Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2, 1
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Introduction

Glykosylering er en viktig protein post-translasjonell modifikasjon, bidrar til organisme fysiologi, vev patologi, og cellegjenkjenning 1-3. Til tross for store fremskritt innen analytisk glycoscience, karakteriserer hele mangfoldet av glykaner på et bestemt protein er fortsatt en svært utfordrende oppgave, spesielt på proteiner isolert fra primære biologiske kilder. Likevel, mikroheterogenitet av glykoprotein glykaner ofte påvirker funksjonelle interaksjoner med andre proteiner. Derfor er vesentlig for forståelsen av den fysiologiske betydningen av cellulært vev og glykosylering 4,5 karakterisering av glykan diversitet. For å forstå bidrag av glykoprotein glykosylering til vev fysiologi og patofysiologi, robust, følsom, og omfattende glycomic analytiske teknikker har blitt stadig viktigere. I proteomikk analyse, blir protein identifikasjoner generelt oppnådd ved LC-MS/ MS-analyse av tryptiske peptider 6. Protein spaltning kan utføres ved hjelp av et renset protein eller proteiner løst ved hjelp av SDS-PAGE-gel i følgende spaltning med proteaser som trypsin 7-9. Pre-anrikning av proteinblanding ved hjelp av SDS-PAGE øker dybden og nøyaktigheten av protein ID. Utviklingen av analoge strategier for glycomic analyse av glykoprotein glykosylering ligger i forkant av glycoscience.

De to hovedklasser av glykaner er festet til protein stamnett gjennom enten N-lenke eller O-kobling. N-bundne glykaner er festet til asparagin (Asn) rester som finnes som en del av et definert som sequon Asn-X-Ser / Thr / Cys (X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin), og kan frigis ved enzymatisk spaltning med N peptid- -glycanase (PNGaseF eller A), enten i oppløsning, i-gel, eller on-blot 10-12. O-bundne glykaner er hovedsakelig festet til serin (Ser) eller treonin (Thr) rester. Imidlertid har bare ett enzym blitt Idenserte som er i stand til å frigjøre O-bundne glykaner fra glykoprotein, og det har en ekstremt begrenset glykan spesifisitet, og slipper bare de enkleste O-bundne glykaner. Kjemisk utslipp strategier forbli metoden for valg for omfattende utgivelsen av O-forbundet glykaner fra glykoproteiner. Reduktiv eller ikke-reduktiv β-eliminering, eller hydrazinolyse er godt karakteriserte kjemiske utslipp teknikker og er i dag de mest brukte metoder for å slippe O-forbundet glykaner fra glykoproteiner 13,14. Selv om reduktiv β-eliminering er blitt brukt til å frigjøre O-bundne glykaner fra glykoproteiner separert ved SDS-PAGE, tidligere tilnærminger HPLC-separasjon som kreves for etterfølgende analyse 15-17.

Flerdimensjonal MS (MS n) analyse gir i dag den rikeste kilden til strukturelle data for karakter glykaner løslatt fra glykoproteiner isolert i de mengder som forventes fra de fleste biologiske kilder. Dybden av MS--basert strukturell karakterisering er det mye lettere å permethylating de frigitte glykaner før sin analyse. Permethylation forbedrer ionisering og har en tendens til å utjevne molare signal responser over et bredt spekter av sukkerstrukturer 18,19. I tillegg permethylation entydig tags terminal og erstattet monosakkarid delene med karakteristiske massene, og dermed styrke strukturoppklaring 20-23. For eksempel sure glykaner er generelt vanskelig å oppdage som ikke-permethylated arter av MS. Selv om sure glykaner kan påvises i negativ ion-modus ved MS, er det umulig å påvise både sure og nøytrale glykaner i samme ion-modus. En stor fordel med glykan permethylation er at alle de frie hydroksylgrupper (OH) på et glykan s monosakkarid-substituenter vil være avkortet med en metylgruppe (OCH3 eller OMe), for således en sialyserte glykan for ladninger nøytralisert, noe som gjør dem så påvises som permethylated nøytral (asiaLO) glykaner. Imidlertid hydroksylene av sulfatrestene på sulfoglycans er motstandsdyktig mot permethylation, noe som resulterer i bibeholdelse av anionisk ladning, som undertrykker ionisering og minsker følsomheten. Dette undertrykkelse hindrer tiden omfattende glycomic analyse av svært komplekse glykoproteiner som muciner, som bærer en høy overflod av sulfaterte glykaner 24-26.

Nye rapporter om rensing av sulfatert glykaner brukt belastet, reverse-fase kromatografi å rense og separate permethylated glykaner før MALDI analyse. Denne metoden er avhengig av fullstendig skille sulfaterte og ikke-sulfat glykaner ved hjelp av ulike mobilfaser for eluering, som vi har funnet å være mindre strenge enn organiske fasen partisjonering. Derfor er nye teknikker som er egnet for påvisning og berikelse av sulfoglycans presenteres her. Disse teknikker gjør det mulig for den kvantitative utvinning av sulfaterte glykaner i den vandige fasen etter vann: DCM (diklormetan)ekstraksjon, som blir rutinemessig utført ved slutten av 27 glykan permethylation reaksjoner. Viktigere, denne robuste separasjon av permethylated sulfoglycans fra en blanding av permethylated ikke-sulfat glykaner samtidig beriker for ladede arter samtidig forenkle MS 2 fragmentering mønstre. En omfattende protokoll for forbedret i-gel O-forbundet glycan analyse er også presentert. Den forbedrede protokollen forbedrer glycan utvinning, øker den strukturelle informasjoner gjennom MS n analyse av permethylated glykaner, og forbedrer følsomheten sulfoglycomic analyser anvendt på essensielle glykoproteiner isolert fra biologiske kilder.

Denne protokollen er ment for O-bundet glykan analyse av hele glykoprotein ekstrakter eller av et spesifikt glykoprotein av interesse løst ved hjelp av SDS-PAGE, og er sammensatt av tre eksperimentelle prosedyrer; A) gel opprydning, B) in-gel reduktiv β-eliminering, og C) glycan permethyning. Målet er å få omfattende O-forbundet glycomic data for glykoproteiner høstet fra primærkilder biologisk interesse (figur 1). Glykoproteiner separert ved SDS-PAGE er visualisert ved farging og bånd av interesse er skåret ut, og den resulterende gel båndet er oppskåret i små stykker. Gelstykkene blir avfarget og underkastet etylacetat vaskinger for å fjerne forurensninger gel (figur 2A). Glycan utgivelsen oppnås ved in-gel reduktiv β-eliminering (figur 2B) og de ​​frigjorte glykaner er permethylated. Vandig-organisk ekstraksjon følgende permethylation kvantitativt partisjoner de anioniske sulfatert glykaner borte fra ikke-sulfat nøytrale glykaner (figur 2C). I-gel reduktiv β-eliminering koplet til vandig-organisk ekstraksjon muliggjør karakterisering av O-bundne glykaner og sulfoglycans frigjøres fra små mengder av glykoprotein separert ved SDS-PAGE. Den strategisk overblikk er summarized i figur 1, og detaljene er vist i figur 2. I tillegg kan en del av de avfarget og vaskes gelbitene bli brukt for protein ID ved standard LC-MS / MS proteomic teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Lab Sikkerhet Bekymringer

I tråd med standard laboratorie beste praksis, observere følgende. Lagre alle organiske løsemidler i passende steder. Hold alle avfallsmaterialer i kjemiske avfallsbeholdere med tydelig merking av kjemiske sammensetninger. Som flere reagenser som brukes i disse protokollene er potensielle kreftfremkallende eller generere flyktige brennbare gasser, håndtere alle reagenser i et avtrekksskap med ventilasjon. Bruk personlig verneutstyr som hansker, frakk og vernebriller når du arbeider med organiske løsemidler.

Figur 1
Figur 1. Prosedyre for i-gel O-glycomics. (A) Proteiner av interesse er løst ved hjelp av SDS-PAGE, oppdaget av egnet farging prosedyrer (Coomassie eller sølv), og skjæres ut. Skåret gelstykkene er skiveri små terninger, avfarget, og vasket med etylacetat for å redusere forurensninger som forstyrrer etterfølgende MS-analyse. En porsjon av gelen skive kan være reservert for in-gel tryptisk fordøyelse og påfølgende proteomikk karakterisering ved LC-MS / MS. (B) O-forbundet glykaner er løslatt fra løst glykoproteiner av i-gel reduktiv β-eliminering. Viktige skritt inkluderer avsalting og borat fjerning av azeotropen med metanol. (C) O-bundne glykaner frigjort ved reduktiv β-eliminering blir permethylated og senere oppdelt i vandige og organiske faser. Sulfoglycans er kvantitativt gjenvunnet i den øvre (vandige) fase under nøytrale og sialyserte glykaner skillevegg inn i den nedre (DCM) lag.

Figur 2
Figur 2. Detalj flytskjema for i-gel glycomics. Hver experimental trinnet vist i figur 1 er illustrert individuelt. (A) gel avfarging og EtOAc utvinning, (B) direkte i-gel reduktiv β-eliminering for O-forbundet glycan utgivelse, og (C) permethylation og fase partisjon. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

1. Gel Eksisjon Fjerning av Gel-avledet Forurensninger

  1. Før du starter prosedyren, forberede kjemikalier og reagenser er oppført i materiallisten.
  2. Løse protein på SDS-PAGE-gel ved anvendelse av standard Tris-glycinbuffer systemer. Stain løst proteiner med enten Coomassie Brilliant Blue eller Silver Stain. Generelt utvinning av O-forbundet glykaner fra sølv farget gels er ca 80-90% av oppgangen oppnådd fra Coomassie beiset geler.
  3. Etter elektroforese, plasser gel på en glassplate og avgiftsdirektoratet tHan regionen av interesse med en ren skalpell eller barberblad.
  4. For å øke utbyttet av O-glykaner, overføre gel band av interesse på en annen glassplate og skjære den utskårede gel stykke inn ca 2 mm kuber. Unngå å lage gel stykker mindre enn 1 mm kuber fordi glycan gjenvinning reduseres. Overfør de små gel stykker inn i en skrukork glassrør (13 x 100 mm) med en rustfritt stål microspatula.
  5. Tilsett 1 ml 25 mM ammonium bikarbonat (AMBIC, NH 4 HCO 3) til prøverør, cap glassrør med en teflonbelagt skrukork cap, og forsiktig bland ved å flikke røret før la stå i 10 min. Ikke ansette kraftig omrøring for å unngå ripping gel stykker.
  6. Fjern forsiktig AMBIC fra glassrør hjelp av enten en Pasteur glass pipette eller en pipette utstyrt med en ekstra lang plastspiss. Unngå knusende og overføre de små gel stykker mens du fjerner AMBIC løsning.
  7. Tilsett 1 ml acetonitril (ACN) iglassrør, cap, og forsiktig bland ved å flikke tube før la stå i 10 min. Pass på at gelstykkene er helt dekket med løsemiddel. Om nødvendig, trykk gel stykker av av rørveggen og inn løsemiddel med pipettespissen.
  8. Pipette off ACN fra glassrør og gjenta trinn 1,5-1,7 før den lyse blå fargen er eliminert. Gjenta minst fem sekvensielle AMBIC / ACN vasker om nødvendig. For sølv farget gels, bruk en destain kit. Fortsett til neste trinn når gelen stykke svinger jevnt hvitt mens i ACN.
  9. Pipette av eventuell væske fra glassrøret, oppsummering røret, legge en ml AMBIC og la stå i 5 min.
  10. Fjern AMBIC og tilsett 2 ml etylacetat (EtOAc) til glassrøret. Oppsummering rør med teflon-foret hette og sted ved 4 ° C over natten med ende-over-ende agitasjon eller alternativt utføre tre EtOAc vaskinger ved værelsestemperatur i 30 minutter hver. Jo lengre EtOAc vaske, jo mer effektiv fjerning av forurensninger.
  11. Fjerneden endelige EtOAc vaske og utføre tre vaskinger hver med 2 ml H 2 O. Fullstendig fjerning av EtOAc vil sikre en robust reduktiv β-elimineringsreaksjon.
  12. Pipette av H 2 O og virke uttørrende på gelen ved å vaske en gang med 1 ml ACN.
    MERK: Etter tørkingen er den dehydratiserte geler er klar for in-gel β-eliminering. Dehydratiserte gel stykker kan lagres ved -20 ° C inntil bruk.
  13. Stoppe vaskeprosessen på ethvert trinn, og lagre gelbitene ved 4 ° C over natten, uavhengig av hvilken buffer eller oppløsning påføres gelen (AMBIC, ACN, H2O). Starte prøveopparbeidelse når som helst i løpet av de neste to dagene.
  14. Bruke en del av de avfarvet og dehydrert gel stykker for protein ID ved hjelp av standard proteomikk tilnærminger.

2. I-gel O-glycan utløsning av Reduktiv β-Elimination

  1. Forbered en stamløsning av en M natriumhydroksid (NaOH) med 50% NaOH eller fast NaOH og oppbevar ved 4 ° C før bruk. Ta 5,2 ml av 50% NaOH (eller 4 g av fast NaOH), og justere volumet til 100 ml for å gjøre 1 M NaOH-løsning. Fortynn 1 M NaOH stamløsning til 100 mM NaOH, som kan bli lagret ved 4 ° C i opptil 6 måneder uten tap av effektivitet i reduktive β-eliminasjonsreaksjoner.
  • Gjør 2 M natriumborhydrid (NaBH 4) i 100 mM NaOH. Oppløs 38 mg NaBH4 i 0,5 ml 100 mM NaOH. Vanligvis bruker 0,5 til 1,0 ml av borhydrid-løsning for hver prøve. Variere volumet av reaksjonsoppløsningen på mengden av tørkede gel stykker fremstilt i trinn 1. forventer å bruke 0,5 ml av borhydrid-løsning for 1-2 skåret ut stykker gel (trinn 1.3).
  • Legg 500 mL av 100 mM NaOH til de dehydrerte gel stykker og la stå i 3-5 minutter på isen for å stabil gelen til grunnvilkårene som forbedrer glycan utvinning.
  • Legg 500 ul av 2 M NaBH4 i 100 mM NaOH, noe som resulterer i sluttkonsentrasjoner på 1 M NaBH
  • I løpet av den første timen med inkubasjon, forsiktig blande rør hvert 15 min. Unngå sterk uro, fordi det kan fragmentere gel stykker. Utføre reaksjonen i en brønn-inkubator ekvilibrert / ovn eller i en varmeblokk. Pass på at gelstykkene er dekket med reaksjonsløsningen.
  • Stopp reaksjonen ved å fjerne prøverøret fra inkubatoren eller varmeblokken og plassere den på is.
    MERK: Etter at β-elimineringsreaksjonen forløpe i 18 timer, må avsaltingsprosessen utføres i løpet av samme dag.

    • 3. Desalting på kationerbytte Kromatografi

    1. Under opprettholdelse av prøverøret på is for å forhindre overdreven varmedannelse, tilsett langsomt 10% eddiksyre (AcOH) dråpevis for å nøytralisere basen. Forsiktig vortex prøverøret mellom hver tilsetting av AcOH. Vær forsiktig med å legge syre sakte og slipp klok som additipå av syre vil frembringe en "vulkan" av bobler. Sentrifuger røret til å eliminere bobler og hindre smitte, om nødvendig.
      1. For å fjerne den store mengde av natrium i reaksjonsblandingen, reaksjonsblandingen passerer gjennom en liten kation-byttekolonne (Dowex eller AG-50W-X8 harpiks, H + -form).
      2. Vask kationbytteharpiks med 1 M NaOH og 1 M HCl før bruk for å fjerne forurensninger som forstyrrer MS-analyse, selv om harpiksen er av analytisk kvalitet.
      3. Sug harpiksen i en M NaOH og fjerne løsning ved dekantering. Legg de-ionisert vann, fjerne vann, deretter legge en M HCl.
    2. Gjenta disse trinnene til løsningen ovenfor harpiksen er fargeløs. Vask renset harpiks med ionisert vann og oppbevar i 5% AcOH ved 4 ° C.
    3. For å gjøre en liten glasskolonne, scratch og bryte tuppen av en Pasteur glass pipette ved hjelp av en keramisk klipperen slik at taper av pipettespissen er ca 1 cm lang. Erte fra hverandre en plugg av glassull og skyver mot det danner en støtte for harpikssjiktet spissen. Fest pipette kolonnen med en klemme eller klesklype og legg over et glass reagensrør.
    4. Vask den tomme pipette med 1 ml metanol (MeOH) og 3 ml 5% AcOH. Swirl H + Dowex AG50 eller kationbytteharpiks oppslemming som er lagret i 5% AcOH og overføre nok av oppslemmingen for å frembringe en 1 ml sjiktvolum i Pasteur-pipette kolonne.
    5. Rens kolonne under anvendelse av fem volumer av 5% AcOH. Sjekk strømme gjennom for utseendet på resinpartikler og ikke bruke kolonnen hvis harpiks er oppdaget.
    6. Plasser kolonne over en ny skrukork glassrør (16 x 125 mm) og belastningsprøve. Samle strømningen gjennom og eluer glykaner med minst 3 volumdeler 5% AcOH i det samme rør.
    7. Dekk røret med Parafilm og gjøre små hull med en nål. Plassere prøverøret ved -80 ° C eller på tørris. Når frosset, tørke prøven ved lyofilisering. Lagre det tørkede materiale ved -20 °C inntil bruk.

    4. Borate Removal

    1. Forbered 10% AcOH i MeOH. Ta 10 ml iseddik og justere volumet til 100 ml med metanol. Oppbevar dette reagenset i en glassflaske med Teflon-lined cap for inntil 6 måneder.
    2. Tilsett 300 ul av 10% AcOH i MeOH til den tørkede, lyofilisert prøverør og virvle. Fjern den resulterende trimethylborat ved fordampning under en N2 stream.
      MERK: Blanding borats salter med metanol under sure forhold produserer trimethylborat som er en flyktig forbindelse.
    3. Tørr under N2-strøm ved 37 ° C. Etter tørking, legge til en annen porsjon av AcOH i MeOH som beskrevet i trinn 4.2. Tørk væsken i 5 min under nitrogen (N2) strøm ved 37 ° C.
      1. Gjenta resuspendering og tørking minst 3 ganger. Lagre det tørkede materiale ved -20 ° C inntil bruk.

    5. C18 Clean-up

    1. Stabilisere en C18 kassett kolonne(Størrelse 1 ml, 100 mg harpiks) ved hjelp av tre volumer av ACN og fem volumer av 5% AcOH. Akselerere passasje av den ekvilibrerende løsninger ved anvendelse av mild positivt lufttrykk.
    2. Legg 500 mL av 5% AcOH til avsaltet og borat-free prøverør og oppløse ved vortex.
    3. Load resuspendert prøven ut på C18-kolonne ekvilibrert og samle strømningen gjennom inn i et glass skrukork rør (13 x 100 mm). Elute O-glykaner med 3 ml 5% AcOH i det samme rør.
    4. Parafilm røret, få små hull med en liten nål eller bruk løst lukket PTFE-foret hette for å dekke røret, og fryse prøven ved -80 ° C eller på tørris. Fjern løsningsmidlet ved frysetørking. Å lagre den tørkede prøven ved -20 ° C inntil bruk.

    6. Base Forberedelse til Permethylation

    MERK: For å oppnå robuste permethylation, forberede NaOH slurry frisk. Alt glass brukes for permethylation reaksjoner bør bli grundig rengjort.

    1. For å fremstille basen reagens for permethylation, tilsett 400 ul av 50% NaOH til et rent glass med skrutopprøret (13 x 100 mm). Legg 800 mL av vannfri MeOH og virvle.
    2. Tilsett 4 ml vannfri dimetylsulfoksid (DMSO) og vortex for å generere et hvitt bunnfall.
    3. Sentrifuger ved 600 xg i 1 min for å pelletere bunnfallet. Pipette av supernatant og kast. Legg en ekstra 4 ml vannfri DMSO til pelleten. Vortex.
    4. Gjenta trinn 6.2 og 6.3 minimum tre ganger eller til ingen hvite utfelling.
    5. Oppløse pelletert base i 3 ml vannfri DMSO og forsiktig bland ved å pipettere opp og ned med en ren Pasteur pipette.
    6. Bruk basen umiddelbart etter følgende reaksjons permethylation som det ikke kan lagres.

    7. Permethylation av frigitte Glykaner

    1. Tilsett 200 ul av vannfritt DMSO til C18-rensede prøven og vortex eller sonicate å resuspendere.
    2. Tilsett 300 ul av resuspended basis oppslemmingen til prøven og umiddelbart tilsett 100 ul av jodmetan (MEI). Forsegle røret med Teflon-lined cap og kraftig blande for 5 min med vortex.
    3. For å stoppe permethylation reaksjon, tilsett 2 ml 5% AcOH på is og vortex. Pipette løsningen opp og ned fem ganger for å redusere gjenværende volumet av Mei av fordampning.
      BEMERK: AcOH nøytraliserer oppløsningen og fjerning av MeI øker ekstraksjonseffektiviteten av sulfaterte glykaner i vannfasen i løpet av fase-partisjonen.
    4. Tilsett 2 ml diklormetan (DCM) og virvle. Sentrifuger ved 600 xg i 1 min ved romtemperatur for å separere de vandige og organiske faser.
    5. Overfør det øverste laget (vandig fase som inneholder mesteparten av permethylated sulfaterte glykaner) inn i en ny glassrør (13 x 100 mm).
    6. Tilsett 2 ml H2O til den organiske fase og virvle. Sentrifuger ved 600 xg i 1 min for å separere de vandige og organiske faser, og kombinere dette andre vandig fase med first vandig fase (trinn 7.5).
    7. Gjenta trinn 7.6, og 7,5 tre ganger til, men det er ikke nødvendig å lagre de vandige faser som følge av de etterfølgende skillevegger.
    8. Fjern det endelige topplaget (vandig fase) så mye som mulig fra det nederste laget (organisk fase) og overfør bunnlaget (organisk fase) i en separat ny glassrør ved bruk av ren Pasteur-pipette.
    9. Tørk den organiske fase under N2-strøm ved 42 ° C.
    10. Dekk røret med Parafilm og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.

    8. C18 Opprydding av Permethylated Sulfatert O-glykaner fra vannfasen

    1. Stabilisere en C18 kassett kolonne med tre bindene av ACN og fem volumer av 5% AcOH.
    2. Laste de vandige faser som er samlet og kombinert fra trinn 7.5 og 7.6 på kolonnen.
    3. Vask kolonnen med 10 ml H2O for avsalting.
    4. Eluere permethylated sulfat O-glykaner inn i en ny glassrør med 2 ml50% ACN. Bruk en ekstra eluering med 85% ACN for å øke utvinningen av permethylated sulfat O-glykaner på større oligosakkarider.
    5. Tørre eluater under en nitrogenstrøm ved 42 ° C.
    6. Lagre det tørkede materiale ved -20 ° C opp til 6 måneder før MS-analyse.

    9. massespektrometri av Permethylated O-glykaner

    1. Analyser permethylated O-glykaner ved direkte infusjon inn i en passende massespektrometer ved å bruke en nanoelectrospray kilde på en sprøyte strømningshastighet på 0,40 til 0,60 mL / min ved 210 ° C kapillær temperatur. For fragmentering av CID i MS / MS og MS n av et ion felle instrument, gjelder 30-40% kollisjonsenergi.
    2. For negative ion-modus, rekonstituere permethylated sulfatert O-glykaner i 50 ul metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM vandig ammoniumacetat (16: 3: 3: 2 på volumbasis). For positiv ion modus, rekonstituere permethylated nøytrale / sialyserte O-glykaner i 50 ul av 1 mM natrium hydroXide i metanol / vann (1: 1).
    3. Bruk den totale ion kartlegging (TIM) og nøytral tap scan (NL scan) funksjonaliteten i Xcalibur programvarepakken versjon 2.0 for MSn analyse for å karakterisere enkelt O-glycan strukturer 13,19.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Effekt av etylacetat Behandling Før In-gel Reduktiv β-Eliminering

    En representativ massespektrum av permethylated O-bundne sukker prøvene frigjort fra bovin mucin ved hjelp av in-gel reduktiv β-eliminering, er vist i figur 3. EtOAc-vaske av gelen stykker og fjerner effektivt SDS polyacryl forurensninger som interfererer med etterfølgende 27 MS-analyse.

    Figur 3
    Figur 3. Etylacetat vask av polyakrylamidgel-brikke før in-gel-β reduktiv eliminering forbedrer påvisning av frigjorte glykaner. (A) Uten vask med etylacetat, massespektrum av permethylated O-bundne glykaner frigjort ved in-gel β-eliminering fra bovin kjertler under mucin er dominert av en overflod av en polydispers contaminant, som nesten fullstendig skjuler de MS-signalene er forbundet med O-bundne glykaner. (B) vasking av gelen stykke med etylacetat eliminerer forurensende toppene, slik at sensitiv påvisning av glykaner. Modifisert fra Kumagai 25.

    Gjenoppretting av O-forbundet Glycan er Greater fra Small Gel Slices

    O-bundne glykaner ble frigjort fra bovin kjertler under mucin ved in-gel-β reduktiv eliminering ved hjelp av gel-stykker som enten var små skiver (~ 2 x 2 mm) og store (~ 5 x 5 mm). Gelstykkene mindre enn ~ 2 x 2 mm ble ikke effektivt utvinnes gjennom vasketrinnene. Etter permethylation, en kjent mengde av et permethylated ekstern standard glykan (maltotri- og maltotetrasaccharide, DP3 DP4 og) ble tilsatt til hver å lette kvantifisering av glykan utvinning 27. Gjenvinningen av O-bundne glykaner fra små stykker gel var nesten 10 ganger større enn fra store stykker gel (Figur 4).

    Figur 4
    Figur 4. Glycan utvinning fra små stykker gel er mer effektiv enn fra større stykker. Små biter (~ 2 x 2 mm) ga mer enn større glykan kuber (~ 5 x 5 mm). Linjer viser relative signalintensiteter for summen av alle O-bundne sukkerstrukturer normalisert til det signal som detekteres for en ekstern standard (maltotrisaccharide DP3, satt til 100%), som ble tilsatt til den frigjorte glykan før MS-analyse. Verdier er gjennomsnitt standardavvik for n = 3. Modifisert fra Kumagai K 25.

    Anrikning av Sulfoglycans av Fase Partition

    En permethylated sulfatert glykan standard (sulfo-Le a) ble fullstendig gjenvunnet i den vandige fase. Permethylated sialyserte glykaner løslatt fra the mucin glykoprotein partisjonert i DCM fasen (figur 5). Utvinningen av hver permethylated glykaner ved vandig-organisk partisjon var sammenlignbar med den tidligere karakteriserte C18 Sep-Pak clean-up-metoden 27. Effektivitet og enkelhet i den fasen partisjon metoden i stor grad forenkler prøvekapasitet og påfølgende analytiske tilnærminger.

    Figur 5
    Figur 5. Differensial utvinning av sulfo- og sialo-glykaner av fase partisjon. Bovine mucin glykoprotein ble tilsatt en kjent mengde av en sulfo-glykan-standard (sulfo-Le a) før de blir underkastet reduktiv β-eliminering. Utgitt glykaner ble permethylated og permethylation reaksjonen ble justert til 1: 1: vann: DCM. De resulterende organiske og vandige fasene ble separert og analysert ved MS. Glycan utvinning ble kvantifisert relAtive til permethylated eksterne sukker standarder, som ble tilsatt i prøven før MS analyse. Glykan gjenvinninger i den organiske (DCM) og vandig (vann) fase blir vist i forhold til det ytre standard, som ble satt til 100%. Sulfoglycans var detekterbar i den organiske fase, men kvantitativt gjenvunnet i den vandige fase. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Modifisert fra Kumagai 25.

    Søknad til In-depth proteomikk og Glycomic Analyser i biologiske prøver

    Humane spytt-proteiner ble separert ved SDS-PAGE og farget med Coomassie Brilliant Blue (G-250). Et høymolekylært protein ved MW ~ 600 kDa ble skåret ut fra gelen og en del av gelen stykket ble underkastet in-gel tryptisk fordøyelse og LC-MS / MS-analyse basert proteomikk, som identifisert dette bånd 16,24 som MUC5B . Det gjenværende av gelen stykket ble underkastet gel-i redu ctive β-eliminering for O-glykan-analyse 27. Etter permethylation og vandig-organiske fase skillevegg (vann: DCM, 1: 1), permethylated glykaner i de vandige og organiske faser ble analysert ved NSI-MS. Ikke-sulfatert permethylated O-glykaner ble utvunnet fra den organiske fase og alle de permethylated sulfoglycans ble gjenvunnet fra den vandige fase, noe som forenkler identifisering og karakterisering av nesten isobar sulfatert og ikke-sulfaterte glykaner, f.eks, Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2- GalNAc-ol (m / z = 1606,8 [M + Na] +) og (SO 3) NeuAc 1 1 1 Fuc Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol (m / z = 1606,7 [M + 2Na-H] +) avviker med kun 0.1 masseenheter og ville være vanskelig å løse uten fysisk separering av de to arter ved fasefordeling (Figur 6).

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "width =" 700px "/>
    Figur 6. Påvisning av isobaric kompleksiteten i nøytrale og sulfo-glykaner adskilt med vandig-organisk partisjon. MS 2 fragmentering mønstre hentet fra foreldre ioner oppdages av total ion kartlegging (TIM) analyse av permethylated O-glykaner løslatt fra menneskelige spyttslimstoff av i-gel β-eliminering og vann: DCM partisjon følgende permethylation. (A) MS 2 TIM fra analyse av DCM-fasen for en 2,8 masseenhet rundt vinduet m / z = 1608. (b) Den 2-MS spekteret av det samme massevindu for TIM analyse av vannfasen. I DCM-fasen, de viktigste fragmentioner tilsvare tapet av 1 Hex -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 Na + (1331,8), tap av Fuc 1 1 Hex -O (1196,7), tap Hex en HexNAc 1 (1143,6), tap av Fuc en Hex en HexNAc 1 (969,5), tapav Fuc en Hex to HexNAc en -O (747,4), Fuc en Hex en HexNAc 1 + Na (660,4), og Hex en HexNAc 1 + Na (486,3). Basert på disse fragmentioner, er en blanding av ikke-sulfaterte strukturer med en sammensetning av Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2-GalNAc-ol foreslått, som vist til høyre av spekteret. I kontrast til de store fragmentioner for vannfasen er tap av SO 3 Na (1486,8), tap av NeuAc (1231,5), tap av Fuc 1 1 Hex -O (1196,7), tap av kombinasjonen av NeuAc og SO 3 Na ( 1111,8), og tap av NeuAc en Hex en -O (1009,4). En blanding av sulfaterte strukturer med en sammensetning av (SO 3 -) 1 1 Fuc NeuAc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol er foreslått. Uten fysisk separasjon av det nøytrale og sulfoglycans ved fasefordeling, tolke MS 2-spektra av slike blandinger er betydelig mer challenging. Modifisert fra Kumagai 25. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    Tags

    Kjemi glykoprotein glykosylering in-gel reduktiv β-eliminering O-forbundet glycan sulfatert glycan massespektrometri protein ID SDS-PAGE glycomics sulfoglycomics
    Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T.,… More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter