Introduction
糖基化是一个重要的蛋白质翻译后修饰，有助于有机体生理学，组织病理学和细胞识别1-3。尽管在分析glycoscience重大进展，在一个特定的蛋白聚糖特征的完整的多样性仍然是一个极具挑战性的任务，特别是对蛋白质的主要生物来源分离出来。然而，糖蛋白的聚糖的微观不均经常会影响与其它蛋白质功能性相互作用。因此，聚糖多样性的表征对于理解细胞和组织中的糖基化4,5-生理意义是必不可少的。为了了解糖蛋白的糖基化对组织的生理与病理生理学，健壮，灵敏，全面的glycomic分析技术的贡献已经变得越来越重要。在蛋白质组分析，蛋白质的鉴定是通过LC-MS通常实现/胰蛋白酶肽6的MS分析。蛋白消化可使用以下在凝胶内消化以蛋白酶如胰蛋白酶7-9纯化的蛋白或蛋白通过SDS-PAGE解析来进行。预富集通过SDS-PAGE的蛋白质混合物的增强的蛋白质的ID的深度和准确性。类似的战略糖蛋白的糖基化glycomic分析的发展，关键在glycoscience的前列。
聚糖的两类主要是通过是N-连接或O-键附着到蛋白质骨架。 N-连接的聚糖附着到天冬酰胺（天冬酰胺）中所定义的的Asn-X-丝氨酸/苏氨酸/半胱氨酸一序列子的部分残基（X为任意氨基酸除脯氨酸外的），并且可以通过酶消化与肽N为释放-glycanase（PNGaseF或A），无论是在溶液中，在-凝胶法，或对印迹10-12。 O-连接的糖链主要附着到丝氨酸（丝氨酸）或苏氨酸（Thr）残基。但是，只有一个酶已经IDENtified，其能够从糖蛋白释放的O-联聚糖的，它有一个极其有限聚糖特异性，只释放最简单的O-连接的聚糖。化学释放策略仍首选从糖蛋白全面释放的O-连接的糖链的方法。还原性或非还原性β-消除，或肼是良好表征的化学释放技术和目前最常用的方法为从糖蛋白13,14释放O-连接的聚糖。虽然还原性β-消除已被用于从糖蛋白，通过SDS-PAGE分离释放O-连接的聚糖，先前的方法需要HPLC分离用于随后的分析15-17。
多维质谱（MS n）的分析，目前提供的数据结构为特征的糖蛋白中分离出大多数生物源预计的数额发布聚糖最丰富的来源。 MS的深度基于结构特征是由permethylating释放聚糖之前，他们的分析大大便利。全甲基增强离子化，容易在广泛的聚糖结构18,19的均衡摩尔信号的响应。此外，全甲基明确标记终端和取代的单糖部分具有鲜明的群众，从而提高结构解析20-23。例如，酸性聚糖一般难以检测作为非全甲基化物种被MS。虽然酸性聚糖可以在负离子模式通过质谱进行检测，就不可能检测酸性和中性聚糖在同一离子模式。聚糖全甲基的一个主要优点是，所有的聚糖的单糖取代基的游离羟基（OH）的将甲基（OCH 3或OMe），因此唾液酸化聚糖的电荷被中和被封端的，这使得它们作为可检测如全甲基化中性（亚洲LO）聚糖。然而，硫酸盐部分的上sulfoglycans的羟基是抗全甲基，导致保留阴离子电荷，从而抑制离子化和降低灵敏度。这种抑制目前防止的非常复杂的糖蛋白，如粘蛋白，它携带高丰硫酸化多糖24-26综合glycomic分析。
上纯化的硫酸化聚糖的最近的报道用过充电，反相层析，纯化和之前的MALDI分析单独的全甲基化的聚糖。此方法依赖于使用用于洗脱不同的流动相，这是我们发现比有机相分配不那么严格的硫酸化和非硫酸化聚糖的完全分离。因此，适合于sulfoglycans的检测和富集新技术是这里提出。这些技术允许的硫酸化聚糖的以下水的定量回收在水相中：DCM（二氯甲烷）提取，这是经常在聚糖全甲基反应27结束时执行。重要的是，从全 甲基非硫酸化多糖的混合物，这种强大的分离全甲基sulfoglycans的伴随丰富的带电物质，同时也简化了MS 2碎裂模式。一个全面的协议，用于改善胶O连接聚糖分析也提出了。改进协议增强聚糖恢复，增加了获得的通过级质谱全甲基化聚糖的分析的结构信息，并提高了施加到从生物来源分离的必不可少的糖蛋白sulfoglycomic分析的灵敏度。
此协议旨在用于通过SDS-PAGE分离感兴趣的特定糖蛋白的全提取物的糖蛋白O-连接的糖链的分析或与由三个实验程序; A）凝胶清理，B）的凝胶还原β-淘汰，C）聚糖permethy分页。我们的目标是获得全面的O连接glycomic数据糖蛋白生物的兴趣（ 图1）的主要来源收获。糖蛋白通过SDS-PAGE分离是通过染色和感兴趣的条带切下，将所得的凝胶带被切成小块的可视化。将凝胶片被脱色，并进行乙酸乙酯洗涤以除去凝胶污染物（ 图2A）。聚糖释放是通过在凝胶还原性β-消除（ 图2B）来实现与所释放的糖链进行全甲基化。水-有机萃取下面的全甲基定量分割阴离子硫酸化聚糖远离非硫酸化的中性聚糖（ 图2C）。在凝胶还原β-消除耦合到水 - 有机萃取使的O-连接的聚糖，以及少量的糖蛋白，通过SDS-PAGE分离的释放sulfoglycans表征。该战略概述研究概述zed有在图1中，其细节示于图2中 。此外，可用于通过标准的LC-MS / MS的蛋白质组技术蛋白的ID的脱色和洗涤凝胶片的一部分上。
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Protocol
注：实验室安全问题
符合标准的实验室的最佳实践，请遵守下列规定。存放在合适的位置所有的有机溶剂。保留所有废旧物资的化学废物容器的化学成分明确的标签。如在这些协议中使用几种试剂是潜在的致癌物质或产生挥发性可燃气体，处理所有的试剂在通风橱中与通风。用有机溶剂工作时穿戴个人防护装备，如手套，实验室外套，保护眼睛。
图1.程序在胶O型糖组学。感兴趣的（A） 的蛋白通过SDS-PAGE分离，通过合适的染色程序（考马斯亮蓝或银）来检测，并切下。切除的凝胶块被切成小方块，脱色，并用乙酸乙酯洗涤，以减少与随后的MS分析干涉污染物。凝胶切片的一部分可通过LC-MS / MS保留用于在凝胶胰蛋白酶消化和随后的蛋白质鉴定。 （B）的 O-连接的聚糖是由凝胶还原性β-消除释放出解决的糖蛋白。基本步骤包括脱盐和硼酸去除共沸物用甲醇。 （C）的 O-连接的通过还原性β-消除释放聚糖全甲基化，并随后分成水相和有机相。 Sulfoglycans定量回收上层（水相），而中性和唾液酸化聚糖的分区到下部（DCM）的层。
图2详细的流程图，用于在凝胶糖组学。每个experimen在图1所示河谷步骤被单独示出。 （A）凝胶脱色和乙酸乙酯提取，（B）直接在凝胶还原β-取消对O连接聚糖的释放，以及（C）全甲基和阶段划分。 请点击这里查看图的放大版本。
1.凝胶切除，并去除凝胶衍生污染物
- 在开始程序之前，在准备材料清单所列化学品和试剂。
- 使用标准的Tris-甘氨酸缓冲系统解决在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质。染色解决了既考马斯亮蓝或银染蛋白质。在一般情况下，从银染色的凝胶O-连接的聚糖的恢复是从考马斯取得的恢复约80-90％染色的凝胶。
- 电泳后，将凝胶在玻璃板上和消费吨用干净的手术刀或刀片，他感兴趣的区域。
- 以增加O型聚糖产量，感兴趣的凝胶带转移到另一玻璃板上，并切断了切除的凝胶片成约2mm的立方体。避免使凝胶碎片小于1mm的立方体因为聚糖回收率降低。传送小凝胶片成螺旋盖的玻璃试管（13×100mm）上用不锈钢microspatula。
- 加入1毫升25mM的碳酸氢铵（AMBIC，NH 4 HCO 3），向样品管中，盖上玻璃管有聚四氟乙烯内衬的螺纹顶帽，并通过轻弹管让静置10分钟，然后轻轻地混合。不使用剧烈搅拌以避免撕裂的凝胶片。
- 小心地使用一个巴斯德玻璃吸管或配有超长的塑料尖吸管玻璃管删除AMBIC。避免粉碎和转移的微小凝胶块，同时消除了AMBIC解决方案。
- 加入1毫升乙腈（ACN）的向玻璃管，帽，然后轻轻地将通过让支架10分钟前弹管混匀。确保了凝胶片被完全覆盖溶剂。如果有必要，推凝胶块脱落管壁进入溶剂枪头。
- 移液器关闭ACN从玻璃管并重复步骤1.5-1.7，直到亮蓝色被消除。如有必要，重复至少五个连续的AMBIC / ACN洗涤。对于银染凝胶，使用脱色试剂盒。进行到下一个步骤，当凝胶片变成均匀的白色，而在ACN。
- 移液器关闭任何液体从玻璃管，重新盖上试管，加入1 ml AMBIC并静置5分钟。
- 除去AMBIC并加入2毫升乙酸乙酯（EtOAc）在玻璃管。重述管有聚四氟乙烯衬里的盖并置于4℃过夜终过端搅动或备选地执行三个的EtOAc洗涤液在室温下每次30分钟。越长的EtOAc洗涤，更有效地去除污染物。
- 清除最终的EtOAc洗涤，并执行各洗涤三次用2ml H 2 O完全除去乙酸乙酯，将确保一个强大的还原β消去反应。
- 移液器关H 2 O和1毫升乙腈洗涤脱水后的凝胶。
注：干燥后，将脱水的凝胶是准备用于凝胶β消去。脱水的凝胶碎片可以储存在-20℃直到使用。 - 阻止洗涤过 程中，在任何步骤，并存储凝胶片在4℃下过夜，无论哪个缓冲液或溶液加到凝胶的（AMBIC，乙腈，H 2 O）。在随后两天随时重新启动的样品制备。
- 用于通过标准的蛋白质组方法的蛋白质的ID使用的脱色和干燥凝胶片的一部分上。
2.凝胶O-聚糖通过还原β-消除发行
- 制备的，用50％NaOH或固体NaOH，并储存于4℃直至使用1M氢氧化钠（NaOH）中的储备液。
注：使β消去反应进行18小时后，脱盐过程必须在同一天内进行。
3.脱盐的阳离子交换层析
- 同时保持样品管在冰上，以防止热的形成过剩，慢慢加入10％乙酸（AcOH中）滴加至中和碱。轻轻涡旋添加乙酸之间的样品管中。小心地慢慢加酸和降明智的additi于酸时会产生泡沫的“火山”。离心管，以消除泡沫，防止溢出，如果需要的话。
- 为了除去在反应混合物中的大量的钠，通过一个小的阳离子交换柱（的Dowex或AG-50W-X8树脂，H +型 ）通过将反应混合物。
- 用1M NaOH和冲洗阳离子交换树脂1M的HCl中，以便用它来删除与MS的分析，干扰，即使树脂是分析纯的污染物之前。
- 浸泡在树脂中的1M NaOH和通过倾析除去溶液。加入去离子水，除去水分，再加入1M的盐酸。
- 重复这些步骤，直到树脂上面的解决方案是无色的。在4℃下于5％AcOH的洗涤清洗的树脂用离子交换水和存储。
- 使一个小的玻璃柱，划痕和使用陶瓷刀具，使得移液管尖的锥大约为1厘米长打破玻璃巴斯德吸管尖。逗除了玻璃棉塞和推向前端形成用于树脂床的支持体。固定用夹具或衣夹和地点在玻璃试管中的吸移管列。
- 用1毫升甲醇（MeOH中）和3毫升5％AcOH的洗空吸管。漩涡的H +的Dowex AG50或阳离子交换树脂浆液储存在5％AcOH中进行传送的浆料，足以产生在巴斯德移液管塔1毫升床体积。
- 冲洗用五卷5％乙酸的列。检查流动通过对树脂粒子的外观和不使用该列是否被检测到的树脂。
- 将列在一个新的螺旋盖的玻璃试管（16×125毫米）和负载样本。收集通过流量和洗脱聚糖与至少3倍体积的5％AcOH的进入同一管中。
- 覆盖用Parafilm管和使微小的孔，用针。将样品管在-80℃下或在干冰上。一旦冻结，干燥样品冷冻干燥。存储该干燥材料在-20℃C，直到使用。
4.硼酸盐去除
- 准备10％乙酸的甲醇。取10毫升冰醋酸中，并调整体积至100毫升，用甲醇。存储此试剂在玻璃瓶用特氟隆衬盖长达6个月。
- 在MeOH中添加300μl的10％AcOH中，以干燥的，冷冻干燥的样品管和涡流。除去所得到的硼酸三甲酯通过蒸发下在N 2流中。
注：在酸性条件下混合硼酸盐，用甲醇产生的硼酸三甲酯是一种挥发性化合物。 - 在N 2流在37℃下干燥。干燥后，如在步骤4.2中所述的甲醇加入AcOH中的另一个等分试样。干燥的液体在氮气下5分钟（N 2），在37℃的流。
- 重复再悬浮和干燥至少3倍。存储该干燥材料在-20℃直到使用。
5. C18清理
- 一个平衡C18墨盒列（大小为1毫升，100毫克树脂），使用三册ACN和五卷5％的乙酸。通过应用温和的正气压的加速平衡的解决方案通过。
- 加入500微升5％的AcOH的脱盐和硼酸盐的无样品管中，并通过涡旋溶解。
- 再悬浮的样品加载至平衡的C18柱，并通过收集流入的玻璃螺旋盖管（13×100毫米）。洗脱O型聚糖用3毫升5％AcOH的进入同一管中。
- 封口膜管，使小孔用小针或使用松散的闭合的PTFE衬里的盖来覆盖管，冷冻的样品在-80℃下或在干冰上。通过冷冻干燥除去溶剂。储存在-20℃直到使用干燥的样品。
6.基本准备全甲基
注：为了实现强大的全甲基，准备氢氧化钠浆新鲜。用于全甲基反应，所有的玻璃器皿，应广泛地清洗。
- 为了制备碱试剂对全甲基，加入400μl的50％的NaOH于洁净的玻璃螺旋盖管（13×100毫米）。加入800微升的无水甲醇和旋涡。
- 加入4毫升无水二甲亚砜（DMSO）和涡流产生白色沉淀。
- 离心机在600×g离心1分钟以沉淀的沉淀物。移液器关闭上清并丢弃。添加额外的4毫升无水DMSO中的沉淀。旋涡。
- 重复步骤6.2和6.3的最小的3次以上，或直至没有形成白色沉淀。
- 溶解在3毫升无水DMSO中的沉淀碱和通过吸取用干净的巴斯德吸管向上和向下轻轻混匀。
- 立即对下面的全甲基反应用的碱，因为它不能被存储。
7.全甲基发布聚糖
- 加入200μl无水DMSO为C18-纯化样品和涡流或超声重悬。
- 加入300微升的resusp的端基泥浆的样品，并立即加入100微升碘甲烷（MEI）。密封管有聚四氟乙烯衬里的盖和剧烈通过涡旋混合5分钟。
- 要停止全甲基反应，在冰和涡加2 ml 5％的乙酸。吸液上下5次通过蒸发来降低尾的剩余量。
注：乙酸中和该溶液，并在逐步分区的过程中除去的MeI的增加硫酸化聚糖的提取效率到水相中。 - 加入2毫升二氯甲烷（DCM）并涡旋。离心机在600×g离心1分钟，在室温下以分离水相和有机相。
- 转移的顶层（含有大部分全甲基化的硫酸化多糖的水相）到一个新的玻璃试管（13×100mm）上。
- 加入2毫升的H 2 O连接至有机相并涡旋。离心机在600×g离心1分钟，以分离水相和有机相，并结合该第二水相用冷杉圣水相（步骤7.5）。
- 重复步骤7.6和7.5 3次以上，但没有必要保存从后续分区所得的水相。
- 除去最后的上层（水相）尽可能多地从所述底部层（有机相）和下层（有机相）转移到用清洁巴斯德吸管单独的新的玻璃试管中。
- 干燥在N 2流中的有机相在42℃。
- 覆盖管用Parafilm并储存在-20℃直至使用。
从水相8的C18清理的全甲基硫酸O型聚糖
- 平衡与三卷ACN和五卷5％乙酸的C18墨盒列。
- 加载收集并从步骤7.5和7.6上柱结合的水相。
- 用10毫升H 2 O代表脱盐洗柱。
- 洗脱全甲基硫酸化O-聚糖成用2ml新的玻璃管的50％ACN。使用一个额外的洗脱85％ACN，以提高较大的低聚糖全甲基硫酸化O-聚糖恢复。
- 在氮气流下，在42℃下干燥洗脱液。
- 于-20℃下向上的干燥材料存储到之前MS分析6个月。
的全甲基O型聚糖9质谱
- 全甲基-O-聚糖通过直接注入到分析用纳电喷雾源在0.40-0.60μl/ min的在210℃的毛细管温度注射器流速适当质谱仪。对于碎片通过CID在MS / MS和的离子阱仪器级质谱，应用30-40％的碰撞能量。
- 对于负离子模式，重构全甲基硫酸化O-聚糖在50μl甲醇/ 2-丙醇/ 1-丙醇/ 13毫摩尔乙酸铵水溶液（16：3：3：2，体积比）。对于正离子模式，重构在50μl的1 mM的钠水电全甲基中性/唾液酸化的O型聚糖西德在甲醇/水（1：1）。
- 使用的总离子映射的Xcalibur软件2.0版（TIM）和中性丢失扫描（NL扫描）功能的MSN分析表征单个O型聚糖结构13,19。
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Representative Results
醋酸乙酯处理对此前在凝胶还原β-消除
从牛用凝胶还原性β-消除粘蛋白释放的全甲基化O-连接的糖链样品的代表性质谱示于图3中 。在凝胶片的乙酸乙酯洗涤有效地除去SDS和聚丙烯酸污染物，它们与随后的MS分析27干涉。
聚丙烯酰胺凝胶片之前在凝胶还原性β-消除图3乙酸乙酯洗涤增强检测释放的聚糖。 （A）在不洗涤，用乙酸乙酯，从牛颌下腺粘蛋白释放的凝胶内β-消除全甲基O-连接的聚糖的质谱图是由多分散的共丰盈为主ntaminant，几乎完全掩盖了与O连接聚糖相关的MS的信号。 （B）中洗涤的凝胶片，用乙酸乙酯消除污染物的峰，从而灵敏地检测聚糖。从熊谷25修改。
回收O连接聚糖是小切胶大
O-连接的聚糖是从牛颌下腺中凝胶还原β-消除用凝胶片那宗的切片小（〜2×2mm）的或大的（〜5×5mm）的释放粘蛋白通过。凝胶片小于〜2×2mm的未有效地通过洗涤步骤中回收。以下全甲基，一个全甲基外部聚糖标准的已知量（maltotri-和maltotetrasaccharide，DP3和DP4）加入到每个便于聚糖恢复27的定量。的O-连接的糖链由小凝胶片的回收率几乎10倍大于从大的凝胶切片（图4）。
从小型凝胶片图4.聚糖回收率比从较大件更有效。小件（〜2×2mm）的产生大于立方体（〜5×5mm）的更多聚糖。条显示为归一化到检测到的外部标准（maltotrisaccharide DP3，设定为100％），将其加入到释放聚糖MS分析之前，该信号都O-连接的聚糖结构的总和的相对信号强度。数值为N = 3的平均标准偏差。从熊谷ķ25修改。
Sulfoglycans由相富集分区
一个全甲基硫酸化多糖标准（磺乐一 ）在水相中完全恢复。从日发布了全甲基化唾液酸化聚糖Ë粘蛋白糖蛋白分成DCM相（ 图5）。每个全甲基化的聚糖通过水-有机分区中的回收率为比得上以前表征的C18的Sep-Pak清理方法27。相位划分方法的效率和简易性极大地方便了样品处理量和随后的分析的方法。
图5.差分的磺基和唾液酸聚糖由相分区恢复。经受还原性β-消除之前牛粘蛋白的糖蛋白中掺入了的磺聚糖标准（磺乐a）一种已知量。释放聚糖全甲基化和全甲基反应调节至1：1：水：DCM中。将所得的有机相和水相分离，并通过质谱进行分析。多糖回收率相对定量ative到全甲基外多糖的标准，这是飙升到MS分析前样品。聚糖回收率到有机（DCM）和水（水）相所示的相对于外部的标准，将其设定为100％。 Sulfoglycans未检测到有机相中，但定量地回收在水相中。结果代表平均值±三次独立实验的SE。从熊谷25修改。
生物样品中的应用深入的蛋白质组学和Glycomic分析
人的唾液蛋白通过SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝（G-250）。高分子量蛋白质在MW〜600 kDa的从凝胶切出，并在凝胶片的一部分进行胶内胰蛋白酶消化和LC-MS / MS的基于蛋白质组分析，其中确定该频带作为MUC5B 16,24 。所述凝胶片的其余部分进行凝胶内热镀莫如β-消除对O型聚糖分析27。以下全甲基和水 - 有机相分区（水：DCM中，1：1），全甲基化在水相和有机相聚糖由NSI-MS进行分析。非硫酸化的全甲基-O-聚糖，从有机相回收，所有的全甲基化sulfoglycans被从水相中，这有利于近等压硫酸化和非硫酸化多糖， 例如鉴定和表征回收，岩藻糖1十六进制3 HexNAc 2半乳糖胺醇（M / Z = 1606.8，[M +的Na] +）和（SO 3）1的NeuAc 1岩藻糖1六角2 HexNAc 1半乳糖胺醇（M / Z = 1606.7，[M + 2Na的-H] +）通过仅0.1质量单位不同，将难以解决，而不物理地相分隔（ 图6）中分离出2种。
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图6检测的同量异序复杂性在中性和磺聚糖通过水-有机间隔隔开。从总离子流图（TIM）的分析，从人类唾液发布全甲基O型聚糖粘蛋白在凝胶β-消除和水的检测母离子质谱获得2分片模式：下面全甲基DCM分区。 （A）中的MS 2从DCM相对于M / Z = 1608（B）的周围的2.8质量部窗口的TIM分析的MS 2谱相同的质量窗口用于水相的TIM的分析。在DCM相，主要碎片离子对应于十六进制1 -O（M / Z 1370.8），岩藻糖1六角3 HexNAc的损失2+钠（1331.8），岩藻糖1的损失六角1 -O（1196.7），损耗妖术1 HexNAc 1（1143.6），亏损岩藻糖1六角1 HexNAc 1（969.5），损耗中岩藻糖1六角2 HexNAc 1 -O（747.4），岩藻糖1六角1 HexNAc 1 +娜（660.4），和十六进制1 HexNAc 1 +娜（486.3）。基于这些碎片离子，提出的非硫酸化的结构，岩藻糖1六角3 HexNAc 2半乳糖胺醇的组合物的混合物中所示的频谱的右边。与此相反，主要碎片离子的水相是损失的SO 3的Na（1486.8），损耗的NeuAc的（1231.5），岩藻糖1十六进制1 -O（1196.7）的NeuAc的组合的损失的损失和SO 3 Na（上1111.8），和1的NeuAc的损失六角1 -O（1009.4）。 1的NeuAc 1岩藻糖1六角2 HexNAc 1半乳糖胺醇提议-硫酸化结构与组成（SO 3）的混合物。如果没有中立，sulfoglycans的物理分离用相分区，诠释MS 2这种混合物的光谱是显著的更多通道allenging。从熊谷25修改。 请点击这里查看图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS ≥99.7% w/w |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μl, needle size 22s G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μl, needle size 22s G |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μl, needle size 26s G |
| Petri Dish Glass 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
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