पूरी तरह से L2d छल्ली से अलग हो जाने के बाद, फ्लोरोसेंट रोशनी के आवेदन बाद इमेजिंग चुनौतीपूर्ण बनाने, तेजी से अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष पर स्पिन करने के लिए पशु का कारण बनता है. यंत्रवत्, स्लाइड से विकासशील पशु हटाने L2D छल्ली हटाने, और अभी भी Dauer विकास को बनाए रखने में सफल नहीं थे, जबकि एक नई स्लाइड पर पशु माउंट करने के लिए प्रयास करता है.

चित्रा 1 क्रूड Dauer फेरोमोन है-20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है कि एक पीला तरल. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

सी चित्रा 2 डीआईसी micrographs एलिगेंस ठेठ Dauer रूपात्मक सुविधाओं के साथ dauers. एक अवरोधित रंध्र (तीर) और आयताकार टर्मिनल बल्ब के साथ एक सिकुड़ा हुआ ग्रसनी का प्रदर्शन एक Dauer (ए) पृष्ठीय मध्य शरीर दृश्य (लाल रंग में उल्लिखित, चित्रा -4 ए में दिखाया L2 के लार्वा के साथ तुलना). नवगठित dauers अक्सर L2d छल्ली (नोक) का हिस्सा बनी रहेगी. अत्यधिक refractile निकायों (तीर) dauers की ठेठ दिखा हाइपोडर्मिस (बी) पृष्ठीय दृश्य. फिर L2d छल्ली स्पष्ट (नोक) है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कच्चे तेल Dauer फेरोमोन को चित्रा 3 खुराक प्रतिक्रिया परख. संशोधित एन जी एम मीडिया में शामिल Dauer फेरोमोन के स्तर को बढ़ाने के संपर्क में एल 1 जानवरों dauers फार्म की संभावना है. डेटा एकत्र और केवल एक बार परीक्षण किया गया जो निम्नलिखित सांद्रता, के अलावा दो अलग प्रयोगों से जमा थे: 0.05%, 2%, और 4%. डाटा एक sigmoidal खुराक प्रतिक्रिया वक्र के लिए फिट थे. आर ² और चुनाव आयोग मूल्यों रसद प्रतिगमन का उपयोग कर की गणना की गई. n0% N = 299, 0.05% N = 81, 0.1% N = 352, 0.5% N = 368, 1% N = 241, 2% N = 125, 4% N इस प्रकार है: प्रत्येक एकाग्रता के लिए जांच जानवरों का भूरा रंग है = 155. त्रुटि सलाखों 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 4 डीआईसी सी की सही देखने micrographs पार्श्व Dauer में गिरना के विभिन्न चरणों के दौरान एलिगेंस. (ए) (लाल रंग में उल्लिखित) ठेठ गोल टर्मिनल ग्रसनी बल्ब के साथ एल 2 पशु. (बी) Dauer में गिरना निम्न लगभग 3 घंटा, टर्मिनल बल्ब सिकुड़ रहा है और L2d छल्ली शुरुआत है नवगठित Dauer छल्ली (नोक) से अलग करने के लिए. (सी) Dauer गिरना की शुरुआत निम्न लगभग 10 घंटा, पशु L2d छल्ली (नोक) से व्यापक रेडियल दबाव और अलगाव आया है. कभी कभी, छल्ली L2d मंच (तीर) के उत्सर्जन वाहिनी अभी भी देखा विकासशील Dauer से जुड़ा जा सकता खड़े हैं. स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा IL2 रिपोर्टर पी _{KLP -6} :: tdTomato. शीर्ष व्यक्त एक भी पशु के 5 पार्श्व दृश्य epifluorescent micrographs, IL2 न्यूरॉन्स की पूरी लंबाई की छवि Dauer में गिरना की शुरुआत निम्न लगभग 3 घंटा. इनसेट Dauer में गिरना की शुरुआत निम्नलिखित विभिन्न समय अंक पर IL2Q डेन्ड्राइट के भाग से पता चलता है. IL2Q शाखाओं की एक तेजी से विस्तार Dauer में गिरना की शुरुआत निम्न लगभग 5 घंटा शुरू कर होता है. स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Dauer विशेष neuroplasticity और अन्य Dauer जुड़े morphological परिवर्तन की एक परीक्षा से नियंत्रित है और या तो आनुवंशिक उत्परिवर्तन (यानी, DAF-C म्यूटेंट) के माध्यम से या फेरोमोन को जंगली प्रकार के पशुओं के जोखिम से dauers की विश्वसनीय गठन की आवश्यकता है. Dauers प्रेरित करने के लिए एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन का उपयोग सुविधाजनक है, यह परिणाम उलझाना सकता है. इसलिए DAF-C परिवर्तन के साथ एकत्र डेटा बाद में Dauer फेरोमोन के लिए जोखिम के Dauer चरण में प्रवेश करने के लिए प्रेरित जंगली प्रकार जानवरों के साथ पुष्टि की जानी चाहिए.

कच्चे तेल Dauer फेरोमोन का उत्पादन अपेक्षाकृत सरल है और इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों ¹⁸ प्रकाशित कर रहे हैं. संदूषण के संभावित अपवाद के साथ, यहाँ प्रस्तुत विधि बहुत विश्वसनीय है. निकालने का उत्पादन करने के लिए, हम मीडिया तरल संस्कृति ¹⁹ में नेमाटोड की बड़ी घनत्व संवर्धन का एक मानक विधि का उपयोग करें. पहल की मात्रा में लचीलेपन की एक बड़ी राशि हैएल निमेटोड inoculum तरल संस्कृति में जोड़ा. नेमाटोड की बड़ी संख्या के साथ शुरू की प्रक्रिया में तेजी लाने जाएगा. हालांकि, यह प्रारंभिक निमेटोड inoculum के सभी संदूषण से मुक्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. फंगल और बैक्टीरियल संदूषण दोनों तरल मीडिया में विकास के दौरान उत्पन्न हो सकती है. फफूंद संदूषण आसानी hyphae की उपस्थिति से पता लगाया जा सकता है. जीवाणु संक्रमण का आकलन करना मुश्किल है. तरल संस्कृति सूचीबद्ध ऊष्मायन अवधि के बाद शीघ्र ही स्पष्ट नहीं है, तो आम तौर पर एक जीवाणु संदूषक देखा जा सकता है. पर्याप्त फेरोमोन उत्पादन के लिए आवश्यक कुल निमेटोड जनसंख्या घनत्व में लचीलापन नहीं है. उदाहरण के लिए, 25,000 नेमाटोड / एमएल के एक एकाग्रता dauers उत्प्रेरण में प्रभावी एक फेरोमोन निर्माण करने के लिए पर्याप्त है. एक वैकल्पिक तरीका पीएचई के एक कक्षीय प्रकार के बरतन और बाद शुद्धि पर आरटी पर एक हे / एन ऊष्मायन द्वारा पीछा M9 बफर (~ 50 मिलीलीटर) की एक छोटी मात्रा के लिए एक तरल संस्कृति से नेमाटोड स्थानांतरित होते हैंविधियों द्वारा romone यहाँ बताया. इस वैकल्पिक प्रभावी है, लेकिन एक उच्च चुनाव आयोग ₅₀ (यानी, कम शक्तिशाली) के साथ एक फेरोमोन पैदा करता है.

कच्चे तेल फेरोमोन के प्रत्येक बैच शक्ति में अलग हो सकता है, यह Dauer उत्प्रेरण में प्रभावशीलता के लिए एक subsample परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. कई अनुप्रयोगों के लिए प्रत्येक फेरोमोन एकाग्रता के लिए एक दोहराने के साथ एक एकल bioassay शक्ति का एक सामान्य अनुमान प्रदान करने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया खुराक पर प्रतिक्रिया bioassays के बीच महत्वपूर्ण बदलाव हो सकता है. एक सटीक प्रभावी खुराक निर्धारित करने के लिए 3 को दोहराने bioassays - प्रयोगों Dauer गठन और गैर Dauer विकास के बीच एक नाजुक संतुलन की आवश्यकता होती है, इसलिए, यह 2 प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. निमेटोड जीव विज्ञान में ascarosides के महत्व को और अधिक व्यापक रूप में मान्यता प्राप्त है के रूप में भविष्य में, यह उचित कीमत पर संश्लेषित Dauer फेरोमोन खरीद करने के लिए संभव हो सकता है.

Dauer विशेष Neu की खोजIL2s में RONAL remodeling तनाव प्रेरित neuroplasticity के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करता है. विशिष्ट जीन neuroplasticity विनियमित व्यवस्था है जिसके द्वारा पहचान करने के लिए, यह वास्तविक समय में remodeling प्रक्रिया का पालन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. vivo इमेजिंग में IL2 की विधि पिछले सी पर बनाता है एलिगेंस तरीकों ^{22, 24, 25.} Dauer गठन के दौरान इमेजिंग के लिए एक बाधा Dauer वसूली की संभावना है. सबसे आसान उपाय शुरू में एक DAF-C उत्परिवर्तन का उपयोग करने के लिए है. किसी भी परिणाम की पुष्टि तो यहाँ बताया तरीकों का उपयोग कर एक गैर DAF-सी पृष्ठभूमि में किया जा सकता है.

सिंह और Sulston Dauer गठन ²⁵ के vivo इमेजिंग के लिए कई बाधाओं का उल्लेख किया. ये शामिल नवगठित dauers रेडियल संकोचन निम्नलिखित खुर्दबीन स्लाइड और अनियंत्रित आंदोलन से दूर भागने. microsphere मोतियों के उपयोग से बच ²² की संभावना समाप्त कर दिया है. होवेDauer गिरना में लगभग 10 घंटा होती है कि रेडियल संकोचन देखें अभी भी बाद इमेजिंग के लिए मुश्किलें पैदा कर.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[P_klp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[P_klp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[P_lag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H₂O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl₂, 1 ml of 1 M MgSO₄
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K₂HPO₄, 1.5 g KH₂PO₄, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H₂O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate_,H₂O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO₄ •7 H₂O, 0.2 g MnCl2•4 H₂O, 0.29 g ZnSO₄ •7 H₂O, 0.025 g CuSO₄ •5 H₂O, H₂O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl₂, and 0.75 ml of 1 M MgSO₄.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H₂O to bring the volume to 4.725 ml. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl₂, 50 µl 0.1 M MgSO₄ and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO₄, H₂O to 1 liter. Sterilize by autoclaving