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Neuroscience

Organotypic स्लाइस संस्कृति Oligodendrocyte गतिशीलता और myelination अध्ययन

Published: August 25, 2014 doi: 10.3791/51835
Automatic Translation
1,3, 1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Stem Cell Institute, University of Connecticut, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine

Abstract

NG2 व्यक्त कोशिकाओं (polydendrocytes, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में चौथा प्रमुख glial सेल आबादी हैं. भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के दौरान वे सक्रिय रूप से पैदा करना और myelinating oligodendrocytes उत्पन्न करते हैं. इन कोशिकाओं को आमतौर पर प्राथमिक अलग संस्कृतियों, न्यूरॉन cocultures में अध्ययन किया, और तय ऊतक में किया गया है. का प्रयोग नव उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस लाइनों संस्कृति प्रणालियों अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम के दोनों ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों में oligodendrocyte वंश कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता टुकड़ा. टुकड़ा संस्कृतियों जल्दी प्रसव के बाद चूहों से तैयार कर रहे हैं और 1 महीने तक के लिए संस्कृति में रखा जाता है. ये स्लाइस सेलुलर व्यवहार और बातचीत की जांच के लिए संस्कृति की अवधि में कई बार imaged किया जा सकता है. इस विधि NG2 कोशिका विभाजन के दृश्य और का विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करते हुए oligodendrocyte भेदभाव के लिए प्रमुख कदम क्षेत्रवार निर्भर अनुमति देता हैईएनटी NG2 सेल और oligodendrocyte कार्यात्मक विविधता. इस बारीकी से vivo में पाया कि जैसा एक सेलुलर वातावरण में समय के साथ इन कोशिकाओं को प्रभावित आंतरिक और बाह्य संकेत जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है.

Introduction

4 - केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की Organoytpic टुकड़ा संस्कृतियों एक semiintact प्रणाली 1 में न्यूरॉन और glial कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अत्यंत उपयोगी साबित किया है. 9 - इन संस्कृतियों को अपनाने और ऐसे बाह्य वातावरण के हेरफेर और दोहराया लंबे समय तक जीना सेल इमेजिंग के लिए आसान पहुँच और electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में 5 प्राथमिक अलग सेल संस्कृतियों के कई लाभ को बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. इसके अलावा, टुकड़ा संस्कृतियों 3 आयामी ऊतक cytoarchitecture, क्षेत्रीय तंत्रिका कनेक्टिविटी बनाए रखने, और सबसे प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं प्रणाली में मौजूद हैं. इन गुणों के सेलुलर और पर्यावरण बातचीत के साथ एकल कक्ष व्यवहार और शरीर विज्ञान की जांच के लिए इन संस्कृतियों एक अद्वितीय और सुविधाजनक प्रणाली बनाने.

NG2 कोशिकाओं पैदा करना और एम उत्पन्न करने के लिए जारी है कि स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में glial कोशिकाओं की आबादी हैंभ्रूण और प्रसव के बाद विकास 10 के दौरान oligodendrocytes yelinating. वे बड़े पैमाने पर अलग प्राथमिक सेल संस्कृतियों में अध्ययन किया गया है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का NG2 सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की हाल ही में विकास तीव्र टुकड़ा तैयारी में विवो भाग्य मानचित्रण और electrophysiological रिकॉर्डिंग में मदद की है. यहां तक ​​कि इन अध्ययनों के साथ, थोड़ा NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का लौकिक गतिशीलता के बारे में जाना जाता है. अलग सेल संस्कृति को व्यापक रूप से औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ में रिश्तेदार की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जाता है, यह यह सेलुलर microenvironment के संदर्भ बनाए रखने के लिए वांछनीय है, विशेष रूप से जब अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में इन कोशिकाओं के कार्यात्मक मतभेद पूछताछ के लिए उपयुक्त नहीं है. टुकड़ा संस्कृतियों, सेल औषधीय जोड़तोड़ करने के लिए उत्तरदायी है और oligodendrocyte myelination 11,12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक सरल विकल्प प्रदान(LPC) lysolecithin या एंटीबॉडी औषधीय उपचार 15 के माध्यम से demyelination 13,14, और remyelination की प्रेरण प्रेरित बाद ular प्रतिक्रिया.

एक विधि की जांच और लाइव इमेजिंग और तय ऊतक (या postfixation) अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से लिया organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का विश्लेषण वर्णित है प्रदर्शन करने के लिए. इस डिवीजन 16 के बाद ही NG2 कोशिकाओं के सेल भाग्य का अध्ययन करने और वृद्धि कारक प्रेरित NG2 सेल प्रसार 17 में region- और उम्र पर निर्भर मतभेदों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तरीका है. यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक आगे आंतरिक और / या पर्यावरण इन glial कोशिकाओं के शरीर विज्ञान और neuronal गतिविधि या माइलिन क्षति के लिए उनकी प्रतिक्रिया को विनियमित तंत्र सेल की जांच के लिए व्यापक रूप से सुलभ है.

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं दिशा निर्देशों का पालन कर रहे हैं और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

नोट: YFP रिपोर्टर 20 (JAX # 006148) लाइनों क्रमशः इस्तेमाल किया गया: NG2cre 18 विधान (JAX # 008533) और NG2creER 16 inducible इन प्रयोगों (JAX # 008538) के लिए ट्रांसजेनिक चूहों 19 (JAX # 003920) या gtRosa26 / ईजी जेड को पार कर छवि NG2 कोशिकाओं और उनकी संतान को. छवि परिपक्व oligodendrocytes करने के लिए, PLPDsRed ट्रांसजेनिक चूहों 21 इस्तेमाल किया गया. लगातार अस्तित्व के लिए, स्लाइस ऊपर अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से प्रसव के बाद 10 दिन तक चूहों से अलग किया जा सकता है.

1 टुकड़ा तैयारी

  1. एक संस्कृति हुड में, छह अच्छी तरह प्लेटें में टिशू कल्चर सम्मिलित जगह और (अभिकर्मकों खंड में नुस्खा) 1 मिलीलीटर टुकड़ा संस्कृति के माध्यम जोड़ें. 5% के साथ 37 डिग्री सेल्सियस विच्छेदन के लिए पहले सीओ 2 कम से कम 2 घंटा सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेटें रखो.
  2. 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों और ऊतक हेलिकॉप्टर जीवाणुरहित.
  3. पूर्व विच्छेदन के शुरू करने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर 95% 2 हे, 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला विच्छेदन बफर (अभिकर्मकों खंड में नुस्खा).
  4. अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें रखने के द्वारा माउस पिल्ले anesthetize. चूहों की पूंछ और पैर की अंगुली बन्द रखो का जवाब नहीं है कि इस बात की पुष्टि द्वारा संज्ञाहरण के उचित गहराई का पता लगाएं.
  5. पशु प्रोटोकॉल का पालन तेज कैंची का उपयोग जानवरों सिर काटना. जल्दी से पहले निष्फल उपकरण का उपयोग कर पार्श्व चीरा के बाद बाण के समान कटौती, बनाकर अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम अधिक खोपड़ी को हटा दें. ध्यान से पक्ष के लिए ऊतक रोलिंग द्वारा मस्तिष्क और सेरिबैलम के उदर सतह से कपाल नसों काटें.
  6. बहुत ठंडा ऑक्सीजन विच्छेदन बफर युक्त एक बाँझ 35 मिमी पकवान में ऊतक रखें.
  7. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, सेरिबैलम और अग्रमस्तिष्क तोड़. फिर एक मध्य बाण के समान कटौती अपरोक्ष बनानेगोलार्द्धों अलग ऊ अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम,.
  8. एक पुस्तिका ऊतक हेलिकॉप्टर के साथ अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम के 300 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक और बाण के समान वर्गों में कटौती. ध्यान दें: एक पुस्तिका ऊतक हेलिकॉप्टर agarose embedding के लिए आवश्यकता के बिना संस्कृति ऊष्मायन के लिए विच्छेदन से तेजी से प्रसंस्करण की अनुमति देता है. पहले 9 वर्णित के रूप में एक vibratome भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. बर्फ पर हौसले bubbled ठंड विच्छेदन बफर में विभाजित स्लाइस स्थानांतरण.
  10. छोटे विदारक का प्रयोग करें या अलग अलग वर्गों को अलग और संस्कृति आवेषण के साथ छह अच्छी तरह व्यंजन preincubated करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए spatulas वजन.
  11. एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक या एक पी 200 pipet टिप का उपयोग संस्कृति डालने की सतह से किसी भी अतिरिक्त विच्छेदन बफर निकालें. तीन अग्रमस्तिष्क या तीन अनुमस्तिष्क स्लाइस को दो एक संस्कृति डालने पर रखा जा सकता है.
    नोट: अग्रमस्तिष्क संस्कृतियों के अनुरूप परिणाम के लिए, यह पूर्वकाल महासंयोजिका की एक तिहाई फैले स्लाइस लेने के लिए आदर्श हैएक ही टुकड़ा में दोनों ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों का अध्ययन करने के क्रम में (चित्रा 1 ए). प्रत्येक जानवर आमतौर पर 6 अग्रमस्तिष्क स्लाइस और 6 सेरिबैलम स्लाइस पैदावार.
  12. इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह प्लेटें प्लेस और फिर 1 1 दिन टुकड़ा तैयारी के बाद टुकड़ा मध्यम मिलीलीटर और टुकड़ा निर्धारण तक हर दूसरे दिन के साथ टुकड़ा मध्यम जगह.
  13. प्रयोग के आधार पर, संस्कृति में 5-7 दिनों के बाद स्लाइस का उपयोग करें. केवल पहले कुछ दिनों के बाद पारदर्शी हो कि स्लाइस का प्रयोग करें और असमान अपारदर्शी क्षेत्रों है कि उन त्यागें. नोट: स्लाइस के भीतर अपारदर्शी क्षेत्रों आंख से दिखाई दे रहे हैं और चरण विपरीत नीचे काले कोशिकाओं का एक पेड़ों का झुरमुट के रूप में दिखाई देते हैं. तकनीक में महारत हासिल करने के बाद, मृत अपारदर्शी स्लाइस स्लाइस के कम से कम 1-5% में, शायद ही कभी हो.

NG2 कोशिका विभाजन और Oligodendrocyte भेदभाव के 2 समय चूक इमेजिंग

नोट: ZEG चूहों 16: हम NG2cre उपयोग NG2 सेल प्रसार और भेदभाव का समय व्यतीत हो जाने के लिए इमेजिंग प्रदर्शनNG2 कोशिकाओं और उनकी संतान (चित्रा 1C ई) में EGFP व्यक्त किया. इस लाइन में संवाददाता अभिव्यक्ति तुरंत कम से कम चार सप्ताह की समय अवधि के लिए सेक्शनिंग के बाद स्लाइस में रहते GFP की छवियों + कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है. स्पष्ट छवियों संस्कृति में पहले 3-5 दिनों में होती है जो टुकड़ा, की प्रारंभिक thinning अवधि के बाद प्राप्त कर रहे हैं.

  1. प्रयोग के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्लाइस रखने के लिए और समय का संक्षिप्त अवधि के लिए ही हटा दें (टुकड़ा प्रति कम से कम 15 मिनट), छह अच्छी तरह से थाली जबकि इमेजिंग पर ढक्कन रखने.
  2. एक डिजिटल कैमरे से लैस एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, एक 10x उद्देश्य का उपयोग पहली बार बिंदु पर छवियों पर कब्जा. नोट: पहली बार अंक प्रयोग द्वारा अलग अलग होंगे और स्लाइस तैयार थे जब दिन या उसके बाद किसी भी समय बिंदु हो सकता है.
  3. टुकड़ा के दोनों ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों में समय बिंदु से एक साथ कई क्षेत्रों से छवियों पर कब्जा. नोट वेंटुकड़ा के भीतर विशिष्ट स्थलों से और बाद इमेजिंग सत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक योजनाबद्ध पर छवि स्थान मानचित्रण ने उतारी ई क्षेत्र. उपयोगी स्थलों सफेद बात इलाकों की स्लाइस और / या अभिविन्यास के किनारों शामिल कर सकते हैं. छवि हर समय बिंदु पर प्रत्येक टुकड़ा पर 4-8 स्थानों.
  4. 4-6 घंटे के अंतराल पर बाद में छवियों पर कब्जा NG2 कोशिका विभाजन और oligodendrocyte भेदभाव, आदर्श से अधिक 5-7 दिनों की जांच करें.
  5. सभी क्षेत्रों के अंतिम छवि पर कब्जा और तुरंत स्लाइस को ठीक. फिर स्लाइस के शीर्ष पर एक और 1 मिलीलीटर जोड़ने, संस्कृति डालने की तह तक (0.1M एल Lysine 0.01 एम सोडियम मेटा periodate के साथ 4% पीएफए) लगानेवाला के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यह झिल्ली से अलग कर सकते हैं के रूप में टुकड़ा पर सीधे लगानेवाला धार नहीं ख्याल रखना. 30 मिनट के लिए ऊतक को ठीक करने और धारा 4 में वर्णित के रूप में विकास मंच विशिष्ट मार्कर का उपयोग immunohistochemistry के साथ आगे बढ़ना.
  6. 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर 3 एक्स 10 मीटर के साथ धो स्लाइसमें. 1-3 दिनों के लिए 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक, दुकान स्लाइस से पहले immunostaining हैं लेकिन आदर्श 24 घंटे के भीतर धुंधला प्रदर्शन करते हैं. Oligodendrocytes (चित्रा 2 डी एफ) में भेदभाव है कि कोशिकाओं के अनुपात में निर्धारित करने के लिए धारा 4 में नीचे वर्णित के रूप में immunohistochemistry के साथ आगे बढ़ें.

टुकड़ा संस्कृतियों में inducible रिपोर्टर ट्रांसजेनिक चूहों का प्रयोग NG2 सेल संतान के 3 भाग्य मानचित्रण

नोट: संस्कृति में एक विशेष समय बिंदु से NG2 कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए, inducible NG2creER: YFP ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. संस्कृति के माध्यम से इथेनॉल में भंग कर 100 एनएम 4OHT जोड़कर Cre पुनर्संयोजन और संवाददाता अभिव्यक्ति को प्रेरित. नोट: रिपोर्टर सकारात्मक कोशिकाओं सभी NG2 सेल चरण में कोशिकाओं होगा ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + कोशिकाओं की एक प्रेरण दक्षता में और इस समय बिंदु पर 1-2 दिनों के भीतर प्रकट करना चाहिए (चित्रा 2A सी)
  2. फिक्स और टुकड़ा धोनेअलग समय बिंदुओं पर विभिन्न जोड़तोड़ के बाद (वर्गों 2.5 और 2.6 में वर्णित).

4 स्लाइस Immunohistochemistry

  1. एक स्केलपेल का उपयोग कर सम्मिलित के बाहर जुड़ी स्लाइस के साथ झिल्ली कट.
  2. झिल्ली को उठा जब टुकड़ा की संरचना को बाधित करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, चिमटी का एक सेट का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से थाली युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के व्यक्तिगत कुओं को स्लाइस स्थानांतरण.
  3. 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS) और 0.1% ट्राइटन-X100 युक्त अवरुद्ध समाधान के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्लाइस स्थानांतरण.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 5% NGS में / प्राथमिक एंटीबॉडी ओ एन स्लाइस सेते हैं. NG2 सेल चरण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, NG2 और PDGFRα के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करें. विभेदित oligodendrocytes की पहचान के लिए, एडिनोमेटस पोली पोसिस कोलाई प्रतिजन के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग (एपीसी, क्लोन cc1).
  5. पीबीएस 3 x15 मिनट में दूसरे दिन धोने स्लाइस पर, फिर माध्यमिक antibo में सेतेआरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% NGS में मर जाता है. पीबीएस 3 x15 मिनट में स्लाइस धो और स्लाइड पर माउंट. झिल्ली उद्देश्य और ऊतक के बीच नहीं होगा कि इतने स्लाइड का सामना करना पड़ स्लाइस और झिल्ली के साथ माउंट.

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Representative Results

प्रतिनिधि डेटा के उदाहरण नीचे दिए गए हैं P8 NG2cre के अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है कि: ZEG, NG2creER: YFP और ट्रांसजेनिक माउस लाइनों PLPDsRed. NG2 कोशिकाओं अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम स्लाइस (चित्रा 1 बी डी, वीडियो 1) और इन कोशिकाओं के phenotype में दिनों में imaged किया जा सकता निर्धारण के बाद निर्धारित और NG2 और cc1 एंटीबॉडी (चित्रा 1E) के साथ immunostaining किया जा सकता है. इमेजिंग रहते हैं के अलावा, सेल प्रसार भी ऐसे Ki67 (चित्रा 1F) के रूप में सेल प्रसार मार्करों के लिए immunohistochemical धुंधला का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है. ये आंकड़े एक व्यक्ति सेल आधार पर NG2 कोशिका विभाजन के बाद oligodendrocyte भेदभाव के अस्थायी गतिशीलता का विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. YFP चूहों (चित्रा 2): NG2 कोशिकाओं की किस्मत मानचित्रण NG2creER में 4OHT साथ स्लाइस में रचनात्मक पुनर्संयोजन के शामिल होने के बाद बाहर किया जा सकता है. YFP संवाददाता व्यक्त NG2 + कोशिकाओं के लिए थेदो दिन मध्यम संस्कृति (2A चित्रा) के लिए 4OHT के अलावा के बाद संस्कृतियों में अंड. छह दिन 4OHT प्रेरण के बाद, YFP + कोशिकाओं के अनुपात cc1 + oligodendrocytes (चित्रा 2B) में भेदभाव था. इन आंकड़ों बाह्य वातावरण औषधीय एजेंटों या NG2 कोशिकाओं के भाग्य पर विभिन्न अपमान के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है, जहां स्लाइस में NG2 कोशिकाओं के भाग्य मानचित्रण प्रदर्शन की व्यवहार्यता दिखा. 4OHT के विभिन्न सांद्रता रचनात्मक पुनर्संयोजन के विभिन्न डिग्री प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 1μM 4OHT लगभग 60-70% पुनर्संयोजन दक्षता में परिणाम है, जबकि उदाहरण के लिए, 2 दिनों के लिए 100 एनएम 4OHT के संपर्क में सभी NG2 व्यक्त कोशिकाओं का लगभग 20-25% में संवाददाता अभिव्यक्ति का कारण बनता है. अंत में, व्यापक माइलिन इन संस्कृतियों में मौजूद है और myelinating oligodendrocytes (चित्रा 3, वीडियो 2) PLPDsRed ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर रहते हैं और तय स्लाइस में imaged किया जा सकता है.


NG2 सेल प्रसार और भेदभाव (एबी) योजनाबद्ध टुकड़ा संस्कृति आवेषण का उपयोग अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम स्लाइस (ए) और बाद के संवर्धन और समय चूक इमेजिंग के अलगाव के चित्रण (बी) के दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए चित्रा 1 स्लाइस संस्कृति विधि. (सी ) NG2cre में NG2 कोशिका विभाजन और बाद oligodendrocyte भेदभाव रूपरेखा चित्रण:. कॉर्टिकल NG2cre के क्षेत्रों से प्राप्त ZEG ट्रांसजेनिक चूहों (डी) उदाहरण छवियों: 122 घंटे की अवधि में दो बार विभाजित एक एकल GFP + सेल (तीर) दिखा ZEG चूहों, समय दर्शाया विरोधी NG2 और एक ही टुकड़ा की cc1 एंटीबॉडी के साथ immunostaining (ई) फिक्सेशन. इमेजिंग प्रयोग के शुरू होने के बाद दिन के रूप में शीर्ष दायें कोने में और पता चलता है कि imaged dividiएनजी कोशिकाओं तीन NG2 + कोशिकाओं (तीर) में हुई. (एफ) के उदाहरण छवि दो Ki67 दिखा + NG2 + एक कॉर्टिकल में NeuN + neuronal नाभिक के साथ intertwined एक कॉर्टिकल टुकड़ा संस्कृति में कोशिकाओं. (जी) उदाहरण छवि दिखा NG2 + कोशिकाओं (तीर) और उनकी प्रक्रियाओं टुकड़ा संस्कृति. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
YFP अभिव्यक्ति की चित्रा 2 प्रेरण अग्रमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में NG2 कोशिकाओं (एबी) NG2creER से अग्रमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों का महासंयोजिका क्षेत्र का लिया छवियों के भाग्य को ट्रैक करने के लिए: 2 के लिए संस्कृति में 24 घंटे के लिए 4OHT के साथ इलाज किया और फिर छोड़ दिया YFP चूहों दिन (ए) या ​​6 दिन (बी) (ए) या ​​cc1 और YFP (बी) के लिए immunostained गया. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
PLPDsRed ट्रांसजेनिक चूहों से टुकड़ा संस्कृतियों में चित्रा 3 इमेजिंग oligodendrocytes. (ए) योजनाबद्ध संवर्धन और PLPDsRed ट्रांसजेनिक चूहों से सेरिबैलम स्लाइस की इमेजिंग, अलगाव चित्रण. विट्रो दिखा calbindin + में 5 दिनों के बाद एक निश्चित सेरिबैलम टुकड़ा से लिया (बी) छवि ( मेलिनकृत साथ सियान) Purkinje न्यूरॉन्सटुकड़ा का सफेद पदार्थ क्षेत्रों में पेश माइलिन बुनियादी प्रोटीन + (MBP) (हरा) axons. स्केल बार 25 माइक्रोन. PLPDsRed चूहों से सेरिबैलम टुकड़ा संस्कृतियों में घंटे में संकेत समय पर हर दूसरे दिन एक ही क्षेत्र से कब्जा कर लिया (सी) कम बढ़ाई छवियों. स्केल बार 100 माइक्रोन. (डी) DsRed + कोशिकाओं केंद्रित कर रहे हैं जहां सफेद पदार्थ क्षेत्रों में MBP अभिव्यक्ति दिखा एक निश्चित PLPDsRed टुकड़ा संस्कृति से लिया कम बढ़ाई छवि. MBP + प्रक्रियाओं के साथ ही DsRed + oligodendrocytes दिखा एक निश्चित PLPDsRed टुकड़ा संस्कृति से लिया स्केल बार 100 माइक्रोन. (ई) उच्च बढ़ाई छवि. स्केल बार 20 माइक्रोन. 48 घंटा इमेजिंग सत्र पर अपेक्षाकृत स्थिर सेल शरीर दिखा एक PLPDsRed सेरिबैलम टुकड़ा से लिया (एफ) समय चूक अनुक्रम, घंटों में ऊपरी सही में संकेत समय. स्केल बार 25 माइक्रोन. प्लीएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक कॉर्टिकल टुकड़ा संस्कृति में NG2 कोशिका विभाजन की 1 वीडियो लाइव इमेजिंग एक NG2cre से ली गई एक कॉर्टिकल टुकड़ा संस्कृति में कई कोशिका विभाजन दिखा प्रतिनिधि समय व्यतीत हो जाने के अनुक्रम:. ZEG ट्रांसजेनिक माउस. वीडियो प्रति सेकंड 5 फ्रेम, चित्र 1 में दिखाया छवियों के असेंबल पर प्रदर्शन किया. (डाउनलोड के तहत "Video_1.mov" देखें)

वीडियो सेरिबैलम टुकड़ा संस्कृतियों में oligodendrocytes के 2 लाइव इमेजिंग एक PLPDsRed ट्रांसजेनिक माउस से ली गई एक सेरिबैलम टुकड़ा में 48 घंटे से अधिक imaged oligodendrocyte आकारिकी (तीर) में छोटे परिवर्तन दिखा प्रतिनिधि समय व्यतीत हो जाने के अनुक्रम. वीडियो प्रति सेकंड 3 फ्रेम, 3 चित्र में दिखाया छवियों के असेंबल पर प्रदर्शन किया. (डाउनलोड के तहत "Video_2.mov" देखें)

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Discussion

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में myelination कुशल न्यूरोनल संचार और axonal अस्तित्व 22 के लिए आवश्यक है. 25 - सबसे मस्तिष्क क्षेत्रों 16,23 में एक निवासी आबादी को बनाए रखते हुए NG2 कोशिकाओं लगातार वयस्कता में myelinating oligodendrocytes उत्पन्न करते हैं. इन कोशिकाओं के भेदभाव को विनियमित कुछ आनुवंशिक और आणविक तंत्र में वर्णित किया गया है लेकिन बहुत खोज की जाना बना रहता है. Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों के कारण संरचनात्मक क्षेत्रों, बाह्य वातावरण की आसान हेरफेर, मजबूत myelination, और सभी प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति बनाए रखने के अपने अद्वितीय विशेषताओं के लिए इन तंत्रों की जांच के लिए एक सुविधाजनक उपकरण हैं. इन विशेषताओं NG2 कोशिकाओं, oligodendrocytes और axons 11,26 के बीच छोटी और लंबी अवधि बातचीत की जांच की सुविधा. इसके अलावा, सेल प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और क्षेत्र पर निर्भर डी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसेल व्यवहार 17 में ifferences. इसके अलावा, औषधीय उपचार सामान्य 17,27,28 में NG2 सेल प्रसार और / या भेदभाव को प्रभावित आणविक तंत्र और demyelinated संस्कृतियों 15,29 जांच करने के लिए संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है. अंत में, यह संभवतः भी एक demyelinating अपमान 30 के बाद पैदा या अंतर करने NG2 कोशिकाओं प्रत्यक्ष कि यौगिकों के उच्च throughput विश्लेषण के लिए स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से संभव है.

मौजूदा तरीकों एक नियंत्रित संस्कृति की स्थापना में axons साथ oligodendrocyte वंश कोशिकाओं और उनकी बातचीत की जांच DRG की जांच करने के लिए विकसित मूल तैयारियों पर आधारित थे, जो अलग पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) या भ्रूण cortical न्यूरॉन्स और NG2 कोशिकाओं 31,32, साथ सह संस्कृतियों शामिल करने के लिए -Schwann सेल 33 सहभागिता. इन संस्कृतियों अक्षतंतु और oligodendrocyte के मौलिक गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैऐसे अक्षतंतु व्यास और NG2 सेल घनत्व को नियंत्रित प्रसार की निर्भरता और भेदभाव 37 की शुरुआत के रूप में अन्य सवालों के अलावा 36 - neuronal गतिविधि पर निर्भर संकेतन सहित वंश सेल बातचीत भेदभाव और माइलिन उत्पादन 32,34 प्रेरित करने के लिए. इन coculture सिस्टम ऐसे सवाल, vivo में स्थिति को सीधा संबंध है और आवेदन को संबोधित करने के लिए आदर्श होते हैं जबकि हमेशा स्पष्ट नहीं है. जैसा कि पहले उल्लेख, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों अलग कोशिकाओं के सह संस्कृति तैयारी में खो जाते हैं कि स्थानीय neuronal कनेक्शन और तीन आयामी cytoarchitecture के कई बनाए रखने का एक अनूठा हालत प्रदान करते हैं. इसके अलावा organotypic टुकड़ा संस्कृतियों के विपरीत, अलग कोशिकाओं के सह संस्कृति प्रणालियों अक्सर अन्य glial कोशिकाओं और NG2 कोशिकाओं के विकास, रखरखाव और शरीर विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है जो बाह्य मैट्रिक्स अणु, oligodendrocytes शामिल नहीं हैं, और माइलिन. विशिष्ट लेबलिंग और वायरल वैक्टर और ट्रांसजेनिक जानवरों, लंबी अवधि के इमेजिंग और organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में भाग्य मानचित्रण के साथ अलग सेल आबादी के हेरफेर के लिए उपलब्ध उपकरणों की विविधता में नाटकीय वृद्धि के साथ NG2 सेल की जांच के लिए एक शक्तिशाली तकनीक साबित करना चाहिए प्रसार, भेदभाव और oligodendrocyte myelination.

टुकड़ा अस्तित्व और डेटा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए इन प्रयोगों प्रदर्शन जब कई महत्वपूर्ण कदम बाहर किया जाना चाहिए. सबसे पहले, स्वस्थ स्लाइसें सेक्शनिंग और स्लाइस के अलगाव उत्पन्न करने के क्रम में संभव के रूप में और बर्फ के ठंडे विच्छेदन बफर में जल्दी के रूप में किया जाना चाहिए. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर एक मोटर चालित मंच के साथ स्वचालित छवि स्थिति अधिग्रहण उपयोगी हो सकता है, जबकि दूसरा, imaged और मार्गदर्शन दोहराया अधिग्रहण क्षेत्रों के सटीक स्थान परिवर्तन को बाधित कर सकते हैं कि कई कारकों multipl अधिक लगातार विश्वसनीय छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक होती हैई दिन. स्लाइस इमेजिंग सत्र के बीच में नहीं है और एक मंच टॉप इनक्यूबेटर में एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जाता है अगर यह विशेष रूप से आवश्यक है. तीसरा, टुकड़ा निर्धारण, धुंधला, और बढ़ते दौरान यह ऊतक के किसी व्यवधान लाइव imaged क्षेत्रों और कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए अक्षमता का परिणाम देगा के रूप में धीरे स्लाइस को संभालने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. न्यूरॉन्स और astrocytes के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है कि टुकड़ा संस्कृति की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक तरीकों के लिए कोई विशिष्ट संशोधन कर रहे हैं.

माना जाना चाहिए कि टुकड़ा संस्कृति विधि करने के लिए कई सीमाएं हैं. Astrocytes, microglia और NG2 कोशिकाओं वृद्धि की चोट के स्थल पर प्रसार और एक glial निशान के गठन के साथ सीएनएस क्षति के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए जाना जाता है. कुछ पुनर्गठन में स्लाइस परिणाम और इन कोशिकाओं से एक प्रारंभिक प्रतिक्रियाशील glial प्रतिक्रिया तैयार करने की प्रक्रिया. मिलान के लिए NG2 सेल प्रसार दरों विवो रिपोर्ट में उन लोगों के लिए इसी तरह के स्तर पर लौटनेडेटा की व्याख्या जब संस्कृति हालांकि वृद्धि की प्रसार दर और इन कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप में कई दिनों के बाद विकास के चरणों पर विचार किया जाना चाहिए. संस्कृति के माध्यम में घोड़े सीरम की उपस्थिति NG2 सेल प्रसार को बदल सकता है और किसी भी प्रयोग के निष्कर्षों की व्याख्या जब विचार किया जाना चाहिए. इस के अलावा, टुकड़ा के भीतर बदल neuronal गतिविधि के लिए ले जा सकता है जो सहज neuronal गतिविधि, संवेदी इनपुट और न्यूरॉन्स के बीच लंबी दूरी कनेक्शन कमी कर रहे हैं, जबकि वहाँ. अंत में, टुकड़ा संस्कृति प्रणाली के भीतर विशिष्ट प्रमोटर संचालित वायरल वैक्टर या ट्रांसजेनिक चूहों, सेल प्रकार विशिष्ट आनुवंशिक जोड़तोड़ के उपयोग के बिना चुनौती दे रहा है. प्रयोगों के डिजाइन जब इन सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए, टुकड़ा संस्कृतियों अलग सेल संस्कृतियों के साथ या बरकरार पशु में जवाब नहीं हो सकता है कि प्रश्न में उपन्यास जानकारी हासिल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो एक अनूठा व्यवस्था कर रहे हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium Invitrogen 11090 50%
Hank’s Balanced Salt Solution Invitrogen 14175 25%
HEPES Sigma-Aldrich H-4034 25mM
L-Glutamine Invitrogen 25030 1mM
Insulin Sigma-Aldrich I6634 1mg/L
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A-0278 0.4mM
Horse Serum Hyclone SH30074.03 25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl Sigma-Aldrich S3014 124mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 3.004mM
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 1.25mM
MgSO4 (anhydrous) Sigma-Aldrich M7506 4.004mM
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich C7902 2mM
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761 26mM
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 10mM
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A-0278 2.0mM
Adenosine Sigma-Aldrich A4036 0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT) Sigma-Aldrich H7904 100nM
Paraformaldehyde (PFA) EM Sciences 19200 4%
L-Lysine Sigma-Aldrich L-6027 0.1M
Sodium Metaperiodate Sigma-Aldrich S-1878 0.01M
Rabbit anti NG2 antibody Chemicon (Millipore) AB5320 1:500
Mouse anti CC1 antibody Calbiochem (Millipore) OP80 1:200
Mouse anti Ki67 antibody Vision Biosystems NCL-Ki67-MM1 1:300
Mouse anti NeuN antibody Chemicon (Millipore) MAB377 1:500
Species specific secondary antibodies Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS) 5%
Triton X-100 0.10%
Mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size Fisher Scientific PICM03050
Bottle top filters Fisher Scientific 09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 90 NG2 CSPG4 polydendrocyte oligodendrocyte पूर्वज सेल oligodendrocyte माइलिन organotypic टुकड़ा संस्कृति समय चूक
Organotypic स्लाइस संस्कृति Oligodendrocyte गतिशीलता और myelination अध्ययन
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Hill, R. A., Medved, J., Patel, K. D., Nishiyama, A. Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination. J. Vis. Exp. (90), e51835, doi:10.3791/51835 (2014).

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