Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री में जेल सुधार reductive β-उन्मूलन व्यापक ओ से जुड़े और के लिए sulfo-Glycomics

doi: 10.3791/51840 Published: November 20, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ग्लाइकोसिलेशन जीवधारी शरीर क्रिया विज्ञान, ऊतक विकृति, और सेलुलर मान्यता 1-3 के लिए योगदान, एक आवश्यक प्रोटीन बाद translational संशोधन है. विश्लेषणात्मक glycoscience में प्रमुख प्रगति के बावजूद, एक विशिष्ट प्रोटीन पर glycans की पूरी विविधता निस्र्पक विशेष रूप से प्राथमिक जैविक स्रोतों से अलग प्रोटीन पर, एक बेहद चुनौती भरा काम रहता है. बहरहाल, ग्लाइकोप्रोटीन glycans की microheterogeneity अक्सर अन्य प्रोटीन के साथ कार्यात्मक बातचीत को प्रभावित करता है. इसलिए, glycan विविधता के लक्षण वर्णन सेलुलर और ऊतक ग्लाइकोसिलेशन 4,5 के शारीरिक महत्व को समझने के लिए आवश्यक है. ऊतक शरीर विज्ञान और pathophysiology, मजबूत, संवेदनशील, और व्यापक glycomic विश्लेषणात्मक तकनीकों को ग्लाइकोप्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के योगदान को समझने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण बन गए हैं. प्रोटिओमिक विश्लेषण में, प्रोटीन पहचान आम तौर पर नियंत्रण रेखा एमएस द्वारा प्राप्त कर रहे हैं/ Tryptic पेप्टाइड्स 6 के एमएस विश्लेषण. प्रोटीन पाचन ऐसे 7-9 trypsin रूप प्रोटिएजों साथ में जेल पाचन निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ द्वारा हल एक शुद्ध प्रोटीन या प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है. एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन मिश्रण की प्री-संवर्धन प्रोटीन आईडी की गहराई और सटीकता को बढ़ाता है. ग्लाइकोप्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की glycomic विश्लेषण के लिए अनुरूप रणनीति के विकास glycoscience के मामले में सबसे आगे है.

glycans के दो प्रमुख वर्गों एन उठाना या ओ-लिंकेज या तो के माध्यम से प्रोटीन अनिवार्य जरूरतों से जुड़े होते हैं. एन से जुड़े glycans asparagine से जुड़े होते हैं (ASN) Asn-एक्स सर्विसेज / Thr / Cys के रूप में परिभाषित एक sequon के हिस्से के रूप में पाया अवशेष (एक्स प्रोलाइन को छोड़कर किसी भी अमीनो एसिड होता है), और peptide- एन के साथ enzymatic पाचन द्वारा जारी किया जा सकता है -glycanase (PNGaseF या ए), या तो समाधान में, में जेल, या पर-धब्बा 10-12. हे से जुड़े glycans मुख्य रूप से सेरीन (SER) या threonine (THR) अवशेषों से जुड़े होते हैं. हालांकि, केवल एक एंजाइम पहचान की गई हैग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans को रिहा करने में सक्षम है और यह केवल सरल ओ-लिंक्ड glycans रिहा, एक अत्यंत सीमित glycan विशिष्टता है कि tified. केमिकल रिलीज रणनीतियों ग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans की व्यापक रिहाई के लिए पसंद की विधि रहते हैं. Reductive या गैर reductive β-उन्मूलन, या hydrazinolysis अच्छी तरह से विशेषता रासायनिक रिहाई तकनीकों हैं और ग्लाइकोप्रोटीन 13,14 से ओ से जुड़े glycans रिहा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण वर्तमान में कर रहे हैं. Reductive β-उन्मूलन एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन से ओ से जुड़े glycans जारी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो पिछले दृष्टिकोण बाद के विश्लेषण के 15-17 के लिए एचपीएलसी जुदाई की आवश्यकता है.

बहुआयामी एमएस (एमएस एन) विश्लेषण वर्तमान में सबसे जैविक स्रोतों से उम्मीद की मात्रा में पृथक ग्लाइकोप्रोटीन से रिहा glycans निस्र्पक के लिए संरचनात्मक डेटा के सबसे अमीर स्रोत प्रदान करता है. एमएस की गहराईआधारित संरचनात्मक लक्षण वर्णन बहुत पहले उनके विश्लेषण के लिए जारी किया glycans permethylating से मदद की है. Permethylation आयनीकरण को बढ़ाता है और glycan संरचनाओं 18,19 के एक विस्तृत रेंज में दाढ़ संकेत प्रतिक्रियाओं बराबर हो जाता है. इसके अलावा, permethylation असंदिग्ध जिससे संरचनात्मक व्याख्या 20-23 बढ़ाने विशिष्ट जनता के साथ टर्मिनल और एवजी मोनोसैकराइड moieties, टैग. उदाहरण के लिए, अम्लीय glycans एमएस द्वारा गैर permethylated प्रजाति के रूप में पता लगाने के लिए आम तौर पर मुश्किल हो जाता है. अम्लीय glycans एमएस द्वारा नकारात्मक आयन मोड में पता लगाया जा सकता है, यह एक ही आयन मोड में दोनों अम्लीय और तटस्थ glycans पता लगाने के लिए असंभव है. Glycan permethylation का एक प्रमुख लाभ permethylated के रूप में एक glycan के मोनोसैकराइड substituents पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूह (ओएच) की उन सभी के रूप में पहचाने बनाने, एक मिथाइल समूह (OCH 3 या OME), इस प्रकार एक sialylated glycan के आरोपों निष्प्रभावी कर रहे हैं के साथ छाया हुआ होगा कि है तटस्थ (एशियालो) glycans. हालांकि, sulfoglycans पर सल्फेट moieties की hydroxyls के आयनीकरण दबा और संवेदनशीलता कम हो जाती है जो ऋणात्मक प्रभारी, की अवधारण, जिसके परिणामस्वरूप permethylation लिए प्रतिरोधी रहे हैं. इस दमन वर्तमान सल्फेटकृत glycans 24-26 के एक उच्च बहुतायत ले जो ऐसे mucins के रूप में बहुत जटिल ग्लाइकोप्रोटीन, की व्यापक glycomic विश्लेषण से बचाता है.

सफ़ाई सल्फेटकृत glycans पर हाल की रिपोर्टों से रिवर्स चरण शुद्ध करने के लिए क्रोमैटोग्राफी और MALDI विश्लेषण करने से पहले अलग permethylated glycans, आरोप लगाया करते थे. इस विधि हम जैविक चरण विभाजन से कम कठोर हो पाया है जो क्षालन के लिए विभिन्न मोबाइल चरणों, का उपयोग सल्फेटकृत और गैर-सल्फेटकृत glycans की पूरी जुदाई पर निर्भर करता है. इसलिए, sulfoglycans का पता लगाने और संवर्धन के लिए उपयुक्त नई तकनीकों यहां प्रस्तुत कर रहे हैं. इन तकनीकों में पानी निम्नलिखित जलीय चरण में सल्फेटकृत glycans की मात्रात्मक वसूली के लिए अनुमति देते हैं: डीसीएम (dichloromethane)नियमित glycan permethylation प्रतिक्रियाओं 27 के अंत में किया जाता है जो निष्कर्षण,. भी एमएस 2 विखंडन पैटर्न को सरल बनाने, जबकि महत्वपूर्ण बात है, permethylated गैर सल्फेटकृत glycans के मिश्रण से permethylated sulfoglycans के इस मजबूत जुदाई समन्वित रूप से आरोप लगाया प्रजातियों के लिए समृद्ध करती. सुधार में जेल ओ-लिंक्ड glycan विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है. सुधार प्रोटोकॉल, glycan वसूली बढ़ाता एमएस के माध्यम से प्राप्य एन permethylated glycans के विश्लेषण संरचनात्मक जानकारी बढ़ जाती है, और जैविक स्रोतों से पृथक आवश्यक ग्लाइकोप्रोटीन के लिए लागू sulfoglycomic विश्लेषण की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है.

इस प्रोटोकॉल पूरे ग्लाइकोप्रोटीन निष्कर्षों की ओ से जुड़े glycan विश्लेषण के लिए या एसडीएस पृष्ठ द्वारा हल ब्याज की एक विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन का इरादा है और तीन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं से बना है; ए) जेल सफाई, बी) में जेल reductive β-उन्मूलन, और सी) glycan permethyआबादी. लक्ष्य जैविक ब्याज (चित्रा 1) के प्राथमिक स्रोतों से काटा ग्लाइकोप्रोटीन के लिए व्यापक ओ-लिंक्ड glycomic डेटा प्राप्त करने के लिए है. एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन धुंधला और ब्याज के बैंड excised हैं और जिसके परिणामस्वरूप जेल बैंड छोटे टुकड़ों में कटा हुआ है द्वारा दिखाए जा रहे हैं. जेल टुकड़े destained और जेल संदूषकों (2A चित्रा) को हटाने के लिए एथिल एसीटेट washes के लिए किया जाता है. Glycan रिहाई में जेल reductive β-उन्मूलन (चित्रा 2B) द्वारा हासिल की है और जारी glycans permethylated रहे हैं. जलीय जैविक निकासी निम्नलिखित permethylation मात्रात्मक दूर गैर सल्फेटकृत तटस्थ glycans (चित्रा -2) से ऋणात्मक सल्फेटकृत glycans विभाजन. इन-जेल जलीय-जैविक निकासी के लिए युग्मित reductive β-उन्मूलन एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग ग्लाइकोप्रोटीन की थोड़ी मात्रा से रिहा ओ-लिंक्ड glycans और sulfoglycans के लक्षण वर्णन में सक्षम बनाता है. सामरिक सिंहावलोकन summari हैचित्रा 1 और विवरण में जेड चित्रा 2 में दिखाया गया है. इसके अलावा, destained और धोया जेल टुकड़े के एक हिस्से मानक नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रोटिओमिक तकनीक से प्रोटीन आईडी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नोट: लैब सुरक्षा चिंताएं

मानक प्रयोगशाला सर्वोत्तम प्रथाओं के साथ रखने में, निम्न पाते. उपयुक्त स्थानों में सभी कार्बनिक सॉल्वैंट्स स्टोर. रासायनिक रचनाओं का स्पष्ट लेबलिंग के साथ रासायनिक कचरे के कंटेनर में सब बेकार सामग्री रखें. इन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कई अभिकर्मकों के रूप में संभावित कार्सिनोजन हैं या अस्थिर दहनशील गैसों उत्पन्न वेंटिलेशन के साथ एक धूआं हुड में सभी अभिकर्मकों संभाल. कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ काम कर रहा है जब इस तरह के दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और नेत्र सुरक्षा के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें.

चित्रा 1
में जेल ओ-Glycomics के लिए 1. प्रक्रिया चित्रा. ब्याज की (ए) प्रोटीन उचित धुंधला प्रक्रियाओं (Coomassie या चांदी) द्वारा पता लगाया, एसडीएस पृष्ठ द्वारा हल, और excised हैं. Excised जेल टुकड़े कटा रहे हैंछोटे cubes में, destained, और बाद में एमएस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कि contaminants को कम करने के लिए एथिल एसीटेट से धोया. जेल टुकड़ा के एक हिस्से को नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस द्वारा में जेल tryptic पाचन और बाद प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए आरक्षित किया जा सकता है. (बी) ओ से जुड़े glycans में जेल reductive β-उन्मूलन द्वारा हल ग्लाइकोप्रोटीन से जारी कर रहे हैं. आवश्यक कदम desalting और मेथनॉल के साथ स्थिरक्वाथी मिश्रण से borate हटाने शामिल हैं. Permethylated और बाद में जलीय और जैविक चरणों में विभाजित कर रहे हैं (सी) reductive β-उन्मूलन द्वारा जारी glycans ओ से जुड़े. Sulfoglycans मात्रात्मक ऊपरी (जलीय) चरण में बरामद कर रहे हैं कम (डीसीएम) परत में तटस्थ और sialylated glycans विभाजन करते हुए.

चित्रा 2
में जेल Glycomics के लिए चित्रा 2. विस्तार प्रवाह चार्ट. प्रत्येक experimenचित्र 1 में दिखाया ताल कदम व्यक्तिगत रूप से यह साफ है. (ए) जेल destaining और EtOAc निकासी, (बी) में जेल reductive ओ-लिंक्ड glycan रिहाई के लिए β-उन्मूलन, और प्रत्यक्ष (सी) permethylation और चरण विभाजन. आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

1. जेल छांटना और जेल व्युत्पन्न प्रदूषणों से हटाना

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, माल की सूची में सूचीबद्ध रसायन और अभिकर्मकों तैयार करते हैं.
  2. मानक Tris-Glycine बफर सिस्टम का उपयोग कर एसडीएस पृष्ठ जेल पर प्रोटीन का समाधान करें. दाग Coomassie खूब ब्लू या रजत दाग के साथ या तो प्रोटीन का संकल्प लिया. सामान्य तौर पर, चांदी दाग ​​जैल से ओ से जुड़े glycans की वसूली Coomassie से हासिल की वसूली की लगभग 80-90% जैल दाग है.
  3. वैद्युतकणसंचलन के बाद, एक गिलास प्लेट और आबकारी टी पर जेल जगहएक स्वच्छ स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग ब्याज की वह क्षेत्र.
  4. हे-glycans की उपज बढ़ाने के लिए एक और गिलास प्लेट पर ब्याज की जेल बैंड हस्तांतरण और लगभग 2 मिमी cubes में excised जेल टुकड़ा काट करने के लिए. Glycan वसूली कम हो जाता है क्योंकि जेल टुकड़े छोटे से कम 1 मिमी क्यूब्स बनाने से बचें. एक स्टेनलेस स्टील microspatula साथ एक पेंच शीर्ष ग्लास ट्यूब (13 x 100 मिमी) में छोटे जेल टुकड़े स्थानांतरण.
  5. नमूना ट्यूब 25 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट (AMBIC, 3 एनएच 4 HCO) के 1 मिलीलीटर, एक Teflon लाइन पेंच शीर्ष टोपी के साथ ग्लास ट्यूब टोपी जोड़ने, और धीरे 10 मिनट के लिए खड़े देने से पहले ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण. जेल टुकड़े तेजस्वी से बचने के क्रम में जोरदार आंदोलन को रोजगार न करें.
  6. ध्यान से एक पाश्चर कांच विंदुक या एक अतिरिक्त लंबी प्लास्टिक की टिप से सुसज्जित एक पिपेट का उपयोग ग्लास ट्यूब से AMBIC हटा दें. मुंहतोड़ और AMBIC समाधान निकालते समय छोटे जेल टुकड़े को स्थानांतरित करने से बचें.
  7. को acetonitrile (ACN) के 1 मिलीलीटर जोड़ेंग्लास ट्यूब, टोपी, और धीरे 10 मिनट के लिए खड़े दे से पहले ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण. जेल टुकड़े पूरी तरह से विलायक के साथ आते हैं कि सुनिश्चित करें. यदि आवश्यक हो, ट्यूब दीवार के बंद और विंदुक टिप के साथ विलायक में जेल टुकड़े धक्का.
  8. ग्लास ट्यूब से ACN बंद पिपेट और चमकदार नीले रंग समाप्त हो रहा है जब तक दोहराएँ 1.5-1.7 कदम. यदि आवश्यक हो तो पांच अनुक्रमिक AMBIC / ACN washes की एक न्यूनतम दोहराएँ. चांदी दाग ​​जैल के लिए, एक destain किट का उपयोग करें. जेल टुकड़ा ACN में समान रूप से सफेद, जबकि बदल जाता है जब अगले कदम के लिए आगे बढ़ें.
  9. , ग्लास ट्यूब से किसी तरल बंद पिपेट ट्यूब संक्षिप्त, AMBIC के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
  10. AMBIC निकालें और ग्लास ट्यूब को एथिल एसीटेट (EtOAc) के 2 मिलीलीटर जोड़ें. वैकल्पिक रूप से अंत से अधिक अंत आंदोलन या साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर Teflon लाइन टोपी और जगह के साथ हालात ट्यूब 30 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर तीन EtOAc washes के प्रदर्शन. अब EtOAc धोने, प्रदूषणों से अधिक कुशल हटाने.
  11. हटानाअंतिम EtOAc धोने और एच 2 ओ के 2 मिलीलीटर के साथ तीन washes के प्रत्येक प्रदर्शन EtOAc का पूरी तरह हटाने के लिए एक मजबूत reductive β-उन्मूलन प्रतिक्रिया सुनिश्चित करेगा.
  12. एच 2 ओ बंद पिपेट और ACN के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने से जेल निर्जलीकरण.
    नोट: सूखने के बाद, निर्जलित जैल में जेल β-उन्मूलन के लिए तैयार हैं. निर्जलित जेल टुकड़े उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता.
  13. परवाह किए बिना जेल के लिए लागू किया जाता है, जो बफर या समाधान की, किसी भी कदम पर कपड़े धोने की प्रक्रिया बंद करो और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल टुकड़े की दुकान (AMBIC, ACN, एच 2 ओ). अगले 2 दिनों के भीतर कभी भी नमूना तैयार पुनरारंभ करें.
  14. मानक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण से प्रोटीन आईडी के लिए destained और निर्जलित जेल टुकड़े के एक हिस्से का उपयोग करें.

Reductive β-उन्मूलन द्वारा 2. में जेल ओ-glycan रिलीज

  1. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 50% NaOH या ठोस NaOH और दुकान का उपयोग 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के एक शेयर के समाधान तैयार है. 50% NaOH (या ठोस NaOH के 4 जी) की 5.2 मिलीलीटर ले लो और 1 एम NaOH समाधान बनाने के लिए 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें. Reductive β-उन्मूलन प्रतिक्रियाओं में दक्षता की हानि के बिना 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, जो 100 मिमी NaOH, के लिए 1 एम NaOH शेयर समाधान पतला.
  • 100 मिमी NaOH में 2 एम सोडियम borohydride (NaBH 4) बनाते हैं. 100 मिमी NaOH के 0.5 मिलीलीटर में NaBH 4 की 38 मिलीग्राम भंग. आम तौर पर, प्रत्येक नमूने के लिए borohydride समाधान के 0.5-1.0 मिलीलीटर का उपयोग करें. चरण 1 में तैयार सूखे जेल टुकड़े की राशि पर प्रतिक्रिया समाधान की मात्रा 1-2 excised जेल टुकड़े (1.3 चरण) के लिए borohydride समाधान के 0.5 मिलीलीटर उपयोग करने की उम्मीद बदलती हैं.
  • निर्जलित जेल टुकड़े करने के लिए 100 मिमी NaOH के 500 μl जोड़ें और glycan वसूली बढ़ाने के जो बुनियादी शर्तों को जेल संतुलित करने के लिए आदेश में बर्फ पर 3-5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
  • 1 एम NaBH के अंतिम सांद्रता में जिसके परिणामस्वरूप, 100 मिमी NaOH में 2 एम NaBH 4 की 500 μl जोड़ें
  • ऊष्मायन के पहले घंटे के दौरान, धीरे ट्यूब हर 15 मिनट मिश्रण. यह जेल टुकड़े टुकड़ा हो सकता है, क्योंकि मजबूत आंदोलन से बचें. एक अच्छी तरह से equilibrated इनक्यूबेटर / ओवन में या एक हीटिंग ब्लॉक में प्रतिक्रिया प्रदर्शन करना. जेल टुकड़े प्रतिक्रिया समाधान के साथ आते हैं कि सुनिश्चित करें.
  • इनक्यूबेटर या हीटिंग ब्लॉक से नमूना ट्यूब को हटाने और बर्फ पर रखकर प्रतिक्रिया बंद करो.
    नोट: β-उन्मूलन प्रतिक्रिया 18 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति के बाद, desalting प्रक्रिया एक ही दिन के भीतर किया जाना चाहिए.
  • कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी पर 3. desalting

    1. बर्फ पर नमूना ट्यूब को बनाए रखने के लिए अत्यधिक गर्मी के गठन को रोकने के लिए करते हैं, धीरे धीरे आधार बेअसर करने के लिए 10% एसिटिक एसिड (AcOH) dropwise जोड़ें. धीरे AcOH के परिवर्धन के बीच नमूना ट्यूब भंवर. धीरे धीरे एसिड जोड़ने के लिए सावधान रहें और additi के रूप में बुद्धिमान ड्रॉपएसिड की पर बुलबुले की एक "ज्वालामुखी" का उत्पादन होगा. यदि आवश्यक हो, बुलबुले को खत्म करने और बाहर छलकते को रोकने के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र.
      1. प्रतिक्रिया मिश्रण में सोडियम की बड़ी राशि को दूर करने के लिए, एक छोटे कटियन विनिमय स्तंभ (Dowex या एजी-50W-X8 राल, एच + प्रपत्र) के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण से गुजरती हैं.
      2. 1 एम NaOH और साथ कटियन विनिमय राल धो 1 एम एचसीएल राल विश्लेषणात्मक ग्रेड का है, भले ही एमएस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कि को दूर करने के क्रम में उपयोग करने के लिए पहले.
      3. 1 एम NaOH में राल लेना और निस्तारण से समाधान निकालें. तो 1 एम एचसीएल जोड़ने, पानी निकालने, de-ionized पानी जोड़ें.
    2. राल ऊपर समाधान बेरंग है जब तक इन चरणों को दोहराएँ. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% AcOH में विआयनीकृत पानी और दुकान से साफ राल धो लें.
    3. एक छोटा गिलास स्तंभ, खरोंच बनाने और पिपेट टिप की घटना लगभग 1 सेमी लंबा है तो एक चीनी मिट्टी कटर का उपयोग कर एक पाश्चर कांच पिपेट की नोक तोड़ने के लिए. कांच ऊन की एक प्लग अलग छेड़ो और राल बिस्तर के लिए एक समर्थन के गठन सिरे की ओर धक्का. एक गिलास टेस्ट ट्यूब पर एक दबाना या clothespin और जगह के साथ पिपेट स्तंभ सुरक्षित.
    4. मेथनॉल के 1 मिलीलीटर (MeOH) और 3 मिलीग्राम के 5% AcOH साथ खाली पिपेट धो लें. भंवर एच + Dowex या AG50 कटियन विनिमय राल घोल 5% AcOH में संग्रहीत और पाश्चर पिपेट स्तंभ में एक 1 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा का उत्पादन करने के घोल का पर्याप्त हस्तांतरण.
    5. 5% AcOH के पांच संस्करणों का उपयोग कर स्तंभ कुल्ला. राल कणों की उपस्थिति के लिए के माध्यम से प्रवाह और राल का पता चला है अगर स्तंभ का उपयोग नहीं करते की जाँच करें.
    6. एक नया पेंच शीर्ष ग्लास ट्यूब (16 एक्स 125 मिमी) और लोड नमूना से अधिक स्तंभ रखें. के माध्यम से प्रवाह लीजिए और एक ही ट्यूब में 5% AcOH के कम से कम 3 संस्करणों के साथ glycans elute.
    7. Parafilm के साथ ट्यूब कवर और एक सुई के साथ छोटे छेद करना. -80 डिग्री सेल्सियस या सूखी बर्फ पर नमूना ट्यूब रखें. जमे हुए एक बार, lyophilization द्वारा नमूना सूखी. -20 डिग्री पर सूखे सामग्री स्टोरउपयोग करें जब तक सी.

    4. Borate निकालना

    1. MeOH में 10% AcOH तैयार करें. हिमनदों एसिटिक एसिड के 10 एमएल लो और मेथनॉल के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें. अप करने के लिए 6 महीने के लिए Teflon लाइन टोपी के साथ एक कांच की बोतल में इस अभिकर्मक स्टोर.
    2. सूखे, lyophilized नमूना ट्यूब और भंवर MeOH में 10% AcOH के 300 μl जोड़ें. एक एन 2 धारा के तहत वाष्पीकरण द्वारा परिणामस्वरूप trimethyl borate निकालें.
      नोट: अम्लीय परिस्थितियों में मेथनॉल के साथ borate लवण मिश्रण एक अस्थिर यौगिक है जो trimethyl borate पैदा करता है.
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एन धारा के तहत सूखी. कदम 4.2 में वर्णित के रूप में सुखाने के बाद, MeOH में AcOH की एक और विभाज्य जोड़ें. नाइट्रोजन के तहत 5 मिनट (एन 2) 37 डिग्री सेल्सियस पर धारा के लिए तरल सूखी.
      1. दोहराएँ मेजबान और सुखाने में कम से कम 3 बार. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे सामग्री स्टोर.

    5. C18 क्लीन-अप

    1. एक C18 कारतूस स्तंभ संतुलित करनाACN के तीन खंडों और 5% AcOH के पांच संस्करणों का उपयोग (आकार 1 मिलीग्राम, 100 मिलीग्राम राल). हल्के सकारात्मक हवा के दबाव के आवेदन के द्वारा equilibrating समाधान के पारित होने में तेजी लाने के.
    2. Desalted और borate मुक्त नमूना ट्यूब को 5% AcOH के 500 μl जोड़ें और भंवर से भंग.
    3. Equilibrated C18 स्तंभ पर resuspended नमूना लोड और एक गिलास पेंच टोपी ट्यूब (13 x 100 मिमी) में के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा. Elute ओ-glycans ही ट्यूब में 5% AcOH के 3 मिलीलीटर के साथ.
    4. , ट्यूब parafilm एक छोटी सुई के साथ छोटे छेद बनाने के लिए या ट्यूब को कवर करने के लिए शिथिल बंद PTFE लाइन टोपी का उपयोग, और -80 डिग्री सेल्सियस या सूखी बर्फ पर नमूना फ्रीज. Lyophilization द्वारा विलायक निकालें. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे नमूना स्टोर.

    Permethylation के लिए 6. बेस तैयार करना

    नोट: मजबूत permethylation प्राप्त NaOH के घोल ताजा तैयार करने के लिए आदेश में. Permethylation प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल सभी कांच के बने पदार्थ बड़े पैमाने पर साफ किया जाना चाहिए.

    1. , Permethylation के लिए आधार अभिकर्मक तैयार एक साफ ग्लास पेंच शीर्ष ट्यूब (13 x 100 मिमी) से 50% NaOH के 400 μl जोड़ें. निर्जल MeOH और भंवर के 800 μl जोड़ें.
    2. एक सफेद वेग उत्पन्न करने के लिए निर्जल डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) और भंवर के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. वेग गोली 1 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट और त्यागें. गोली के लिए निर्जल DMSO के एक अतिरिक्त 4 मिलीलीटर जोड़ें. भंवर.
    4. दोहराएँ कदम 6.2 और तीन से अधिक बार की या कोई सफेद वेग रूपों तक 6.3 एक न्यूनतम.
    5. 3 एमएल निर्जल DMSO में pelleted आधार भंग और धीरे से एक स्वच्छ पाश्चर विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण.
    6. यह जमा नहीं किया जा सकता है के रूप में निम्नलिखित permethylation प्रतिक्रिया के लिए तुरंत बेस का प्रयोग करें.

    विमोचन Glycans 7. Permethylation

    1. C18 शुद्ध नमूना और भंवर या resuspend को sonicate को निर्जल DMSO के 200 μl जोड़ें.
    2. Resusp के 300 μl जोड़ेंनमूने के लिए एंडेड आधार गारा और तुरंत iodomethane के 100 μl (मेई) जोड़ें. Teflon लाइन टोपी के साथ ट्यूब सील और सख्ती भंवर से 5 मिनट के लिए मिश्रण.
    3. , Permethylation प्रतिक्रिया रोक बर्फ और भंवर पर 5% AcOH के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए. पिपेट समाधान ऊपर और नीचे 5 बार वाष्पीकरण द्वारा मेई की शेष मात्रा को कम करने के लिए.
      नोट: AcOH समाधान neutralizes और मेई को हटाने के चरण-विभाजन के दौरान पानी चरण में सल्फेटकृत glycans की निकासी क्षमता बढ़ जाती है.
    4. Dichloromethane (डीसीएम) और भंवर के 2 मिलीलीटर जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र जलीय और जैविक चरणों अलग करने के लिए.
    5. एक नई ग्लास ट्यूब (13 x 100 मिमी) में शीर्ष स्तर (permethylated सल्फेटकृत glycans का बहुमत होता है कि जलीय चरण) स्थानांतरण.
    6. जैविक चरण और भंवर के लिए एच 2 ओ के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 600 XG 1 के लिए मिनट पर अपकेंद्रित्र जलीय और जैविक चरणों अलग और एफआईआर के साथ इस दूसरे जलीय चरण गठबंधन करने के लिएसेंट जलीय चरण (चरण 7.5).
    7. दोहराएँ कदम 7.6 और 7.5 तीन गुना अधिक है, लेकिन बाद के विभाजन से उत्पन्न जलीय चरणों को बचाने के लिए कोई जरूरत नहीं है.
    8. नीचे की परत (जैविक चरण) से जितना संभव हो उतना अंतिम ऊपर परत (जलीय चरण) निकालें और स्वच्छ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक अलग नई ग्लास ट्यूब में नीचे की परत (जैविक चरण) हस्तांतरण.
    9. 42 डिग्री सेल्सियस पर 2 एन धारा के तहत जैविक चरण सूखी.
    10. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर Parafilm के साथ ट्यूब और दुकान को कवर किया.

    जलीय चरण से Permethylated सल्फेटकृत ओ-glycans 8. C18 क्लीन-अप

    1. ACN के तीन खंडों और 5% AcOH के पांच संस्करणों के साथ एक C18 कारतूस स्तंभ संतुलित करना.
    2. एकत्र और कदम स्तंभ पर 7.5 और 7.6 से संयुक्त जलीय चरणों लोड करें.
    3. Desalting के लिए एच 2 ओ के 10 एमएल के साथ स्तंभ धो लें.
    4. Elute permethylated सल्फेटकृत 2 मिलीलीटर के साथ एक नई ग्लास ट्यूब में हे-glycans50% ACN की. बड़े oligosaccharides पर permethylated सल्फेटकृत ओ-glycans की वसूली बढ़ाने के लिए 85% ACN के साथ एक अतिरिक्त क्षालन का प्रयोग करें.
    5. 42 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन धारा के तहत सूखी eluates.
    6. एमएस विश्लेषण करने से पहले 6 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस ऊपर में सूखे सामग्री स्टोर.

    Permethylated ओ-glycans 9. मास स्पेक्ट्रोमेट्री

    1. 210 डिग्री सेल्सियस केशिका तापमान में 0.40-0.60 μl / मिनट की एक सिरिंज प्रवाह की दर में एक nanoelectrospray स्रोत का उपयोग कर एक उपयुक्त मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रत्यक्ष अर्क से permethylated ओ-glycans का विश्लेषण करें. एमएस / एमएस और एक आयन जाल साधन के एमएस एन में सीआईडी ​​द्वारा विखंडन के लिए, 30-40% टक्कर ऊर्जा लागू होते हैं.
    2. नकारात्मक आयन मोड के लिए, पुनर्गठित permethylated सल्फेटकृत ओ-glycans मेथनॉल / 2-propanol / 1-propanol के 50 μl में / 13 मिमी जलीय अमोनियम एसीटेट (16: 3: 3: मात्रा द्वारा 2). सकारात्मक आयन मोड के लिए, 1 मिमी सोडियम हाइड्रो का 50 μl में तटस्थ / sialylated ओ-glycans permethylated पुनर्गठितमेथनॉल / पानी में xide (1: 1).
    3. व्यक्तिगत ओ-glycan संरचनाओं 13,19 विशेषताएँ एमएसएन विश्लेषण के लिए Xcalibur सॉफ्टवेयर पैकेज संस्करण 2.0 की कुल आयन मानचित्रण (टिम) और तटस्थ नुकसान स्कैन (नाथन स्कैन) कार्यक्षमता का उपयोग.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    इन-जेल reductive β-उन्मूलन के लिए एथिल एसीटेट उपचार के प्रभाव से पहले

    में जेल reductive β-उन्मूलन का उपयोग mucin गोजातीय से रिहा permethylated ओ-लिंक्ड glycan नमूने का एक प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रम 3 चित्र में दिखाया गया है. जेल टुकड़े की EtOAc धोने प्रभावी ढंग बाद एमएस विश्लेषण 27 के साथ हस्तक्षेप जो एसडीएस और polyacryl contaminants को हटा.

    चित्रा 3
    पूर्व में जेल reductive β-उन्मूलन के लिए polyacrylamide जेल टुकड़ा चित्रा 3. इथाइल एसीटेट धोने जारी glycans का पता लगाने को बढ़ाता है. एथिल एसीटेट, गोजातीय submaxillary mucin से में जेल β-उन्मूलन द्वारा जारी permethylated ओ-लिंक्ड glycans की बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम के साथ धोने के बिना (ए) एक polydisperse सह के एक बहुतायत का बोलबाला हैलगभग पूरी तरह से ओ से जुड़े glycans के साथ जुड़े एमएस संकेतों obscures जो ntaminant,. (बी) वॉशिंग एथिल एसीटेट के साथ जेल टुकड़ा glycans के संवेदनशील पता लगाने की अनुमति, संदूषक चोटियों समाप्त. Kumagai 25 से संशोधित.

    हे से जुड़े glycan की रिकवरी लघु जेल स्लाइस से अधिक है

    हे से जुड़े glycans में जेल reductive β-उन्मूलन या तो छोटे से कटा रहे थे कि जेल टुकड़े (~ 2 एक्स 2 मिमी) या बड़े (~ 5 एक्स 5 मिमी) का उपयोग करके mucin गोजातीय submaxillary से जारी किए गए. जेल टुकड़े छोटे ~ 2 एक्स 2 मिमी कुशलता से धोने के कदम के माध्यम से बरामद नहीं किया गया है. बाद permethylation, एक permethylated बाहरी glycan मानक का एक ज्ञात राशि (maltotri- और maltotetrasaccharide, Dp3 और Dp4) glycan वसूली 27 की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए प्रत्येक को जोड़ा गया है. छोटे जेल टुकड़े से ओ से जुड़े glycans की वसूली लगभग (बड़े जेल स्लाइस से अधिक से अधिक 10 गुना थाचित्रा 4).

    चित्रा 4
    छोटे जेल टुकड़े से चित्रा 4. glycan वसूली बड़े टुकड़े से अधिक से अधिक कुशल है. छोटे टुकड़े (~ 2 एक्स 2 मिमी) बड़े क्यूब्स (~ 5 एक्स 5 मिमी) से अधिक glycan झुकेंगे. बार्स एमएस विश्लेषण से पहले जारी glycan को जोड़ा गया है जो एक बाहरी मानक (100% के लिए सेट maltotrisaccharide Dp3,), के लिए पता लगाया संकेत के लिए सामान्यीकृत सब ओ से जुड़े glycan संरचनाओं की राशि के लिए रिश्तेदार संकेत तीव्रता दिखाते हैं. मान N = 3 के लिए मतलब मानक विचलन कर रहे हैं. Kumagai कश्मीर में 25 से संशोधित.

    चरण विभाजन से Sulfoglycans का संवर्धन

    एक permethylated सल्फेटकृत glycan मानक (sulfo-ल क) पूरी तरह से जलीय चरण में बरामद किया गया था. वें से जारी Permethylated sialylated glycansई डीसीएम चरण में विभाजित ग्लाइकोप्रोटीन (चित्रा 5) mucin. जलीय-जैविक विभाजन से प्रत्येक permethylated glycans की वसूली पहले विशेषता C18 Sep-पाक सफाई विधि 27 के बराबर था. चरण विभाजन विधि की दक्षता और सादगी बहुत नमूना throughput और बाद के विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की सुविधा.

    चित्रा 5
    चरण विभाजन से sulfo- और sialo-glycans चित्रा 5. विभेदक वसूली. गोजातीय mucin ग्लाइकोप्रोटीन reductive β-उन्मूलन के लिए किए जाने से पहले एक sulfo-glycan मानक (sulfo-ल क) के नाम से जाना जाता राशि के साथ नुकीला गया था. विमोचन glycans permethylated गया और permethylation प्रतिक्रिया 1 को समायोजित किया गया: 1: पानी: डीसीएम. जिसके परिणामस्वरूप जैविक और जलीय चरणों अलग और एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया. Glycan वसूली रिलायंस एनर्जी मात्रा निर्धारित किया गया थाएमएस विश्लेषण से पहले नमूने में नुकीला गया जो permethylated बाहरी glycan मानकों को ative. जैविक (डीसीएम) और जलीय में glycan वसूलियां (जल) चरणों 100% करने के लिए स्थापित किया गया था जो बाहरी मानक के सापेक्ष दिखाए जाते हैं. Sulfoglycans जैविक चरण में undetectable थे लेकिन मात्रात्मक जलीय चरण में बरामद किया. परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसई ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं. Kumagai 25 से संशोधित.

    जैविक नमूने में गहराई प्रोटिओमिक के लिए आवेदन और Glycomic विश्लेषण

    मानव लार प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ द्वारा अलग और Coomassie खूब ब्लू (जी-250) के साथ दाग रहे थे. मेगावाट ~ 600 केडीए में एक उच्च आणविक भार प्रोटीन जेल से excised गया था और जेल टुकड़ा के एक हिस्से MUC5B 16,24 के रूप में इस बैंड की पहचान की, जिसमें जेल tryptic पाचन और नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण, के अधीन था . जेल टुकड़ा के शेष में जेल redu के अधीन था ओ-glycan विश्लेषण 27 के लिए ctive β-उन्मूलन. बाद permethylation और जलीय-जैविक चरण विभाजन (जल: डीसीएम, 1: 1), जलीय और जैविक चरणों में glycans प्रासंगिकता एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया permethylated. गैर-सल्फेटकृत 3 HexNAc 2 fuc 1 हेक्स, हे glycans जैविक चरण से बरामद किए गए और permethylated sulfoglycans के सभी जैसे लगभग समदाब रेखीय सल्फेटकृत और गैर-सल्फेटकृत glycans, की पहचान और लक्षण वर्णन की सुविधा है, जो जलीय चरण से बरामद किए गए permethylated GalNAc-राजभाषा (एम / Z = 1606.8, [एम + ना] +) और (एसओ) 3 1 NeuAc 1 fuc 1 हेक्स 2 HexNAc 1 GalNAc-राजभाषा (एम / Z = 1606.7, [एम + 2Na-एच] +) केवल 0.1 जन इकाइयों से अलग और शारीरिक रूप से चरण विभाजन (चित्रा 6) द्वारा दो प्रजातियों को अलग करने के बिना हल करने के लिए मुश्किल होगा.

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "चौड़ाई =" 700px "/>
    जलीय-जैविक विभाजन द्वारा अलग तटस्थ और sulfo-glycans में समदाब रेखीय जटिलता के 6. जांच चित्रा. द्वारा में जेल β-उन्मूलन और पानी mucin मानव लार से रिहा permethylated ओ-glycans की कुल आयन मानचित्रण (टिम) विश्लेषण द्वारा पता लगाया माता पिता आयनों से प्राप्त एमएस 2 विखंडन पैटर्न permethylation निम्नलिखित डीसीएम विभाजन. मी / z = 1608 (बी) के चारों ओर एक 2.8 जन इकाई खिड़की के लिए डीसीएम चरण के टिम विश्लेषण से (ए) एम 2 पानी चरण के टिम विश्लेषण के लिए एक ही बड़े पैमाने पर खिड़की के एमएस 2 स्पेक्ट्रम. डीसीएम-चरण में प्रमुख टुकड़ा आयनों हेक्स 1 -O (एम / Z 1370.8), fuc 1 हेक्स 3 HexNAc के नुकसान 2 + ना (1331.8), fuc 1 के नुकसान हेक्स 1 -O (1196.7), हानि के अनुरूप fuc 1 की हेक्स 1 HexNAc 1 (1143.6), नुकसान की हेक्स 1 HexNAc 1 (969.5), नुकसानfuc 1 हेक्स 2 HexNAc 1 -O (747.4), fuc के 1 हेक्स 1 HexNAc 1 + ना (660.4), और हेक्स 1 HexNAc 1 + ना (486.3). स्पेक्ट्रम के अधिकार के लिए दिखाया के रूप में इन टुकड़ा आयनों के आधार पर, fuc 1 हेक्स 3 HexNAc 2 GalNAc-राजभाषा की एक रचना के साथ गैर-सल्फेटकृत संरचनाओं का एक मिश्रण का प्रस्ताव है. इसके विपरीत, पानी चरण के लिए प्रमुख टुकड़ा आयनों अतः 3 ना (1486.8) NeuAc की, नुकसान (1231.5), fuc 1 हेक्स 1 -O (1196.7), NeuAc के संयोजन के नुकसान के नुकसान के नुकसान और इतने 3 ना (हैं 1111.8), और NeuAc 1 की हानि -O (1009.4 हेक्स 1). 1 NeuAc 1 fuc 1 हेक्स 2 HexNAc 1 GalNAc-राजभाषा का प्रस्ताव है - एक की रचना (अतः 3) के साथ सल्फेटकृत संरचनाओं का मिश्रण. एमएस 2 की व्याख्या चरण विभाजन से तटस्थ और sulfoglycans की भौतिक जुदाई, बिना इस तरह के मिश्रण का स्पेक्ट्रा काफी अधिक चर्चा हैallenging. Kumagai 25 से संशोधित. आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3, (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126, (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280, (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3, (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224, (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6, (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17, (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250, (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71, (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283, (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423, (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74, (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15, (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6, (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203, (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282, (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5, (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77, (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77, (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79, (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12, (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19, (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30, (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85, (18), 8692-8699 (2013).
    मास स्पेक्ट्रोमेट्री में जेल सुधार reductive β-उन्मूलन व्यापक ओ से जुड़े और के लिए sulfo-Glycomics
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter