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Medicine

Construction des chambres de vapeur utilisée pour exposer des souris à l'alcool pendant l'équivalent de toutes trois trimestres de développement humain

Published: July 13, 2014 doi: 10.3791/51839
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurosciences, School of Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Nous démontrons la construction des chambres à vapeur de l'alcool à l'aide de matériaux facilement disponibles qui abritent simultanément 6 cages de souris. Nous décrivons en outre leur utilisation dans un modèle de souris de l'exposition d'alcoolisation fœtale équivalent à tous les trois trimestres de la grossesse humaine. Ce paradigme expose des animaux pendant la gestation et après la naissance 1-12 jours.

Abstract

L'exposition à l'alcool pendant le développement peut entraîner une constellation d'anomalies morphologiques et comportementales qui sont collectivement connus comme des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (ETCAF). A la fin la plus sévère du spectre est le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), caractérisé par un retard de croissance, une dysmorphie cranio-faciale, et les déficits neurocomportementaux. Des études sur des modèles animaux, y compris les rongeurs, ont permis d'élucider de nombreux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la physiopathologie de l'ETCAF. administration de l'éthanol à des rongeurs enceintes a été utilisé pour modéliser l'exposition humaine au cours des premier et deuxième trimestres de la grossesse. Troisième trimestre de la consommation d'éthanol chez l'homme a été modélisée à l'aide rongeurs nouveau-nés. Cependant, quelques études sur des rongeurs ont caractérisé l'effet de l'exposition à l'éthanol pendant l'équivalent de trois trimestres de la grossesse humaine, un modèle d'exposition qui est commun chez les femmes enceintes. Ici, nous montrons comment construire des chambres de vapeur de facilement omatériaux btainable qui peuvent chacune accueillir jusqu'à six cages de souris standard. Nous décrivons un paradigme de la chambre de vapeur qui peut être utilisé pour modéliser une exposition à l'éthanol, avec un minimum de manipulation, pendant les trois trimestres. Nos études montrent que les barrages enceintes développées tolérance métabolique importante à l'éthanol. Cependant, les souris néonatale n'a pas développé la tolérance métabolique et le nombre de fœtus, le poids du fœtus, le poids du placenta, le nombre de chiots / portée, le nombre de morts chiots / portée, et du poids des petits n'ont pas été significativement affectée par l'exposition à l'éthanol. Un avantage important de ce modèle est son applicabilité à des études sur des souris génétiquement modifiées. De plus, ce paradigme minimise la manipulation des animaux, un facteur de confusion important dans la recherche d'alcoolisme foetal.

Introduction

Boire pendant la grossesse peut nuire au fœtus, causant des altérations persistantes dans de nombreux organes et systèmes qui réduisent de manière significative la qualité de vie pour les personnes touchées et leurs familles. On estime qu'environ 10-30% des femmes boivent pendant la grossesse aux États-Unis, avec 1-8% de boire dans un 1,2 motif de frénésie. La gamme des effets produits par l'exposition à l'éthanol au cours du développement du fœtus est collectivement connu sous le nom de troubles du spectre de l'alcoolisation foetale (ETCAF). Des estimations récentes indiquent que ETCAF est un problème majeur de santé publique avec une prévalence aussi élevée que 2-5% aux États-Unis 3. La manifestation la plus grave de FASDs est le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), qui se caractérise par un retard de croissance, des anomalies cranio-faciales, et des déficits neurocomportementaux, y compris les troubles d'apprentissage. La prévalence du SAF a été estimée à 0,2-0,7% aux États-Unis 3. Les traitements actuellement disponibles pour FASDs sont que partiellement efficaceset le développement de traitements plus efficaces est limitée par la mauvaise compréhension des fondements moléculaires et cellulaires de ce spectre complexe de troubles.

Les données des anomalies congénitales nationales Prevention Study (NBDPS) indiquent que les femmes enceintes boivent plus souvent au cours du 1 er trimestre, avant la grossesse a été détectée, suivie par l'abstinence durant les derniers stades de gestation 2. Le NBDPS également constaté que le deuxième modèle le plus courant de la consommation d'éthanol pendant la gestation implique potable dans tous les trimestres de la grossesse 2. Les raisons en sont le manque de sensibilisation sur les effets potentiellement nocifs de l'exposition du fœtus à l'éthanol (même à faibles doses), l'accès limité à des soins prénatals, l'histoire positive pour les troubles neuropsychiatriques, et l'abus de dépendance ou à l'éthanol 4. Fait intéressant, le NBDPS indiqué que le troisième modèle le plus courant de la consommation impliqué l'abstinence pendant la 1 ème trimestres suivis par le secteur au cours de la 3 ème trimestre, quand on suppose souvent que l'alcool est sûr parce que l'organogenèse a été presque complétée. Cependant, le 3 ème trimestre est une période de forte sensibilité à des lésions du système nerveux induite par l'éthanol-parce que c'est une période où les circuits neuronaux subissent profond raffinement 2. Le NBDPS également identifié d'autres modèles, moins fréquentes de la consommation d'alcool qui se produisent pendant la grossesse, y compris la consommation tout au long de la 1 ère et 2 ème trimestres suivis par l'abstinence pendant la 3 e trimestre 2.

Dans une tentative pour modéliser les différents modes de consommation d'éthanol observés chez les femmes enceintes, un certain nombre de paradigmes de développement d'exposition à l'éthanol ont été établies au moyen de diverses espèces animales, des rats et des souris étant 5,6 plus courante. La durée de la grossesse chez ces animaux généralement lasct environ 3 semaines, ce qui correspond à la 1 ère et 2 ème trimestres de la grossesse humaine. De nombreuses études sur des rongeurs ont évalué l'impact de différentes doses et les modes d'exposition à l'éthanol au cours de cette période. Des exemples de procédés fréquemment utilisés pour administrer de l'éthanol à des souris et des rats enceintes comprennent l'administration par l'intermédiaire d'une alimentation de 7,8, l'addition d'éthanol à l'eau de boisson 9,10, boire volontaire des solutions sucrées 11 saccharine, gavage gastrique 12, 13 l'inhalation des vapeurs de liquides , et sous-cutanée ou injection intrapéritonéale 14. Les résultats de ces études ont récapitulé plusieurs des déficits observés chez l'homme avec FASDs, démontrant que l'exposition durant les premiers stades de la grossesse est suffisante pour endommager les circuits neuronaux dans le cerveau (revue dans 6,15).

Des expériences avec des rongeurs ont également démontré que l'exposition au cours de l'équivalent de la 3 ème 16-18 intubation intra-gastrique 19, 20 injection sous-cutanée, l'inhalation de vapeurs et 21,22. Ces études ont démontré de manière convaincante que la poussée de croissance du cerveau est une période de grande vulnérabilité aux effets sur le développement de l'éthanol 6.

Comme mentionné ci-dessus, de boire pendant tous les trimestres de la grossesse est un motif commun de la consommation d'éthanol chez les femmes 2. Cependant, relativement peu d'études ont évalué l'impact de ce type d'exposition en utilisant des modèles animaux. Certaines de ces études ont pris Advantage des animaux de grande taille où la 3ème trimestre équivalent se produit in utero au lieu de la période néonatale, comme dans le cas des rats et des souris. Ces modèles animaux comprennent les primates non humains, les moutons 23,24 et 25 à 27. Cependant, ces modèles animaux n'ont pas été largement utilisé dans la recherche de FASDs, en partie, à cause du coût élevé et la nécessité pour les établissements de soins spécialisés. Rongeurs ont été le plus souvent utilisé pour caractériser l'effet de tout trimestre exposition à l'éthanol sur le développement foetal 5. Les cobayes ont été particulièrement avantageuse à cet égard compte tenu de leur vaste développement prénatal et similitudes dans la maturation du cerveau à celle des humains 28,29. Avec cobayes, il a été possible de caractériser l'effet de l'exposition à l'éthanol in utero qui comprend la période de développement équivalent de la troisième trimestre humaine 3. Le coût relativement élevé de ces animaux, ainsi que la durée relativement longue de leur grossesse(~ 67 jours), a limité leur utilisation à quelques laboratoires travaillant sur la recherche ETCAF.

En raison de leur rapport coût-efficacité et une large utilisation dans la recherche biomédicale, les chercheurs ont utilisé des rats pour modéliser l'exposition à l'éthanol pendant tous les trimestres de la grossesse. Dans les études initiales, les rats ont été exposés pendant la grossesse par les régimes alimentaires liquides suivies par l'administration d'éthanol par gastrostomie à élevés artificiellement les nouveau-nés (jours après la naissance (P) 1-10) résultant en des niveaux de production d'éthanol dans le sang de pointe (BEC) dans les barrages de 0,08 g / dl et dans les chiots 0,16 g / dl. Ce paradigme a provoqué des modifications durables dans la myélinisation du nerf optique et réduit le nombre de fibres gliales Bergmann dans le cervelet 30-32. De même, Maier et collaborateurs utilisant des conditions d'élevage artificiels administrés éthanol aux barrages de rats enceintes de manière excessive comme par intubation intragastrique suivie par l'administration néonatale pendant une partie de la 3 ème trimestre équivalent (P4-9) 33,34. PBEC maternelle et chiot EAK ont été de 0,3 g / dl à la fois jour de gestation 20 et P6. Cette exposition paradigme de tout-trimestre a entraîné un retard de croissance était significativement supérieure à celle observée chez les petits exposés pendant des périodes sélectionnées de gestation 33. De plus, les rats exposés à de l'éthanol au cours de l'équivalent de tous les trimestres de la grossesse ont présenté une réduction dans le nombre de Purkinje du cervelet et les cellules granulaires qui était supérieure à celle observée chez les animaux exposés pendant 34 autres périodes. La réduction du nombre de cellules de l'hippocampe ont également été signalés avec ce paradigme, mais ces effets semblent être principalement une conséquence de l'exposition au cours de la 3 ème trimestre équivalent 35. Une méthode qui implique l'administration d'éthanol par gavage intragastrique pour les rats et les souris enceintes néonatale a également été utilisé pour modéliser toute exposition de trimestre 36. Cette méthode, qui a abouti à CAE de 0,13 g / dl dans les barrages (de jour de gestation 17) et 0,24 g / dl chez les petits P6, lon induitealtérations g durables dans les niveaux de neurotransmetteurs monoamines dans l'hippocampe et l'hypothalamus, et une expression accrue d'ADN méthyltransférases de méthyle et de CpG protéine 2 de liaison de l'hippocampe 37,38. L'utilisation d'un paradigme d'exposition similaire (BEC = 0,14 à 0,2 g / dl dans les barrages et 0,2 g / dl chez les petits), Gil-Mohapel et al. 39 a détecté une augmentation du nombre de nouveaux neurones immatures dans le gyrus denté de rats adultes que peut représenter un mécanisme de compensation pour une lésion neuronale induite par l'éthanol ou une altération de la maturation des neurones adultes de souche. Les enquêteurs ont également tenté de modéliser toute exposition trimestre de l'éthanol en exposant barrages par les régimes alimentaires liquides ou l'eau potable durant la grossesse et l'allaitement 9,40. Cependant, l'utilité de l'exposition des chiots par le lait de leur mère est limitée car elle se traduit généralement dans les CEB faible chiot (par exemple, de 0,002 à 0,05 g / dl; 41,42).

Les souris ont également été utilisés extensvement à caractériser les effets de l'exposition à l'éthanol de développement. Ce modèle animal de nombreuses actions des forces décrites ci-dessus pour le modèle animal de rat, avec l'avantage supplémentaire que de nombreuses souches de souris génétiquement modifiées sont disponibles 5. Souris ont été utilisés avec succès pour caractériser les effets de l'éthanol au cours de la 1 ère, 2 ème ou 3 ème trimestres de la grossesse 43,44. Cependant, l'impact de toute exposition de trimestre sur ces animaux n'a pas été bien caractérisée, car il est techniquement plus difficile à exposer des souris pendant l'équivalent de tous les trimestres de la grossesse humaine. Par exemple, l'élevage artificiel et gavage gastrique, qui ont été utilisés avec succès chez le rat, nécessitent des procédures plus spécialisées dans les souris 45. Au meilleur de notre connaissance, une seule étude à ce jour a tenté d'étudier l'effet de toute exposition trimestre de l'éthanol en utilisant des souris; ces animaux ont été exposés à une solution d'éthanol dans de l'eau potable During grossesse et l'allaitement 46. BEC maternels étaient de 0,07 g / dl et chiot BEC n'ont pas été déterminées, mais devrait être une fraction de ceux dans les barrages.

Ici, nous décrivons un nouveau modèle pour l'exposition tout trimestre éthanol de souris où l'alcool est administré à deux barrages enceintes et les nouveau-nés par des chambres d'inhalation de vapeurs. chambres de vapeur ont été construits sur la base d'une conception précédente 47. Nous fournissons des instructions détaillées sur la façon de construire les chambres d'inhalation et d'appliquer les procédures d'exposition. Nous fournissons également des informations sur les CAE qui peuvent être obtenus et l'impact de l'exposition sur la survie des nouveau-nés et de la croissance.

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Protocol

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par l'Université du Nouveau Mexique Sciences-santé Centre institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1. Assemblée Chambre de vapeur

  1. Feuilles coupe en polycarbonate avec une scie circulaire ou une scie sauteuse pour les dimensions indiquées dans la vidéo pour le haut, en bas, devant, derrière, sur les côtés et la porte (figure 1 et tableau 1).
  2. Avec une scie sauteuse ou circulaire, couper une ouverture de 8 pouces de haut par 16 pouces de large dans le milieu de la face avant.
  3. Mesurer et marquer les trous de la charnière de piano sur le 18 pouces par 10 feuille de polycarbonate de pouce qui va devenir la porte de la chambre.
  4. Dans la porte, percez contre évier trous avec un foret de 5/16 de pouce de forage, et avec une mèche de 3/16 de pouce, percez le trou pour les vis. Assurez-vous de percer des trous contre l'évier à l'intérieur de la porte pour les têtes de vis.
  5. Préparer les feuilles de polycarbonate pour le soudage.
  6. Assemblez vientnt, les panneaux arrières et latérales sur le panneau de fond en utilisant souder # 16.
  7. Sceller toutes les lacunes entre les panneaux de souder # 16.
  8. Fixez le panneau supérieur avec à souder # 16.
  9. Utiliser des brides de barres ou manuels lourds à tenir tout en place, tandis que les soudures guérir.
  10. Attacher une 1 pouce par un morceau de polycarbonate de 12 pouces sur la face avant 1 pouce au-dessous de l'ouverture pour la fixation de la charnière de porte.
  11. Attendre au moins 24 heures pour souder à guérir.
  12. Couper 2 morceaux de tuyaux PER de 12 pouces de long et 1 morceau de longue tuyaux PER de 1 pouce.
  13. Avec une mèche de 5/16, percer un trou dans chacun des tubes de PEX 12 pouces environ 1 à 2 pouces d'une extrémité.
  14. Fixez 2 x 12 pouces tuyaux PER à un connecteur en T 3/8 pouces avec les trous situés hors du connecteur.
  15. Boucher les extrémités ouvertes du tube PEX 3/8 pouces bouchons.
  16. Fixez la charnière de piano à la face avant et la porte à l'aide 4-40 des vis et écrous.
  17. Utilisation de la porte en tant que guide, mark les trous nécessaires à la charnière à piano sur l'entretoise 1 pouce sur la face avant de la chambre.
  18. Avec une mèche de 3/16 de pouce, percez les trous dans le panneau avant de la charnière piano.
  19. Fixez la porte et la charnière de piano sur le panneau avant à l'aide 4-40 des vis et écrous.
  20. Assembler les pinces à genouillère comme le montre la vidéo avec une rondelle et un écrou de part et d'autre de la branche latérale.
  21. Mark et foret 3/16 trous de pouce pour la genouillère sur le panneau avant et attachent genouillère avec 4-40 des vis et écrous.
  22. Ajouter 3/8 pouces joints à boudin en caoutchouc à l'intérieur de la porte.
  23. Avec un peu de forage ennuyeux 5/8 de pouce, percer un trou dans le centre du panneau supérieur pour le port d'entrée.
  24. Percez un trou de 1/2 pouce de fond / centre du panneau arrière de l'orifice de sortie.
  25. Assembler l'orifice de sortie en poussant la partie filetée de la 3/8 pouce adaptateurs traversant la paroi à travers la paroi arrière de la chambre à vapeur dans le trou d'orifice de sortie. Fixez l'écrou dul'intérieur de la chambre à maintenir en place.
  26. Retirez la protection de feuilles de polycarbonate.
  27. Fixer la pièce de tuyaux PER de 1 pouce au connecteur en T et forcer le tube PEX à travers le trou dans la partie supérieure de la chambre de l'intérieur.
  28. Fixez un coude à 90 3/8 de pouce vers le haut de la tuyaux PER de 1 pouce de l'extérieur.
    REMARQUE: Percez un trou de 1/2 pouce dans la porte et insérer un joint cloisons 1/2 pouce dans le trou.
  29. Répétez les étapes 1-22 pour l'air que la chambre de contrôle.

2. Rack et de l'Assemblée Air livraison

  1. Si vous placez les chambres sur le chariot / support mentionné dans la liste des matériaux, assembler le panier selon les instructions du fabricant.
  2. Avec des noix et des boulons de rechange, attachez un morceau de polycarbonate de la ferraille à la crémaillère de tenir les régulateurs de débit d'air.
  3. N'importe où sur la pièce de polycarbonate, marquer et percer 3/4 trous de pouce pour les régulateurs de débit d'air ferraille et attacher les régulateurs avec les écrousfourni.
  4. Fixez 3/8 pouces à travers les murs adaptateur pour les ports des régulateurs de débit d'air d'entrée et de sortie.
  5. Assemblez le ballon de l'éthanol avec la pierre d'aération, # 8 bouchon et la libération rapide en ligne connecteurs.
  6. Utilisation de 3/8 de pouce de tube TYGON, connecter les régulateurs de débit de la pompe à air et le ballon de l'éthanol comme le montre la figure 1.
  7. Pour la seule chambre air, attacher l'orifice de sortie du régulateur de débit d'air à l'entrée 3/8 de pouce 90 coude avec des tubes en TYGON 3/8 de pouce, comme indiqué sur la figure 1.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la configuration des chambres de vapeur. Un connecteur en T est relié à la pompe à air à faible bruit. Un côté du connecteur en T est connecté directement à un régulateur de débit d'air pour l'air de la chambre uniquement en phase vapeur. Les autres side est divisé à nouveau et fixée à 2 régulateurs de débit d'air différents, l'un pour l'air et l'autre pour l'éthanol. La chambre à air est relié directement au régulateur comme indiqué. Pour la chambre de vapeur d'éthanol, un régulateur de débit d'air est reliée à la pierre de l'aérateur immergé dans de l'éthanol liquide dans la fiole de filtration. L'orifice du bras latéral du récipient de filtre est reliée à la sortie du régulateur d'air, comme indiqué. La vapeur d'éthanol fusionné et de l'air est alors reliée à l'entrée de la chambre de vapeur d'éthanol. Les tubes de sortie (non représentés) sont connectés à une sortie de ventilation de la pièce.

3. Essai Chambers et de la vapeur d'ajuster les niveaux de l'éthanol

  1. Ajouter 600 ml d'éthanol 190 proof dans le flacon de filtre, insérer la pierre d'aération, et raccorder le tube à l'entrée de la branche latérale du ballon.
  2. Fermer les portes de la chambre et tourner sur la pompe à air.
  3. Régler les régulateurs de débit d'air de telle sorte que la moitié environ autant d'air s'écoule à travers le liquide comme de l'alcool de l'air est mélangé avec. Adjust le seul écoulement d'air de l'air à l'écoulement combiné de l'alcool et de l'air de la chambre de l'éthanol.
  4. Permettre aux chambres à s'équilibrer pendant au moins 30 min avant de mesurer la concentration en éthanol de l'air.
  5. Mesurer la concentration en éthanol de l'air en extrayant l'air de 5 ml avec une aiguille 18G et une seringue de 60 ml à travers le septum. Diluer l'échantillon avec de l'air de la chambre en tirant le piston jusqu'à 60 ml (01h12 dilution). Mesurer le niveau de l'éthanol de l'air en utilisant un alcootest conformément aux instructions du fabricant. La dilution de l'air de la chambre est nécessaire pour atteindre les niveaux de vapeur d'alcool à l'intérieur de la plage de détection de l'alcootest.
    NOTE: Si vous utilisez différents niveaux d'exposition à l'alcool la dilution peut être nécessaire d'ajuster.
  6. Comme point de départ, régler les régulateurs de débit d'air que nécessaire pour atteindre une concentration en alcool de l'air de l'ordre de 4,5 à 5 g / dl (g d'alcool vaporisé par dl de l'air).

4. L'Elevage

  1. les femmes de la maison de Groupe C578BL / 6 souris (vieux 2-3 mois) pendant au moins 1 semaine à synchroniser les cycles ovariens.
  2. Maison individuelle mâles C57BL / 6 (vieux 2-5 mois) pendant au moins 2 semaines.
  3. Après la synchronisation, mettre une seule femelle avec un seul mâle pour 5 jours pour permettre l'accouplement.
  4. Après l'accouplement, les mâles et supprimer individuellement les femmes de la maison et placez-les dans des chambres.

5. Pré-et post-natal exposition éthanol vapeur

  1. Exposer barrages enceintes à la vapeur d'éthanol pendant 4 heures par jour à partir de 10 heures au cours du cycle de lumière (lumière allumée de 6 heures-18 heures), sauf le jour de la naissance pour éviter chiot mort.
  2. Peser barrages jour de gestation (G) 5, G13-G14, G18 et G20 à surveiller la grossesse; literie a été modifié le jour que les femmes ont été pesés à minimiser la manipulation.
  3. Chaque jour remplacer la nourriture pour les groupes d'éthanol exposée pour éviter la consommation de pellets avec toute l'éthanol absorbé en eux.
  4. Le jour de l'naissance ne pas exposer les animaux. Après la naissance d'exposer les femelles et les petits pour 4 heures par jour à partir de 10 heures à partir de P1-P12.
  5. Peser chiots sur P2, P8, P12, P25 et; et changer la literie sur P8 et P12 pour minimiser la manipulation supplémentaire.
  6. Immédiatement après la dernière exposition (P12), transférer les cages à une chambre standard de logement des animaux.

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Representative Results

La figure 2A montre que les souris enceintes et les enfants nouveau-nés ont été exposés à des concentrations de vapeur d'éthanol relativement stables dans les chambres. Celles-ci vont entre 4-6 g / dl. Figure 2B montre les BEC obtenus chez les souris enceintes en fonction du temps. CAE ont été mesurées en utilisant un alcool déshydrogénase standard basé d'essai 48. Au G5, CAE a augmenté rapidement à ~ 60 mM de 2 heures après le début de l'exposition et a atteint un sommet à la fin de la période d'exposition de 4 heures. CAE a diminué progressivement à ~ 12 mM après un 4 heures supplémentaires après la fin de l'exposition. Par G13-14, il y avait une diminution spectaculaire de BEC à environ 60% des niveaux détectés à G5. En outre, les niveaux BEC augmenté plus lentement et a diminué plus rapidement, ce qui entraîne une plus courte présence d'éthanol dans le sang des souris gravides. A court terme (G18-20), CAE ont encore été réduits à environ 30% des niveaux détectés à G5. Ces résultats sont cohérents avec le développement de la tolérance métabolique rapide à l'éthanol chez les souris enceintes. figure 2C montre que la progéniture néonatale ont été exposés à BEC près de 30 mM. CAE a augmenté progressivement chez ces animaux, pour atteindre un pic à la fin de la période d'exposition de 4 heures et diminuant progressivement aux niveaux de référence de 8 heures après la fin de l'exposition paradigme de 4 heures. Par contraste avec les femelles gravides, il n'y avait pas de différence entre les CEB mesurées dans les nouveau-nés qui ont été exposés au début (P2) par rapport à la fin (P7-P12) dans la période néonatale. Ces résultats indiquent que la souris néonatale n'a pas développé la tolérance métabolique de l'éthanol.

Figure 2
Figure 2. Caractérisation des niveaux d'éthanol. A) les niveaux de la chambre de vapeur d'éthanol sont demeurés relativement constants tout au long des phases de gestation et après la naissance de la paradigmatique d'expositionm. Pour mesurer ces niveaux, l'air de la chambre a été retiré avec une seringue à travers le bouchon de caoutchouc, dilué avec de l'air ambiant, et expulsé dans l'orifice d'entrée d'un alcootest (voir la vidéo pour plus de détails). Les valeurs ont été obtenues à partir de 5 et 4 tours d'exposition différentes pour les phases de gestation et après la naissance, respectivement. B) taux d'éthanol dans le sang mesurées à différents points dans le temps pour les jours de gestation estime indiquées dans les barrages enceintes (n = 5-7 barrages). La limite d'intoxication juridique (17,4 mM ou 0,08 g / dl) est indiqué par la ligne pointillée. La barre grise indique le temps les barrages ont été exposés à l'éthanol. C) Identique à B, mais pour les souris nouveau-nés (n = 5-9 chiots de portées différentes).

La figure 3 montre que le paradigme de l'exposition n'a pas affecté significativement le gain de poids chez les mères ou les petits. Tableau 2 montre que l'exposition à l'éthanol n'a pas affecté significativement le nombre de fetu viablesession, le nombre de fœtus résorbés, le poids du fœtus, et le poids du placenta (mesurés à court terme). Tableau 2 montre aussi que le nombre de petits par portée et de la mortalité des nouveau-nés n'ont pas été significativement affectée par l'exposition à l'éthanol. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. L'absence d'un effet de l'exposition à l'éthanol sur le poids des barrages et chiot. A) un gain de poids de barrage en fonction de l'estimation jours de gestation (n = 8-12). La masse estimée à jour de gestation 5 correspond à la masse mesurée sur le premier jour d'exposition B) de la prise de poids. Pup en fonction de l'âge (n = 7-9). Pour les deux groupes, les barres d'erreur sont plus petites que les symboles. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dimensions (cm) Hauteur Largeur
Haut 32 22
Bas 32 22
Avant 32 14
Arrière 32 14
Side 1 21,5 14
Side 2 21,5 14
Porte 18 10

Tableau 1. Dimensions de feuilles de polycarbonate.

Air EtOH
7,50 ± 1,08, n = 6 7,33 ± 1,52, n = 6
Moyenne foetus Poids (g): ~ E18 1,04 ± 0,09, n = 6 0,82 ± 0,09, n = 6
Moyenne Placenta Poids (g): ~ E18 0,12 ± 0,003, n = 6 0,14 ± 0,01, n = 6
Nombre de fœtus résorbés: ~ E18 0,50 ± 0,34, n = 6 0,50 ± 0,50, n = 6
Nombre de petits / portée 7.11 ± 0.67, n = 9 6,89 ± 0,42, n = 9
Nombre de morts chiots / portée 0,11 ± 0,11, n = 9 0,66 ± 0,24, n = 9

Tableau 2. Pré-et post-natale caractérisation de souris exposition aux vapeurs de paradigme.

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Discussion

Ici, nous décrivons en détail les méthodes pour la construction de chambres d'inhalation de vapeurs. Les matériaux et les outils nécessaires pour construire les chambres sont disponibles à partir d'un certain nombre de fournisseurs commerciaux et les étapes de la construction des chambres sont relativement simples. Le système que nous décrivons ici ne contient pas les vannes de ligne de contrôle pour prévenir le refoulement et le mixage. Nous n'avons pas pu mesurer toute l'éthanol détectable dans l'air seulement chambres suggérant que nous n'avons pas de mélange ou reflux de l'éthanol dans l'air seulement chambres. L'air seulement les chambres doivent être vérifiés périodiquement vapeur d'éthanol (il convient de noter que la chambre à air doit toujours être testée avant de la chambre de l'éthanol pour éviter la détection de la vapeur d'éthanol résiduel présent dans l'alcootest et / ou une seringue). Idéalement, les chambres doivent être placés dans des salles dédiées à l'établissement de soins des animaux où les cages de souris peuvent être logés en permanence pendant toute la durée de l'exposition paradigme, ce qui élimine la nécessité de transporter les souris, ce qui réduit le stress. Une chambre standard avec une sortie de ventilation est tout ce qui est nécessaire pour ce paradigme. Cependant, si la chambre est partagée avec d'autres chercheurs, il peut être nécessaire de placer les chambres dans une chambre avec des cabines séparées pour minimiser l'exposition des autres animaux à odeur de l'éthanol. Chaque chambre peut accueillir jusqu'à 6 cages standard de la souris, ce qui en fait une méthode moins de main-d'œuvre de l'exposition que, par exemple, gavage intragastrique.

Le paradigme d'exposition peut être facilement modifiée en fonction de l'exigence d'une expérience spécifique. Les animaux peuvent être exposés à l'éthanol pendant l'équivalent de tous les trimestres de la grossesse humaine. Il convient de noter que l'équivalent de développement de rongeur au développement humain peut varier en fonction de quelle région du cerveau est considéré et ce développement un processus s'intéresse à (neurogenèse, l'intégration synaptique, etc.) Dans cette étude, nous avons défini le troisième triMester équivalent que la période de poussée de croissance du cerveau. Les chercheurs sont invités à consulter le site Web de temps 49 traduire. D'après les résultats représentés sur la figure 2B, il est recommandé que l'exposition a commencé à être à un niveau inférieur de la vapeur d'éthanol (par exemple, ~ 3 g / dl) et augmente progressivement pour compenser l'apparition d'une tolérance métabolique. Au cours de la mise en œuvre de la procédure, les enquêteurs devraient suivre de près BEC à différents jours de gestation afin de déterminer si cela se traduit par des niveaux plus stables dans les femelles gravides. Un inhibiteur de l'alcool déshydrogénase a été utilisé pour empêcher le développement d'une tolérance chez des souris exposées à l'éthanol dans des chambres de vapeur 50. Cependant, il n'est pas recommandé que cet agent est utilisé chez les souris enceintes, car des études suggèrent qu'il a des effets potentiellement tératogènes qui pourraient compliquer l'interprétation des résultats 51,52. En outre, des injections de toute forme seront une source de stress supplémentaire pour le barrage enceinte,potentiellement confondant l'expérience 53.

Contrairement aux barrages enceintes, l'exposition de la chambre de vapeur au cours de la période néonatale n'a pas abouti à la mise au point de la tolérance métabolique. CAE n'étaient pas différents entre P2 et P7-12 souris. BEC pointe étaient similaires à ceux détectés dans les barrages de G13-14 et légèrement plus élevé que ceux détectés au G18-20. Toutefois, CAE a pris plus de temps pour revenir à la ligne de base chez les petits. Il reste à déterminer si l'exposition à l'éthanol dans des chambres à vapeur au cours de la période de gestation altère la capacité des enfants nouveau-nés à métaboliser l'éthanol. Cependant, sur la base de la littérature, on peut s'attendre à des chiots qui ont été exposés pendant la gestation à l'éthanol à présenter une légère diminution de la capacité ou inchangé à métaboliser l'éthanol 54,55. Dans nos études, nous n'avons pas observé de différence de poids des petits moyenne, et nos données montrent que la fin de la gestation, les CAE maternelle s'élèvent à peine au-dessus du intoxication juridique sans more à 2 h. Ces données suggèrent que les mères ne sont pas affectés de façon significative de l'exposition à l'alcool pendant la période post-natale. Néanmoins, cela devrait être approfondie, surtout si les animaux sont exposés à des niveaux plus élevés d'éthanol.

Ce paradigme de l'exposition a des limites. Des souris femelles n'ont pas été exposés au cours des cinq premiers jours de la grossesse, car ils sont élevés avec les hommes au cours de cette période. Un intervalle plus court de reproduction peut être tentée (par exemple, 2-3 jours), mais cela peut entraîner une réduction du nombre de femmes qui tombent enceintes. Alternativement, les animaux peuvent être élevés pour un temps plus court et femelles vérifié pour les prises de copulation. Une autre limitation est que toutes les souris dans une chambre donnée ne peuvent être exposés à une seule concentration de vapeur d'éthanol. En outre, certains aspects de la vapeur d'éthanol exposition de la chambre sont paradigme de stress, tels que le fait que les barrages sont logés individuellement tout au long de la majorité de la gestation et sont exposésà l'odeur de l'éthanol solide. Il est également possible que l'exposition à la vapeur d'éthanol provoque des altérations dans le système respiratoire des barrages et / ou petits. En outre, l'exposition à des rats nouveau-nés n'est pas un modèle parfait de l'exposition humaine au cours du troisième trimestre (par exemple, l'unité de placenta et le fœtus n'est pas présent dans ce modèle). Néanmoins, nous soutenons que les avantages de ce paradigme emportent sur ses faiblesses, et qu'il peut être un modèle utile pour caractériser les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de l'ETCAF.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Pris en charge par les Instituts nationaux de la santé accorde R01-AA015614, R01-AA014973, T32-AA014127 et K12-GM088021. Les auteurs remercient Samantha L. Blomquist pour l'assistance technique et les Drs. Kevin Caldwell et Donald Partridge pour évaluer critique du manuscrit et de la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" McMaster-Carr 8574K23 10
Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h McMaster-Carr 93085K67 10 ft
Weld-on #16 McMaster-Carr 7515A11 3
Piano hinge 12" long McMaster-Carr 1658A11 2 x 1 ft
Hold-down toggle clamps standard McMaster-Carr 5126A26 8
PEX tubing 1/2" McMaster-Carr 51275K88 10 ft
Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K608 1
Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5462K79 1
Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K596 1
3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe McMaster-Carr 5463K851 1
Phillips Machine screw 4-40 McMaster-Carr 91772A112 1
Machine screw hex nut 4-40 McMaster-Carr 90480A005 1
Panel-mount flowmeter 2-20 McMaster-Carr 41945K76 3
FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK VWR 89001-800 2
Precision Seal Septa VWR 89084-490 1
VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole VWR 59581-367 1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' VWR 89068-556 1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' VWR 89068-502 1
Aerator Stone P2120 VWR 32573-007 1
3/8" T-connectors Pk of 20 VWR 46600-060 1
VWR Disconnectors tapered Pk of 10 VWR 46600-110 1
3/8 Hose Barb valved in-line coupling Colder Products Company HFCD17612 1
Air pump medium capacity LMI Manufacturers DB60L 1
Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H Global industrial T9A990135 1
Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel Global industrial T9A500591 1

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Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. A., Valenzuela, C. F. Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development. J. Vis. Exp. (89), e51839, doi:10.3791/51839 (2014).

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