Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Konstruktion av Vapor Chambers används för att exponera Möss till alkohol under motsvarande för alla tre trimestern av mänsklig utveckling

Published: July 13, 2014 doi: 10.3791/51839
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurosciences, School of Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Vi visar byggandet av alkoholångor kammare som använder lättillgängliga material som samtidigt inrymmer 6 mus burar. Vi beskriver vidare användning i en musmodell av fetalt alkoholexponering motsvarar alla 3 trimestern av graviditet. Detta paradigm utsätter djur under dräktigheten och postnatal dagar 1-12.

Abstract

Utsätts för alkohol under utveckling kan leda till en konstellation av morfologiska och beteendeavvikelser som kollektivt kallas Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Vid den allvarligaste änden av skalan är fetalt alkoholsyndrom (FAS), som kännetecknas av tillväxthämning, kraniofaciala dysmorfologi och neurobehavioral underskott. Studier med djurmodeller, omfattande gnagare, har klar många molekylära och cellulära mekanismer som är inblandade i patofysiologin för FASDs. Etanol administration till dräktiga gnagare har använts för att modellera mänsklig exponering under den första och andra trimestern av graviditeten. Tredje trimestern etanolförbrukning hos människor har modellerats med hjälp av neonatala gnagare. Emellertid har få studier på gnagare som kännetecknas effekten av etanolexponering under den motsvarar alla tre trimestern av graviditet, ett mönster av exponering som är vanligt hos gravida kvinnor. Här visar vi hur man bygger ånga kammare från lätt obtainable material som var och en kan rymma upp till sex standard mus burar. Vi beskriver en ångkammaren paradigm som kan användas för att modellera exponering för etanol, med minimal hantering, under alla tre trimestern. Våra studier visar att gravida dammar utvecklat betydande metabolisk tolerans mot etanol. Däremot gjorde neonatal möss inte utveckla metabolisk tolerans och antal foster, fostrets vikt, placenta vikt, antal valpar / kull, antalet döda valpar / kull, och ungarna vikt påverkades inte signifikant av etanolexponering. En viktig fördel med denna paradigm är dess tillämplighet på studier med genetiskt modifierade möss. Dessutom minimerar denna paradigm hantering av djur, en stor förväxla i fetalt alkoholforskning.

Introduction

Att dricka under graviditeten kan skada fostret, vilket orsakar ihållande förändringar i många organ och system som väsentligt minskar livskvaliteten för de drabbade individerna och deras familjer. Det uppskattas att cirka 10-30% av kvinnorna dricker under graviditeten i USA, med 1-8% dricka i en binge mönster 1,2. Utbudet av effekter som etanol exponering under fosterutvecklingen är kollektivt kallas fetalt alkoholspektrumstörningar (FASDs). Nya beräkningar visar att FASDs är ett stort folkhälsoproblem med en prevalens så hög som 2-5% i USA 3. Den mer allvarliga manifestation av FASDs är fetalt alkoholsyndrom (FAS), som kännetecknas av tillväxthämning, kraniofaciala missbildningar, och neurobehavioral underskott, inklusive inlärningssvårigheter. Förekomsten av FAS har uppskattats till 0,2-0,7% i USA 3. De för närvarande tillgängliga behandlingar för FASDs är bara delvis effektivaoch utveckling av mer effektiva behandlingar är begränsat av bristande förståelse av de cellulära och molekylära grunderna för detta komplexa spektrum av störningar.

Data från de nationella fosterskador Prevention Study (NBDPS) visar att gravida kvinnor dricker oftast under 1: a trimestern, innan graviditeten har upptäckts, följt av avhållsamhet under senare stadier av dräktigheten 2. Den NBDPS fann också att den näst vanligaste mönster av etanolförbrukning under dräktigheten innebär att dricka i alla trimester 2. Orsakerna till detta är bland annat bristande medvetenhet om de potentiellt skadliga effekterna av fosteretanolexponering (även vid låga doser), begränsad tillgång till mödravård, positiv historia för neuropsykiatriska störningar, och missbruk av eller beroende av etanol 4. Intressant, NBDPS rapporterade att den tredje vanligaste konsumtionsmönster inblandade avhållsamhet under 1 2: a trimestern följt av förbrukningen under den 3: e trimestern, då det antas ofta att dricka är säker eftersom organogenesen har mestadels klar. Dock är det 3: e trimestern en period med hög känslighet för etanol-inducerad nervsystemet eftersom detta är en period när neuronala kretsar genomgår djupgående förfining 2. Den NBDPS identifierade också andra, mindre frekventa mönster av alkoholkonsumtion som inträffar under graviditeten, inklusive förbrukningen i hela 1: a och 2: a trimestern följt av avhållsamhet under 3: e trimestern 2.

I ett försök att modellera de olika mönster av etanolkonsumtion observerats hos gravida kvinnor, har ett antal utvecklings etanol exponering paradigm fastställts med hjälp av olika djurarter, med råttor och möss vara vanligast 5,6. Varaktigheten av graviditeten i dessa djur vanligtvis lasts ca 3 veckor, vilket motsvarar den 1: a och 2: a trimestern av graviditet. Många studier på gnagare har utvärderat effekten av olika doser och mönster för etanolexponering under denna period. Exempel på metoder som ofta används för att administrera etanol till dräktiga möss och råttor innefattar administration via flytande kost 7,8, tillsats av etanol till dricksvatten 9,10, frivilligt drickande av sackarin-sötade lösningar 11, gastrisk sond 12, ånga inandning 13 och subkutan eller intraperitoneal injektion 14. Resultaten av dessa studier har sammanfattat flera av de brister som observerats hos människor med FASDs, visar att exponering under tidiga stadier av graviditeten är tillräckligt för att skada neuronala kretsar i hela hjärnan (granskas 6,15).

Experiment med gnagare har också visat att exponering under motsvarigheten till den 3: e 16-18, intragastrisk intubation 19, subkutan injektion 20, och ånga inandning 21,22. Dessa studier har på ett övertygande sätt visat att hjärnans tillväxt spurt är en period med hög sårbarhet för utvecklingseffekterna av etanol 6.

Som nämnts ovan, att dricka under alla trimestern av graviditeten är ett gemensamt mönster av etanolkonsumtionen hos kvinnor 2. Emellertid har jämförelsevis få studier utvärderat effekterna av detta mönster av exponeringen med djurmodeller. En del av dessa studier har tagit advantage av stora djur där 3: e trimestern-motsvarighet sker i livmodern istället för nyföddhetsperioden som i fallet med råttor och möss. Dessa djurmodeller inkluderar icke-mänskliga primater 23,24 och får 25-27. Dessa djurmodeller har inte använts i stor utsträckning FASDs forskning, delvis, på grund av höga kostnader och behovet av specialiserade vårdinrättningar. Gnagare har oftare används för att karakterisera effekten av all-trimestern etanolexponering på fostrets utveckling 5. Marsvin har varit särskilt fördelaktigt i detta avseende med tanke på deras omfattande prenatal utveckling och likheter i hjärnans mognad till det av människan 28,29. Med marsvin, har det varit möjligt att karakterisera effekten av etanol exponering in utero som inkluderar den period som motsvarar utvecklingen av människan 3: e trimestern. Den jämförelsevis höga kostnaderna för dessa djur, samt den relativt långa varaktigheten av graviditeten(~ 67 dagar), har begränsat användningen till några laboratorier som arbetar på FASDs forskning.

På grund av deras kostnadseffektivitet och bred användning inom biomedicinsk forskning, har utredare använt råttor att modellera exponering för etanol under alla trimestern av graviditeten. I initiala studier exponerades råttor under graviditeten via flytande kost följt av administration av etanol via gastrostomi att artificiellt uppfödda nyfödda (postnatal dagar (P) 1-10) resulterar i maximal blodetanolnivåer (BEC) i dammarna av 0,08 g / dl och i valparna 0,16 g / dl. Detta paradigm orsakade långvariga förändringar i synnerven myelination och minskat antalet Bergmann glia fibrer i lillhjärnan 30-32. Likaså Maier och medarbetare med hjälp av artificiella uppfödningsförhållanden administreras etanol till gravida rått dammar i en binge liknande sätt via intragastrisk intubation följt av neonatal administration under en del av 3: e trimestern motsvarande (P4-9) 33,34. PEAK maternal och pup BEC var 0,3 g / dl hos både graviditets dag 20 och P6. Denna allt-trimestern exponering paradigm lett tillväxthämning som var betydligt större än den som observerats hos valpar som exponerats under utvalda perioder av dräktigheten 33. Dessutom råttor som exponerats för etanol under motsvarande alla trimestern uppvisade en minskning av antalet cerebellar Purkinje och granulat celler som var större än den som observerats hos djur som exponerats under andra perioder 34. Minskningar i hippocampus cellantal rapporterades också med detta paradigm, men dessa effekter verkar i första hand vara en följd av exponering under 3: e trimestern-ekvivalenter 35. Ett förfarande som innebär att etanol administrering via intragastrisk sondmatning till både gravida råttor och neonatala möss har också använts för att modellera alla trime exponering 36. Denna metod, som gav BEC av 0,13 g / dl hos mödrarna (graviditets dag 17) och 0,24 g / dl i P6 valpar, framkallad long variga förändringar i monoaminsignalsubstans nivåer i hippocampus och hypothalamus, och ökad expression av DNA-metyltransferaser och metyl-CpG-bindande protein 2 i hippocampus 37,38. Med hjälp av en liknande exponering paradigm (BEC = 0,14 till 0,2 g / dl i dammar och 0,2 g / dl hos valpar), Gil-Mohapel et al. 39 upptäcktes en ökning av antalet nya omogna nervceller i gyrus dentatus av vuxna råttor som kan utgöra en kompensationsmekanism för att etanol-inducerad neuronal skada eller en förändrad mognaden av vuxna födda nervceller. Utredarna har också försökt att modellera alla trimestern etanolexponering genom att exponera dammar via flytande kost eller dricksvatten under både graviditet och amning 9,40. Däremot är nyttan av att utsätta valparna via modersmjölken begränsad eftersom det resulterar normalt i låga pup BEC (t.ex. 0,002 till 0,05 g / dl, 41,42).

Möss har också använts Extenstivt att karakterisera effekterna av utvecklingsetanolexponering. Denna djurmodell delar många av de styrkor som beskrivits ovan för råttdjurmodell, med den ytterligare fördelen att många genetiskt modifierade musstammar är tillgängliga 5. Möss har med framgång använts för att karakterisera effekterna av etanol under 1: a, 2: a eller 3: e trimestern av graviditeten 43,44. Men effekten av alla trimestern exponering på dessa djur har inte väl karakteriserade eftersom det är tekniskt svårare att utsätta möss under den motsvarar alla trimestern av graviditet. Exempelvis artificiell uppfödning och gastrisk gavage, som har använts med framgång i råttor kräver mer specialiserade förfaranden i möss 45. Så vitt vi vet har endast en studie hittills försökt att studera effekten av alla trimestern etanolexponering med hjälp av möss; dessa djur exponerades för etanol-lösning i dricksvatten During graviditet och amning 46. Maternal BEC var 0,07 g / dl och pup BEC var inte bestämd, men förväntas vara en bråkdel av de i dammar.

Här beskriver vi en ny modell för alla trimestern etanol exponering av möss där alkohol administreras till både gravida dammar och nyfödda via ånga inandning kammare. Vapor kammare byggdes utifrån en tidigare utformning 47. Vi ger detaljerade instruktioner om hur man bygger inandning kamrarna och utföra de moment exponering. Vi ger också information om de BEC som kan uppnås och effekterna av exponering för överlevnad och tillväxt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samtliga Djur förfaranden godkändes av University of New Mexico-Health Sciences Center Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Vapor kammarenheten

  1. Skär polykarbonatskivor med en cirkelsåg eller sticksåg med de mått som anges i videon för toppen, botten, front, baksida, sidor och dörr (figur 1 och tabell 1).
  2. Med en cirkelsåg eller sticksåg, klippa en öppning 8 inches hög med 16 inches bred i mitten av frontpanelen.
  3. Mät och markera hålen för pianogångjärnet på 18 tum med 10 tums polykarbonatskiva som kommer att bli dörren till kammaren.
  4. I dörren, borra disk diskbänk hål med en 5/16 tums borr, och med en 3/16 tum borr, borra hål för skruvarna. Se till att borra motverka sjunka hål på insidan av dörren för skruvskallarna.
  5. Förbered polykarbonatskivor för svetsning.
  6. Montera front, rygg och sidopaneler på bottenpanelen med Svets # 16.
  7. Täta eventuella mellanrum mellan panelerna med Svets # 16.
  8. Fäst den övre panelen med Svets # 16.
  9. Använd bar klämmor eller tunga läroböcker för att hålla allt på plats medan svetsarna bota.
  10. Fäst en 1 tum med en 12 tums bit av polykarbonat på framsidan 1 tum under öppningen för fastsättning av gångjärnet.
  11. Lämna minst 24 timmar för Svets att bota.
  12. Klipp 2 st PEX-rör 12 inches lång och 1 bit 1 tum lång PEX-rör.
  13. Med en 5/16 borr, borra ett hål i var och en av de 12 tum PEX slang cirka 1 till 2 inches från ena änden.
  14. Fäst 2 x 12 tum PEX slang till en 3/8 tum T-koppling med hålen ligger bort från kontakten.
  15. Förslut öppna ändarna av PEX-rör med 3/8 tum pluggar.
  16. Fäst piano gångjärn till frontpanelen och dörren med hjälp av 4-40 skruvar och muttrar.
  17. Använda dörren som en guide, mArk hål som behövs för pianogångjärnet på en tum spacer på frontpanelen av kammaren.
  18. Med en 3/16 tum borr, borra hålen i frontpanelen för piano gångjärn.
  19. Fäst dörren och piano gångjärn till frontpanelen med 4-40 skruvar och muttrar.
  20. Sätt ihop klämmorna toggle som visas i videon med en bricka och mutter på vardera sidan av sidoarmen.
  21. Markera och borra 3/16 tum hål för växla klämmor på frontpanelen och fäst växla klämmor med 4-40 maskinskruvar och muttrar.
  22. Tillsätt 3/8 tum gummi glödlampa tätningar på insidan av dörren.
  23. Med en 5/8 tum tråkig borr, borra ett hål i mitten av den övre panelen för inloppsporten.
  24. Borra ett 1/2 tums hål i botten / mitten av den bakre panelen för utgångsporten.
  25. Montera utgångsporten genom att skjuta den gängade delen av 3/8 tum genom väggen adaptrar genom den bakre väggen av ångkammaren i utgångsporten hålet. Fäst muttern fråninsidan av kammaren för att hålla på plats.
  26. Ta bort skyddshöljet från polykarbonatskivor.
  27. Fäst en tums bit PEX slangen till T-anslutningen och tvinga PEX-rör genom hålet i den övre delen av kammaren från insidan.
  28. Fäst en 3/8 tum 90 armbåge till toppen av den 1 tum PEX-rör från utsidan.
    OBS: Borra ett 1/2 tums hål i dörren och sätt in en 1/2 tums tätning septa i hålet.
  29. Upprepa steg 1-22 för luft bara kontrollera kammare.

2. Rack och Air Delivery Assembly

  1. Om placerar kamrarna på vagnen / rack som nämns i materialet listan, montera vagnen enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Med extra skruvar och muttrar, bifoga en skrot bit av polykarbonat till racket för att hålla luftflödesregulatorer.
  3. Var som helst på skrot bit polykarbonat, markera och borra 3/4 tums hål för luftflödesregulatorer och bifoga regulatorer med muttrarnatillhandahålls.
  4. Fäst 3/8 tum genom-väggadapter till in-och utloppsportar för luftflödesregulatorer.
  5. Montera etanol kolven med luftningssten, # 8 propp och snabbkoppling in-line-kontakter.
  6. Med användning av 3/8 tum Tygonrör ansluter flödesregulatorer för att luftpumpen och etanol kolv såsom visas i fig. 1.
  7. För den enda luftkammaren, fäster utgångsporten av luftflödesregulator till inloppet 3/8 tum 90 armbåge med 3/8 tum Tygonrör såsom visas i fig. 1.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av konfigurationen av ångformiga kamrarna. En T-anslutning som är ansluten till den låga brusluftpumpen. Ena sidan av den T-anslutning är direkt ansluten till en luftflödesregulator för luften endast ångkammaren. De övriga äride delas igen och fäst två olika luftflödesregulatorer, en för luft och en för etanol. Luftkammaren är direkt ansluten till regulatorn som visas. För etanolånga kammaren, är en luftflödesregulator ansluten till luftaren stenen nedsänkt i flytande etanol i filterkolven. Den sidoarm port filterkolv är förbunden med utgången från luftregulatorn såsom anges. Den sammanslagna etanolånga och luft är sedan ansluten till inloppet av den etanolånga kammaren. De utloppsrören (ej visade) är anslutna till ett ventilationsutlopp i rummet.

3. Test Vapor Chambers och Justera Etanol nivåer

  1. Addera 600 ml 190 proof etanol till filter kolv, sätt i luftnings sten, och koppla upp till inloppsröret till sidoarmen hos kolven.
  2. Stäng kammardörrar och slå på luftpump.
  3. Justera luftflödesregulatorer, så att ungefär hälften så mycket luft strömmar genom den flytande alkohol som luften det blandas med. Adjust luften bara luftflöde till det kombinerade flödet av alkohol och luft av etanolkammaren.
  4. Tillåt kamrarna i jämvikt under åtminstone 30 min före mätning av luftetanolkoncentration.
  5. Mät luftetanolkoncentrationen genom att extrahera 5 ml luft med en 18G nål och en 60 ml spruta genom skiljeväggen. Späd det provet med rumsluften genom att dra tillbaka kolven till 60 ml (1:12 spädning). Mät luftetanolnivå med hjälp av en alkoholmätare i enlighet med tillverkarens anvisningar. Behövs Utspädningen av kammarluften för att uppnå alkoholångor nivåer inom detektionsområdet i alkoholmätare.
    OBS: Om med användning av olika nivåer av alkohol exponering utspädnings kan behöva justeras.
  6. Som utgångspunkt, justera luftflödesregulatorer som behövs för att uppnå en luft alkoholkoncentration på cirka 4.5-5 g / dl (g förångas alkohol per dl av luft).

4. Husdjursförädling

  1. Grupp hus honor C578BL / 6 möss (2-3 månader gamla) i minst 1 vecka för att synkronisera äggstock cykler.
  2. Individuellt hus manliga C57BL / 6 möss (2-5 månader gamla) i minst 2 veckor.
  3. Efter synkronisering, sätta en enda kvinna in med en enda hane i 5 dagar för att möjliggöra för parning.
  4. Efter parning, ta bort hanar och individuellt hus honor och placera dem i kamrarna.

5. Pre-och Post-natal Etanol Vapor Exponering

  1. Exponera gravida dammar till etanolånga i 4 timmar per dag med start klockan 10 under ljuscykel (ljus på från 06:00 till 18:00), utom den dagen de föddes för att hindra valpen död.
  2. Väg dammar på graviditets dag (G) 5, G13-G14, och G18-G20 att övervaka graviditet; strö ändrades på dagar som honor vägdes för att minimera hanteringen.
  3. Varje dag ersätta mat för etanol utsatta grupper för att undvika konsumtion av pellets med en etanol absorberas i dem.
  4. På dagen förfödelse inte utsätta djur. Efter födseln exponera dammar och valpar för 4 timmar per dag med start klockan 10 från P1-P12.
  5. Väg valpar på P2, P8, P12 och P25; och byta sängkläder på P8 och P12 för att minimera ytterligare hantering.
  6. Omedelbart efter den sista exponeringen (P12), överför burarna till en standard djurstallar rum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2A visar att både dräktiga möss och neonatal avkomma utsattes för relativt stabila etanolångor som kamrarna. Dessa varierade mellan 4-6 g / dl. Figur 2B visar BEC uppnåtts i de dräktiga möss som en funktion av tiden. BEC mättes med användning av en standard alkoholdehydrogenas baserad analys 48. Vid G5, BEC steg snabbt till ~ 60 mM 2 timmar efter starten av exponering och nådde en topp i slutet av 4 tim exponeringsperioden. BEC minskade gradvis till ~ 12 mM efter ytterligare 4 timmar efter det att exponeringen. Vid G13-14, var det en dramatisk minskning av BEC till cirka 60% av den nivå som upptäckts på G5. Dessutom BEC nivåer steg långsammare och minskade snabbare, vilket resulterar i en kortare närvaro av etanol i blodet hos gravida möss. På kort sikt (G18-20), var BEC ytterligare till cirka 30% av den nivå som upptäckts på G5. Dessa resultat överensstämmer med den development av snabb metabolisk tolerans mot etanol i de dräktiga möss. Figur 2C visar att nyfödda avkomma utsattes för BEC nära 30 mM. BEC successivt ökat i dessa djur, med en topp i slutet av den 4 hr exponeringsperioden och gradvis minskande till basnivåer 8 timmar efter utgången av den 4 tim exponerings paradigm. I motsats till de gravida dammar, det fanns ingen skillnad mellan BEC uppmätta hos nyfödda som exponerats tidigt (P2) vs sent (P7-P12) i den neonatala perioden. Dessa fynd tyder på att den neonatala möss inte utveckla metabolisk tolerans mot etanol.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av etanolnivåer. A) Etanol ångkammaren nivåer förblev relativt konstanta under hela graviditets och postnatala faser av exponering paradigm.. För att mäta dessa nivåer, var kammarluft dras med en spruta genom gummiväggen, späds med luften, och utvisades till inloppet av en alkoholmätare (se video för detaljer). Värden erhölls från 5 och 4 olika exponerings rundor för graviditetsdiabetes och postnatal faser resp. B) Blodetanolnivåer som mäts vid olika tidpunkter för de angivna beräknade graviditets dagar i gravida dammar (n = 5-7 dammar). Den lagliga berusning gränsen (17,4 mM eller 0,08 g / dl) indikeras av den streckade linjen. Det grå fältet visar tiden dammarna exponerades för etanol. C) Samma som i B, men för neonatala möss (n = 5-9 valpar från olika kullar).

Figur 3 visar att exponeringen paradigm inte signifikant påverkade viktökning hos mödrarna eller valparna. Tabell 2 visar att etanol exponering inte signifikant påverka antalet livskraftiga Fetuses, antal resorberas foster, fostrets vikt och placenta vikt (mätt på kort sikt). Tabell 2 visar också att antalet valpar per kull och mortalitet bland ungarna inte signifikant påverkades av etanolexponering. klicka gärna här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3. Avsaknad av en effekt av etanolexponering på dammen och födelsevikt. A) Dam viktökning som en funktion av den uppskattade dräktighetsdagen (n = 8-12). Vikten på beräknade graviditets dag 5 motsvarar vikten mätt på den första dagen av exponeringen. B) Pup viktökning som en funktion av ålder (n = 7-9). För båda panelerna, felstaplarna är mindre än de symboler. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51839/51839fig3highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mått (inches) Höjd Bredd
Topp 32 22
Botten 32 22
Främre 32 14
Tillbaka 32 14
Side 1 21,5 14
Sida 2 21,5 14
Dörr 18 10

Tabell 1. Mått för polykarbonatskivor.

Luft EtOH
7,50 ± 1,08, n = 6 7,33 ± 1,52, n = 6
Genomsnitt Fetus Vikt (g): ~ E18 1,04 ± 0,09, n = 6 0,82 ± 0,09, n = 6
Genomsnitt Placenta Vikt (g): ~ E18 0,12 ± 0,003, n = 6 0,14 ± 0,01, n = 6
Antalet Åter absorberas Foster: ~ E18 0,50 ± 0,34, n = 6 0,50 ± 0,50, n = 6
Antal valpar / kull 7,11 ± 0,67, n = 9 6,89 ± 0,42, n = 9
Antal döda valpar / kull 0,11 ± 0,11, n = 9 0,66 ± 0,24, n = 9

Tabell 2. Pre-och postnatal karakterisering av mus ånga exponering paradigm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi i detalj de metoder för konstruktion av ånga inandning kammare. De material och verktyg som krävs för att bygga kamrarna är lätt tillgängliga från ett antal kommersiella leverantörer och stegen för konstruktion av kamrarna är relativt enkelt. Det system som vi beskriver här innehåller inga ventiler i online-kontroll för att förhindra tillbakaflöde och blandning. Vi kunde inte mäta någon påvisbar etanol i luften bara kamrar som tyder på att vi inte har någon blandning eller återflöde av etanol i luften bara kamrarna. Luften bara kammare bör kontrolleras för etanolånga regelbundet (det bör noteras att luftkammaren alltid bör testas före etanolkammaren för att undvika upptäckt av kvarvarande etanolånga i alkoholmätare och / eller spruta). Helst ska kamrarna placeras i särskilda rum på djurvård anläggning där mus burar kan kontinuerligt hållas under hela eXposure paradigm, vilket eliminerar behovet att transportera de möss, och därigenom minska stress. En standard rum med en ventilationsutloppet är allt som behövs för detta paradigm. Men om rummet delas med andra utredare, kan det vara nödvändigt att placera kamrarna i ett rum med separata bås för att minimera exponeringen av andra djur till etanol lukt. Varje kammare kan rymma upp till 6 standard mus burar, vilket gör det till en mindre arbetskrävande metod för exponering än, till exempel, intragastrisk sondmatning.

Exponerings paradigmet kan lätt modifieras i enlighet med kravet på ett specifikt experiment. Djur kan utsättas för etanol under den motsvarar alla trimestern av graviditet. Det bör noteras att gnagare utvecklings motsvarande mänsklig utveckling kan variera beroende på vilken hjärnregion bedöms och vilken utvecklingsprocess man är intresserad av (neurogenes, synaptisk integration, etc). I denna studie definierades den tredje trimester-ekvivalenter som hjärnan tillväxt spurt period. Forskare uppmuntras att besöka webbplatsen översätta tiden 49. Baserat på de resultat som visas i figur 2B, rekommenderar vi att exponering startas vid en lägre nivå av etanolånga (t.ex. ~ 3 g / dl) och gradvis ökas för att kompensera för utvecklingen av metabol tolerans. Under genomförandet av förfarandet, bör utredarna noga övervaka BEC vid olika graviditets dagar för att avgöra om detta leder till mer stabila nivåer i de gravida dammar. En hämmare av alkoholdehydrogenas har använts för att förhindra utvecklingen av tolerans hos möss som exponerats för etanol i ånga kammare 50. Det är dock inte rekommenderat att detta medel användas i gravida möss, eftersom studier tyder på att det har potentiellt teratogena effekter som skulle kunna försvåra tolkningen av resultaten 51,52. Dessutom kommer injektioner av någon form orsaka ytterligare stress till den gravida dammen,potentiellt confounding experiment 53.

I motsats till gravida dammar, gjorde ånga kammarexponering under nyföddhetsperioden inte leda utvecklingen av metabola tolerans. BEC skilde sig inte åt mellan P2 och P7-12 möss. Peak BEC var liknande de som upptäckts i dammarna vid G13-14 och något högre än de som upptäcks vid G18-20. Men BEC tog längre tid att återgå till utgångsvärdet i valparna. Det återstår att avgöra om etanolexponering i ånga kammare under graviditetsperioden förändrar förmåga neonatal avkomma att metabolisera etanol. Men baserat på litteraturen, det kan förväntas för valpar som exponerats under dräktigheten till etanol för att uppvisa en något minskad eller oförändrad kapacitet att metabolisera etanol 54,55. I våra studier har vi inte observera en skillnad i genomsnittlig valp vikt, och våra data visar att i slutet av dräktigheten, moderns BEC stiger knappt över den juridiska berusning utan more än 2 timmar. Dessa data antyder att mödrarna inte signifikant påverkas av alkohol exponering under postnatala perioden. Trots det bör det undersökas ytterligare, särskilt om djuren utsätts för högre etanol.

Denna exponering paradigm har vissa begränsningar. Honmöss inte exponeras under de första fem dagarna av graviditeten eftersom de är uppvuxna med hanarna under denna period. En kortare avel intervall kan försök (t ex 2-3 dagar), men det kan leda till en minskning av antalet kvinnor som blir gravida. Alternativt kan djuren föds upp under en kortare tid och honor kontrolleras för kopulation pluggar. En annan begränsning är att alla möss i en given kammare endast kan utsättas för en enda koncentration av etanolånga. Dessutom har vissa aspekter av etanolånga kammarexponering paradigm är stressande, som det faktum att dammarna är ensamma inrymt under större delen av dräktigheten och utsättstill starka etanollukt. Det är också möjligt att etanolånga exponering orsakar vissa förändringar i andningssystemet hos dammar och / eller avkomman. Dessutom är exponeringen för neonatala råttor inte en perfekt modell av mänsklig exponering under tredje trimestern (till exempel, finns inte i denna modell av placenta och foster enhet). Trots detta menar vi att fördelarna med detta paradigm uppväger dess svagheter, och att det kan vara en användbar modell för att karakterisera de mekanismer som är inblandade i patofysiologin för FASDs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Med stöd av National Institutes of Health bidrag R01-AA015614, R01-AA014973, T32-AA014127 och K12-GM088021. Författarna tackar Samantha L. Blomquist för tekniskt bistånd och Dr. Kevin Caldwell och Donald Partridge för kritiskt utvärdera manuskriptet och video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycarbonate 1/4" clear 48" x 24" McMaster-Carr 8574K23 10
Foam Rubber bulb seal 3/8"w x 7/32"h McMaster-Carr 93085K67 10 ft
Weld-on #16 McMaster-Carr 7515A11 3
Piano hinge 12" long McMaster-Carr 1658A11 2 x 1 ft
Hold-down toggle clamps standard McMaster-Carr 5126A26 8
PEX tubing 1/2" McMaster-Carr 51275K88 10 ft
Barbed Tee tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K608 1
Barbed plug fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5462K79 1
Barbed Elbow tube fitting (Black) Pkg 10 McMaster-Carr 5463K596 1
3/8" Through-Wall Adapters, Tube to Threaded Pipe McMaster-Carr 5463K851 1
Phillips Machine screw 4-40 McMaster-Carr 91772A112 1
Machine screw hex nut 4-40 McMaster-Carr 90480A005 1
Panel-mount flowmeter 2-20 McMaster-Carr 41945K76 3
FLASK, FILTER 1,000 ml 6/PACK VWR 89001-800 2
Precision Seal Septa VWR 89084-490 1
VWR Black Rubber Stopper #8 1-hole VWR 59581-367 1
TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50' VWR 89068-556 1
TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50' VWR 89068-502 1
Aerator Stone P2120 VWR 32573-007 1
3/8" T-connectors Pk of 20 VWR 46600-060 1
VWR Disconnectors tapered Pk of 10 VWR 46600-110 1
3/8 Hose Barb valved in-line coupling Colder Products Company HFCD17612 1
Air pump medium capacity LMI Manufacturers DB60L 1
Nexelate Wire Shelving 36"W X 24"D X 63"H Global industrial T9A990135 1
Stem Casters Set of (4) 5" Polyurethane Wheel Global industrial T9A500591 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). World Health Organization Who. Alcohol use and binge drinking among women of childbearing age--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 61 (28), 534-538 (2012).
  2. Ethen, M. K., et al. Alcohol consumption by women before and during pregnancy. Matern Child Health J. 13, 274-285 (2009).
  3. May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15, 176-192 (2009).
  4. Wendell, A. D. Overview and epidemiology of substance abuse in pregnancy. Clin Obstet Gynecol. 56, 91-96 (2013).
  5. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Exp Biol Med (Maywood. 230, 389-393 (2005).
  6. Valenzuela, C. F., Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. Does moderate drinking harm the fetal brain? Insights from animal models). Trends Neurosci. 35, 284-292 (2012).
  7. Sliwowska, J. H., Song, H. J., Bodnar, T., Weinberg, J. Prenatal Alcohol Exposure Results in Long-Term Serotonin Neuron Deficits in Female Rats: Modulatory Role of Ovarian Steroids. Alcohol Clin. Exp. Res. 10, (2013).
  8. Sutherland, R. J., McDonald, R. J., Savage, D. D. Prenatal exposure to moderate levels of ethanol can have long-lasting effects on hippocampal synaptic plasticity in adult offspring. Hippocampus. 7, 232-238 (1997).
  9. Naassila, M., Daoust, M. Effect of prenatal and postnatal ethanol exposure on the developmental profile of mRNAs encoding NMDA receptor subunits in rat hippocampus. J Neurochem. 80, 850-860 (2002).
  10. Servais, L., et al. Purkinje cell dysfunction and alteration of long-term synaptic plasticity in fetal alcohol syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9858-9863 (2007).
  11. Brady, M. L., Allan, A. M., Caldwell, K. K. A limited access mouse model of prenatal alcohol exposure that produces long-lasting deficits in hippocampal-dependent learning and memory. Alcohol Clin Exp Res. 36, 457-466 (2012).
  12. Bake, S., Tingling, J. D., Miranda, R. C. Ethanol exposure during pregnancy persistently attenuates cranially directed blood flow in the developing fetus: evidence from ultrasound imaging in a murine second trimester equivalent model. Alcohol Clin Exp Res. 36, 748-758 (2012).
  13. Cuzon, V. C., Yeh, P. W., Yanagawa, Y., Obata, K., Yeh, H. H. Ethanol consumption during early pregnancy alters the disposition of tangentially migrating GABAergic interneurons in the fetal cortex. J Neurosci. 28, 1854-1864 (2008).
  14. Godin, E. A., et al. Magnetic resonance microscopy defines ethanol-induced brain abnormalities in prenatal mice: effects of acute insult on gestational day 7. Alcohol Clin Exp Res. 34, 98-111 (2010).
  15. Gil-Mohapel, J., Boehme, F., Kainer, L., Christie, B. R. Hippocampal cell loss and neurogenesis after fetal alcohol exposure: insights from different rodent models. Brain Res Rev. 64, 283-303 (2010).
  16. Diaz, J., Samson, H. H. Impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol. Science. 208, 751-753 (1980).
  17. Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol exposure impairs eyeblink conditioning in weanling rats. Alcohol Clin Exp Res. 22, 270-275 (1998).
  18. West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1, 213-222 (1984).
  19. Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning at short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49, 589-605 (2007).
  20. Ikonomidou, C., et al. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  21. Heaton, M. B., Paiva, M., Madorsky, I., Siler-Marsiglio, K., Shaw, G. Effect of bax deletion on ethanol sensitivity in the neonatal rat cerebellum. J Neurobiol. 66, 95-101 (2006).
  22. Ryabinin, A. E., Cole, M., Bloom, F. E., Wilson, M. C. Exposure of neonatal rats to alcohol by vapor inhalation demonstrates specificity of microcephaly and Purkinje cell loss but not astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 19, 784-791 (1995).
  23. Kraemer, G. W., Moore, C. F., Newman, T. K., Barr, C. S., Schneider, M. L. Moderate level fetal alcohol exposure and serotonin transporter gene promoter polymorphism affect neonatal temperament and limbic-hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation in monkeys. Biol Psychiatry. 63, 317-324 (2008).
  24. Schneider, M. L., et al. Moderate-level prenatal alcohol exposure alters striatal dopamine system function in rhesus monkeys. Alcohol Clin Exp Res. 29, 1685-1697 (2005).
  25. Ramadoss, J., Hogan, H. A., Given, J. C., West, J. R., Cudd, T. A. Binge alcohol exposure during all three trimesters alters bone strength and growth in fetal sheep. Alcohol. 38, 185-192 (2006).
  26. Ramadoss, J., Lunde, E. R., Pina, K. B., Chen, W. J., Cudd, T. A. All three trimester binge alcohol exposure causes fetal cerebellar purkinje cell loss in the presence of maternal hypercapnea, acidemia, and normoxemia: ovine model. Alcohol Clin Exp Res. 31, 1252-1258 (2007).
  27. Ramadoss, J., Tress, U., Chen, W. J., Cudd, T. A. Maternal adrenocorticotropin, cortisol, and thyroid hormone responses to all three-trimester equivalent repeated binge alcohol exposure: ovine model. Alcohol. 42, 199-205 (2008).
  28. Byrnes, M. L., Reynolds, J. N., Brien, J. F. Brain growth spurt-prenatal ethanol exposure and the guinea pig hippocampal glutamate signaling system. Neurotoxicol Teratol. 25, 303-310 (2003).
  29. Catlin, M. C., Abdollah, S., Brien, J. F. Dose-dependent effects of prenatal ethanol exposure in the guinea pig. Alcohol. 10, 109-115 (1993).
  30. Phillips, D. E., Krueger, S. K. Effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on glial cell development in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 10, 197-206 (1992).
  31. Phillips, D. E., Krueger, S. K., Rydquist, J. E. S. hort- Short- and long-term effects of combined pre- and postnatal ethanol exposure (three trimester equivalency) on the development of myelin and axons in rat optic nerve. Int J Dev Neurosci. 9, 631-647 (1991).
  32. Shetty, A. K., Burrows, R. C., Wall, K. A., Phillips, D. E. Combined pre- and postnatal ethanol exposure alters the development of Bergmann glia in rat cerebellum. Int J Dev Neurosci. 12, 641-649 (1994).
  33. Maier, S. E., Chen, W. J., Miller, J. A., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability regional differences in alcohol-induced microencephaly as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during rat brain development. Alcohol Clin Exp Res. 21, 1418-1428 (1997).
  34. Maier, S. E., Miller, J. A., Blackwell, J. M., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: regional differences in cell loss as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during brain development. Alcohol Clin Exp Res. 23, 726-734 (1999).
  35. Livy, D. J., Miller, E. K., Maier, S. E., West, J. R. Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability: effects of binge-like alcohol exposure on the developing rat hippocampus. Neurotoxicol Teratol. 25, 447-458 (2003).
  36. Kelly, S. J., Lawrence, C. R. Intragastric intubation of alcohol during the perinatal period. Methods Mol Biol. 447, 101-110 (2008).
  37. Perkins, A., Lehmann, C., Lawrence, R. C., Kelly, S. J. Alcohol exposure during development: Impact on the epigenome. Int J Dev Neurosci. 31, 391-397 (2013).
  38. Tran, T. D., Kelly, S. J. Alterations in hippocampal and hypothalamic monoaminergic neurotransmitter systems after alcohol exposure during all three trimester equivalents in adult rats. J Neural Transm. 106, 773-786 (1999).
  39. Gil-Mohapel, J., et al. Altered adult hippocampal neuronal maturation in a rat model of fetal alcohol syndrome. Brain Res. 1384, 29-41 (2011).
  40. Popovic, M., Caballero-Bleda, M., Guerri, C. Adult rat's offspring of alcoholic mothers are impaired on spatial learning and object recognition in the Can test. Behav Brain Res. 174, 101-111 (2006).
  41. Guerri, C., Sanchis, R. Alcohol and acetaldehyde in rat's milk following ethanol administration. Life Sci. 38, 1543-1556 (1986).
  42. Matta, S. G., Elberger, A. J. Combined exposure to nicotine and ethanol throughout full gestation results in enhanced acquisition of nicotine self-administration in young adult rat offspring. Psychopharmacology (Berl. 193, 199-213 (2007).
  43. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level). Addict Biol. 9, 137-149 (2004).
  44. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Exp Biol Med (Maywood). 230, 366-375 (2005).
  45. Lewis, S. M., et al. Modifying a displacement pump for oral gavage dosing of solution and suspension preparations to adult and neonatal mice). Lab Anim (NY). 39, 149-154 (2010).
  46. Cebolla, A. M., et al. Effects of maternal alcohol consumption during breastfeeding on motor and cerebellar Purkinje cells behavior in mice. Neurosci Lett. 455, 4-7 (2009).
  47. Becker, H. C., Hale, R. L. Repeated episodes of ethanol withdrawal potentiate the severity of subsequent withdrawal seizures: an animal model of alcohol withdrawal "kindling". Alcohol Clin. Exp. Res. 17, 94-98 (1993).
  48. Galindo, R., Valenzuela, C. F. Immature hippocampal neuronal networks do not develop tolerance to the excitatory actions of ethanol. Alcohol. 40, 111-118 (2006).
  49. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
  50. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Weathersby, R. T. Repeated ethanol withdrawal experience increases the severity and duration of subsequent withdrawal seizures in mice. Alcohol. 14, 319-326 (1997).
  51. Ukita, K., Fukui, Y., Shiota, K. Effects of prenatal alcohol exposure in mice: influence of an ADH inhibitor and a chronic inhalation study. Reprod Toxicol. 7, 273-281 (1993).
  52. Varma, P. K., Persaud, T. V. Influence of pyrazole, an inhibitor of alcohol dehydrogenase on the prenatal toxicity of ethanol in the rat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 26, 65-73 (1979).
  53. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43, 42-51 (2004).
  54. Arias, C., Molina, J. C., Mlewski, E. C., Pautassi, R. M., Spear, N. Acute sensitivity and acute tolerance to ethanol in preweanling rats with or without prenatal experience with the drug. Pharmacol Biochem Behav. 89, 608-622 (2008).
  55. Nizhnikov, M. E., Molina, J. C., Varlinskaya, E. I., Spear, N. E. Prenatal ethanol exposure increases ethanol reinforcement in neonatal rats. Alcohol Clin Exp Res. 30, 34-45 (2006).

Tags

Medicin foster etanol exponering paradigm ånga utveckling alkoholism fosterskadande djur mus modell
Konstruktion av Vapor Chambers används för att exponera Möss till alkohol under motsvarande för alla tre trimestern av mänsklig utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper,… More

Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. A., Valenzuela, C. F. Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development. J. Vis. Exp. (89), e51839, doi:10.3791/51839 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter