In vivo avbildning av Dauer specifika Neuronal Remodeling i C. elegans

Abstract

Mekanismerna som kontrollerar stress fenotypisk plasticitet hos djur är ofta komplexa och svåra att studera in vivo. Ett klassiskt exempel på stressframkallad plasticitet är dauer skede av C. elegans. Dauers är en alternativ utvecklingslarvstadiet bildas under förhållanden med låga koncentrationer av bakteriell mat och höga koncentrationer av en dauer feromon. Dauers visar omfattande utvecklings och beteende plasticitet. Till exempel kan en uppsättning av fyra inner-labial kvadranten (IL2Q) nervceller genomgår omfattande reversibel ombyggnad under dauer bildning. Använda den välkända miljö vägar regler dauer posten, en tidigare etablerad metod för framställning av rå dauer feromon från storskaliga flytande nematod kulturer demonstreras. Med den här metoden, en koncentration av 50.000 - är tillräcklig för att ge en mycket potent rå dauer feromon 75.000 nematoder / ml flytande kultur. Rå feromon potens är determined av en dos-respons-bioanalys. Slutligen är de metoder som används för in vivo tidsförlopp avbildning av IL2Qs under dauer bildning beskrivs.

Introduction

Fenotypisk plasticitet, inbegripet utvecklings och beteende plasticitet, är viktigt för anpassning till ogynnsamma miljöförhållanden och anses vara en drivande kraft i evolutionen ^1. C. elegans är en modellorganism som ofta används för studier i utveckling och neurobiologi. Under ideala förhållanden C. elegans utvecklas genom fyra larvstadier innan de kommer in i vuxen reproduktiva stadiet. Men under förhållanden med låg tillgång på foder och hög befolkningstäthet, C. elegans kan genomgå en utvecklings switch och ingå en långlivad och stresståliga dauer etapp ^2. Dauers visa flera morfologiska och beteendemässiga skillnader från icke-dauers vilket sannolikt förmedlar denna stresstålighet. Miljököer och genetiska signalvägar som reglerar dauer posten har utförligt beskrivits ^{3, 4, 5, 6, 7.} Men de molekylära mekanismer som styr enskilda fenotypiska förändringar som sker dnder dauer bildning är mindre väl förstådd.

Undersökningen av Dauer specifika fenotyper kräver produktionen av Dauer djur. Detta kan åstadkommas på tre sätt: 1) Plocka från en starved kultur av C. elegans, 2) Användning av dauer bildning konstitutiv (daf-c) mutanter, 3) Induktion av dauer bildning genom renat feromon. Det är relativt enkelt att plocka dauers från en vanlig NGM platta med ett C. elegans befolkning som har förbrukat sin bakterielivsmedelsförsörjning. I våra händer, en standard NGM tallrik ursprungligen ympats med 50 pl OP50 Escherichia coli, som tillåts växa i 3 dagar och därefter ympats med 3-4 vuxna hermafroditer hålls vid 25 ° C kommer att uttömma livsmedelsförsörjningen inom en vecka och producera flera tusen dauers inom ytterligare 3 dagar (förutom många utsvultna icke dauers). Men denna metod otillfredsställande för undersöka processer som sker under molt i dAuer. Det är svårt att avgöra vilken av de flera tusen djur på en typisk svalt platta går in i Dauer. Vidare användning av ett svalt platta ger ingen möjlighet för synkronisering. Användningen av daf-c-mutanter möjliggör synkronisering och tillförlitlig alstring av dauers. Det finns dock ingen garanti för att en viss daf-c mutationen inte att påverka andra Dauer specifika fenotyper ensamma eller i kombination med ytterligare mutationer.

Närvaron av en dauer feromon först följer av Cassada och Russell och senare visas av Golden och Riddle. Den dauer feromon har sedan dess kemiskt karakteriseras ^{2, 8, 9, 10.} Det renade feromon består av en komplex blandning av ascarosides, som i olika former reglerar både beteende-och utvecklingsprocesser ^9, tillåter ^11. Användning av en rå dauer feromonextrakt för tillförlitlig kontrollerad induktion av synkroniserade dauers i en vildtyp bakgrund. Nervsystemet och tillhörande gliaceller genomgår ombyggnad under dauer larv formation ^{12, 13, 14.} Några av dessa förändringar är irreversibla, till exempel ombyggnad av gliaceller under dauer ^{13, 14.} Men andra remodeling händelser är reversibla vid en återgång till gynnsamma miljöförhållanden. Till exempel en uppsättning av fyra IL2Q nervceller genomgår en snabb och reversibel neuronal ombyggnad under dauer bildningen inklusive: Dendrite arborization, en övergång från enstaka dendritiska till multidendritic neuron och axon remodeling ^12. Metoderna häri möjliggöra tillförlitlig in vivo imaging stress-inducerad neuroplasticitet i en modellorganism. De metoder som presenteras för produktion och testning av rå dauer feromon är tidigare beskrivits och sammanställts från flera källor ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Rå Dauer Pheromone Produktion

1. Väx OP50 E. coli från en enda koloni O / N vid 37 ° C under skakning i 100 ml LB-buljong vid 200 rpm. OBS: Denna O / N-kulturen kan göras i förväg och lagras vid 4 ° C.
2. Väx N2 C. elegans på Juni 15-20 cm petriskålar med NGM agar (Se recept i tabell 1) ympas med 50 ul av OP50 E. coli tills bakterierna är nästan slut ^19.
3. Gör 5x 250 ml S-media (se recept i tabell 1) i en L Erlenmeyerkolvar ^19. OBS: Denna lösning kan göras i förväg.
4. Odla en kultur av OP50 E. coli i 4 L LB-buljong O / N genom ympning med 1 ml OP50 i E. coli och skakning vid 37 ° C under 16 tim.
5. Tvätta nematoderna från plattorna (steg 1.2) med 1 ml S basal lösning (se recept i tabell 1) och överföra nematoder 4-5 plattor till var och en av fyra 1 L E-kolvar med S medierna framställts i steg 1.3 (4 5 plattorför varje kolv) ^19.
6. Centrifugera OP50 från steg 1,4 vid 650 xg under 10 minuter och avlägsna supernatanten. Resuspendera varje bakterie pelleten i 10 ml S basal lösning. Ta lika mycket resuspenderade bakterier till varje kolv av nematoder.
7. Placera kolvarna på en orbital skakanordning vid rumstemperatur (20-25 ° C) och 100 till 150 varv per minut under 4-5 dagar tills lösningen börjar att klara, vilket indikerar en utarmning av mat.
8. När maten är slut, odla en annan O / N kultur OP50 E. coli i 4x 1 L LB buljong. Centrifugera bakterier vid 650 xg under 10 minuter och tillsätt en pellet från en kolv till var och en av S media kolvar med nematoder. Returnera S media kolvar till skakapparat, som i steg 1.7, under ytterligare 3-4 dagar tills maten är slut igen.
9. Ta en ~ 1 ml alikvot av lösningen från varje kolv och uppskatta nematoden koncentration genom under provtagning 1 pl från varje 1 ml alikvot och räkna antalet nematoder. OBS!nematodpopulation ska vara 50.000 - 75.000 nematoder / ml. Vid denna koncentration de flesta nematoder är dauers.
10. Kassera förorenade kolvar. OBS: Förorening manifesterar ofta som svamphyfer ses under steg 1.9.
11. Centrifugera nematoder i 4.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Kasta nematoden pellets och behålla supernatanten. Alternativt, se diskussionen för att använda dessa djur för att göra en låg potens feromon.
12. Filtrera supernatanten genom # 1 Whatman-filterpapper. OBS: En termos kommer att påskynda denna process.
13. Ytterligare filtrera supernatanten genom 0,45 ìm steril vakuumfiltreringsenheter. OBS: Filtrat kan hållas O / N vid 4 ° C eller gå vidare till 1.14.
14. Lägg filtratet till en 2 liter bägare med en omrörarstav. Placera i ett dragskåp på en värmeomrörningsplatta. Koka upp under omrörning och indunsta till ca 200 ml. Överför lösningen till en 500 ml bägare. Fortsätt koka tills cirka 50 ml är left. OBS: Var försiktig under detta steg eftersom det är möjligt för lösningen att koka över. Färgen på de slutliga 50 ml är en mörkbrun. När som helst under tillagningen, kan värmen stängas av och filtratet lagrade O / N vid RT eller 4 ° C.
15. Låt svalna och centrifugera under 5 min vid 1000 x g. Häll supernatanten i en 100 ml bägare och kasta pelleten.
16. Koka supernatanten ner till en brun skorpa. Ta bort från värmen och bryta upp skorpan med en spatel. Tillsätt så mycket 200 proof etanol för att täcka skorpa. Täck bägaren med Parafilm och låt det sitta O / N vid RT. Häll av etanol i en ren bägare och sätta åt sidan. Lägg färsk etanol för att täcka skorpa. Upprepa O / N extraktioner 3 gånger. Pool extrakten.
17. Använd en vakuumpump för att torka extrakten etanol. Om en vakuumpump inte finns tillgänglig, tilletanolextraktet till en ren bägare och värm till 50 ° C under omröring i ett dragskåp. OBS: När etanolen avdunstat en klibbig rest av light brun färg bör förbli. Om uppvärmning används, bör man för att inte bränna lösningen genom upphettning för länge.
18. Lös återstoden i 10 ml destillerat sterilt vatten. Filtrera sterilisera denna lösning med en 0,22 fim sprutfilter och förvara vid -20 ° C i 1 ml alikvoter. OBS: 1 ml vatten används för att lösa upp resten för varje 100 ml av den ursprungliga vätske nematoden kultur. Till exempel, om en av de vätskeformiga odlingskolvar är förkastas på grund av kontaminering, och justera den mängd vatten som användes för att lösa återstoden.

2. Bestämning av Pheromone dosrespons

1. Förbered Dauer feromon genom att göra 6x 5 ml NGM media med Noble agar, utan pepton och kompletterat med 50 | ig / ml streptomycinsulfat och en rad Dauer feromon (se recept i tabell 1) ^{4, 19.} Blanda komponenter i ett 13x100 mm glas kultur rör, koka över en bunsenbrännare, och häll sedan i 3 cm petriskålar.
2. Väg amicrocentrifuge röret. Tillsätt 1 ml O / N-kulturen av E. coli OP50 till röret och centrifugera vid ~ 17.000 xg i ett mikrocentrifugrör. Avlägsna all supernatant. Väg röret igen och bestämma vikten av den bakteriella pelleten. Resuspendera pelleten med M9-buffert (se recept i tabell 1) för en slutlig koncentration av 4% ^(vikt / _volym). Alikvotera 10 ul av bakteriesuspensionen på mitten av varje feromon platta ^4. Förvara plattorna O / N vid RT.
3. Plocka 10-15 dräktig N2 vildtyp hermafroditer en dag efter det att molt i vuxen ålder på de feromonplattorna ^4. Förvara plattorna vid 25 ° C under 3-4 tim.
4. Plocka bort alla vuxna hermafroditer. Anteckna antalet ägg för varje platta. Förslut plattorna med parafilm och återgå till 25 ° C under 3 dagar ^17.
5. Räkna andelen dauers (Figur 2). Anmärkning: För båda metoderna är det viktigt att notera att dauers (och i en mindre extält icke dauers) kommer att klättra upp väggarna och på locket på petriskålar. Därför är det viktigt att undersöka alla ytor på skålen för nematoder.
6. Montera data till en dos-responskurva och uppskatta _EC90 koncentrationen av feromon (tillräckligt feromon för att framkalla 90% av djuren att bilda dauers) som visas i figur 3 Anm. Vi använder vanligtvis en logistisk regressionsmodell för att uppskatta EC ₉₀ , men olika paket statistiska programvaror kan ha alternativa metoder som ger liknande uppskattningar.

3 Live avbildning av Dauer IL2 nervceller

1. Förbered dauer feromonplattor som i protokoll 2 med hjälp av EC ₉₀ värde bestämdes i steg 2.6.
2. Framkalla dauers använder metoderna i protokoll 2 med en stam som bär en integrerad IL2 reporter transgen (myIs13 [P _KLP-6 :: GFP], myIs14 [P _KLP-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] eller qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} OBS: Om q Is56 används kommer uttryck av GFP inte synas i IL2Qs förrän flera timmar in i dauer molt och några av de ursprungliga remodeling evenemang kommer inte att vara synlig. Dessutom, medan den fluorescerande signalen från P _lag-2 :: GFP transgen är ytterst ljusare i IL2s under dauer än P _KLP-6 fluorescerande reportrar, P _lag-2 :: GFP transgen uttrycker också svagt i huvudet muskler som kan maskera de fina IL2 grenar.
3. Efter ägg-läggning, ta bort de vuxna hermafroditer, täta plattorna med Parafilm och inkubera i 34 timmar vid 25 ° C ^17. OBS: Den tid till dauer molt varierar något mellan olika individer. Den mest snabba period av dendrit arborization börjar 4-5 h efter debuten av Dauer molt (39-44h efter äggläggning vid 25 ° C) ^12.
4. Dagen före avbildning, utgör en lösning av 10% ^(vikt / _volym) agaros i M9 buffert med dauer feromon på EC ₉₀ koncentrationen. Alikvot ca 100 l av agaros på ett mikroskopglas och snabbt, men försiktigt, placera en annan bild ovanpå för att skapa en plan agaros yta. När agarosen stelnat, linda glasen i Saran wrap och förvara i en fuktkammare (pipettspets rutan med våta pappershanddukar).
5. Efter 34 timmars inkubationstid, undersöka feromonplattor för nematoder som har slutat svalget pumpning. Separata glasen så att endast en yta av en rutschbana har agaros på den. Välj ett eller flera nematoder på en 10% agaros pad och 1 μ l på 0,1 mikron polystyrenkulor ^22. OBS: Med en väl synkroniserad befolkning, de flesta av nematoderna på plattan kommer att komma in i molt från L2D till dauer. Dock kan det finnas variation bland individuals. Därför är det viktigt att notera ytterligare funktioner (stomi ocklusion, svalg ombyggnad) för att uppskatta hur lång tid djuren har varit i dauer molt (se representativa resultat för exempel).
6. Bestäm orientering (vänster / höger, dorsal / ventral) av nematoden. Fånga Z-stack bilder av en IL2Q dendrite vid 100x förstoring med lägsta möjliga fluorescensintensiteten var 15 min eller efter behov för det specifika experimentet. Fortsätt att ta bilder tills nematoden har separerats från L2D nagelband och immobilisering är omöjligt eller om djuret återhämtar sig från Dauer (svalg börjar pumpa). När inte aktivt avbildning, placera bilden i en fuktkammare. OBS: Vi använder en epifluorescent mikroskop med en motoriserad scen och differential interferens kontrast (DIC) optik.

Representative Results

Produktionen av rå dauer feromonresulterar i en gul vätska (Figur 1) som är både värme och kyla stabila. Lika delar av rå feromon lagras vid -20 ° C på obestämd tid utan någon uppenbar förlust i verksamheten. Efter produktionen av feromon är en enda dos-respons bioanalys tillräcklig för en grov uppskattning av potens. Emellertid är det för de flesta experiment nödvändigt att upprepa bioanalysen 2-3 gånger och ta ett genomsnitt från varje experiment. Representativa resultat från två feromon bioanalyser ges i figur 3. Från dessa data ett _EC50 och _EC90 kan beräknas.

Förutom resistens mot natriumdodecylsulfat ² kan dauers erkännas av flera morfologiska funktioner, inklusive en ockluderad stomi, lateral Alae, refraktila kroppar i de främre huden och en krympt svalget (figur 2 och figur 4A for L2 larver). Dauers har också flera distinkta beteendemässiga egenskaper inklusive:. En benägenhet att förbli beteendemässigt vilande, förekomsten av tillfällig spridning strategi som kallas nictation, undertryckande av huvud födosökande rörelser, undertryckande av svalget pumpning och induktion av utskiljningskanal pulsera ^{2, 5, 23} beteendemässiga egenskaper visar variationen mellan individer.

Den molt i Dauer tar ca 12 timmar från slutet av pre-dauer L2 stadiet (L2D) ^4. Denna period motsvarar stereotypa tillväxt av IL2Q hållare. Den första märkbara händelsen under molt i Dauer är undertryckandet av svalg pumpning. Dämpning av pumpning är gemensam för alla molts i C. elegans. Emellertid fortsätter undertryckande av svalget pumpning hela dauer scenen och slutar ca 4 h efter en retur av djuret till gynnsamma miljöförhållanden. Under den inledande perioden av svalget pumpningsuppression, ett skikt av nagelformer över stomin. Dessa förändringar sker under den första timmen efter uppkomsten av molt i Dauer. Under denna inledande period finns det ofta bildningen av en ytterligare neurite process som sträcker sig från de IL2Q cellkroppar. Men denna initiala ytterligare process dras vanligen inom 2 h efter debuten av molt i Dauer ^12.

Under timmar 2-5 efter uppkomsten av molt i Dauer svalget börjar renovera visar en gradvis minskning i storlek (figur 4B). Samtidigt, korta puncta formuläret och dra längs IL2Q primära dendritliknande (Figur 5). Under timmarna 4-8 efter debuten av molt, genomgår kroppen en successiv radiell krympning vilket resulterar i lösgöring av nematoden från L2D ytterhud (Figur 4C). Denna period är korrelerad med utväxt av 2 ° dendriter från de primära dendriter och inrättandet av enTTERLIGARE dendriter från IL2Q cellkroppar (Dauer specifika primära dendriter-1d °). Den dendritiska tillväxten är inte konstant, utan snarare kännetecknas av både den dynamiska bildningen och indragning av processer som illustreras i figur 5. De 2 ° och 1d ° dendriter i allmänhet sträcka sig till den ventrala (till IL2Vs) eller dorsala (för IL2Ds) midlines. När dauer nagelband är helt skild från L2D nagelband, tillämpning av fluorescerande ljus gör att djuret snabbt snurra på sin längdaxel, vilket gör efterföljande bildbehandling utmanande. Försök att ta bort utvecklings djuret från bilden, mekaniskt bort L2D nagelband och montera djur på en ny bild och samtidigt bibehålla dauer utveckling var inte lyckat.

Figur 1 Rå dauer feromon ären gul vätska som kan lagras på obestämd tid vid -20 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 DIC mikrofotografier av C. elegans dauers med typisk Dauer morfologiska särdrag. (A) Dorsal halva kroppen vy av en Dauer demonstrerar en ockluderad stomi (pil) och en krympt svalget med rektangulär terminal glödlampa (beskrivs i rött, jfr L2 larv visas i figur 4A). Nybildade dauers kommer ofta att behålla en del av L2D nagelband (pilspets). (B) Rygg tanke hypodermis visar mycket ljusbrytande kroppar (pil) typisk för dauers. Igen L2D ytterhud är uppenbar (pilspets). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Dosrespons analys för att rå dauer feromon. L1 djur som exponerats för ökande nivåer av dauer feromon införlivats i modifierad NGM media är mer benägna att bilda dauers. Data samlades in och sammanslogs från två separata experiment med undantag för följande koncentrationer, som endast testades en gång: 0,05%, 2% och 4%. Data anpassades till en sigmoidal dos-responskurva. ^R-2 och EG-värden beräknades med hjälp av logistisk regression. Den numbra av djur undersöktes för varje koncentration är som följer: 0% n = 299, 0,05% n = 81, 0,1% n = 352, 0,5% n = 368, 1% n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. Felstaplar representerar 95% konfidensintervall.

Figur 4 DIC lateral rätt uppfattning mikrofotografier av C. elegans under olika skeden av molt i Dauer. (A) L2 djur med typiska rundade terminalsvalg lampa (röd kontur). (B) Ca 3 timmar efter molt i Dauer är terminalen lampan krymper och L2D nagelband börjar att lösgöra från den nybildade Dauer ytterhud (pilspets). (C) Cirka 10 h efter starten av Dauer molt, har djuret genomgått omfattande radiell krympning och lösgörande från L2D ytterhud (pilspets). Emellanåt den nagelband fodrade utskiljningskanal av L2D scenen (pil) syns fortfarande sitter i utvecklings dauer. Skala barer, 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Sido view epifluorescent mikrofotografier av ett enda djur som uttrycker IL2 reporter P _KLP-6 :: tdTomato. Top, hellång bild av IL2 nervceller ca 3 timmar efter starten av molt i Dauer. Inset visar partiet av IL2Q dendrit vid olika tidpunkter efter starten av molt i Dauer. En snabb utvidgning av de IL2Q grenar inträffar börjar cirka 5 h efter debuten av molt i Dauer. Skala barer, 10 | im.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

En undersökning av dauer specifika neuroplasticity och andra Dauer associerade morfologiska förändringar kräver kontrollerad och tillförlitlig bildning dauers antingen genom genetisk mutation (dvs, daf-c-mutanter) eller genom exponering av vildtyp djur till feromon. Medan användningen av en genetisk mutation för att inducera dauers är praktiskt, kan det confound resultat. Därför uppgifter som samlats in med daf-c mutationer bör därefter bekräftats med vildtyp djur inducerade att komma in i Dauer skede genom exponering för dauer feromon.

Produktionen av rå dauer feromon är relativt enkel och variationer av detta protokoll publiceras ^18. Möjligen med undantag för kontaminering, är den metod som presenteras här mycket tillförlitliga. För att producera extraktet, använder vi en vanlig metod för att odla stora tätheter av nematoder i S medie flytande kultur ^19. Det finns en stor mängd av flexibilitet i den mängd inil nematod inokulum sattes till den flytande kulturen. Från och med större antal nematoder kommer påskynda förfarandet. Det är emellertid viktigt att se till att alla de ursprungliga nematod inokulum är fri från föroreningar. Både svamp-och bakterieangrepp kan uppstå under tillväxt i flytande medier. Svamp föroreningar lätt kan upptäckas genom närvaron av hyfer. Bakteriell kontamination är svårare att bedöma. Typiskt en bakteriell förorening kan observeras om vätskekulturen inte klara snart efter de listade inkuberingsperioder. Det finns flexibilitet i det totala nematoden befolkningstäthet som behövs för att producera tillräckligt med feromon. Till exempel, är tillräcklig för att producera en feromon effektiv vid inducering dauers en koncentration av 25.000 nematoder / ml. En alternativ metod består i att överföra de nematoder från en vätskekultur till en liten volym av M9-buffert (~ 50 ml) följt av en O / N inkubering vid RT på en orbital skakapparat och efterföljande rening av den pheromone genom de metoder som beskrivs häri. Detta alternativ är effektivt, men ger ett feromon med högre _EC50 (dvs mindre potent).

Eftersom varje parti av rå feromon kan skilja i styrka, är det viktigt att testa ett delprov på effektivitet i att framkalla dauer. För många tillämpningar en enda bioassay med ett replikat för varje feromon koncentrationen är tillräcklig för att ge en allmän uppskattning av potens. Däremot kan det finnas betydande variation mellan självständigt utförda dos-respons biologiska testsystem. Därför, om experiment kräver en känslig balans mellan Dauer bildning och icke-Dauer utveckling kommer det att vara nödvändigt att utföra 2-3 replikat bioanalyser för att bestämma en exakt effektiv dos. I framtiden eftersom betydelsen av ascarosides i nematod biologi är mer allmänt erkänt, kan det vara möjligt att köpa syntetiserat dauer feromon till en rimlig kostnad.

Upptäckten av dauer specifika neuRonal ombyggnad i IL2s ger en plattform för att studera de molekylära mekanismerna av stress-inducerad neuroplasticitet. För att identifiera den mekanism genom vilken specifika gener reglerar neuroplasticitet, kan det vara nödvändigt att följa remodelleringsprocessen i realtid. Metoden för IL2 in vivo imaging bygger på tidigare C. elegans Metoder ^{22, 24, 25.} Ett hinder för avbildning under dauer bildningen är möjligheten att dauer återhämtning. Den enklaste lösningen är att börja använda en daf-c mutation. Bekräftelse av resultat kan därefter utföras på ett icke daf-c bakgrund med användning av de metoder som beskrivs häri.

Singh och Sulston noterade flera hinder för avbildning av dauer bildning ²⁵ in vivo. Dessa inkluderade nybildade dauers flyr bort objektglas och okontrollerade rörelser efter radiell krympning. Användningen av mikrosfär pärlor har eliminerat risken för flykt ^22. However den radiella krympning som sker ungefär 10 timmar in i dauer molt fortfarande skapar svårigheter för efterföljande bildbehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving