Introduction
글리코 실화는 유기체 생리학, 조직 병리학, 및 셀룰러 인식 1-3에 기여 필수적인 단백질 번역 후 변형이다. 분석, 당질의 주요 발전에도 불구하고, 특정 단백질에 글리 칸의 전체 다양성을 특징 짓는 특히 차 생물 소스에서 고립 된 단백질에, 매우 어려운 과제 남아있다. 그럼에도 불구하고, 당 단백질 글리 칸의 microheterogeneity 자주 다른 단백질과 기능의 상호 작용에 영향을 미친다. 따라서, 글리 칸 다양성의 특성화 세포 및 조직 당화 4,5의 생리적 중요성을 이해하는데 필수적이다. 조직의 생리 및 병태 생리, 강력한 민감하고 포괄적 인 glycomic 분석 기술에 당 단백질 글리코 실화의 기여를 이해하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 단백질체 분석에서 동정 된 단백질은 일반적으로 LC-MS에 의해 달성된다/ 트립신 펩티드 (6)의 MS 분석. 단백질 분해는 7-9의 트립신과 같은 프로테아제의 겔 소화 다음 SDS-PAGE에 의해 해결 정제 된 단백질 또는 단백질을 사용하여 수행 될 수있다. SDS-PAGE에 의해 단백질 혼합물의 예비 농축 단백질 ID의 깊이와 정확도를 향상시킨다. 당 단백질의 당화의 glycomic 분석을위한 유사한 전략의 개발은 당질의 최전선에있다.
글리 칸의 두 가지 주요 클래스는 N-O 결합 또는 쇄교 어느 통해 단백질 골격에 부착된다. N 연결된 글리 칸은 아스파라긴에 부착된다 아스파라긴 (Asn)에서 Asn-X-빼앗아 /의 Thr / Cys이고 정의 sequon의 일부로서 발견 잔기 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임), 및 펩티드 - N과 효소 절단에 의해 해제 될 수있다 -glycanase (PNGaseF 또는 A), 하나 솔루션에서 젤, 또는 온 오점 10-12. O 연결 글리 칸은 주로 세린 (SER) 또는 트레오닌 (THR) 잔기에 부착된다. 그러나, 단지 하나의 효소 IDEN되었습니다당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출 할 수 있고, 그것은 단지 간단한 O 연결 글리 칸을 방출 극히 제한 글리 칸으로 발견 된 특이성을 갖는다. 화학 릴리스 전략은 당 단백질의 O 연결 글리 칸의 종합 릴리스에 대한 선택의 방법 남아있다. 환원성 또는 비 환원성 β-제거, 또는 하이드라진 잘 특성화 된 화학 분리 기법이며, 당 단백질 (13, 14)에서 O 연결 글리 칸을 해제하기위한 가장 널리 사용되는 방식은 현재. 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출하기 위해 사용되었지만, 이전 접근법은 15-17 후속 분석을 위해 HPLC 분리를 요구했다.
다차원 MS (MS N) 분석은 현재 대부분의 생물학적 소스에서 예상되는 금액에 고립 된 당 단백질에서 방출 된 글리 칸의 특성에 대한 구조적 데이터의 가장 부유 한 소스를 제공합니다. MS의 깊이기반 구조 특성이 크게 전에 그들의 분석 글리 칸을 방출 permethylating에 의해 촉진된다. 메틸화는 이온화를 개선하고 글리 칸 구조 (18, 19)의 넓은 범위에 걸쳐 몰 응답 신호를 등화시키는 경향이있다. 또한, 메틸화는 모호하여 구조적 해명 20-23 향상 특유 매스와 단자 및 치환 단당 잔기를 붙인다. 예를 들어, 산성 글리 칸은 MS에 의해 비 메틸화 종으로 감지 할 수 일반적으로 어렵다. 산성 글리 칸이 MS에 의해 마이너스 이온 모드에서 검출 될 수 있지만, 동일한 이온 모드에서 모두 산성 및 중성 글리 칸을 검출하는 것은 불가능하다. 글리 칸 메틸화의 큰 장점은 메틸화로 글리 칸의 단당류 치환체에 자유 수산기 (OH)가 모두 그들로서 검출하게 메틸기 (OCH 3 또는 SID), 따라서 시알 릴화 된 글리 칸의 전하를 중화로 캡핑 될 것이라는 것이다 중립 (아시아LO) 글리 칸. 그러나, sulfoglycans에 황산 부분의 수산기는 이온화를 억제하고 감도를 감소 음이온 전하의 보존 결과, 메틸화에 저항. 이 억제는 현재 황산 글리 칸 24 ~ 26의 높은 풍요 로움을 가지고 같은 점액과 같은 매우 복잡한 당 단백질의 포괄적 인 glycomic 분석을 방지 할 수 있습니다.
정화 황산 글리 칸 최근 보고서는 역 위상 정화 크로마토 그래피 및 MALDI 분석에 앞서 별도의 메틸화 글리 칸, 충전에 사용됩니다. 이 방법은 우리가 유기 상 분할보다 덜 엄격한 것으로 나타났습니다 용출 다른 이동상을 사용하여 황산 및 비 황산 글리 칸의 완전한 분리에 의존한다. 따라서, sulfoglycans의 검출 및 농축에 적합한 새로운 기술이 여기에 제시되어있다. 이러한 기술은 다음과 같은 물 성상 황산 화 글리 칸의 정량적 복구 할 수 : DCM (디클로로 메탄)일상적 당쇄 메틸화 반응 (27)의 끝에서 수행된다 추출. 또한이 MS 단편화 패턴을 단순화 중요한 메틸화 비 설페이트 화 글리 칸의 혼합물로부터 메틸화 sulfoglycans이 견고한 분리 병용 하전 종 풍부. 개선에 - 겔 O 연결된 글리 칸 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 제공됩니다. 개선 된 프로토콜은, 글리 칸 회복을 향상 MS 통해 얻어지는 N 메틸화 글리 칸의 분석 구조 정보를 증가시키고 생물학적 공급원으로부터 격리 필수 당 단백질에인가 sulfoglycomic 분석의 감도를 향상시킨다.
이 프로토콜은 전체 당 단백질 추출물 O 연결된 글리 칸 분석을 위해 또는 SDS-PAGE에 의해 해결 관심 특정 당 단백질의 의도와 세 실험 절차로 구성된다; A) 젤 청소, B)에서 - 겔 환원 β-제거, 및 C) 글리 칸 permethy만큼은. 목표는 생물학적 관심 (그림 1)의 기본 소스에서 수확 당 단백질에 대한 포괄적 인 O-연결 glycomic 데이터를 획득하는 것입니다. SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질 염색 관심 대역 절제되고 결과 겔 밴드를 작은 조각으로 분리된다 시각화된다. 겔 조각 탈색 및 겔 오염물 (도 2a)를 제거 에틸 아세테이트 세척을 실시한다. 글리 칸 릴리스에 - 겔 환원 β-제거 (그림 2B)에 의해 달성되고 발표 된 글리 칸은 메틸화된다. 수성 유기 추출 다음과 메틸화 정량적으로 떨어져 비 황산 중립 글리 칸 (그림 2C)에서 음이온 성 황산 글리 칸을 분할한다. 에 - 겔 수성 유기 추출 결합 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질의 소량에서 방출 O 연결 글리 칸과 sulfoglycans의 특성을 수 있습니다. 전략적 개요 summari입니다도 1 및 세부 데이빗은도 2에 도시되어있다. 또, 탈색 및 세척 겔 조각 부는 표준 LC-MS / MS 단백체 기술에 의해 단백질 ID를 위해 사용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 연구실 안전에 관한 사항
표준 실험실 모범 사례에 준하여 다음 사항을 준수하십시오. 적절한 위치에있는 모든 유기 용제를 저장합니다. 화학 성분의 명확한 표시와 화학 폐기물 용기에있는 모든 폐기물을 보관하십시오. 이러한 프로토콜에 사용되는 몇 가지 시약 잠재적 인 발암 물질이나, 휘발성 가연성 가스를 생성 환기 흄 후드에서 모든 시약을 처리합니다. 유기 용매를 사용하여 작업 할 때와 같은 장갑, 실험실 코트, 및 눈 보호 등의 개인 보호 장비를 착용 할 것.
에 - 겔 O-글라 이코믹스 1. 절차를 그림. 관심의 (A) 단백질은 적절한 염색 절차 (코마 또는 실버)에 의해 감지, SDS-PAGE에 의해 해결하고 절제되어있다. 절제된 젤 조각 썰어작은 큐브로, 탈색, 이후 MS 분석을 방해 오염물을 감소시키기 위해 에틸 아세테이트로 세척 하였다. 겔 슬라이스의 일부는 LC-MS / MS에 의해 겔 트립신 소화 및 후속 단백체 특성화를 위해 예약 될 수있다. (B) O 연결 글리 칸은에 - 겔 환원 β-제거하여 해결할 당 단백질에서 해제됩니다. 필수 단계는 탈염 및 메탄올 공비에 의한 붕산 제거를 포함한다. 메틸화 및 이후 수성 및 유기 단계로 분할된다 (C) 환원 β-제거가 발표 한 글리 칸을 O 링크. Sulfoglycans 정량적 상단 (수성) 단계에서 회수 낮은 (DCM) 층으로 중립 시알 글리 칸을 분할한다.
에 - 겔 글라 이코믹스 그림 2. 상세 흐름도. 각 experimen도 1에 도시 탈 단계가 개별적으로 도시되어있다. (A) 젤 탈색하고, EtOAc 추출, (B)에서 - 겔 환원 O 연결된 글리 칸 릴리스에 대한 β-제거하고, 직접 (C)과 메틸화 및 위상 파티션. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 젤 절제 젤 유래 오염 물질의 제거
- 절차를 시작하기 전에, 재료 목록에 화학 물질과 시약을 준비합니다.
- 표준 트리스 - 글리신 버퍼 시스템을 사용하여 SDS-PAGE 겔상의 단백질을 해결. 얼룩은 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 실버 얼룩 중 하나와 단백질을 해결. 일반적으로, 실버 스테인드 젤에서 O 연결 글리 칸의 회복은 코마에서 달성 복구의 약 80~90%가 젤 스테인드입니다.
- 전기 영동 후, 유리판 및 소비세 t에 겔을 배치깨끗한 메스 또는 면도날을 사용하여 관심의 그는 지역.
- 오 글리 칸의 수율을 증가 다른 유리 접시에 관심의 겔 밴드를 전송하고 약 2mm 큐브로 적출 된 젤 조각을 잘라합니다. 글리 칸 복구가 감소되기 때문에 젤 조각을 1 mm보다 작 큐브를 피합니다. 스테인리스 microspatula와 나사 상부 유리관 (13 × 100 ㎜)로 작은 겔 조각을 전송.
- 샘플 튜브에 25 mM의 중탄산 암모늄 (AMBIC, 3 NH 4 HCO) 1 ml를, 테플론 늘어선 나사 상단 뚜껑과 유리 튜브 캡 추가하고 부드럽게 10 분간 방치시키는 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각들을 추출 피하기 위하여 격렬하게 교반을 채용하지 않는다.
- 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫 또는 매우 긴 플라스틱 팁 장착 피펫을 사용하여 유리 튜브로부터 제거 AMBIC. 스매싱과 AMBIC 솔루션을 제거하는 동안 작은 젤 조각을 전송하지 마십시오.
- 아세토 니트릴 (ACN)의 1 ML을 추가유리 튜브, 모자, 부드럽게 10 분간 방치셔서 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각이 완전히 용매로 덮여 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 튜브 벽의 해제 및 피펫 팁과 용매에 젤 조각을 밀어 넣습니다.
- 유리관에서 ACN을 피펫과 밝은 푸른 색이 제거 될 때까지 반복 1.5-1.7 단계를 반복합니다. 필요한 경우 다섯 순차적 AMBIC / ACN 세척의 최소를 반복합니다. 실버 스테인드 젤의 경우, destain 키트를 사용합니다. 겔 조각이 ACN에 균일하게 흰색 동안 켤 때 다음 단계로 진행합니다.
- 유리 튜브에서 액체를 피펫 튜브를 요약하자면, AMBIC 1 ㎖를 추가하고 5 분 동안 서 보자.
- AMBIC를 제거하고 유리관에 에틸 아세테이트 (EtOAc로) 2 ㎖를 추가한다. 또는 엔드 오버 엔드 교반 또는 야간에 4 ° C에서 테플론 늘어선 모자와 장소 요점을 되풀이 튜브 30 분 각각 실온에서 세 EtOAc로 세척을 수행합니다. 이상을 EtOAc 세척, 오염 물질의보다 효율적으로 제거.
- 제거최종 EtOAc를 씻고 H 2 O 2 ㎖ 세 세척을 각각 수행 EtOAc로의 완전한 제거는 강력한 환원 β-제거 반응을 보장합니다.
- H 2 O를 피펫 ACN 1 ㎖로 한번 세정함으로써 겔을 탈수.
참고 : 건조 후, 탈수 젤에서 젤 β-제거를위한 준비가되어 있습니다. 탈수 겔 조각을 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다. - 무관 겔에 적용되는 버퍼 또는 용액 중, 어느 단계에서 세척 공정을 중지하고 밤새 39 ° C에서 겔 조각을 저장 (AMBIC, ACN, H 2 O). 다음 2 일 이내에 언제든지 샘플 준비를 다시 시작합니다.
- 표준 프로 테오 믹 방법에 의해 단백질 ID 용 탈색 탈수 젤 조각의 일부를 사용한다.
환원 적 β-제거 2.에서 젤 O-글리 칸 출시
- 사용할 때까지 4 ° C에서 50 %의 NaOH 또는 고체의 NaOH 및 저장소를 사용하여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 원액을 준비합니다.
NOTE : β-제거 반응이 18 시간 동안 진행시킨 후, 탈염 처리가 당일 내에서 수행되어야한다.
양이온 교환 크로마토 그래피 3. 탈염
- 얼음 샘플 튜브를 유지하는 것은 과도한 열이 형성되지 않도록하면서 천천히 염기 중화 10 % 아세트산 (아세트산) 적가 하였다. 부드럽게 아세트산의 추가 사이의 샘플 튜브를 소용돌이. 천천히 산을 추가 할주의와 additi으로 현명한 드롭산에 거품의 "화산"을 생성합니다. 필요한 경우, 기포를 제거하고 유출을 방지하기 위해 튜브를 원심 분리기.
- 반응 혼합물에 나트륨의 다량을 제거하기 위해, 작은 양이온 교환 칼럼 (웩스 또는 AG-50W-X8 수지, H + 형)를 통해 반응 혼합물을 전달한다.
- 1 M의 NaOH와 함께 양이온 교환 수지를 씻어 1 M HCl을 수지는 분석 등급의 경우에도, MS 분석을 방해 오염물을 제거하기 위해 사용 전에.
- 1 M의 NaOH에 수지를 만끽하고 경사 분리하여 용액을 제거. 다음 1 M 염산을 추가, 물을 제거, 탈 이온수를 추가합니다.
- 수지 위의 액이 무색이 될 때까지이 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 5 % 아세트산에 탈 이온수 및 저장소와 청소 수지를 씻으십시오.
- 작은 유리 칼럼, 스크래치하고 피펫 팁의 테이퍼는 대략 1cm 길이가되도록 세라믹 커터를 사용하여 유리 파스퇴르 피펫 팁을 끊어도. 글래스 울 플러그 떨어져 애타게 수지 베드를위한 지원을 형성 팁쪽으로 밀어. 유리 테스트 튜브를 통해 클램프 또는 빨래와 장소 피펫 열을 고정합니다.
- 1 ml의 메탄올 (메탄올) 및 3 ㎖의 5 % 아세트산으로 빈 피펫을 씻으십시오. 소용돌이 H + 웩스 AG50 또는 양이온 교환 수지 슬러리를 5 % 아세트산에 저장하고 파스퇴르 피펫 열에 1ml의 베드 볼륨을 생성하기 위해, 슬러리의 충분한 옮긴다.
- 5 % 아세트산의 5 권을 사용하여 열을 씻어. 수지 입자의 외관 흐를 수지가 검출되는 경우에 열을 사용하지 않는 체크.
- 새로운 나사 위에 유리 튜브 (16 × 125mm) 및로드 샘플을 통해 열을 놓습니다. 통한 유동을 수집하고 동일한 튜브에 5 % 아세트산 중 적어도 3 볼륨으로 글리 칸을 용출.
- 파라 필름으로 관을 덮고 바늘로 작은 구멍을합니다. -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플 튜브를 놓습니다. 동결되면, 동결 건조하여 샘플을 건조. -20 °에서 건조 된 물질을 저장사용할 때까지 C.
4. 붕산염 제거
- 메탄올 10 % 아세트산을 준비합니다. 빙초산 10 mL를 취하여 메탄올 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 최대 6 개월 테플론 늘어선 모자와 유리 병에서이 시약을 보관하십시오.
- 건조, 동결 건조 된 샘플 튜브와 소용돌이에 메탄올 10 % 아세트산 300 μL를 추가합니다. N 2 스트림에서 증발에 의한 결과 트리메틸 보레이트를 제거합니다.
참고 : 산성 조건에서 메탄올로 보레이트 염을 혼합 휘발성 화합물 인 트리메틸 보레이트를 생성합니다. - 37 ° C에서 N 2 스트림에서 건조. 4.2 단계에 설명 된대로 건조 후, 메탄올의 아세트산의 또 다른 나누어지는를 추가합니다. 질소 하에서 5 분 (N 2) 37 ° C에서 스트림 액체를 건조.
- 반복 재 부상 및 건조 적어도 3 회. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 물질을 저장합니다.
5. C18 정리
- C18 카트리지 열 평형ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권을 사용 (크기 1 ml를, 100 mg의 수지). 온화한 포지티브 공기압의인가에 의해 평형화 용액의 통과를 가속화.
- 탈염과 붕산염 무료 샘플 튜브에 5 % 아세트산 500 μL를 추가하고 소용돌이에 의해 용해.
- 평형 C18 컬럼으로 재현 탁 샘플을로드하고 유리 스크류 캡 튜브 (13 × 100 ㎜)로 통해 흐름을 수집합니다. 용출 O 글리 칸 같은 튜브에 5 % 아세트산 3 ㎖와.
- 튜브를 파라 필름 작은 바늘로 작은 구멍을 만들거나 튜브를 다루 느슨하게 밀폐 된 PTFE가 늘어선 캡을 사용하고, -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플을 동결. 동결 건조하여 용매를 제거합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 샘플을 저장합니다.
메틸화 6. 자료 준비
참고 : 강력한 메틸화를 달성의 NaOH를 슬러리 신선한을 준비하기 위해. 메틸화 반응에 사용되는 모든 유리 제품은 광범위하게 청소해야합니다.
- , 메틸화에 대한 기본 시약을 준비 깨끗한 유리 나사 탑 튜브 (13 × 100 mm)의 50 % NaOH를 400 μl를 추가합니다. 무수 메탄올와 소용돌이의 800 μl를 추가합니다.
- 백색 침전물을 생성하기 위해 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)와 소용돌이 4㎖를 추가.
- 침전물을 펠렛 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 피펫 버린다. 펠렛에 무수 DMSO의 추가 4 ML을 추가합니다. 소용돌이.
- 단계를 반복 6.2 세 번이나 더 흰색 침전물이 형성 될 때까지 6.3 최소.
- 3 ㎖ 무수 DMSO의 펠렛 기반을 녹여 부드럽게 깨끗한 파스퇴르 피펫으로 상하를 피펫 팅하여 혼합한다.
- 이 저장 될 수있는 다음의 메틸화 반응에 즉시베이스를 사용한다.
출시 글리 칸의 7 메틸화
- C18 정제 시료와 소용돌이 또는 재현 탁하는 초음파 처리에 무수 DMSO 200 μl를 추가합니다.
- resusp 300 μl를 추가샘플에 종단 기본 슬러리 즉시 요오드 메탄 100 ㎕ (메이)를 추가합니다. 테플론 늘어선 모자와 튜브를 봉인하고 적극적으로 소용돌이에 의해 5 분간 섞는다.
- , 메틸화 반응을 중지 얼음 소용돌이에 5 % 아세트산 2 ㎖를 추가합니다. 피펫 솔루션 위아래로 5 회 증발 된 Mel의 남은 양을 줄일 수 있습니다.
주 : 아세트산이 용액을 중화 메이의 제거 단계 파티션 중에 수상으로 황산 화 글리 칸의 추출 효율을 증가시킨다. - 디클로로 메탄 (DCM)와 소용돌이의 2 ML을 추가합니다. 실온에서 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기 수성 및 유기 상을 분리한다.
- 새로운 유리관 (13 × 100 ㎜)로 상부층 (메틸화 황산 화 글리 칸의 대부분을 포함 성상)을 전송.
- 유기상와 소용돌이에 H 2 O 2 ㎖를 추가합니다. 600 XG 1 분 원심 분리기는 수성 및 유기 상을 분리하고, 전나무와이 두 번째 수상을 결합세인트 수상 (단계 7.5).
- 반복 단계 7.6 및 7.5 세 번 이상하지만 이후의 파티션에서 얻어진 수성 상을 저장할 필요가 없다.
- 바닥층 (유기상)로부터 가능한 한 많은 최종 상부 층 (성상)을 제거하고 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 별도의 새로운 유리관에 바닥층 (유기상)을 전송.
- 42 ° C에서 N 2 스트림에서 유기상을 건조.
- 사용할 때까지 -20 ° C에서 파라 필름과 관과 상점을 커버.
수성 단계에서 메틸화 황산염 O-글리 칸의 8 C18 정리
- ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권과 C18 카트리지 열 평형.
- 수집 단계 컬럼으로 7.5과 7.6에서 결합 수성 상을로드합니다.
- 탈염을위한 H 2 O 10 mL로 컬럼을 세척 할 것.
- 용출 메틸화 황산 2 mL를 새 유리 튜브에 O-글리 칸50 % ACN의. 큰 올리고당에 메틸화 황산 O-글리 칸의 회복을 향상시키기 위해 85 % ACN으로 추가 용출을 사용합니다.
- 42 ° C에서 질소 기류 하에서 건조 용출액.
- MS 분석 이전에 6개월에 -20 ° C의 최대의 건조물을 저장합니다.
메틸화 O-글리 칸의 9 질량 분석
- 210 ° C의 온도에서 모세관 0.40-0.60 μL / 분의 주사기 유량 nanoelectrospray 소스를 사용하여 적절한 질량 분석기로 직접 주입함으로써 메틸화 O 글리 칸 분석. MS / MS 및 이온 트랩 악기의 MS N에서 CID에 의해 분열를 들어 30 ~ 40 %의 충돌 에너지를 적용합니다.
- 음이온 모드의 재구성 메틸화 설페이트 O 글리 칸 메탄올 / 2- 프로판올 / 1- 프로판올 50 μL에 / 13 mM의 아세트산 암모늄 수용액 (16 : 3 : 3 : 2 부피비). 양이온 모드의 경우, 1 mM 염화나트륨 하이드로 50㎕의 중성 / O 시알 릴화 된 글리 칸을 메틸화 재구성메탄올 / 물 xide (1 : 1).
- 개별 O-글리 칸 구조 13, 19, 21, 23의 특성을의 MSN 분석 Xcalibur 소프트웨어 패키지 버전 2.0의 총 이온 매핑 (TIM) 및 중립 손실 스캔 (NL 스캔) 기능을 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
인 - 젤 환원 적 β-제거에 에틸 아세테이트 치료의 효과 이전
에 - 겔 환원 β-제거를 사용하여 점액 소에서 방출 메틸화 O 연결된 글리 칸 샘플의 대표적인 질량 스펙트럼은 그림 3과 같다. 겔 조각의 EtOAc로 세척 효과적으로 이후 MS 분석 (27)을 방해 SDS와 폴리 아크릴 오염 물질을 제거합니다.
이전에 젤 환원 β-제거에 폴리 아크릴 아마이드 젤 조각 그림 3. 에틸 아세테이트 세척 출시 글리 칸의 검출을 향상시킵니다. 에틸 아세테이트, 소 submaxillary 점액에서 젤 β-제거가 발표 한 메틸화 O 연결 글리 칸의 질량 스펙트럼으로 세척하지 않고 (A)는 다 분산 공동의 풍부에 의해 지배된다거의 O 연결 글리 칸과 연관된 MS 신호 가려 ntaminant. (B) 세탁 에틸 아세테이트로 겔 조각 글리 칸의 민감한 검출을 허용 오염물 피크를 제거한다. 쿠마 가이 (25)에서 수정.
O-연결 글리 칸의 복구 작은 젤 조각에서 큰
O 연결 글리 칸은에 - 겔 환원 β-제거 중 작은 슬라이스 된 젤 조각 (~ 2 × 2mm) 또는 대형 (~ 5 × 5mm)를 사용하여 점액 소 submaxillary에서 출시되었습니다. 젤 조각들은 작은 ~ 2 × 2mm 효율적 세척 단계를 통해 복구되지 않은 이상. 다음과 메틸화, 메틸화 외부 글리 칸 표준 알려진 양 (maltotri-과 maltotetrasaccharide, DP3 및 DP4)의 글리 칸 복구 (27)의 정량을 용이하게하기 위해 각에 추가되었습니다. 작은 겔 조각을 O 연결 글리 칸의 회복은 거의 (대형 겔 조각에서보다 큰 1/10이었다그림 4).
작은 젤 조각에서 그림 4. 글리 칸 회복은 더 큰 조각에서보다 효율적이다. 작은 조각 (~ 2 × 2mm)가 큰 큐브 (~ 5 × 5mm)보다 더 글리 칸 얻었다. 바 MS 분석 전에 릴리스 글리 칸에 첨가 외부 기준 (100 %로 설정 maltotrisaccharide DP3), 검출 신호에 정규화 모든 O 연결된 글리 칸 구조의 합에 대한 상대적인 신호 세기를 나타낸다. 값은 N = 3에 대한 평균 표준 편차이다. 쿠마 가이 K (25)에서 수정.
상 분할에 의한 Sulfoglycans의 농축
메틸화 황산 화 글리 칸 규격 (술포 르는) 완전히 수성상에서 회수 하였다. 일부터 출시 메틸화 시알 글리 칸전자 DCM 단계로 분할 당 단백질 (그림 5) 점액. 수성 유기 분할하여 각 메틸화 된 글리 칸의 복구는 이전에 특징 C18 9 월 박 청소 방법 (27)에 필적했다. 위상 분할 방법의 효율성 및 단순성 크게 샘플 처리량 및 후속 분석 방법을 용이하게한다.
상 분할에 의한 술포과 시알 글리 칸의 그림 5. 차동 복구. 소 점액 당 단백질은 환원 β-제거를 실시하기 전에 설포 - 글리 칸 표준 (설포 - 르)의 알려진 양 타서. 릴리즈 글리 칸은 메틸화 된 및 메틸화 반응은 1로 조정 하였다 : 1 : 물 : DCM. 생성 된 유기 및 수 성상을 분리하고, MS에 의해 분석 하였다. 글리 칸 복구 REL을 정량 하였다MS 분석하기 전에 샘플로 아군했다 메틸화 외부 글리 칸 표준에 극상. 유기 (DCM) 수성로 글리 칸 회수율 (물) 상을 100 %로 설정하고 외부 표준에 대해 도시된다. Sulfoglycans 유기 단계에서 탐지했다하지만 정량적으로 수성 단계에서 회복되었다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험의 SE ± 평균을 나타냅니다. 쿠마 가이 (25)에서 수정.
생물학적 샘플에서 심층 프로테옴에 응용 프로그램 및 Glycomic 분석
인간 타액 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루 (G-250)으로 염색 하였다. MW ~ 600 kDa의에서 고 분자량 단백질을 겔로부터 절단하고, 겔 조각의 부분 MUC5B (16, 24)으로이 대역을 식별에 겔 트립신 소화 및 LC-MS / MS 기반 단백질체 분석 하였다 . 겔 조각의 나머지 부분에 겔 redu시켰다 O-글리 칸 분석 27이 뽑은 β-제거. 다음 메틸화 수성 - 유기상 파티션 (물 : DCM, 1 : 1), 수성 및 유기상의 글리 칸은 NSI-MS로 분석 하였다 메틸화. 비 설페이트 3 HexNAc이 FUC 한 육각, O 글리 칸을 유기상으로부터 회수하고, 메틸화 sulfoglycans 모든 예 거의 등압 설페이트 및 비 설페이트 화 글리 칸의 확인 및 특성화를 촉진 수성 상으로부터 회수 메틸화 의 GalNAc- 올 (M / Z = 1606.8, [M + 나 +)와 (SO 3) 1 NeuAc의 1 FUC 1 Hex 2 HexNAc 1의 GalNAc- 올 (M / Z = 1606.7, [M + 2Na를-H] +) 0.1 질량 단위에 따라 다를 물리적 위상 파티션 (그림 6)에 의해 두 종을 분리하지 않고 해결하기 어려울 것입니다.
PLOAD / 51840 / 51840fig6highres.jpg "폭 ="700 픽셀 "/>
수성 유기 파티션으로 구분 중립과 설포 글리 칸에서 등압 복잡성 6. 탐지 그림. 로에서 젤 β-제거 및 물 점액 인간의 타액에서 분리 메틸화 O-글리 칸의 총 이온 매핑 (TIM) 분석에 의해 감지 부모 이온에서 얻은 MS 2 조각 패턴과 메틸화 다음 DCM 파티션. m / z = 1608 (B) 약 2.8 질량 부 창 DCM상의 TIM 분석에서 (A) MS (2) 수상의 TIM 분석 윈도우의 동일한 질량이 MS 스펙트럼. DCM-단계에서 주요 조각 이온가 16 일 -O (M / Z 1370.8), FUC 1 육각 3 HexNAc의 손실이 + 나 (1331.8), FUC 1의 손실 진수 (1) -O (1196.7), 손실에 해당 FUC 1의 진수 1 HexNAc 1 (1143.6), 손실의 진수 1 HexNAc 1 (969.5), 손실FUC 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747.4), FUC 1 육각 1 HexNAc 1 + 나 (660.4) 및 육각 1 HexNAc 1 + 나 (486.3). 스펙트럼의 오른쪽에 도시 된 바와 같이 이러한 단편 이온들에 기초하여, FUC 한 육각 3 HexNAc 2의 GalNAc 올 성분과 비 설페이트 구조의 혼합물을 제안한다. 대조적으로, 수상의 주요 단편 이온은 SO 3 나트륨 (1486.8)의 NeuAc의 손실 (1231.5), FUC 한 육각 일 -O (1196.7), NeuAc의 조합 손실, 손실 및 SO 3 나트륨 (아르 1111.8) 및 NeuAc의 1의 손실 -O (1009.4 육각 1). 1 NeuAc의 1 FUC 1 Hex 2 HexNAc 1의 GalNAc 올을 제안 -의 구성 (SO 3)과 황산 구조의 혼합. MS 2 해석 상 파티션으로 중립과 sulfoglycans의 물리적 분리,없이 같은 혼합물의 스펙트럼은 훨씬 더 많은 채널입니다allenging. 쿠마 가이 (25)에서 수정. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS ≥99.7% w/w |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μl, needle size 22s G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μl, needle size 22s G |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μl, needle size 26s G |
| Petri Dish Glass 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
