Abstract
NG2 expressie brengende cellen (polydendrocytes, oligodendrocyt precursor cellen) zijn de vierde grote gliale celpopulatie in het centrale zenuwstelsel. Tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling ze actief verspreiden en genereren myeliniserende oligodendrocyten. Deze cellen zijn vaak onderzocht bij primaire los culturen, neuron cocultures, en in vaste weefsel. Met vrijgekomen transgene muizenlijnen snede kweeksystemen kunnen worden gebruikt om de proliferatie en differentiatie van oligodendrocyt afkomstcellen onderzoeken zowel grijze en witte stof gebieden van de voorhersenen en cerebellum. Plak culturen worden bereid uit vroege postnatale muizen en in kweek gehouden gedurende 1 maand. Deze segmenten kunnen meerdere malen worden afgebeeld in de kweekperiode cellulaire gedrag en interacties te onderzoeken. Deze methode maakt visualisatie van NG2 celdeling en de stappen die leiden tot oligodendrocyte differentiatie, terwijl waardoor een gedetailleerde analyse van de regio-afhankelijkent NG2 cel en oligodendrocyte functionele heterogeniteit. Dit is een techniek die kan worden gebruikt om de intrinsieke en extrinsieke signalen beïnvloeden deze cellen in de tijd in een cellulaire omgeving die lijkt op die in vivo onderzoeken.
Introduction
Organoytpic slice cultures van het centrale zenuwstelsel zijn uitermate bruikbaar voor het bestuderen neuron en gliale celbiologie in een semiintact systeem 1 te zijn - 4. Deze culturen zijn relatief eenvoudig vast te stellen en te behouden vele voordelen van primaire gedissocieerde celculturen, zoals manipulatie van de extracellulaire omgeving en gemakkelijke toegang voor herhaalde langdurige live cell imaging en elektrofysiologische opnames 5-9. Bovendien slice cultures onderhouden 3-dimensionele tissue cytoarchitecture, regionale neurale verbindingen en meest belangrijke celtypen aanwezig zijn in het systeem. Deze eigenschappen maken deze culturen een uniek en handig systeem om enkele cel gedrag en fysiologie met cellulaire en milieu-interacties te onderzoeken.
NG2 cellen een populatie van gliale cellen in het centrale zenuwstelsel die blijven prolifereren en genereren myelinating oligodendrocyten tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling 10. Zij zijn uitgebreid bestudeerd in gedissocieerde primaire celculturen en recente ontwikkeling van transgene muizen lijnen met NG2 celspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten heeft vergemakkelijkt in vivo lot mapping en elektrofysiologische opnames in acute slice preparaten. Zelfs met deze studies is er weinig bekend over de temporele dynamiek van NG2 celproliferatie en oligodendrocyt differentiatie. Hoewel gedissocieerde celkweek op grote schaal gebruikt voor de relatieve faciliteit farmacologische en genetische manipulaties, is het niet geschikt voor het ondervragen functionele verschillen van deze cellen in verschillende hersengebieden bijzonder wanneer het wenselijk is om de context van de cellulaire micro-omgeving behouden. Plak culturen een eenvoudig alternatief dat vatbaar is voor farmacologische manipulaties en zijn gebruikt voor oligodendrocyten myelinisatie 11,12 onderzoeken cellular reactie na lysolecithine (LPC) of antilichamen geïnduceerde demyelinisatie 13,14 en inductie van remyelinisatie via farmacologische behandeling 15.
Werkwijze onderzoeken en live imaging en vast weefsel (of postfixatie) analyse van NG2 celproliferatie en oligodendrocyt differentiatie in organotypische slice culturen uit zowel de voorhersenen en cerebellum beschreven. Dit is een krachtige methode die gebruikt kan worden om de cel lot van NG2 enkelvoudige cellen te bestuderen na splitsing 16 en regio- en leeftijdsafhankelijke verschillen groeifactor geïnduceerde celproliferatie NG2 17 ontdekken. Deze relatief eenvoudige techniek breed toegankelijk verder te onderzoeken cel intrinsieke en / of ecologische mechanismen reguleren van de fysiologie van deze gliacellen en hun respons op neuronale activiteit of myelinebeschadiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures worden volgens de richtlijnen en hebben door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Connecticut is goedgekeurd.
LET OP: Voor deze experimenten constitutieve NG2cre 18 (JAX # 008533) en induceerbare NG2creER 16 (JAX # 008538) transgene muizen gekruist tot Z / EG 19 (JAX # 003920) of gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) lijnen respectievelijk werden gebruikt om beeld NG2 cellen en hun nageslacht. Om het beeld mature oligodendrocyten, PLPDsRed transgene muizen 21 werden gebruikt. Voor een constante overleving, kunnen segmenten worden geïsoleerd uit muizen tot postnatale dag 10 van zowel de voorhersenen en cerebellum.
1 Slice Voorbereiding
- In een cultuur kap, plaats weefselkweek inserts in zes putjes en voeg 1 ml slice kweekmedium (recept in reagentia sectie). Plaats de platen in de celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 minstens 2 uur vóór dissectie.
- Steriliseren alle gereedschappen en weefsel chopper met 70% ethanol.
- Bubble dissectie buffer (recept reagentia punt) met 95% O2, 5% CO2 op ijs gedurende ten minste 15 minuten voor het begin van dissectie.
- Verdoven muis pups door ze op ijs gedurende 5-10 minuten volgens de goedgekeurde dieren protocollen. Vast te stellen de juiste diepte van de anesthesie door te bevestigen dat de muizen niet reageren op de staart en teen knijpen.
- Onthoofden dieren met behulp van een scherpe schaar volgende dierlijke protocollen. Verwijder snel de schedel over de voorhersenen en cerebellum door eerst een sagittale snede gevolgd door laterale incisie, met gesteriliseerde instrumenten. Knip craniale zenuwen van het ventrale oppervlak van de hersenen en kleine hersenen door voorzichtig rollen het weefsel aan de zijkant.
- Plaats weefsel in een steriele 35 mm schotel met ijskoude geoxygeneerde dissectie buffer.
- Met behulp van een scheermesje, verbreken het cerebellum en de voorhersenen. Maak dan een mid-sagittale cut through de voorhersenen en het cerebellum, het scheiden van de hemisferen.
- Snijd 300 micrometer dikke coronale en sagittale delen van de voorhersenen en het cerebellum met een handmatige tissue chopper. OPMERKING: Een handmatige weefsel chopper maakt een snelle verwerking van dissectie tot cultuur incubatie zonder de noodzaak voor agarose inbedding. Een vibratome kan ook worden gebruikt zoals hiervoor beschreven 9.
- Transfer gescheiden plakjes in vers borrelen koude dissectie buffer op ijs.
- Gebruik kleine ontleden of wegen spatels om individuele secties te scheiden en over te brengen naar zes goed gerechten met cultuur inserts voorgeïncubeerde.
- Overtollige buffer dissectie van het oppervlak van de kweek inzetstuk met een wegwerpbare pipet of P 200 pipet tip. Twee tot drie voorhersenen of drie cerebellaire schijfjes kan op de ene cultuur insert geplaatst worden.
OPMERKING: Voor consistente resultaten met voorhersenen culturen, is het ideaal om plakjes te nemen verspreid over de voorste een derde van het corpus callosum(Figuur 1A) om zowel grijze en witte stof gebieden bestuderen in hetzelfde segment. Elk dier levert meestal 6 voorhersenen plakjes en 6 cerebellum plakjes. - Plaats de zes well platen in de incubator en vervang het segment medium met 1 ml medium slice 1 dag na slice voorbereiding en vervolgens om de dag tot slice fixatie.
- Afhankelijk van het experiment gebruikt plakjes na 5-7 dagen kweek. Gebruik alleen schijven die transparant na de eerste paar dagen geworden en gooi die ongelijke ondoorzichtige gebieden hebben. OPMERKING: Ondoorzichtige regio's binnen schijfjes zijn zichtbaar met het blote oog en verschijnen als een klomp van donkere cellen onder fase contrast. Nadat de techniek beheerst, overleden ondoorzichtige segmenten zelden voorkomen, bij minder dan 1,5% van segmenten.
2 Time-lapse imaging van NG2 celdeling en Oligodendrocyte Differentiatie
OPMERKING: Om time lapse imaging van NG2 cel proliferatie en differentiatie te voeren gebruiken we NG2cre: ZEG muizen 16die EGFP uitdrukken in NG2 cellen en hun nakomelingen (figuur 1C-E). Reporter expressie in deze lijn voldoende robuust om live beelden van GFP + cellen in plakken direct na het snijden gedurende een periode van ten minste vier weken verkrijgen. De duidelijkste beelden worden verkregen na de eerste verdunning periode van het deel, die optreedt gedurende de eerste 3-5 dagen in kweek.
- Gedurende het experiment houdt de plakken in een cel incubator bij 37 ° C en verwijderen slechts korte tijd (minder dan 15 minuten per segment), waarbij het deksel op de zes wells plaat tijdens beeldvorming.
- Met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera beelden opnemen op het eerste tijdstip met een 10X objectief. OPMERKING: De eerste keer punten zal verschillen per experiment en kan de dag waarop de schijfjes werden bereid of enig tijdstip na zijn.
- Leg beelden van verschillende gebieden op tijdstip een in zowel grijze en witte stof gebieden van het segment. Opmerking the regio afgebeeld door specifieke oriëntatiepunten binnen het segment en in kaart brengen van het beeld locatie op een schema dat kan worden gebruikt voor verdere beeldvorming sessies. Handige oriëntatiepunten kunnen bestaan randen van de plakjes en / of oriëntatie van witte stof traktaten. Afbeelding 4-8 locaties op elk plakje op elk tijdstip.
- Leg volgende opnamen met een interval van 4-6 uur of behandeling NG2 celdeling en oligodendrocyt differentiatie, idealiter via 5-7 dagen.
- Leg een laatste beeld van alle regio's en bevestig de plakjes onmiddellijk. Voeg 1 ml fixeermiddel (4% PFA met 0,1 M L-lysine 0,01 M natrium meta-perjodaat) aan de onderkant van de kweekinsert, voeg nog eens 1 ml bovenop de segmenten. Zorg ervoor dat u de fixerende direct spuiten op het schijfje als het kan los van het membraan. Fix het weefsel voor 30 min en verder te gaan met behulp van immunohistochemie ontwikkelingsstadium-specifieke markers zoals beschreven in paragraaf 4.
- Was segmenten met 0,2 M natriumfosfaatbuffer 3 x 10 m. Indien nodig, opslag segmenten bij 4 ° C in 0,2 M natriumfosfaatbuffer gedurende 1-3 dagen voor immunokleuring maar idealiter kleuring voeren binnen 24 uur. Doorgaan met immunohistochemie zoals hieronder beschreven in punt 4 van het aandeel van de cellen die zijn gedifferentieerd in oligodendrocyten (figuur 2D-F) te bepalen.
3 Fate Mapping van NG2 cel Nageslacht Met behulp Inducible Reporter transgene muizen in Slice Culturen
OPMERKING: Om het lot van NG2 cellen te volgen vanaf een bepaald tijdstip in de cultuur, induceerbare NG2creER: kan YFP transgene muizen worden gebruikt.
- Laten Cre recombinatie en reporter expressie door toevoeging van 100 nM 4OHT opgelost in ethanol aan het kweekmedium. OPMERKING: Reporter positieve cellen moeten verschijnen binnen 1-2 dagen bij een inductie efficiëntie van ~ 20-25% YFP- + NG2 + / NG2 + cellen en op dit tijdstip zullen allemaal cellen op de NG2 cel stadium (Figuur 2A-C)
- Fix en was de snees op verschillende tijdstippen na diverse manipulaties (beschreven in secties 2.5 en 2.6).
4 Slice Immunohistochemistry
- Snijd de membranen met de plakjes bijgevoegde uit de inserts met behulp van een scalpel.
- Transfer segmenten individuele putjes van een 24 wells plaat met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een set van pincet, verzorgen de samenstelling van het segment niet te verstoren bij het ophalen van het membraan.
- Breng de segmenten een 24 wells plaat met blokkerende oplossing met 5% normaal geitenserum (NGS) en 0,1% Triton-X100 in PBS gedurende 1 uur.
- Incubeer de segmenten in primaire antilichaam O / N in 5% NGS in PBS bij 4 ° C. Voor het identificeren van cellen in de NG2 cel stadium gebruiken antilichamen tegen NG2 en PDGFRα. Voor het identificeren van gedifferentieerde oligodendrocyten, maken gebruik van een antilichaam tegen het adenomateuze polyposis coli antigeen (APC; kloon CC1).
- Op de tweede dag was plakjes in PBS 3 x15 min, daarna broeden in het voortgezet Antibosterft in 5% NGS in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was plakjes in PBS 3 x15 min en monteren op dia's. Monteer met plakjes op en membraan waarmee de dia, zodat het membraan niet zal zijn tussen de doelstelling en het weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van representatieve gegevens worden hieronder gegeven die zijn verkregen met behulp van slice culturen van zowel de voorhersenen en het cerebellum van P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP en PLPDsRed transgene muis lijnen. NG2 cellen kunnen worden afgebeeld op dagen voorhersenen en cerebellum segmenten (Figuur 1B-D, Video 1) en het fenotype van deze cellen kan worden bepaald na fixatie en immunokleuring met NG2 en CC1 antilichamen (figuur 1E). Naast leven imaging kan celproliferatie worden vastgesteld met immunohistochemische kleuring voor celproliferatie merkers zoals Ki67 (Figuur 1F). Deze gegevens maken het mogelijk voor een gedetailleerde analyse van de temporele dynamiek van oligodendrocyte differentiatie na NG2 celdeling op individuele cel basis. YFP muizen (Figuur 2): Fate kartering van NG2 cellen na inductie van cre recombinatie in plakken met 4OHT in NG2creER uitgevoerd. YFP- reporter uitdrukken NG2 + cellen waren found in de kweken twee dagen na toevoeging van 4OHT aan het kweekmedium (Figuur 2A). Zes dagen na 4OHT inductie, een deel van de YFP + cellen had gedifferentieerd in CC1 + oligodendrocyten (Figuur 2B). Deze gegevens laten de haalbaarheid zien van het lot mapping van NG2 cellen in plakken wanneer het extracellulaire milieu kan worden gemanipuleerd om de effecten van farmacologische middelen of pathologieën van het lot van NG2 cellen testen. Verschillende concentraties van 4OHT kan worden gebruikt om verschillende gradaties van cre recombinatie bereiken. Bijvoorbeeld, blootstelling aan 100 nM 4OHT 2 dagen veroorzaakt reporterexpressie in ongeveer 20-25% van alle NG2 expressie brengen terwijl 1 uM 4OHT resulteert in ongeveer 60-70% recombinatie efficiëntie. Tot slot, uitgebreide myeline is aanwezig in deze culturen en myeliniserende oligodendrocyten kan worden afgebeeld in levende en vaste schijven met behulp PLPDsRed transgene muizen (figuur 3, Video 2).
Figuur 1 Slice kweekmethode voor langdurige beeldvorming van NG2 celproliferatie en differentiatie (AB) Schematische die de isolatie van voorhersenen en cerebellum segmenten (A) en daaropvolgende kweken en time-lapse imaging middels slice cultuur inserts (B). (C ) Depiction waarin NG2 celdeling en daaropvolgende oligodendrocyt differentiatie in NG2cre. ZEG transgene muizen (D) Voorbeeld afbeeldingen verkregen van corticale gebieden van NG2cre: ZEG muizen die een enkele GFP + cellen (pijlen) tweemaal verdelen over een periode van 122 uur, tijd afgebeeld in rechtsboven in uren na het begin van het beeldvormende experiment. (E) Fixatie en immunokleuring met anti-NG2 en CC1 antilichamen van dezelfde slice blijkt dat de afgebeelde dividing cellen resulteerde in drie NG2 + cellen (pijlen). (F) afbeelding Voorbeeld voor twee Ki67 + NG2 + cellen in een corticale stukje cultuur. (G) image Voorbeeld NG2 + cellen (pijlpunten) en hun processen te verweven met NeuN + neuronale kernen in een corticale slice cultuur. Schaal Bars 25 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Inductie van YFP expressie om het lot van NG2 cellen in voorhersenen slice culturen (AB) Foto's genomen van het corpus callosum regio voorhersenen slice culturen uit NG2creER volgen: YFP muizen behandeld met 4OHT voor 24 uur en dan links in de cultuur voor 2 dagen (A) of 6 dagen (B) (A) of CC1 en YFP (B) aantonen van de differentiatie van reporter NG2 positieve cellen in oligodendrocyten terwijl in kweek 6 dagen na Cre recombinatie (pijl). Schaal Bars 25 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Imaging oligodendrocyten in slice culturen uit PLPDsRed transgene muizen. (A) Schematische afbeelding van de isolatie, het kweken en de beeldvorming van de kleine hersenen plakjes van PLPDsRed transgene muizen. (B) Foto genomen vanaf een vaste cerebellum schijfje na 5 dagen in vitro tonen calbindin + ( cyaan) Purkinje neuronen met gemyeliniseerdmyelinebasiseiwit + (MBP) (groen) axonen projecteren in de witte stof gebieden van de snee. Scale Bar 25 micrometer. (C) Lage vergroting beelden die uit dezelfde regio om de andere dag op de in uren in cerebellum slice culturen uit PLPDsRed muizen tijden. Schaal bar 100 urn. Laag vergroting afbeelding uit vaste PLPDsRed slice cultuur geeft MBP expressie in witte stof gebieden waar DsRed + cellen geconcentreerd (D). Scale Bar 100 micrometer. (E) Hoge vergroting foto genomen van een vaste PLPDsRed slice cultuur showing single DsRed + oligodendrocyten met MBP + processen. Scale Bar 20 urn. (F) Time-lapse sequence genomen uit een PLPDsRed cerebellum slice zien relatief stabiel cellichamen over de 48 uur-imaging-sessie, de tijd aangegeven in de rechterbovenhoek in uren. Scale Bar 25 micrometer. Pleidooise klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Video 1 Live-Imaging van NG2 celdeling in een corticale slice cultuur Vertegenwoordiger time lapse-reeks toont meerdere celdelingen in een corticale slice cultuur afkomstig uit een NG2cre:. ZEG transgene muis. Video getoond bij 5 frames per seconde, montage van beelden weergegeven in figuur 1. (Zie "Video_1.mov" onder Downloads)
Video 2 Live-beeldvorming van oligodendrocyten in cerebellum slice culturen Vertegenwoordiger time lapse-reeks, die aan kleine veranderingen in oligodendrocyte morfologie (pijl) in beeld gebracht meer dan 48 uur in een cerebellum stukje genomen uit een PLPDsRed transgene muis. Video getoond op 3 beelden per seconde, montage van beelden weergegeven in figuur 3. (Zie "Video_2.mov" onder Downloads)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelination in het centrale zenuwstelsel is essentieel voor efficiënte neuronale communicatie en axonaal overleving 22. NG2 cellen continu genereren myeliniserende oligodendrocyten in de volwassenheid met behoud van een bevolking in de meeste gebieden van de hersenen 16,23 - 25. Sommige genetische en moleculaire mechanismen tot regeling van de differentiatie van deze cellen zijn beschreven, maar er is nog veel te ontdekken. Organotypische slice culturen zijn een handig hulpmiddel om deze mechanismen te onderzoeken vanwege hun unieke eigenschappen behouden anatomische gebieden, gemakkelijke manipulatie van het extracellulaire milieu, robuust myelinisatie, en de aanwezigheid van alle belangrijke celtypes. Deze kenmerken vergemakkelijken onderzoek naar de korte en lange termijn de interacties tussen NG2 cellen, oligodendrocyten en axonen 11,26. Bovendien celtransplantatie is relatief gemakkelijk uit te voeren en kan worden gebruikt om regio-afhankelijke d onderzoekenifferences in celgedrag 17. Bovendien kan farmacologische behandelingen worden toegevoegd aan het kweekmedium moleculaire mechanismen beïnvloeden NG2 celproliferatie en / of differentiatie in normale 17,27,28 en gedemyeliniseerde culturen 15,29 onderzoeken. Tenslotte is het technisch mogelijk slice cultures gebruiken schermen presteren voor hoge doorvoer analyse van verbindingen die NG2 cellen direct te prolifereren en differentiëren, eventueel ook na een insult demyeliniserende 30.
Huidige methoden om oligodendrocyt lineage cellen en hun interacties met axonen in een gecontroleerde cultuur instelling onderzoeken omvatten mede-culturen met gedissocieerde dorsale wortel ganglion (DRG) of embryonale corticale neuronen en NG2 cellen 31,32, die waren gebaseerd op de originele bereidingen ontwikkeld om DRG onderzoeken -Schwann cel interacties 33. Deze kweken werden gebruikt om fundamentele eigenschappen van axon en oligodendrocyt onderzoekenlineage cel interacties zoals neuronale activiteit-afhankelijke signalering differentiatie en myeline productie induceren 32,34 - 36 naast andere kwesties als de afhankelijkheid van axon diameter en NG2 celdichtheid controle proliferatie en het begin van differentiatie 37. Hoewel deze coculture systemen zijn ideaal voor dergelijke vragen, directe correlatie en de toepassing van de in vivo situatie aan te pakken is niet altijd duidelijk. Zoals eerder vermeld, organotypische slice cultures een unieke voorwaarde dat er vele lokale neuronenverbindingen en driedimensionale cytoarchitecture die verloren in co-kweek preparaten van gedissocieerde cellen. Verder tegenstelling organotypische slice cultures, co-kweeksystemen van gedissocieerde cellen vaak geen andere gliale cellen en extracellulaire matrix moleculen waarvan aangetoond dat dit essentiële rol spelen in de ontwikkeling, onderhoud en fysiologie van NG2 cellen, oligodendrocyten omvattenEn myeline. Met de enorme groei in de verscheidenheid van de hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor specifieke etikettering en manipulatie van verschillende celpopulaties met virale vectoren en transgene dieren, lange termijn beeldvorming en het lot in kaart brengen in organotypische slice culturen moeten blijken te zijn een krachtige techniek voor het onderzoeken van NG2 cel proliferatie, differentiatie en oligodendrocyte myelinisatie.
Enkele kritische stappen worden uitgevoerd bij het uitvoeren van deze experimenten slice overleving en data reproduceerbaarheid te waarborgen. Ten eerste, om gezond plakjes snijden en isolatie van segmenten genereren moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd en in ijskoude buffer dissectie. Ten tweede, terwijl de automatische image positie verwerven met een gemotoriseerde podium op de fluorescentiemicroscoop nuttig kan zijn, er zijn veel factoren die de precieze verplaatsing van de regio's in beeld gebracht en handmatige herhaalde overname kan verstoren is noodzakelijk om consistente, betrouwbare beelden dan multipl krijgene dagen. Dit is met name noodzakelijk wanneer de plakken worden in een celkweek incubator tussen beeldvorming sessies en niet in een fase-top incubator. Ten derde, tijdens plak fixatie, kleuring en mounting is zeer belangrijk voor de plakjes voorzichtig behandelen als een verstoring van het weefsel resulteert in het onvermogen om levende belichte gebieden en cellen verplaatsen. Er zijn geen specifieke wijzigingen traditionele methoden voor slice cultuur preparaten die worden gebruikt voor studies van neuronen en astrocyten.
Er zijn verscheidene beperkingen aan het segment kweekmethode die moeten worden overwogen. Astrocyten, microglia en NG2 cellen is bekend reageren CNS-letsel bij verhoogde proliferatie op de plaats van schade en de vorming van een gliale litteken. Het proces van voorbereiding van de plakjes resultaten in een aantal reorganisaties en een eerste reactieve gliale reactie van deze cellen. NG2 celproliferatie tarieven terug te keren naar een niveau vergelijkbaar met die gerapporteerd in vivo voor elkaar afgestemdontwikkelingsstadia na enkele dagen in kweek maar de hogere proliferatiesnelheden en eerste reactieve fenotype van deze cellen moeten worden gehouden bij het interpreteren van de data. De aanwezigheid van het paard serum in het kweekmedium kan NG2 celproliferatie beïnvloeden en dient te worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten van een experiment. Daarnaast, terwijl er spontane neuronale activiteit, sensorische en lange verbindingen bereik tussen neuronen ontbreken, wat kan leiden tot veranderde neuronale activiteit in de slice. Tot slot, zonder het gebruik van specifieke promotor gedreven virale vectoren of transgene muizen, celtype- specifieke genetische manipulaties binnen slice cultuur-systemen is een uitdaging. Hoewel deze beperkingen moeten worden overwogen bij het ontwerpen experimenten, slice culturen een uniek systeem dat kan worden gebruikt om nieuwe inzicht vragen die niet kan worden beantwoord met gedissocieerde celculturen of in het intacte dier krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
