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Chemistry

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2, 1
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Introduction

A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience.

As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N p�tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17.

Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26.

As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas.

Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.

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Protocol

NOTA: Preocupações de segurança de laboratório

Em consonância com as melhores práticas de laboratório padrão, observe o seguinte. Guarde todos os solventes orgânicos em locais apropriados. Mantenha todos os materiais de resíduos em contentores de resíduos químicos com uma rotulagem clara de composições químicas. Como vários reagentes utilizados nestes protocolos são potenciais agentes cancerígenos ou gerar gases combustíveis voláteis, lidar com todos os reagentes em um exaustor com ventilação. Use equipamento de proteção individual, como luvas, jaleco e proteção para os olhos quando se trabalha com solventes orgânicos.

A Figura 1
Figura 1. Processo para O-glycomics em gel. (A) As proteínas de interesse são resolvidos por SDS-PAGE, detectada por procedimentos de coloração apropriados (Coomassie ou prata), e excisadas. Pedaços de gel são excisadas fatiasem pequenos cubos, descorados, e lavou-se com acetato de etilo, para reduzir os contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS. Uma porção da porção de gel pode ser reservada para em gel de digestão tríptica e subsequente caracterização proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos ligados a O são libertados a partir de glicoproteínas resolvidos por eliminação redutiva β-em-gel. Passos essenciais incluem dessalinização e remoção de borato de azeótropo com metanol. (C) glicanos libertados pela eliminação redutiva β-O-ligada são permetilado e posteriormente repartiu-se em fases aquosa e orgânica. Sulfoglycans são quantitativamente recuperado na fase superior (aquosa) enquanto partição glicanos neutros e sialilados no (DCM) camada inferior.

A Figura 2
Figura 2. Detalhe fluxograma para glycomics em-gel. Cada experimenTal passo mostrado na Figura 1 é ilustrado individualmente. (A) descoloração gel e extração AcOEt, (B) dirigir redutora β-eliminação em gel para liberação glycan O-ligados, e (C) permetilação e fase de partição. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

1. Gel excisão e remoção de contaminantes Gel derivadas

  1. Antes de iniciar o procedimento, preparar produtos químicos e reagentes listados na Lista de Materiais.
  2. Resolver proteína em gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampão de Tris-Glicina padrão. Stain proteínas com ou Coomassie Brilliant Blue ou prata Stain resolvido. Em geral, a recuperação de glicanos ligados em O a partir de géis corados com prata é aproximadamente 80-90% da recuperação conseguida a partir de géis corados com Coomassie.
  3. Após a electroforese, colocar o gel sobre uma placa de vidro e t especial de consumoEle região de interesse utilizando um bisturi limpo ou lâmina de barbear.
  4. Para aumentar o rendimento de O-glicanos, transferir a banda gel de interesse para outra placa de vidro e cortar o pedaço gel extirpado em aproximadamente dois milímetros cubos. Evitar fazer pedaços de gel menor do que 1 milímetro porque os cubos de recuperação de glicano é reduzida. Transferir os pequenos pedaços do gel para um tubo de vidro de tampa de rosca (13 x 100 mm) com um microspatula aço inoxidável.
  5. Adicione 1 ml de 25 mM de bicarbonato de amônio (Ambic, NH 4 HCO 3) para o tubo de amostra, tampar o tubo de vidro com um parafuso de topo revestido de teflon, e misture delicadamente sacudindo o tubo antes de deixar repousar por 10 min. Não se empregar agitação vigorosa, a fim de evitar rasgar os pedaços de gel.
  6. Remova cuidadosamente Ambic do tubo de vidro usando uma pipeta de vidro Pasteur ou pipeta equipado com uma ponta de plástico extra-longa. Evite esmagamento e transferindo os pequenos pedaços de gel durante a remoção da solução Ambic.
  7. Adicionar 1 ml de acetonitrilo (ACN) para otubo de vidro, tampa, e misture delicadamente sacudindo tubo antes de deixar descansar por 10 min. Certifique-se de que as peças de gel são completamente coberto com solvente. Se necessário, empurre pedaços de gel fora da parede do tubo e em solvente com ponteira.
  8. Pipeta off ACN do tubo de vidro e repita os passos 1,5-1,7 até que a cor azul brilhante é eliminado. Repetir um mínimo de cinco lavagens seqüenciais Ambic / ACN, se necessário. Para prata manchada géis, use um kit destain. Vá para a próxima etapa, quando a peça se transforma em gel enquanto uniformemente branca em ACN.
  9. Pipetar qualquer líquido do tubo de vidro, recapitular o tubo, adicionar 1 ml de Ambic e deixe descansar por 5 min.
  10. Remover Ambic e adicionar 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para o tubo de vidro. Recapitulando tubo com tampa forrada de Teflon e colocar a 4 ° C durante a noite com agitação ao longo de ponta a ponta ou, alternativamente, executar três lavagens de EtOAc à temperatura ambiente durante 30 min cada. Quanto maior for a lavagem de EtOAc, o mais eficiente a remoção de contaminantes.
  11. RemoverEtOAc a última lavagem e executar três lavagens cada uma com 2 ml de H 2 O. A remoção completa de EtOAc irá assegurar uma reacção de eliminação redutiva β-robusta.
  12. Pipetar fora H2O e desidratar o gel por lavagem uma vez com 1 mL de ACN.
    NOTA: Após a secagem, os géis são desidratados pronto para β-eliminação em gel. Pedaços de gel desidratados podem ser armazenados a -20 ° C até à sua utilização.
  13. Parar o processo de lavagem em qualquer passo e armazenar os pedaços de gel a 4 ° C durante a noite, independentemente de qual tampão ou solução é aplicada ao gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie a preparação da amostra a qualquer momento dentro dos próximos dois dias.
  14. Usar uma porção dos pedaços de gel descorado e desidratados para identificação de proteínas por abordagens proteomic padrão.

2. Em gel de-O-glicano A libertação por redutiva β-Eliminação

  1. Prepara-se uma solução stock de 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), utilizando NaOH a 50% ou NaOH sólido e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Tirar 5,2 ml de NaOH a 50% (ou 4 g de NaOH sólido) e ajustar o volume para 100 ml para fazer uma solução M de NaOH. Dilui-se a solução stock de NaOH a 1 M NaOH a 100 mM, que podem ser armazenadas a 4 ° C, até 6 meses, sem perda de eficiência em reacções β-eliminação redutiva.
  • Adicione 2 M de boro-hidreto de sódio (NaBH4) em NaOH 100 mM. Dissolve-se 38 mg de NaBH4 em 0,5 ml de NaOH 100 mM. Geralmente, usam 0,5-1,0 ml da solução de boro-hidreto para cada amostra. Variar o volume da solução de reacção sobre a quantidade de pedaços de gel seco preparado no passo 1. Esperar para utilizar 0,5 ml de solução de boro-hidreto por 1-2 pedaços excisados ​​do gel (passo 1.3).
  • Adicionar 500 mL de NaOH 100 mM para os pedaços de gel desidratados e deixar repousar durante 3-5 min em gelo, a fim de equilibrar o gel às condições básicas que melhoram a recuperação de glicano.
  • Adicionar 500 ul de 2 M NaBH4 em NaOH 100 mM, resultando em concentrações finais de 1 M NaBH
  • Durante a primeira hora de incubação, misturam suavemente o tubo a cada 15 min. Evitar agitação forte, uma vez que pode fragmentar os pedaços de gel. Realizar a reacção num incubador / forno bem equilibrada ou num bloco de aquecimento. Assegure-se que os pedaços de gel são cobertos com uma solução de reacção.
  • Parar a reacção por remoção do tubo de amostra a partir da incubadora ou do bloco de aquecimento e colocando-a em gelo.
    NOTA: Depois de se deixar a reacção β-eliminação prosseguir durante 18 h, o processo de dessalinização deve ser realizada no mesmo dia.

    • 3. Cromatografia em Dessalinização permutadora de catiões

    1. Enquanto se mantém o tubo de amostra em gelo para evitar a formação de calor excessivo, adiciona-se lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota a neutralizar a base. Gentilmente vortex o tubo de amostra entre as adições de AcOH. Tenha o cuidado de adicionar ácido lentamente e gota a gota, como o additino de ácido irá produzir um "vulcão" das bolhas. Centrifuga-se o tubo para eliminar as bolhas e evitar transbordamento, se necessário.
      1. A fim de remover a grande quantidade de sódio na mistura de reacção, passar a mistura de reacção através de uma coluna de permuta catiónica pequena (ou resina Dowex AG-50W-X8, na forma H +).
      2. Lava-se a resina de permuta catiónica com NaOH e 1 M de HCl 1 M, antes da utilização, a fim de remover os contaminantes que interferem com a análise por MS, mesmo se a resina é de grau analítico.
      3. Soak a resina em NaOH 1 M e remover a solução por decantação. Adicionar água deionizada, remover a água, em seguida, adicione 1 M HCl.
    2. Repita essas etapas até que a solução acima da resina é incolor. Lava-se a resina limpas com água deionizada e armazenar em 5% de AcOH a 4 ° C.
    3. Para fazer com que uma pequena coluna de vidro, zero e quebrar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro usando um cortador de cerâmica, de modo que a inclinação da ponta da pipeta é cerca de 1 cm de comprimento. Provocar uma separação de um tampão de lã de vidro e empurrar no sentido da ponta formando um suporte para o leito de resina. Fixe a coluna pipeta com uma pinça ou prendedor de roupa e coloque sobre um tubo de ensaio de vidro.
    4. Lava-se a pipeta de vazio com 1 ml de metanol (MeOH) e 3 ml de 5% de AcOH. Redemoinho H + Dowex ou pasta de resina de permuta catiónica AG50 armazenado em 5% de AcOH e transferir suficiente da lama para produzir um volume de leito de 1 ml na coluna pipeta de Pasteur.
    5. Lavar a coluna com cinco volumes de 5% de AcOH. Verifique fluir através do aparecimento de partículas de resina e não use a coluna de resina se for detectado.
    6. Coloque coluna sobre um novo tubo de tampa de rosca de vidro (16 x 125 mm) e amostra de carga. Recolhe-se o fluxo através de glicanos e eluir com, pelo menos, 3 volumes de 5% de AcOH no mesmo tubo.
    7. Cobrir o tubo com Parafilm e fazer pequenos furos com uma agulha. Colocar o tubo de amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Uma vez congelado, secar a amostra por liofilização. Armazenar o material seco a -20 °C até à sua utilização.

    4. Remoção Borato

    1. Prepare a 10% de AcOH em MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial e ajustar o volume a 100 ml com metanol. Guarde este reagente em um frasco de vidro com tampa forrada de Teflon para até 6 meses.
    2. Adicionar 300 ul de AcOH a 10% em MeOH à, liofilizada tubo de amostra seca e vortex. Remover o borato de trimetilo resultante por evaporação sob uma corrente de N 2.
      NOTA: Mistura de sais borato com metanol sob condições ácidas produz borato de trimetilo, que é um composto volátil.
    3. Seca-se sob fluxo de N2, a 37 ° C. Após a secagem, adiciona outra aliquota de AcOH em MeOH como se descreveu na etapa 4.2. Seca-se o líquido durante 5 min sob atmosfera de azoto (N 2) fluxo a 37 ° C.
      1. Repetir a ressuspensão e secagem, pelo menos, 3 vezes. Armazenar o material seco a -20 ° C até à sua utilização.

    5. C18 Clean-up

    1. Equilibrar a coluna de cartucho C18(Tamanho 1 ml, 100 mg de resina), utilizando três volumes de ACN e cinco volumes de 5% AcOH. Acelerar a passagem das soluções equilibrantes através da aplicação de pressão positiva de ar suave.
    2. Adicionar 500 ul de 5% de AcOH para o tubo de amostra dessalinizada e livre de borato dissolver e por vórtice.
    3. Carga da amostra ressuspensa numa coluna C18, equilibrada e recolher o fluxo através de um tubo em vidro com tampa de rosca (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos com 3 ml de 5% de AcOH para o mesmo tubo.
    4. Parafilme o tubo, fazer pequenos buracos com uma agulha pequena ou use a tampa forrada de PTFE frouxamente fechada para cobrir o tubo, e congelar a amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Remover o solvente por liofilização. Armazenar a amostra seca a -20 ° C até à sua utilização.

    6. Preparação Base para permetilação

    NOTA: A fim de alcançar permetilação robusto, preparar NaOH pasta fresca. Toda a vidraria utilizado para reacções de permetilação deve ser extensivamente limpo.

    1. Para preparar o reagente de base para permetilação, adicionar 400 ul de NaOH a 50% para um tubo de tampa de rosca de vidro limpas (13 x 100 mm). Adicionar 800 mL de MeOH anidro e vortex.
    2. Adicionar 4 ml de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) e vortex para gerar um precipitado branco.
    3. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar o precipitado. Pipeta off sobrenadante e descartar. Adicionar um adicional de 4 mL de DMSO anidro para o sedimento. Vortex.
    4. Repita o passo 6.2 e 6.3, no mínimo, mais três vezes, ou até que forme um precipitado branco.
    5. Dissolva a base peletizada em 3 ml de DMSO anidro e misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur limpa.
    6. Utilize a base imediatamente para a reacção seguinte como a permetilação não pode ser armazenado.

    7. permetilação de glicanos libertados

    1. Adicionar 200 ul de DMSO anidro para a amostra C18-purificado e vortex ou sonicado para ressuspender.
    2. Adicionar 300 ul da resusppasta base de ended para a amostra e imediatamente adicionar 100 ml de iodometano (MEI). Selar tubo com tampa forrada de Teflon e vigorosamente para misturar 5 min por vórtice.
    3. Para parar a reacção permetilação, adicionar 2 ml de 5% de AcOH em gelo e vortex. Pipeta solução cima e para baixo cinco vezes para reduzir o volume restante de MeI por evaporação.
      NOTA: O AcOH neutraliza a solução de MeI e remoção aumenta a eficiência da extracção de glicanos sulfatados para a fase aquosa durante a-partição de fase.
    4. Adicionar 2 ml de diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min à temperatura ambiente para separar as fases aquosa e orgânica.
    5. Transferir a camada superior (fase aquosa que contém a maioria dos glicanos sulfatados permetilado) para um novo tubo de vidro (13 x 100 mm).
    6. Adicionar 2 ml de H 2 O para a fase orgânica e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para separar as fases aquosa e orgânica e combinar esta segunda fase aquosa com o abetofase aquosa st (passo 7.5).
    7. Repetir o passo 7.6 e 7.5 mais três vezes, mas não há necessidade de guardar as fases aquosas resultantes das partições subsequentes.
    8. Retirar a camada final de topo (fase aquosa), tanto quanto possível a partir da camada inferior (fase orgânica) e transferir a camada inferior (fase orgânica) para um tubo de vidro de novo separada usando uma pipeta de Pasteur limpa.
    9. Seca-se a fase orgânica sob fluxo de N2 a 42 ° C.
    10. Cobrir o tubo com parafilme e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.

    8. C18 Clean-up de permetilado Sulfatado O-glicanos da fase aquosa

    1. Equilibrar a coluna de cartucho C18 com três volumes de ACN e cinco volumes de 5% de AcOH.
    2. Carregar as fases aquosas recolhidas e combinadas a partir dos passos 7.5 e 7.6 na coluna.
    3. Lava-se a coluna com 10 ml de H 2 O para dessalinização.
    4. Eluir a permetilado sulfatado O-glicanos para um novo tubo de vidro com 2 mlde 50% de ACN. Use uma eluição adicional com 85% de ACN para melhorar a recuperação de permetilado sulfatados O-glicanos em oligossacarídeos maiores.
    5. Eluatos secos sob corrente de azoto a 42 ° C.
    6. Armazenar o material seco a -20 ° C até 6 meses antes da análise por MS.

    9. Espectrometria de Massa de permetilado O-glicanos

    1. Analise permetilado O-glicanos por infusão directa para um espectrómetro de massa adequado usando uma fonte de nanoelectrospray a um caudal de 0,40-0,60 seringa ul / min a 210 ° C de temperatura de capilar. Para fragmentação por CID em MS / MS e MS n de um instrumento ion trap, aplicar 30-40% da energia de colisão.
    2. Para o modo de ião negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos em 50 mL de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amónio aquoso (16: 3: 3: 2 em volume). Para o modo de ião positivo, reconstituir permetilado neutros / O-glicanos sialilados em 50 ul de 1 mM de sódio hidrohidróxido O em metanol / água (1: 1).
    3. Use o mapeamento de íons (TIM) e varredura de perda neutra (varredura NL) funcionalidade do pacote de software Xcalibur versão 2.0 para análise MSN para caracterizar estruturas O-glicano individuais 13,19.

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    Representative Results

    Efeito de acetato de etilo Tratamento Antes de Na-gel redutiva β-Eliminação

    Um espectro de massa representativo do permetilado amostras de glicano ligadas em O libertados de bovino usando mucina redutiva β-eliminação no-gel é mostrado na Figura 3. A lavagem de EtOAc dos pedaços de gel de SDS e remove eficazmente poliacrílicos contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS 27.

    A Figura 3
    Figura 3. Ethyl lavagem acetato de peça em gel de poliacrilamida antes redutora β-eliminação em gel melhora a detecção de glicanos liberados. (A) Sem lavagem com acetato de etilo, o espectro de massa de glicanos ligados em O permetilado libertadas por β-eliminação em gel de mucina submaxilar bovina é dominado por uma abundância de um co polidispersantaminant, que obscurece quase completamente os sinais de MS associados com glicanos ligados a O. (B) lavar o pedaço de gel com acetato de etilo elimina os picos contaminantes, permitindo a detecção sensível de glicanos. Modificado de Kumagai 25.

    Recuperação de ligada-O Glycan é maior de pequenas fatias de gel

    Glicanos ligados em O foram liberados da submandibular bovina mucina por in-gel β-eliminação redutiva usando pedaços de gel que foram ou fatias pequenas (~ 2 x 2 milímetros) ou grande (~ 5 x 5 mm). Os pedaços de gel menor do que aproximadamente 2 x 2 mm foram eficientemente recuperados não através dos passos de lavagem. Seguindo permetilação, uma quantidade conhecida de um padrão externo de glicano permetilado (maltotri- e maltotetrasaccharide, DP3 e DP4) foi adicionado a cada um para facilitar a quantificação de recuperação 27 de glicano. A recuperação dos glicanos ligados em O a partir de pequenos pedaços de gel era quase 10 vezes maior do que a partir de grandes pedaços de gel (A Figura 4).

    Figura 4
    Figura 4. Glicano recuperação de pequenas peças de gel é mais eficiente do que a partir de pedaços maiores. Pequenos pedaços (~ 2 x 2 milímetros) produziu mais de glicanos de cubos maiores (~ 5 x 5 mm). As barras mostram as intensidades de sinal relativas para a soma de todas as estruturas de glicano ligadas em O normalizados para o sinal detectado por um padrão externo (maltotrisaccharide DP3, definida como 100%), que foi adicionado ao glicano libertado antes de análise por MS. Os valores são o desvio padrão médio para n = 3. Modificado de Kumagai K 25.

    Enriquecimento de Sulfoglycans por fase de partição

    Um padrão de glicanos sulfatados permetilado (sulfo-Le a) foi completamente recuperado na fase aquosa. Glicanos sialiladas permetilado liberados de the glicoproteína mucina particionado em fase de DCM (Figura 5). A recuperação de cada um dos glicanos permetilado por partição aquosa-orgânica foi comparável ao do C18 Sep-Pak método de limpeza anteriormente caracterizada 27. A eficiência e simplicidade do método de partição de fase facilita muito de amostras e métodos analíticos posteriores.

    A Figura 5
    Figura recuperação 5. Diferencial de sulfo- e sialo-glicanos por partição de fase. Bovina glicoproteína mucina foi enriquecida com uma quantidade conhecida de um padrão sulfo-glicano (sulfo-Le um) antes de ser submetido a β-eliminação redutiva. Glicanos libertados foram permetilado e a reacção permetilação foi ajustado para 1: 1: água: DCM. As fases orgânica e aquosa resultantes foram separadas e analisadas por MS. Recuperação Glycan foi quantificada relAtive a padrões glycan externos permetilado, que foram cravadas na amostra antes da análise MS. Recuperações de glicano para a orgânico (DCM) e aquosa (água) as fases são mostradas em relação ao padrão externo, o qual foi definido como 100%. Sulfoglycans foram indetectáveis ​​na fase orgânica, mas quantitativamente recuperadas na fase aquosa. Os resultados representam a média ± DP de três experiências independentes. Modificado de Kumagai 25.

    As análises de aplicativos para em profundidade proteômica e Glycomic em amostras biológicas

    Proteínas da saliva humanos foram separados por SDS-PAGE e corados com Coomassie Brilliant Blue (G-250). Uma proteína de elevado peso molecular MW de ~ 600 kDa foi excisada do gel e uma porção do pedaço de gel foi submetido a em gel de digestão tríptica e LC-MS / proteomic análise baseada em MS, que identificou esta banda como MUC5B 16,24 . O restante do pedaço de gel foi submetido a redu em gel ctive β-eliminação para análise-O glycan 27. Seguindo permetilação e partição de fase aquoso-orgânico (água: DCM, 1: 1), permetilado glicanos nas fases aquosas e orgânicas foram analisadas por NSI-MS. Não-sulfatado permetilado O-glicanos foram recuperados a partir da fase orgânica e todas as sulfoglycans permetilado foram recuperados a partir da fase aquosa, o que facilita a identificação e caracterização de sulfatado quase isobárica e não-glicanos sulfatados, por exemplo, Fuc 1 Hex 3 2 HexNAc GalNAc-ol (m / z = 1606,8 [M + Na] +) e (SO 3) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol (m / z = 1606,7 [M + 2Na-H] +) diferem em apenas 0,1 unidades de massa e seria difícil de resolver sem separar fisicamente as duas espécies por partição de fase (Figura 6).

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    Figura 6. Detecção de complexidade isobárica em neutros e sulfo-glicanos separados por partição aquosa-orgânica. MS padrões 2 de fragmentação obtidos a partir de íons de pais detectadas pela análise total de mapeamento ion (TIM) de permetilado O-glicanos libertados de saliva humana mucina por β-eliminação em gel e água: partição DCM seguinte permetilação. (A) a partir de análise de MS 2 TIM fase de DCM durante uma janela de 2,8 unidade em torno de massa m / z = 1608. (B) O espectro de MS 2 pela mesma janela de massa para análise TIM da fase de água. No DCM-fase, os principais fragmentos iónicos correspondem à perda de Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 + Na 2 HexNAc (1331,8), perda de Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), perda de Hex 1 HexNAc 1 (1143,6), perda de Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), perdade Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660,4) e Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Com base nestes iões de fragmento, uma mistura de estruturas não-sulfatados com uma composição de Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol é proposto como mostrado à direita do espectro. Em contraste, as principais iões fragmentados para a fase aquosa são a perda de SO 3 Na (1486,8), perda de NeuAc (1231,5), perda de Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), perda da combinação de NeuAc e SO3Na ( 1111,8), e perda de NeuAc 1 Hex 1 -O (1009,4). Uma mistura de estruturas sulfatados com uma composição de (SO 3 -) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol é proposto. Sem a separação física do neutro e sulfoglycans por partição de fase, a interpretação de espectros de MS 2 tais misturas é significativamente mais challenging. Modificado de Kumagai 25. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

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    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

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    Química glicoproteína glicosilação β-eliminação redutiva glicanos O-ligados glicanos sulfatados espectrometria de massa proteína de identidade SDS-PAGE glycomics sulfoglycomics em-gel
    Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa
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    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T.,… More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

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