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Chemistry

Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2, 1
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Introduction

La glicosilazione è una proteina post-traduzionale modifica essenziale, contribuendo alla fisiologia organismal, patologia dei tessuti, e il riconoscimento cellulare 1-3. Nonostante i grandi progressi nella glicoscienza analitica, che caratterizza la diversità completa di glicani su una specifica proteina rimane un compito estremamente impegnativo, soprattutto sulle proteine ​​isolate da fonti biologiche primarie. Tuttavia, la microeterogeneità di glicani glicoproteina interessa frequentemente interazioni funzionali con altre proteine. Pertanto, la caratterizzazione della diversità glycan è essenziale per comprendere il significato fisiologico di cellulare e tissutale glicosilazione 4,5. Per comprendere il contributo della glicoproteina glicosilazione alla fisiologia dei tessuti e fisiopatologia, robusto, sensibile, e tecniche analitiche glycomic globali sono diventati sempre più importanti. In analisi proteomica, identificazione di proteine ​​sono in genere raggiunti da LC-MS/ Analisi MS di peptidi triptici 6. Proteina digestione può essere effettuata con una proteina o proteine ​​purificate risolto mediante SDS-PAGE dopo digestione in gel con proteasi quali tripsina 7-9. Pre-arricchimento della miscela proteica mediante SDS-PAGE migliora la profondità e la precisione di ID proteine. Lo sviluppo di strategie analoghe per l'analisi glycomic della glicoproteina glicosilazione si trova in prima linea glicoscienza.

I due principali classi di glicani sono attaccati alla backbone della proteina sia attraverso N-linkage o O-linkage. Glicani N-linked sono collegati a asparagina (Asn) residui presenti come parte di un sequon definita come Asn-X-Ser / Thr / Cys (X è un qualsiasi amminoacido prolina eccezione), e può essere rilasciato per digestione enzimatica con peptide- N -glycanase (PNGaseF o A), sia in soluzione, in gel, oppure on-blot 10-12. Glicani O-linked sono collegate principalmente alla serina (Ser) e treonina (Thr) residui. Tuttavia, solo un enzima è stato idenficato che è in grado di rilasciare glicani O-linked dalla glicoproteina e ha una specificità glicani estremamente limitata, rilasciando solo i semplici glicani O-linked. Strategie di rilascio di sostanze chimiche rimangono il metodo di scelta per il rilascio completo di glicani O-linked da glicoproteine. Β-eliminazione riduttiva o non riduttiva, o idrazinolisi sono tecniche di rilascio chimico ben caratterizzati e sono attualmente i metodi più comunemente usati per il rilascio glicani O-linked da glicoproteine ​​13,14. Sebbene riduttivo β-eliminazione è stato usato per rilasciare glicani O-linked da glicoproteine ​​separate mediante SDS-PAGE, approcci precedenti necessari separazione HPLC per la successiva analisi 15-17.

Multidimensionale MS (MS n) analisi attualmente fornisce la fonte più ricca di dati strutturali per la caratterizzazione di glicani rilasciati da glicoproteine ​​isolate negli importi previsti dalla maggior parte delle fonti biologiche. La profondità della SMbasata caratterizzazione strutturale è notevolmente facilitata da permethylating i glicani rilasciati prima della loro analisi. Permethylation migliora la ionizzazione e tende a livellare le risposte di segnale molari in una vasta gamma di strutture glycan 18,19. Inoltre, permethylation tag senza ambiguità frazioni monosaccaridi terminali e sostituiti con masse distintivi, rafforzando in tal modo delucidazione strutturale 20-23. Ad esempio, glicani acidi sono generalmente difficili da rilevare come specie non-permethylated da MS. Sebbene glicani acidi possono essere rilevati in modalità ioni negativi da MS, è impossibile rilevare sia glicani acidi e neutri nella stessa modalità ioni. Uno dei principali vantaggi di permethylation glycan è che tutti i gruppi idrossilici liberi (OH) su sostituenti monosaccaridi di un glycan sarà limitato con un gruppo metilico (OCH 3 o OME), in tal modo gli oneri a sialylated di glicani sono neutralizzati, che li rende come rilevabile come permethylated neutro (asiaLO) glicani. Tuttavia, gli idrossili di frazioni solfato di sulfoglycans sono resistenti permethylation, con conseguente ritenzione di carica anionica, che sopprime ionizzazione e diminuisce la sensibilità. Questa soppressione attualmente impedisce un'analisi completa glycomic di glicoproteine ​​molto complessi come mucine, che trasportano una grande abbondanza di glicani solfati 24-26.

Recenti rapporti sulla depurazione solfato glicani hanno usato pagano, cromatografia a fase inversa per purificare e glicani permethylated separati prima dell'analisi MALDI. Questo metodo si basa sulla completa separazione dei glicani solfati e non solfati utilizzando diverse fasi mobili per l'eluizione, che abbiamo trovato ad essere meno rigorosi di organico partizionamento fase. Pertanto, le nuove tecniche adatte per la rilevazione e l'arricchimento di sulfoglycans sono qui presentati. Queste tecniche consentono il recupero quantitativo dei glicani solfatate in fase acquosa segue acqua: DCM (diclorometano)estrazione, che viene normalmente eseguita al termine di reazioni permethylation glycan 27. È importante sottolineare che questo robusto separazione tra sulfoglycans permethylated da una miscela di glicani non solfati permethylated arricchisce in concomitanza per le specie cariche ma anche di semplificare MS 2 modelli di frammentazione. Un protocollo completo per una migliore analisi glicani in gel-O-linked è anche presentato. Il protocollo migliorata migliora il recupero glicani, aumenta le informazioni strutturali ottenibili tramite MS n analisi dei glicani permethylated, e migliora la sensibilità delle analisi sulfoglycomic applicate a glicoproteine ​​essenziali isolati da fonti biologiche.

Questo protocollo è destinato O-glicani legati analisi di estratti glicoproteina interi o di una specifica glicoproteina di interesse risolto mediante SDS-PAGE e si compone di tre procedure sperimentali; A) Gel clean-up, B) in-gel riduttivo β-eliminazione, e C) permethy glycanmento. L'obiettivo è quello di ottenere dati completi O-linked glycomic per glicoproteine ​​raccolti dalle fonti primarie di interesse biologico (Figura 1). Glicoproteine ​​separate mediante SDS-PAGE sono visibili con la colorazione e bande di interesse sono asportato e la band gel risultante viene tagliata a piccoli pezzi. I pezzi di gel sono decolorato e sottoposti a lavaggi acetato di etile per rimuovere i contaminanti gel (Figura 2A). Rilascio Glycan si ottiene in gel riduttivo β-eliminazione (Figura 2B) ed i glicani rilasciati sono permethylated. Acquosa-organico estrazione secondo permethylation partizioni quantitativamente le anionici solfato glicani lontano da glicani neutri non solfati (Figura 2C). Nel gel riduttivo β-eliminazione accoppiato ad estrazione acquoso-organici permette la caratterizzazione di glicani e sulfoglycans O-linked rilasciate da piccole quantità di glicoproteina separati mediante SDS-PAGE. La visione strategica è summarized nella figura 1 ed i dettagli sono mostrati in Figura 2. Inoltre, una parte dei pezzi di gel decolorato e lavati può essere utilizzato per l'identificazione di proteine ​​mediante tecniche di proteomica LC-MS / MS standard.

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Protocol

NOTA: Le preoccupazioni di sicurezza di laboratorio

In linea con le migliori prassi standard di laboratorio, osservare quanto segue. Conservare tutti i solventi organici nelle posizioni appropriate. Conservare tutti i materiali di scarto in contenitori per rifiuti chimici con una chiara etichettatura di composizione chimica. Come diversi reagenti utilizzati in questi protocolli sono potenziali agenti cancerogeni o generare gas infiammabili volatili, gestire tutti i reagenti in una cappa aspirante con ventilazione. Indossare dispositivi di protezione individuale, come guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione quando si lavora con solventi organici.

Figura 1
Figura 1. Procedura per in-gel O-glycomics. (A) Le proteine ​​di interesse sono risolte mediante SDS-PAGE, rilevato da adeguate procedure di colorazione Coomassie (o argento), e asportati. Pezzi di gel asportati vengono affettatidadini, decolorato, e lavato con acetato di etile per ridurre i contaminanti che interferiscono con successiva analisi MS. Una parte della fetta gel può essere riservato a in-gel digestione trittico e la successiva caratterizzazione proteomica mediante LC-MS / MS. (B) glicani O-linked vengono rilasciati da glicoproteine ​​risolti da in-gel riduttivo β-eliminazione. Passi essenziali includono la dissalazione e la rimozione borato da azeotropo con metanolo. (C) glicani rilasciati da riduttiva β-eliminazione O-linked sono permethylated e successivamente diviso in fasi acquose e organiche. Sulfoglycans sono quantitativamente recuperati nella fase superiore (acquosa) mentre glicani neutri e sialylated partizione in quella inferiore (DCM) strato.

Figura 2
Figura 2. Particolare diagramma di flusso per glycomics in-gel. Ogni speriTal passo mostrato in figura 1 è illustrata singolarmente. (A) decolorazione di gel ed estrazione EtOAc, (B) direttamente in-gel riduttivo β-eliminazione per il rilascio glicani O-linked, e (C) permethylation e la fase di partizione. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

1. Gel escissione e rimozione di contaminanti Gel-derivati

  1. Prima di iniziare la procedura, preparare i prodotti chimici e reagenti elencati nella Lista dei materiali.
  2. Risolvere proteine ​​in SDS-PAGE gel con sistemi tampone Tris-Glycine standard. Stain proteine ​​sia con Coomassie Brilliant Blue o argento Stain risolto. In generale, il recupero di glicani O-linked di argento colorato gel è di circa 80-90% del recupero ottenuto da Coomassie macchiato gel.
  3. Dopo l'elettroforesi, posizionare il gel su una lastra di vetro e accise tegli regione di interesse con un bisturi pulito o lama di rasoio.
  4. Per aumentare la resa di O-glicani, trasferire la band gel di interesse su un'altra lastra di vetro e tagliare il pezzo di gel asportato in cubetti di circa 2 mm. Evita di fare pezzi di gel inferiori a 1 mm cubi, perché il recupero glicano si riduce. Trasferire i piccoli pezzi di gel in un tubo di vetro con tappo a vite (13 x 100 mm) con microspatula in acciaio inox.
  5. Aggiungere 1 ml di 25 mM di bicarbonato di ammonio (AMBIC, NH 4 HCO 3) alla provetta, tappare la provetta di vetro con un tappo a vite rivestita di teflon, e mescolare delicatamente muovendo il tubo prima di lasciare riposare per 10 min. Non impiegare vigorosa agitazione per evitare lo strappo dei pezzi di gel.
  6. Rimuovere con cautela AMBIC dal tubo di vetro utilizzando una pipetta di vetro Pasteur o una pipetta dotato di una punta in plastica extra-lunga. Evitare distruggendo e il trasferimento dei piccoli pezzi di gel durante la rimozione della soluzione AMBIC.
  7. Aggiungere 1 ml di acetonitrile (ACN) per latubo di vetro, tappo, e mescolare delicatamente muovendo il tubo prima di lasciare riposare per 10 min. Assicurarsi che i pezzi di gel sono completamente coperti con del solvente. Se necessario, spingere pezzi di gel al largo della parete del tubo e in un solvente con la punta della pipetta.
  8. Pipettare ACN fuori dal tubo di vetro e ripetere i passaggi 1,5-1,7 fino a quando il colore blu brillante viene eliminato. Ripetere un minimo di cinque lavaggi sequenziali AMBIC / ACN, se necessario. Per argento macchiato gel, utilizzare un kit Decolorare. Procedere alla fase successiva quando il pezzo di gel diventa uniformemente bianco mentre in ACN.
  9. Pipettare il liquido dal tubo di vetro, richiudere la provetta, aggiungere 1 ml di AMBIC e lasciare riposare per 5 minuti.
  10. Rimuovere AMBIC e aggiungere 2 ml di acetato di etile (EtOAc) al tubo di vetro. Recap tubo con tappo rivestita di teflon e posto a 4 ° C per una notte con l'agitazione end-over-end o, in alternativa effettuare tre lavaggi EtOAc a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuno. Più lungo è il lavaggio EtOAc, il più efficace la rimozione di contaminanti.
  11. Rimuoverela finale EtOAc lavare ed eseguire tre lavaggi ciascuna con 2 ml di H 2 O. La rimozione completa di EtOAc garantirà una robusta reazione β-eliminazione riduttiva.
  12. Pipettare off H 2 O e disidratare il gel lavando una volta con 1 ml di ACN.
    NOTA: Dopo l'essiccazione, i gel disidratati sono pronti per in-gel β-eliminazione. Pezzi di gel disidratati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso.
  13. Arrestare il processo di lavaggio ad ogni passo e memorizzare i pezzi di gel a 4 ° C per una notte, indipendentemente dal tampone o soluzione viene applicata al gel (AMBIC, ACN, H 2 O). Riavviare la preparazione dei campioni in qualunque momento entro i prossimi 2 giorni.
  14. Utilizzare una parte dei pezzi di gel decolorato e disidratati per ID proteine ​​mediante approcci di proteomica standard.

2. In-gel O-glicani uscita da riduttiva β-eliminazione

  1. Preparare una soluzione stock di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) utilizzando il 50% di NaOH o solido deposito NaOH ed a 4 ° C fino all'utilizzo. Prendere 5.2 ml di NaOH al 50% (o 4 g di NaOH solido) e regolare il volume a 100 ml di rendere soluzione 1 M di NaOH. Diluire la soluzione madre 1 M NaOH NaOH 100 mM, che può essere conservato a 4 ° C fino a 6 mesi senza perdita di efficienza nelle reazioni β-eliminazione riduttiva.
  • Fai 2 M boroidruro di sodio (NaBH4) in NaOH 100 mM. Disciogliere 38 mg di NaBH 4 in 0,5 ml di NaOH 100 mM. Generalmente, utilizzare 0,5-1,0 ml della soluzione di boroidruro per ogni campione. Variare il volume della soluzione di reazione della quantità di pezzi di gel secchi preparati nel passaggio 1. aspettano di utilizzare 0,5 ml di soluzione di boroidruro per 1-2 pezzi di gel escisse (passo 1.3).
  • Aggiungere 500 ml di NaOH 100 mM per i pezzi di gel disidratato e lasciare riposare per 3-5 minuti in ghiaccio, al fine di equilibrare il gel per le condizioni di base che aumentano il recupero glicani.
  • Aggiungere 500 ml di 2 M NaBH4 in NaOH 100 mM, con concentrazioni finali di 1 M NaBH
  • Durante la prima ora di incubazione, mescolare delicatamente il tubo ogni 15 min. Evitare di forte agitazione, perché può frammentare i pezzi di gel. Eseguire la reazione in un ben equilibrato-incubatore / forno o in un blocco riscaldante. Assicurarsi che i pezzi di gel sono coperte di soluzione di reazione.
  • Arrestare la reazione rimuovendo la provetta dal termostato o il blocco di riscaldamento e l'immissione sul ghiaccio.
    NOTA: Dopo aver lasciato la reazione di β-eliminazione di procedere per 18 ore, il processo di dissalazione deve essere eseguita entro il giorno stesso.

    • 3. Desalting on-scambio cationico cromatografia

    1. Pur mantenendo la provetta in ghiaccio per evitare formazione eccessiva di calore, aggiungere lentamente 10% di acido acetico (AcOH) goccia a goccia per neutralizzare la base. Vortice lentamente la provetta tra le aggiunte di AcOH. Fare attenzione a aggiungere l'acido lentamente e rilasciare saggio come additisu di acido produrrà un "vulcano" di bolle. Centrifugare la provetta per eliminare le bolle e prevenire ricaduta, se necessario.
      1. Al fine di eliminare la grande quantità di sodio nella miscela di reazione, passare la miscela di reazione attraverso una piccola colonna di scambio cationico (o Dowex AG-50W-X8 resina, forma H +).
      2. Lavare la resina a scambio cationico con 1 M NaOH e 1 M HCl prima dell'uso per rimuovere i contaminanti che interferiscono con l'analisi MS, anche se la resina è di grado analitico.
      3. Bagnare la resina in 1 M NaOH e rimuovere la soluzione per decantazione. Aggiungi deionizzata, eliminare l'acqua, quindi aggiungere 1 M HCl.
    2. Ripetere questi passaggi fino a quando la soluzione di cui sopra la resina è incolore. Lavare la resina pulita con acqua deionizzata e conservare in 5% AcOH a 4 ° C.
    3. Per fare un piccolo bicchiere di colonna, graffi e rompere la punta di un vetro pipetta Pasteur con un taglierino in ceramica in modo che il cono del puntale è di circa 1 cm di lunghezza. Tease parte un tappo di lana di vetro e spingere verso la punta forma un supporto per il letto di resina. Fissare la colonna pipetta con un morsetto o molletta e posizionare sopra una provetta di vetro.
    4. Lavare la pipetta vuota con 1 ml di metanolo (MeOH) e 3 ml di 5% AcOH. Turbinio H + Dowex o AG50 scambio cationico liquami memorizzati in 5% AcOH e trasferire abbastanza dello slurry per produrre un volume di 1 ml letto nella colonna pipetta Pasteur.
    5. Lavare la colonna con cinque volumi del 5% AcOH. Controllare il flusso attraverso la comparsa di particelle di resina e non utilizzare la colonna in caso di rilevamento di resina.
    6. Mettere colonna su un nuovo tubo tappo a vite in vetro (16 x 125 mm) e il campione del carico. Raccogliere il flusso attraverso ed eluire glicani con almeno 3 volumi di 5% AcOH nella stessa provetta.
    7. Coprire il tubo con parafilm e fare piccoli fori con un ago. Inserire il tubo campione a -80 ° C o in ghiaccio secco. Una volta congelato, essiccare il campione mediante liofilizzazione. Conservare il materiale essiccato a -20 °C fino all'utilizzo.

    4. Rimozione borato

    1. Preparare 10% AcOH in MeOH. Prendere 10 ml di acido acetico glaciale e regolare il volume a 100 ml con metanolo. Conservare questo reattivo in una bottiglia di vetro con tappo in teflon foderato per un massimo di 6 mesi.
    2. Aggiungere 300 ml di 10% AcOH in MeOH a secco, tubo campione liofilizzato e agitare. Rimuovere la risultante trimetil borato mediante evaporazione in corrente di N 2.
      NOTA: Miscelazione sali borato con metanolo in condizioni acide produce trimetil borato che è un composto volatile.
    3. Secco sotto flusso di N 2 a 37 ° C. Dopo l'essiccazione, aggiungere un'altra aliquota di AcOH in MeOH come descritto al punto 4.2. Essiccare il liquido per 5 min sotto azoto (N 2) flusso a 37 ° C.
      1. Ripetere risospensione e l'essiccazione di almeno 3 volte. Conservare il materiale essiccato a -20 ° C fino al momento dell'uso.

    5. C18 Clean-up

    1. Equilibrare una colonna cartuccia C18(Dimensioni 1 ml, 100 mg di resina) con tre volumi di ACN, e cinque volumi del 5% AcOH. Accelerare il passaggio delle soluzioni equilibratrici mediante l'applicazione di pressione d'aria positiva mite.
    2. Aggiungere 500 ml di 5% AcOH alla provetta dissalato e senza borato e sciogliere dal vortice.
    3. Caricare campione risospeso nella colonna C18 equilibrata e raccogliere il flusso attraverso in una provetta con tappo a vite di vetro (13 x 100 mm). Eluire O-glicani con 3 ml di 5% AcOH nella stessa provetta.
    4. Parafilm il tubo, fare piccoli fori con un piccolo ago o utilizzare il tappo rivestito in PTFE liberamente chiusa per coprire il tubo, e congelare il campione a -80 ° C o in ghiaccio secco. Rimuovere il solvente mediante liofilizzazione. Conservare il campione essiccato a -20 ° C fino al momento dell'uso.

    6. Preparazione Base per Permethylation

    NOTA: Al fine di raggiungere robusta permethylation, preparare NaOH liquame fresco. Tutta la vetreria utilizzata per le reazioni permethylation dovrebbe essere ampiamente pulito.

    1. Per preparare il reagente base per permethylation, aggiungere 400 ml di NaOH al 50% in una provetta con tappo a vite vetro pulito (13 x 100 mm). Aggiungere 800 ml di MeOH anidro e vortice.
    2. Aggiungere 4 ml di anidra dimetil solfossido (DMSO) e agitare per generare un precipitato bianco.
    3. Centrifugare a 600 xg per 1 minuto per far sedimentare il precipitato. Pipettare il surnatante e gettarlo. Aggiungere un ulteriore 4 ml di DMSO anidro al pellet. Vortex.
    4. Ripetere il punto 6.2 e 6.3 almeno altre tre volte o fino a quando non forma un precipitato bianco.
    5. Sciogliere la base di pellet in 3 ml di DMSO anidro e mescolare delicatamente pipettando su-e-giù con una pipetta Pasteur pulito.
    6. Utilizzare la base immediatamente per la reazione seguente permethylation quanto non può essere conservato.

    7. Permethylation di glicani rilasciati

    1. Aggiungere 200 ml di DMSO anidro al campione C18-purificato e vortice o agli ultrasuoni per riportare in sospensione.
    2. Aggiungere 300 ml di resuspended base di liquami al campione e aggiungere immediatamente 100 ml di iodometano (MEI). Sigillare tubo con tappo rivestita di teflon e mescolare energicamente per 5 minuti in vortice.
    3. Per interrompere la reazione permethylation, aggiungere 2 ml di 5% AcOH su ghiaccio e vortex. Pipetta soluzione su e giù 5 volte a ridurre il volume rimanente di Mei per evaporazione.
      NOTA: Il HoAc neutralizza la soluzione e la rimozione di Mei aumenta l'efficienza di estrazione di glicani solfatati nella fase acquosa durante la fase di partizione.
    4. Aggiungere 2 ml di diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugare a 600 xg per 1 minuto a temperatura ambiente per separare le fasi acquosa e organica.
    5. Trasferire lo strato superiore (fase acquosa che contiene la maggior parte dei glicani solfatati permethylated) in un nuovo tubo di vetro (13 x 100 mm).
    6. Aggiungere 2 ml di H 2 O per la fase organica e vortice. Centrifugare a 600 xg per 1 min per separare le fasi acquosa e organica e combinare questa seconda fase acquosa con l'abetest fase acquosa (punto 7.5).
    7. Ripetere la fase 7.6 e 7.5 altre tre volte, ma non vi è alcuna necessità di salvare le fasi acquose risultanti dalle partizioni successive.
    8. Rimuovere lo strato finale superiore (fase acquosa) il più possibile dallo strato inferiore (fase organica) e trasferire lo strato inferiore (fase organica) in una nuova provetta separata utilizzando pulito pipetta Pasteur.
    9. Asciugare la fase organica in N 2 flusso a 42 ° C.
    10. Coprire il tubo con Parafilm e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

    8. C18 Clean-up di Permethylated solfatate O-glicani dalla fase acquosa

    1. Equilibrare una colonna cartuccia C18 con tre volumi di ACN, e cinque volumi del 5% AcOH.
    2. Caricare le fasi acquose raccolti e combinati dalle fasi 7.5 e 7.6 nella colonna.
    3. Lavare la colonna con 10 ml di H 2 O per la dissalazione.
    4. Eluire il permethylated solfato O-glicani in un nuovo tubo di vetro con 2 mldel 50% ACN. Utilizzare un ulteriore eluizione con l'85% ACN per migliorare il recupero di permethylated solfati O-glicani su oligosaccaridi più grandi.
    5. Eluati a secco sotto flusso di azoto a 42 ° C.
    6. Conservare il materiale essiccato a -20 ° C fino a 6 mesi prima dell'analisi MS.

    9. Spettrometria di Massa di Permethylated O-glicani

    1. Analizzare permethylated O-glicani mediante infusione diretta in un spettrometro di massa appropriato utilizzando una sorgente nanoelectrospray ad una portata siringa ,40-,60 microlitri / min a 210 ° C di temperatura capillare. Per frammentazione CID in MS / MS e MS n di uno strumento trappola ionica, applicare il 30-40% di energia di collisione.
    2. Per la modalità di ioni negativi, ricostituire permethylated solfato O-glicani in 50 ml di metanolo / 2-propanolo / 1-propanolo / 13 mM di acetato di ammonio acquoso (16: 3: 3: 2 in volume). Per la modalità di ioni positivi, ricostituire permethylated / sialylated O-glicani neutri in 50 ml di 1 mM di sodio idroidrossido in metanolo / acqua (1: 1).
    3. Utilizzare la mappatura totale di ioni (TIM) e la scansione perdita del neutro (scansione NL) funzionalità della versione del pacchetto software Xcalibur 2.0 per l'analisi MSN a caratterizzare singole strutture O-glicani 13,19.

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    Representative Results

    Effetto di acetato di etile Trattamento Prima di In-gel riduttiva β-eliminazione

    Uno spettro di massa di campioni rappresentativi glicani O-linked permethylated rilasciati da bovini mucina utilizzo nel gel riduttivo β-eliminazione è mostrato in Figura 3. Il lavaggio EtOAc dei pezzi di gel rimuove efficacemente SDS e Polyacryl contaminanti che interferiscono con successiva analisi MS 27.

    Figura 3
    Figura 3. etile acetato di lavaggio di poliacrilammide gel pezzo prima in gel riduttivo β-eliminazione migliora il rilevamento di glicani rilasciati. (A) Senza lavare con acetato di etile, lo spettro di massa di glicani O-linked permethylated rilasciati da in-gel di β-eliminazione di bovini mucina sottomascellari è dominato da una grande varietà di un polidisperso contaminant, che oscura quasi completamente i segnali MS abbinati glicani O-linked. (B) lavaggio del pezzo gel con acetato di etile elimina i picchi di contaminanti, consentendo rivelazione sensibile di glicani. Modificato da Kumagai 25.

    Recupero di O-linked Glycan è più da piccole fette Gel

    Glicani O-linked sono stati rilasciati da sottomascellari bovina mucina da in-gel riduttivo β-eliminazione utilizzando pezzi di gel che sono stati entrambi a fette piccole (~ 2 x 2 mm) o grande (~ 5 x 5 mm). Pezzi di gel minore di ~ 2 x 2 mm non sono stati recuperati in modo efficiente attraverso le fasi di lavaggio. A seguito di permethylation, una quantità nota di uno standard glicano esterna permethylated (maltotri- e maltotetrasaccharide, DP3 e DP4) è stato aggiunto ad ogni per facilitare la quantificazione del recupero glicano 27. Il recupero di glicani O-linked da piccoli pezzi di gel era quasi 10 volte superiore a dai grandi fette di gel (Figura 4).

    Figura 4
    Figura 4. Riposo Glycan da piccoli pezzi di gel è più efficiente da pezzi più grandi. Piccoli pezzi (~ 2 x 2 mm) hanno prodotto più glycan di cubi più grandi (~ 5 x 5 mm). Barre mostrano intensità di segnale relativi per la somma di tutte le strutture glicani O-linked normalizzati al segnale rilevato per uno standard esterno (maltotrisaccharide DP3, impostato a 100%), che è stato aggiunto al glycan rilasciato prima dell'analisi MS. I valori sono la deviazione standard medio per n = 3. Modificato da Kumagai K 25.

    Arricchimento di Sulfoglycans da Phase Partition

    Un permethylated standard di glicani solfato (solfo-Le a) è stato completamente recuperato nella fase acquosa. Glicani sialylated Permethylated rilasciate da the mucina glicoproteina partizionati in fase DCM (Figura 5). Il recupero di ogni glicani permethylated per partizione acquoso-organico era paragonabile a quella del precedente caratterizzato C18 Sep-Pak pulizia metodo 27. L'efficienza e la semplicità del metodo divisorio fase facilita notevolmente la velocità di campionamento e metodi analitici successivi.

    Figura 5
    Figura 5. recupero differenziale di sulfo- e sialo-glicani di partizione fase. Bovino glicoproteina mucina è stata aggiunta una quantità nota di uno standard solfo-glicani (solfo-Le a) prima di essere sottoposto a riduttivo β-eliminazione. Glicani rilasciati sono stati permethylated e la reazione permethylation è stata corretta a 1: 1: acqua: DCM. Le fasi organiche e acquose risultanti sono stati separati e analizzati da MS. Recupero glycan è stato quantificato relative alle norme glycan esterni permethylated, che sono state aggiunte nel campione prima dell'analisi MS. Recuperi Glycan nella organico (DCM) e acquosa (acqua) fasi vengono mostrati rispetto alla standard esterno, che è stato impostato a 100%. Sulfoglycans erano rilevabili nella fase organica, ma quantitativamente recuperati nella fase acquosa. I risultati rappresentano la media ± SE di tre esperimenti indipendenti. Modificato da Kumagai 25.

    Applicazione di approfondita analisi proteomica e Glycomic in campioni biologici

    Proteine ​​saliva umana sono state separate mediante SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue (G-250). Una proteina ad alto peso molecolare Mw ~ 600 kDa è stata escissa dal gel ed una porzione del pezzo gel è stato sottoposto al gel di digestione con tripsina e LC-MS / analisi proteomica MS, che individua questa banda come MUC5B 16,24 . Il resto del pezzo gel è stato sottoposto a redu in gel ctive β-eliminazione per O-glicani analisi 27. Dopo permethylation e la partizione fase acquosa-organica (Acqua: DCM, 1: 1), permethylated glicani nelle fasi acquosa e organica sono stati analizzati mediante NSI-MS. Non-solfato permethylated O-glicani sono stati recuperati dalla fase organica e tutti i sulfoglycans permethylated sono stati recuperati dalla fase acquosa, che facilita l'identificazione e la caratterizzazione di solfato quasi isobarica e glicani non solfati, ad esempio, Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-olo (m / z = 1606,8, [M + Na] +) e (SO 3) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc GalNAc 1-olo (m / z = 1606,7, [M + 2Na-H] +) differire di soli 0,1 unità di massa e sarebbe difficile soluzione senza separare fisicamente le due specie per partizione fase (Figura 6).

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    Figura 6. Individuazione di complessità isobarica in folle e sulfo-glicani separati da partizioni acquoso-organici. MS 2 modelli di frammentazione ottenuti da ioni genitore rilevate dal mapping di ioni (TIM) analisi totale di O-glicani permethylated rilasciati da salivare umana mucina da in-gel di β-eliminazione e acqua: partizione DCM seguente permethylation. (A) MS 2 dall'analisi TIM della fase DCM per una finestra di 2,8 unità di massa intorno a m / z = 1608. (B) La MS 2 spettro della stessa finestra di massa per analisi TIM della fase acquosa. Nella DCM-fase, i principali ioni frammento corrispondono alla perdita di Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1.331,8), perdita di Fuc 1 Hex 1 -O (1.196,7), la perdita Hex 1 HexNAc 1 (1.143,6), perdita di Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), la perditadi Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660.4), e Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Sulla base di questi frammenti di ioni, una miscela di strutture non solfatati con una composizione di Fuc 1 3 Hex HexNAc 2 GalNAc-olo si propone come mostrato a destra dello spettro. Per contro, le grandi frammenti di ioni per la fase acquosa sono la perdita di SO 3 Na (1486,8), perdita di NeuAc (1231,5), perdita di Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), perdita di combinazione di NeuAc e SO 3 Na ( 1111,8), e la perdita di NeuAc 1 Hex 1 -O (1009,4). Una miscela di strutture solfati con una composizione di (SO 3 -) si propone 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc GalNAc 1-olo. Senza separazione fisica del neutro e sulfoglycans per partizione fase, interpretando MS 2 spettri di tali miscele è significativamente più challenging. Modificato da Kumagai 25. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

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    References

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    Chimica glicoproteina glicosilazione in gel riduttivo β-eliminazione glicani O-linked glicani solfato spettrometria di massa identificazione di proteine SDS-PAGE glicomica sulfoglycomics
    Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa
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    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T.,… More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

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