Organotypic स्लाइस संस्कृति Oligodendrocyte गतिशीलता और myelination अध्ययन
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
NG2 व्यक्त कोशिकाओं (polydendrocytes, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में चौथा प्रमुख glial सेल आबादी हैं. भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के दौरान वे सक्रिय रूप से पैदा करना और myelinating oligodendrocytes उत्पन्न करते हैं. इन कोशिकाओं को आमतौर पर प्राथमिक अलग संस्कृतियों, न्यूरॉन cocultures में अध्ययन किया, और तय ऊतक में किया गया है. का प्रयोग नव उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस लाइनों संस्कृति प्रणालियों अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम के दोनों ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों में oligodendrocyte वंश कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता टुकड़ा. टुकड़ा संस्कृतियों जल्दी प्रसव के बाद चूहों से तैयार कर रहे हैं और 1 महीने तक के लिए संस्कृति में रखा जाता है. ये स्लाइस सेलुलर व्यवहार और बातचीत की जांच के लिए संस्कृति की अवधि में कई बार imaged किया जा सकता है. इस विधि NG2 कोशिका विभाजन के दृश्य और का विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करते हुए oligodendrocyte भेदभाव के लिए प्रमुख कदम क्षेत्रवार निर्भर अनुमति देता हैईएनटी NG2 सेल और oligodendrocyte कार्यात्मक विविधता. इस बारीकी से vivo में पाया कि जैसा एक सेलुलर वातावरण में समय के साथ इन कोशिकाओं को प्रभावित आंतरिक और बाह्य संकेत जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है.
Introduction
4 – केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की Organoytpic टुकड़ा संस्कृतियों एक semiintact प्रणाली 1 में न्यूरॉन और glial कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अत्यंत उपयोगी साबित किया है. 9 – इन संस्कृतियों को अपनाने और ऐसे बाह्य वातावरण के हेरफेर और दोहराया लंबे समय तक जीना सेल इमेजिंग के लिए आसान पहुँच और electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में 5 प्राथमिक अलग सेल संस्कृतियों के कई लाभ को बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. इसके अलावा, टुकड़ा संस्कृतियों 3 आयामी ऊतक cytoarchitecture, क्षेत्रीय तंत्रिका कनेक्टिविटी बनाए रखने, और सबसे प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं प्रणाली में मौजूद हैं. इन गुणों के सेलुलर और पर्यावरण बातचीत के साथ एकल कक्ष व्यवहार और शरीर विज्ञान की जांच के लिए इन संस्कृतियों एक अद्वितीय और सुविधाजनक प्रणाली बनाने.
NG2 कोशिकाओं पैदा करना और एम उत्पन्न करने के लिए जारी है कि स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में glial कोशिकाओं की आबादी हैंभ्रूण और प्रसव के बाद विकास 10 के दौरान oligodendrocytes yelinating. वे बड़े पैमाने पर अलग प्राथमिक सेल संस्कृतियों में अध्ययन किया गया है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का NG2 सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की हाल ही में विकास तीव्र टुकड़ा तैयारी में विवो भाग्य मानचित्रण और electrophysiological रिकॉर्डिंग में मदद की है. यहां तक कि इन अध्ययनों के साथ, थोड़ा NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का लौकिक गतिशीलता के बारे में जाना जाता है. अलग सेल संस्कृति को व्यापक रूप से औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ में रिश्तेदार की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जाता है, यह यह सेलुलर microenvironment के संदर्भ बनाए रखने के लिए वांछनीय है, विशेष रूप से जब अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में इन कोशिकाओं के कार्यात्मक मतभेद पूछताछ के लिए उपयुक्त नहीं है. टुकड़ा संस्कृतियों, सेल औषधीय जोड़तोड़ करने के लिए उत्तरदायी है और oligodendrocyte myelination 11,12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक सरल विकल्प प्रदान(LPC) lysolecithin या एंटीबॉडी औषधीय उपचार 15 के माध्यम से demyelination 13,14, और remyelination की प्रेरण प्रेरित बाद ular प्रतिक्रिया.
एक विधि की जांच और लाइव इमेजिंग और तय ऊतक (या postfixation) अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से लिया organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का विश्लेषण वर्णित है प्रदर्शन करने के लिए. इस डिवीजन 16 के बाद ही NG2 कोशिकाओं के सेल भाग्य का अध्ययन करने और वृद्धि कारक प्रेरित NG2 सेल प्रसार 17 में region- और उम्र पर निर्भर मतभेदों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तरीका है. यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक आगे आंतरिक और / या पर्यावरण इन glial कोशिकाओं के शरीर विज्ञान और neuronal गतिविधि या माइलिन क्षति के लिए उनकी प्रतिक्रिया को विनियमित तंत्र सेल की जांच के लिए व्यापक रूप से सुलभ है.
Protocol
Representative Results
Discussion
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में myelination कुशल न्यूरोनल संचार और axonal अस्तित्व 22 के लिए आवश्यक है. 25 – सबसे मस्तिष्क क्षेत्रों 16,23 में एक निवासी आबादी को बनाए रखते हुए NG2 कोशिकाओं लगातार वयस्कता में myelinating …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -. J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
