Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2, 1
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Introduction

Гликозилирование является важным белком посттрансляционная модификация, способствуя организменном физиологии, ткани патологии и клеточной признания 1-3. Несмотря на значительные достижения в аналитической glycoscience, характеризующий полное разнообразие гликанах на специфического белка остается чрезвычайно сложной задачей, особенно на белки, выделенные из первичных биологических источников. Тем не менее, микрогетерогенность гликопротеина гликанов часто влияет функциональных взаимодействий с другими белками. Таким образом, характеристика гликана разнообразия имеет важное значение для понимания физиологическое значение клеточной и тканевой гликозилирования 4,5. Для того чтобы понять вклад гликопротеина гликозилирования к ткани физиологии и патофизиологии, надежной, чувствительной и комплексных glycomic аналитических методов становятся все более важными. В протеомного анализа, белковые идентификации, как правило, достигается с помощью ЖХ-МС/ MS анализ триптических пептидов 6. Белок пищеварение может быть осуществлена ​​с использованием очищенного белка или белков решена путем SDS-PAGE в следующий-гель расщеплением протеаз, таких как трипсин 7-9. Предварительно обогащение смеси белков с помощью SDS-PAGE повышает глубину и точность белка ID. Развитие аналогичных стратегий для glycomic анализа гликопротеина гликозилирования лежит на переднем крае glycoscience.

Два основных класса гликанах крепятся к белковых магистралей через любой N-связи или O-связи. N-связанных гликанов прикреплены к аспарагина (Asn) остатки, найденные в рамках sequon определяется как Asn-X-Ser / Thr / Cys (Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина), и может быть выпущен ферментативным расщеплением с пептидные N -glycanase (помощью PNGазы F или), либо в растворе, в-гель, или на 10-12-блота. О-связанных гликаны основном привязаны к серин (Ser) или треонина (Thr) остатков. Тем не менее, только один фермент был идентифицированы, что способна высвобождать О-связанных гликанов из гликопротеина, и это имеет очень ограниченную специфичность гликана, выпуская только самые простые О-связанных гликанов. Стратегии Химическая релиз остаются методом выбора для комплексного выпуска О-связанных гликанов из гликопротеинов. Восстановительное или нередуктивных β-устранение, или гидразинолиз методики хорошо охарактеризованные химической релиз и в настоящее время наиболее часто используемые подходы к выпуская О-связанных гликаны из гликопротеинов 13,14. Хотя восстановительное β-элиминирования был использован, чтобы выпустить О-связанных гликанов из гликопротеинов, разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ, прежние подходы требуется разделение ВЭЖХ для последующего анализа 15-17.

Многомерные MS (MS н) анализ в настоящее время предоставляет богатейший источник структурных данных для определения характеристик гликаны выпущенные из гликопротеинов, выделенных в сумме, от большинства биологических источников. Глубина МС-based структурная характеристика в значительной степени способствует permethylating высвободившиеся гликаны до их анализа. Permethylation усиливает ионизацию и имеет тенденцию к выравниванию молярных ответов сигналов в широком диапазоне гликанов структур 18,19. Кроме того, permethylation однозначно теги терминала и замещенных моносахаридов фрагменты с характерными массами, тем самым повышая структурного анализа 20-23. Например, кислотные гликанов, как правило, трудно обнаружить, как не-перметилированный видов с помощью МС. Хотя кислые гликанов могут быть обнаружены в режиме отрицательных ионов с помощью МС, невозможно обнаруживать как кислых и нейтральных гликанов в том же режиме ионов. Основным преимуществом гликановой permethylation является то, что все количества свободных гидроксильных групп (ОН) на моносахаридных заместителей гликанов будет ограничен метильной группой (ОСН 3 или OMe), таким образом, расходы сиалилированы гликанов являются нейтрализованной, что делает их, как обнаруживается, как перметилированный нейтральный (АзияLO) гликаны. Тем не менее, гидроксильные сульфатных остатков на sulfoglycans устойчивы к permethylation, в результате удержания анионного заряда, который подавляет ионизацию и снижает чувствительность. Это подавление настоящее время препятствует всеобъемлющей glycomic анализ очень сложных гликопротеинов, таких как муцинов, которые несут высокую численность сульфатированных гликанах 24-26.

Последние сообщения на очистных сульфатированный гликанов использовали заряжен, хроматографией с обращенной фазой, чтобы очистить и отдельные перметилированный гликанов до анализа MALDI. Этот метод основан на полном разделении сульфатированных и не сульфатированных гликанах использованием различных подвижных фаз для вымывания, которые мы нашли, чтобы быть менее строгими, чем органическую фазу разделения. Таким образом, новые методы, пригодные для обнаружения и обогащения sulfoglycans представлены здесь. Эти методы позволяют для количественного восстановления сульфатированных гликанов в водной фазе следующим воды: ДХМ (дихлорметан)экстракция, который обычно выполняется в конце гликанов реакций permethylation 27. Важно отметить, что этот надежный разделение перметилированных sulfoglycans из смеси перметилированных не-сульфатированных гликанов одновременно обогащает для заряженных частиц а также упрощение МС 2 модели фрагментации. Комплексный протокол для улучшения вывода связями гликана анализа в геле также представлены. Улучшенный протокол усиливает гликана восстановление, увеличивает структурную информацию, получаемую с помощью MS н анализ перметилированных гликанов, и улучшает чувствительность анализа sulfoglycomic применяемых к основным гликопротеинов, выделенных из биологических источников.

Этот протокол предназначен для O-связанных гликанов анализа целых гликопротеиновых экстрактов или конкретного интереса гликопротеина решена путем SDS-PAGE и состоит из трех экспериментальных процедур; ) Гель очистки, B) в геле восстановительное β-устранение, и C) гликана permethyтельства. Цель состоит в том, чтобы получить всесторонние О-связанных glycomic данные для гликопротеинов, собранного из основных источников биологического интереса (рисунок 1). Гликопротеины разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ которые визуализировали окрашиванием и полосы, представляющие интерес, вырезали и полученный гель полоса нарезанный на небольшие кусочки. Гелевые куски обесцвечивают и подвергали этилацетат промывок для удаления загрязнений гелевые (фиг.2А). Glycan релиз достигается в-гель восстановительного β-элиминирования (рис 2В), а высвобожденные гликаны перметилированный. Водно-органических добыча следующие permethylation количественно разбивает анионные сульфатированной гликаны от не-сульфатированных нейтральных гликанах (рис 2в). В-гель восстановительное β-элиминирования, соединенный с водно-органической экстракции дает характеристику О-связанных гликанов и sulfoglycans освобожденных из небольших количеств гликопротеина разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ. Стратегический обзор является конспектыЗет на рисунке 1 и детали показаны на рисунке 2. Кроме того, часть обесцвечивают и промывают кусочки геля может быть использован для белка ID стандартными LC-MS / MS протеомическим методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторные соображений безопасности

В соответствии со стандартными лабораторными лучших практик, соблюдайте следующие. Храните все органические растворители в соответствующих местах. Храните все отходы в контейнерах химических отходов с четкую маркировку химических составов. Как несколько реагентов, используемых в этих протоколах, являются потенциальными канцерогенами или генерировать летучие горючие газы, обрабатывать все реагенты в вытяжном шкафу с вентиляцией. Средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, халат и средства защиты глаз при работе с органическими растворителями.

Рисунок 1
Рисунок 1. Порядок в-гель уплотнительных glycomics. (A) Белки интерес решаются SDS-PAGE, обнаружены с помощью соответствующих процедур окрашивания (Coomassie или серебра), и вырезали. Вырезанные куски геля нарезанныйна маленькие кубики, обесцвечивают и промывают этилацетатом, чтобы уменьшить загрязняющие вещества, которые мешают последующего анализа MS. Часть куска геля могут быть зарезервированы для в-гель триптического пищеварения и последующей протеомного характеристики ЖХ-МС / МС. (B) О-связанных гликаны освобождаются от разрешенных гликопротеинов в-гель восстановительного β-элиминирования. Эфирные шаги включают обессоливания и борат ее удаления азеотропа с метанолом. (C) О-связанных гликанов выпущенные восстановительным β-элиминирования которые перметилированный и затем разделяется на водную и органическую фазы. Sulfoglycans количественно извлекают в верхней (водной) фазе в то время как нейтральные и сиалилированы гликанов раздела в нижнем слое (DCM).

Рисунок 2
Рисунок схема 2. Деталь для в-гель glycomics. Каждый экспериментальТаль шаг показано на рисунке 1 в индивидуальном рисунке. (A) гель Обесцвечивание и добыча EtOAc, (B) направлять в-гель восстановительное β-элиминирование для O-связанного гликана выпуска и (C) permethylation и фазы раздел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

1. Гель иссечение и удаление Гель-производных загрязняющих веществ

  1. Перед началом процедуры, подготовить химикаты и реактивы, перечисленные в списке материалов.
  2. Устранение белка на SDS-PAGE геле с использованием стандартных Трис-глицин буферных систем. Пятно решен белки с любой Кумасси или серебром. В общем, восстановление О-связанных гликанов из серебра окрашивали гелей составляет примерно 80-90% от достигнутой восстановления от окрашивани гел кумасси синим.
  3. После электрофореза разместить гель на стеклянную пластину и акцизного тон область интереса с помощью чистой скальпель или лезвие бритвы.
  4. Для повышения урожайности уплотнительных гликанах, передать гель полосу интерес на другой стеклянной пластиной и вырезать вырезали гель кусок в приблизительно 2 мм кубов. Избегайте кусочки геля меньше, чем 1 мм, поскольку кубики гликанов восстановления уменьшается. Перенесите небольшие кусочки геля в винтовой верхней стеклянной трубки (13 х 100 мм) с microspatula из нержавеющей стали.
  5. Добавить 1 мл 25 мМ бикарбоната аммония (AMBIC, NH 4 HCO 3) в пробирку, крышка стеклянную трубку с тефлоновым покрытием винта верхней крышки, и аккуратно перемешать, щелкая трубки, прежде чем дать постоять 10 мин. Не используют интенсивном перемешивании, чтобы избежать копирования на кусочки геля.
  6. Осторожно снимите AMBIC из стеклянной трубки, используя либо стеклянной пипетки Пастера или пипетки, оснащенный удлиненной пластиковым наконечником. Избегайте разбивая и передачи небольшие кусочки геля при удалении AMBIC решение.
  7. Добавить 1 мл ацетонитрила (ACN), чтобыстеклянная трубка, крышка, и аккуратно перемешать, щелкая трубки, прежде чем дать постоять 10 мин. Убедитесь, что кусочки геля полностью покрыты растворителем. При необходимости, нажмите кусочки геля от стенки трубы и в растворителе с кончика пипетки.
  8. Внесите от ACN из стеклянной трубки и повторите шаги 1.5-1.7 до ярко-синий цвет не будет устранена. Повторите не менее пяти последовательных промываний AMBIC / ACN при необходимости. Для серебряных окрашенных гелей, использовать комплект destain. Переходите к следующему шагу, когда гель штука получается равномерно белым цветом, а в АКН.
  9. Внесите от любой жидкости из стеклянной трубки, резюмировать трубку, добавить 1 мл AMBIC и дать постоять 5 мин.
  10. Удалить AMBIC и добавить 2 мл этилацетата (EtOAc), чтобы стеклянной трубки. Резюме трубка с тефлоновым покрытием и крышкой месте при 4 ° С в течение ночи с конечным над уровнем конца перемешиванием или, альтернативно выполнить три EtOAc промывок при комнатной температуре в течение 30 минут каждый. Чем дольше стирки EtOAc, тем эффективнее удаление загрязняющих веществ.
  11. УдалятьОкончательный EtOAc мыть и выполнить три моет каждый с 2 мл H 2 O. Полное удаление EtOAc обеспечит надежную восстановительной реакции β-элиминации.
  12. Внесите от H 2 O и обезвоживают гель путем однократной промывки 1 мл ACN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сушки обезвоженных гели готовы к в-гель β-элиминирования. Обезвоженные куски гель можно хранить при -20 ° С до использования.
  13. Остановка процесса стирки на любой стадии и хранить кусочки геля при температуре 4 ° С в течение ночи, независимо от того, какой буфер или раствор наносят на гель (AMBIC, ACN, H 2 O). Перезапуск пробоподготовки в любое время в течение следующих 2 дней.
  14. Используйте часть из обесцвечивали и обезвоженных кусочков геля для белка ID стандартными протеомическим подходов.

2. В-гель O-гликана выпуска восстановительным β-ликвидации

  1. Подготовка исходного раствора 1 М гидроксида натрия (NaOH) с использованием 50% NaOH или твердого NaOH и хранят при температуре 4 ° С до использования. Возьмем 5,2 мл 50% NaOH (или 4 г твердого NaOH) и регулировать громкость до 100 мл, чтобы сделать раствор 1 М NaOH. Развести 1 М NaOH исходного раствора до 100 мМ NaOH, который можно хранить при температуре 4 ° С в течение 6 месяцев без потери эффективности в восстановительных реакций β-элиминирования.
  • Сделайте 2 М натрийборгидрид (NaBH 4) в 100 мМ NaOH. Растворите 38 мг NaBH 4 в 0,5 мл 100 мМ NaOH. Как правило, используют 0,5-1,0 мл раствора борогидрида для каждого образца. Vary объем реакционного раствора на количество высушенных кусочков геля, полученного на стадии 1. Ожидать использовать 0,5 мл раствора боргидрида в течение 1-2 вырезанных частей геля (шаг 1,3).
  • Добавить 500 мкл 100 мМ NaOH в обезвоженных куски геля и дать настояться в течение 3-5 минут на льду, с тем чтобы уравновесить гель для основных условий, которые повышают гликана восстановление.
  • Добавить 500 мкл 2 М NaBH 4 в 100 мМ NaOH, в результате чего в конечной концентрации 1 М NaBH
  • В течение первого часа инкубации, осторожно перемешать трубу на каждые 15 мин. Избегать сильного перемешивания, потому что это может фрагментировать кусочки геля. Выполните реакцию в хорошо уравновешенном инкубатора / печи или в нагревательном блоке. Убедитесь, что кусочки геля покрыты реакционного раствора.
  • Остановка реакции путем удаления пробирки с образцом из инкубатора или нагревательный блок и размещение его на льду.
    Примечание: После того как реакция β-элиминирование провод т в течение 18 ч, процесс обессоливания должны быть выполнены в тот же день.

    • 3. обессоливания на катионообменной хроматографии

    1. Сохраняя пробирку на льду, чтобы предотвратить образование избыточного тепла, медленно добавить 10% по каплям уксусную кислоту (уксусной кислоты), чтобы нейтрализовать базу. Аккуратно вихрь пробирку между добавками уксусной кислоты. Будьте осторожны, чтобы добавить кислоту медленно и по каплям, как дополнительна кислоты будет производить "вулкан" пузырей. Центрифуга трубки, чтобы устранить пузырьки и предотвратить выплеск, если это необходимо.
      1. Для того чтобы удалить большое количество натрия в реакционной смеси, проходят реакционной смеси через небольшую колонку катионообменной смолой Dowex (или AG-50W-X8 смолы, Н + форма).
      2. Промыть катионообменную смолу с 1 М NaOH и 1 М HCl до использования с целью удаления загрязняющих веществ, которые мешают анализа MS, даже если смола аналитической чистоты.
      3. Замочите смолы в 1 М NaOH и удалить решение декантацией. Добавить деионизированной воды, удаления воды, затем добавьте 1 М HCl.
    2. Повторите эти действия, пока над смолы раствор не станет бесцветным. Промыть очищенный смолы с деионизированной водой и хранить в 5% уксусной кислоте при температуре 4 ° С.
    3. Чтобы сделать маленький стеклянный столбца, царапины и сломать кончик стеклянной пипетки Пастера с использованием керамического ножа так, чтобы конусность кончика пипетки примерно 1 см в длину, Дразните друг от друга вилку стекловаты и толкать к кончику, образующей опору для слоя смолы. Закрепите колонку пипетки с помощью зажима или прищепки и место над стеклянную пробирку.
    4. Промыть пустой пипетки с 1 мл метанола (MeOH) и 3 мл 5% AcOH. Вихревой Н + Dowex или AG50 катионообменной смолы суспензию хранили в 5% уксусной кислоты и передать достаточное количество суспензии для получения объема 1 мл кровать в столбце пипетки Пастера.
    5. Промойте колонку, используя пять томов 5% уксусной кислоты. Проверьте течь через появления частиц смолы и не использовать колонку, если смола обнаружен.
    6. Столбец Поместите над новой винт сверху стеклянной трубки (16 х 125 мм) и образца нагрузки. Сбор поток через гликанов и элюируют с по крайней мере 3 объемами 5% -ного раствора AcOH в одной и той же трубе.
    7. Накройте трубку с парафильмом и сделать крошечные отверстия с помощью иглы. Поместите пробирку при -80 ° С или на сухом льду. После того, как замороженный, сухой образец по лиофилизации. Хранить высушенный материал при -20 °С до использования.

    4. Борат удаления

    1. Подготовьте 10% уксусной кислоты в метаноле. Возьмем 10 мл ледяной уксусной кислоты и отрегулировать объем до 100 мл с помощью метанола. Храните этот реагент в стеклянной бутылке с тефлоновым покрытием крышки на срок до 6 месяцев.
    2. Добавить 300 мкл 10% -ного раствора AcOH в МеОН с высушенный лиофильной сушкой пробирку и вихря. Удаление полученного триметилбората выпариванием при N 2 потока.
      Примечание: Смешивание боратные соли с метанолом в кислой среде производит триметилбората, который представляет собой летучее соединение.
    3. Сухой под N 2 поток при 37 ° С. После сушки добавить другую аликвоту АсОН в МеОН, как описано в шаге 4.2. Сушат жидкость в течение 5 мин в атмосфере азота (N 2) поток при 37 ° С.
      1. Повторите ресуспендирование и сушки, по крайней мере в 3 раза. Хранить высушенного материала при температуре -20 ° С до использования.

    5. С 18 Очистка

    1. Равновесие столбец C18 картриджа(Размер 1 мл, 100 мг смолы) с использованием трех томов ACN и пять томов 5% уксусной кислоты. Ускорение прохождение уравновешивающим решений путем применения мягкого положительном давлении воздуха.
    2. Добавить 500 мкл 5% уксусной кислоты в обессоленной и боратном свободной пробирку и растворяют с помощью вихря.
    3. Загрузка ресуспендировали образец на уравновешенную колонку C18 и собирать поток через стекло в завинчивающейся крышкой пробирку (13 х 100 мм). Элюировать O-гликанов с 3 мл 5% -ного раствора AcOH в одной и той же трубе.
    4. Парафином трубку, чтобы маленькие отверстия с малым иглой или при помощи свободно закрытую тефлоновую картонных колпачок, чтобы покрыть трубу, и заморозить образца при -80 ° С или на сухом льду. Удаление растворителя лиофилизацией. Хранить высушенного образца при -20 ° С до использования.

    6. База Подготовка к Permethylation

    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения надежной permethylation, подготовить NaOH суспензии свежей. Все изделия из стекла используются для permethylation реакций следует широко чистить.

    1. Для приготовления основного реагента для permethylation, добавить 400 мкл 50% -ного NaOH к чистым стекла с завинчивающейся крышкой пробирку (13 х 100 мм). Добавить 800 мкл безводного МеОН и вихря.
    2. Добавить 4 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО) и вихря генерировать белый осадок.
    3. Центрифуга при 600 х г в течение 1 мин для осаждения осадка. Внесите от супернатанта и выбросить. Добавить еще 4 мл безводного ДМСО к осадку. Vortex.
    4. Повторите шаг 6.2 и 6.3, как минимум, еще три раза или до каких-либо белый осадок.
    5. Растворите гранулированный базу в 3 мл безводного ДМСО и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз с чистой пипетки Пастера.
    6. Немедленно использовать базу для следующей реакции permethylation как это не могут быть сохранены.

    7. Permethylation выпускаемой гликаны

    1. Добавить 200 мкл безводного ДМСО в C18-очищенного образца и вихря или разрушать ультразвуком ресуспендировать.
    2. Добавить 300 мкл resuspсостава базы суспензия для образца и сразу добавить 100 мкл йодометана (МЭИ). Уплотнение трубки с тефлоновым покрытием крышки и энергично перемешать в течение 5 мин по вихря.
    3. Для остановки реакции permethylation, добавляют 2 мл 5% -ного раствора AcOH на льду и вихря. Пипетка раствор вверх и вниз в 5 раз снизить оставшийся объем ОЭП выпариванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: АсОН нейтрализует решение и удаление MeI повышает эффективность извлечения сульфатированных гликанах в водной фазе во время поэтапного раздела.
    4. Добавить 2 мл дихлорметана (DCM) и вихря. Центрифуга при 600 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы отделить водную и органическую фазы.
    5. Передача верхний слой (водный фазы, которая содержит большую часть перметилированных сульфатированных гликанов) в новую стеклянную трубку (13 х 100 мм).
    6. Добавить 2 мл H 2 O в органическую фазу и вихря. Центрифуга при 600 х г в течение 1 мин, чтобы отделить водную и органическую фазы и комбинировать этот второй водной фазы с пихтыул водную фазу (шаг 7,5).
    7. Повторите шаг 7,6 и 7,5 три раза больше, но нет никакой необходимости, чтобы сохранить водные фазы в результате последующих разделах.
    8. Удалить конечный верхний слой (водный фаза) в максимально возможной степени с нижним слоем (органической фазе) и передать нижний слой (органической фазе) в отдельную новой стеклянной трубки с помощью чистой пипетки Пастера.
    9. Органическую фазу сушат в атмосфере N2 потоке при 42 ° С.
    10. Накройте трубку с парафильмом и хранить при -20 ° С до использования.

    8. С18 Очистка от перметилированный сульфатного О-гликанов из водной фазы

    1. Равновесие колонку С18 картриджа с тремя объемами ACN и пяти объемами 5% -ного раствора AcOH.
    2. Загрузка Водные фазы собирали и объединяли с шагом 7,5 и 7,6 на колонку.
    3. Промыть колонку с 10 мл H 2 O для обессоливания.
    4. Элюирования перметилированный O-сульфатированный гликанов в новую стеклянную трубку с 2 мл50% ACN. Используйте дополнительный элюирование с 85% ACN, чтобы добавлять восстановление перметилированных сульфатированных уплотнительных гликанах на больших олигосахариды.
    5. Сухие элюаты в потоке азота при 42 ° С.
    6. Хранить высушенный материал при температуре -20 ° С до 6 месяцев до анализа MS.

    9. Масс-спектрометрия из перметилированных уплотнительных гликанах

    1. Анализ перметилированный O-гликанов от прямого вливания в соответствующий масс-спектрометре с использованием источника nanoelectrospray при скорости потока шприца 0,40-0,60 мкл / мин при 210 ° C температуре капиллярной. Для фрагментации по CID в MS / MS и MS п в ловушки инструмента ионов, применяется 30-40% энергии столкновения.
    2. Для режима отрицательных ионов, восстановить перметилированный сульфатированный О-гликанов в 50 мкл смеси метанол / 2-пропанол / 1-пропанола / 13 мМ водный ацетат аммония (16: 3: 3: 2 по объему). Для режиме положительных ионов, нейтральных воссоздать перметилированный / сиалилированы O-гликанов в 50 мкл 1 мМ натрий гидроXide в смеси метанол / вода (1: 1).
    3. Используйте общее отображение ионный (TIM) и нейтральный сканирования потери (NL сканирования) функциональность программного комплекса Xcalibur версии 2.0 для анализа MSN охарактеризовать отдельные O-гликана структур 13,19.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Влияние этилацетат лечения До В-гель восстановительным β-ликвидации

    Представитель масс-спектр перметилированных О-связанных гликановых образцов, освобожденных из шкур крупного рогатого скота муцина с использованием в геле восстановительное β-элиминирование показано на рисунке 3. EtOAc мыть гелевых штук эффективно удаляет SDS и полиакрил загрязнений, которые мешают последующего анализа MS 27.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. этилацетат мыть гель кусок полиакриламидном до в-гель восстановительного β-элиминирования повышает обнаружение выпущенных гликанах. (A) Без промывки этилацетат, масс-спектре перметилированных гликанах О-связанных опубликованным в-гель β-элиминирования из бычьей подчелюстной муцина преобладают обилием полидисперсной сотрудничестваntaminant, которая почти полностью закрывает сигналы MS, связанных с О-связанных гликанов. (B) Стиральная гель кусок этилацетатом устраняет загрязняющие пики, позволяя чувствительного обнаружения гликанах. Модифицированная от Kumagai 25.

    Восстановление O-связанный Гликан Большой от малых Гелевые срезы

    О-связанных гликаны были освобождены из бычьей подчелюстной муцина по в-гель восстановительное β-устранение с помощью геля штук, которые были либо нарезанные небольшой (~ 2 х 2 мм) или большой (~ 5 х 5 мм). Кусочки геля меньше, чем ~ 2 х 2 мм были не эффективно восстановлены с помощью этапов промывки. После permethylation, известное количество перметилированный внешнего стандарта гликанов (maltotri- и maltotetrasaccharide, DP3 и DP4) добавляли в каждую чтобы облегчить количественную оценку гликановой восстановления 27. Восстановление О-связанных гликанов из маленьких кусочков гель был почти в 10 раз больше, чем от крупных кусочков геля (Рисунок 4).

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Glycan восстановление из маленьких кусочков геля является более эффективным, чем от крупных кусков. Маленькие кусочки (~ 2 х 2 мм) давала более гликанов, чем более крупные кубики (~ 5 х 5 мм). Бары показывают относительные интенсивности сигнала на сумму всех О-связанных гликановых структур, нормированных для обнаруженного сигнала для внешнего стандарта (maltotrisaccharide dP3, установлен на 100%), который был добавлен к выпустили гликана до анализа MS. Значения средней стандартное отклонение для п = 3. Модифицированная от Kumagai К 25.

    Обогащение Sulfoglycans по фазе раздела

    Перметилированный сульфатированный гликанов стандарт (сульфо-Ле) был полностью восстановлен в водной фазе. Перметилированных сиалилированы гликаны освобожденные из йе муцина гликопротеин разделами в фазу DCM (рисунок 5). Восстановление каждый перметилированных гликанов с помощью водно-органической перегородкой была сравнима с таковой ранее отличающийся С18 Sep-Pak очистке методом 27. Эффективность и простота метода раздела фаз значительно облегчает пропускной способностью и последующие аналитические подходы.

    Рисунок 5
    Рисунок 5. Дифференциальная восстановление сульфо- и sialo-гликанов по фазе раздела. Бычий муцина гликопротеин, был обработан с известным количеством сульфо-гликанов стандарта (сульфо-Ле а) прежде, чем быть подвергнут восстановительному β-элиминирования. Освобожденные гликаны перметилированный и реакцию permethylation доводили до 1: 1: вода: ДХМ. Полученные в результате органические и водные фазы разделяли и анализируют методом МС. Glycan восстановление количественно отнтельной к перметилированных внешних гликановых стандартам, которые были шипами в образец перед анализом MS. Гликана восстановление в органическую (DCM) и водный (вода) фазы показаны по отношению к внешнему стандарту, который был установлен на 100%. Sulfoglycans были обнаружить в органической фазе, но количественно извлекают в водную фазу. Результаты представляют собой среднее ± SE из трех независимых экспериментов. Модифицированная от Kumagai 25.

    Применение к углубленному протеомные и Glycomic Анализы в биологических образцах

    Белки слюны человека были разделены с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивали Кумасси (G-250). Высокая молекулярная масса белка, по меньшей МВт ~ 600 кДа вырезали из геля и часть куска гель подвергали гель-в трипсинизированном пищеварения и LC-MS / MS-анализа, основанного протеомики, в котором определены эту группу также MUC5B 16,24 , Остальная часть куска гель подвергали гель-в Реду ctive β-ликвидация для О-гликана анализа 27. После permethylation и фазы раздел водно-органический (вода: ДХМ, 1: 1), перметилированный гликанов в водной и органической фаз анализировали с помощью NSI-МС. Номера сульфатированный перметилированный O-гликанов были извлечены из органической фазы, и все перметилированных sulfoglycans извлекали из водной фазы, что облегчает идентификацию и характеристику почти изобарической сульфатированного и не-сульфатированных гликанов, например, Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ол (м / з = 1606,8 [M + Na] +) и (SO 3) 1 1 NeuAc Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ол (м / з = 1606,7, [М + 2Na-H] +) отличаются лишь 0,1 единицы массы и будет трудно решить без физического разделения двух видов путем фазового раздела (Рисунок 6).

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "ширина =" 700px "/>
    Рисунок 6. Обнаружение изобарической сложности в нейтральных и сульфо-гликанах разделенных водно-органической раздела. MS узоры 2 осколочные полученные от родительских ионов, обнаруженных общей отображение ионный (TIM) анализа перметилированных уплотнительных гликанах освобожденных из человеческой слюны муцин по в-гель β-элиминирование и воду: DCM разделов следующие permethylation. (А) МС 2 из TIM анализа DCM фазы для 2,8 единицы массы окна вокруг M / Z = 1608. (В) МС 2 Спектр той же массовой окна для TIM анализа водной фазы. В DCM-фазы, основные осколочных ионов соответствуют потере Hex 1 -О (м / г 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1331,8), потеря Fuc 1 Hex 1 -О (1196,7), потери из Hex 1 HexNAc 1 (1143,6), потеря Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), потеряиз Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -О (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660,4), и Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). На основе этих фрагментов ионов, смесь не-сульфатированных структур с составом Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2-ола GalNAc предлагается как показано в правой части спектра. В отличие от этого, основные фрагменты ионов для водной фазы являются потеря SO 3 Na (1486,8), потери NeuAc (1231,5), потери Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), потери комбинации NeuAc и SO 3 Na ( 1111,8), и потеря NeuAc 1 Hex 1 -О (1009,4). Смесь сульфатированных структур с композицией (SO 3 -) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1-ол GalNAc предлагается. Без физического разделения нейтральных и sulfoglycans по фазе раздела, интерпретируя MS 2 спектры таких смесей является значительно более чallenging. Модифицированная от Kumagai 25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    Tags

    Химия выпуск 93 гликопротеин гликозилирования в-гель восстановительное β-элиминации О-связанное гликана сульфатированной гликана масс-спектрометрия белок ID SDS-PAGE glycomics sulfoglycomics
    Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T.,… More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter