Summary
O trato corticoespinhal, uma das principais vias sensório-motores, pode ser lesionado unilateralmente no tronco cerebral de roedor, a fim de testar terapias de indução neuroplasticidade para o sistema nervoso central. Este procedimento cirúrgico ("pyramidotomy") e avaliação pós-operatória são descritos neste protocolo.
Abstract
O trato corticoespinhal (CST) pode ser completamente cortado unilateralmente nas pirâmides medulares do tronco cerebral de roedores. A CST é um aparelho motor que tem grande importância para o controlo muscular distai em seres humanos e, em menor grau, em roedores. Um corte unilateral de uma pirâmide resultados na perda da CST inervação da medula espinhal, principalmente no lado contralateral da medula espinhal levando à deficiência motora transitória nos membros anteriores e sustentada perda de destreza. Projeções ipsilateral do trato corticoespinhal são menores. Nós refinamos nosso método cirúrgico para aumentar as chances de completude lesão. Nós descrevemos o cuidado pós-cirúrgico. Déficits no teste Montoya escadaria pellet atingindo eo teste escada horizontal mostrado aqui são detectados até 8 semanas postinjury. Déficits no teste criação cilindro só são detectados transitoriamente. Portanto, o ensaio do cilindro só pode ser adequado para a detecção de recuperação curto prazo. Mostramos como, electrofisiologicamentee anatomicamente, pode-se avaliar lesões e alterações de plástico. Nós também descrevem como analisar as fibras da CST ileso brotando através da linha média para as áreas necessitadas. É um desafio para obter> 90% lesões completas consistentemente devido à proximidade com a artéria basilar no bulbo e as taxas de sobrevivência pode ser baixa. Abordagens cirúrgicas alternativas e testes comportamentais são descritos neste protocolo. O modelo pyramidotomy é uma boa ferramenta para avaliar os tratamentos de indução de neuroplasticidade, que aumentam surgimento de fibras intactas após a lesão.
Introduction
O trato corticoespinhal (CST) é uma das principais vias do motor na medula espinhal humana. Danos a este aparelho depois da medula espinhal ferimento resulta em considerável perda de destreza. A CST é especialmente importante para o movimento motora fina em seres humanos, como o movimento dígitos e controle muscular distal. Também é encontrada em roedores, embora a sua localização anatómica na medula espinhal é diferente da dos seres humanos e é menos danos CST incapacitante 1-4.
Um modelo in vivo de lesões em CST envolve pyramidotomy unilateral, onde uma pirâmide no tronco cerebral ventral rostral é cortado para o cruzamento (Figura 1). As pirâmides são uma característica anatômica clara no lado ventral do bulbo através do qual a CST é executado antes que decussates. Em ratos, a maioria das fibras (cerca de 95%) cruzado em X na extremidade caudal da medula e são posteriormente encontradas na parte medial dorsal da medula espinhal. No entanto, approximately 10% das fibras decussated executado nas colunas dorsolateral. O restante ~ 5% de fibras ficar uncrossed no lado ipsilateral e viajar na parte medial ventral 5,6. Após pyramidotomy a medula espinhal perde a sua entrada direta da CST contralateral (Figura 1).
O modelo pyramidotomy é particularmente bom para testar as respostas das fibras intactas do CST não lesionado para um tratamento. Ele permite a avaliação de plasticidade e surgimento das fibras intactas através da linha mediana da medula espinhal, que inervam as áreas desnervado. O trato corticoespinhal tem sido observada a brotar consideravelmente em modelos de lesão na coluna vertebral e medeia especialmente forelimb 7-10 recuperação. Um tratamento pode visam reforçar esta recuperação membro anterior. A eficácia de uma terapia pode ser testado com avaliações comportamentais, técnicas de rastreamento anatômicas do trato não lesionado e experimentos eletrofisiológicos terminais 3,11,12. </ P>
A vantagem em comparação com a maioria dos outros modelos pré-clínicos de lesões na coluna vertebral é que ela afeta especificamente um trato em comparação com outras lesões na coluna vertebral que afetam muitas vezes vários setores. Apenas um trato em uma localização anatômica clara, superficial está lesionado. Outra vantagem é que o pyramidotomy é um modelo de lesão reprodutível. É um adequado em recurso vivo para pesquisadores para testar o efeito de terapias de indução de neuroplasticidade potenciais, que visam a recuperação da função motora após lesões ou doenças que afetam o sistema motor 13,14.
Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos estavam de acordo com as diretrizes do Reino Unido Home Office e animais (Scientific Procedures) Act, de 1986.
1. Cirurgia e Injury
NOTA: Usando ratos mais pesados do que 220 g pode ajudar na recuperação pós-operatória se o cirurgião encontra animais muitas vezes perdem mais de 10% do seu peso corporal pré-operatório.
- Antes da cirurgia, testar os animais para a sua preferência forepaw com o teste de criação de cilindro de 15 ou o Montoya staicase teste 24. De preferência, corte a pirâmide / a CST correspondente ao forepaw dominante.
NOTA: Durante dois dias antes da cirurgia, coloque os seguintes itens nas gaiolas, de modo que os ratos se familiarizar com os alimentos que serão benéficas durante a recuperação da cirurgia: pacotes de hidrogel, amasse molhado, e altos suplementos alimentares calóricos. Versões estéreis desses suplementos alimentares estão disponíveis a partir de vários fornecedores. - Anestesiar feminino Lister de capuz (ratos com um peso compreendido entre 200 e 250 g) com isoflurano (5% para a indução e 1 a 2% para manutenção) em oxigénio (taxa de fluxo: 1,5 L / min). NOTA: A escolha do anestésico é importante. Anestésico por inalação permite a regulação rápida da profundidade da anestesia do que a cetamina, o qual é também vulgarmente utilizado. O isoflurano permite um melhor controlo da frequência respiratória e profundidade. A escolha do anestésico é isoflurano. NOTA: Usando ratos mais pesados do que 220 g pode ajudar na recuperação pós-operatória se o cirurgião encontra animais muitas vezes perdem mais de 10% do seu peso corporal pré-operatório.
- Carprofeno administrar por via subcutânea, um analgésico, quando os animais são anestesiados para reduzir a inflamação e para proporcionar analgesia. Nota: Carprofen é dado durante a cirurgia pyramidotomy em nosso laboratório de acordo com o conselho do nosso veterinário. Os opióides podem causar mais depressão respiratória durante a cirurgia.
- Manter os animais a 37 ° C durante a cirurgia utilizando um larsistema cobertor othermic e uma sonda de temperatura retal.
- Confirme anestesia completo, marcando para o reflexo de retirada da pata pitada eo reflexo de piscar.
Nota: Opcional: Para combater problemas respiratórios durante a cirurgia, intubação e ventilação pode ser viável. No entanto, tenha em mente que a traquéia deve ser deslocado durante a cirurgia. - Uma vez anestesiados, coloque o rato em decúbito dorsal, fazer a barba do pescoço ventral e esterilizá-lo com 1% de toalhetes de clorexidina e / ou toalhetes com álcool. Aplicar um cobertor cirúrgico estéril sobre o animal e manter a área estéril em todos os momentos.
- Uma vez anestesiados, coloque o rato em decúbito dorsal, fazer a barba do pescoço ventral e esterilizá-lo com 1% de clorexidina e álcool toalhetes. Aplicar um cobertor cirúrgico estéril sobre o animal e manter a área estéril em todos os momentos.
NOTA: Opcionalmente, a cabeça do rato pode ser fixado em um quadro estereotáxico na posição supina durante a cirurgia para desativar a mobilidade da cabeça, ou seja,o osso occipital. - Faça uma incisão na linha média de 2 a 3 cm de comprimento desde o queixo até quase o final rostral do esterno utilizando um bisturi estéril (# 10). Opcionalmente, aplicar grampos bulldog pequenos para retrair a pele.
- Blunt dissecar as camadas superiores do tecido, como glândulas (p.ex. glândula submandibular e parótida) e músculos que cobrem a traqueia usando ação reversa com uma tesoura embotados e pinças dentadas. Fique sempre na linha média. Os tecidos devem ser separados facilmente.
- Uma vez que a traqueia é exposta, deslocá-lo para um dos lados. A linha média é visível por baixo, com duas almofadas de gordura branca, marcando a linha média no final rostral.
- Rostral para as almofadas de gordura branca, dissecar tecido sem corte até que a superfície ventral do crânio (osso basioccipital) é alcançado.
- Insira afastadores longo dentadas (5,5 milímetros de comprimento dente ou 16 mm) para manter a traqueia deslocada para um lado (máximo de 1 cm) e para expor a base do crânio. Deslocamento da traquéia pode obrespiração struct.
NOTA: Para alguns animais, solte os afastadores em vários momentos durante a cirurgia para remover a pressão sobre a traquéia, por exemplo, a cada 10 minutos por 2 min. Afastadores gancho pode ser usado em vez de afastadores longas-dentado para reduzir a tensão de deslocamento. - Cauterizar cuidadosamente pequenos vasos sanguíneos visíveis na extremidade rostral indo em direção à laringe para evitar sangramento.
NOTA: De modo a evitar cauterizar os vasos sanguíneos do nervo laríngeo recorrente são cuidadosamente puxado para fora a partir da parede do tecido antes que eles são cauterizados. - Ajustar o microscópio para o restante da cirurgia.
- Remover o periósteo que cobre a base do crânio com uma pinça fina. Ajuste os retratores para conseguir a melhor visão possível para a perfuração.
- Sinta a superfície irregular do osso basioccipital com uma pinça fina, observando uma elevação na linha média, que abrange a artéria basilar. Rostralmente, o crânio torna-se levantou como uma ligeira convexidade.
- Dependendo de qual lado da lesão é desejada, faça um furo de cerca de 1 mm lateral à linha média em movimentos mediolaterais.
NOTA: Lembre-se que o rato está na posição supina, e do seu lado esquerdo pode ser do lado do investigador mão direita! - Uma vez que é feito um orifício, ampliar direção à linha média com pequenas verticais up-and-para baixo-movimentos com a broca até a artéria basilar é claramente visível e ampliar lateralmente por pelo menos 2 mm.
- Certifique-se que a artéria basilar é claramente visível. A pirâmide pode ser identificado pela sua forma ligeiramente protuberantes (Figura 2) e pelo que fazem fronteira com os vasos sanguíneos.
- Remova todos os fragmentos de ossos restantes com uma pinça fina.
- Aplicar uma gota de cloridrato de doxapram, um estimulante respiratório, na língua.
- Abra a dura longitudinalmente com uma agulha de calibre 26 e uma pinça fina lateral à artéria basilar. Banhe-se ao líquido cefalorraquidiano (LCR) e qualquer sangramento com cotonetes.
- Evitando INJUry da artéria basilar, fazer um corte de aproximadamente 1,5 mm de largura que abrange a largura da pirâmide e 0,5 mm de profundidade com Vannas mola Tesoura perpendicular à artéria basilar (Figura 2) para interromper as fibras de TCS.
NOTA: Marque a microtesoura antemão a 0,5 mm a partir das pontas. Uma vez que a dura-máter é aberta na artéria basilar pode ser movido ligeiramente para um lado permitir um melhor acesso à pirâmide. - Repetir o corte, utilizando a ponta de uma agulha de calibre 26 para garantir a lesão inclui as fibras próximas da artéria basilar.
- Parar o sangramento com uma leve pressão aplicada por cotonetes. Opcionalmente, o corte pode ser coberto com gelfoam.
- Retire os afastadores, substituir os tecidos e fios de sutura apenas a pele com 3-0 Vicryl.
- Após a cirurgia, manter o animal em uma incubadora a 32 ° C até estar completamente acordados e administrar por via subcutânea, 5 ml de solução salina, se necessário. Não deixe o animal autônoma.
- Dê Carporfen por via subcutâneacomo um anti-inflamatório e como um analgésico para a dor pós-operatória após a cirurgia um dia.
- Monitorar os animais de perto por uma semana após a cirurgia e, pelo menos, uma vez por semana depois disso.
- Conforme necessário após a cirurgia, pacotes de gel de hidratação lugar, comida em puré bebê, purê molhado e ração seca no piso da gaiola. Fornecer garrafas de água com bicos longos (faltando válvulas de rolamento de esferas).
Representative Results
As taxas de sobrevivência.
Em um estudo representativo realizado por nós tivemos uma taxa de sobrevivência de 16 dos 20 ratos fêmeas encapuzados Lister (200-250 g). A complicação mais comum é a respiração dificuldades por causa do deslocamento da traquéia ou danos aos centros respiratórios no tronco cerebral apenas dorsal para as pirâmides (solitarii núcleo, ambíguas e parabrachilis). Resultados semelhantes têm sido relatados na literatura 16.
Resultados comportamentais.
Uma série de testes comportamentais foram utilizados para avaliar o resultado sensório-motora após pyramidotomy em roedores: o teste de escada horizontal, o único pelete atingir teste, o teste de criação cilindro e teste em escada Montoya são as avaliações comportamentais mais vulgarmente utilizados. Outros testes descritos na literatura são o pellet atingindo teste, teste de corda de escalada, análise de marcha eo teste de fita adesiva3,17-19. A maioria destes mostram um déficit motor funcional uma semana após a lesão. Atualmente, a maioria dos estudos descritos na literatura apenas realizar o teste comportamental até 42 dias 4,11,13,20,21, ou por um período mais curto 3,18,22. Realizamos testes de comportamento durante um período prolongado de tempo e ter visto essencialmente completa recuperação da função motora das 8 semanas após pyramidotomy para alguns dos testes comportamentais, excepto o teste de escada e o ensaio de Montoya escada horizontal. Este é provavelmente por várias razões. Em primeiro lugar, o rostral CST feridos para a lesão pode formar sinapses nos neurônios no tronco cerebral que atuam relés como indiretos para os neurônios motores na medula espinhal. Em segundo lugar, o ileso (contralateral) CST pode brotar e formas sinapses nos neurônios no tronco cerebral ou da medula espinhal que atuam como relés para os neurônios motores. Em terceiro lugar, outros tratos motores poupados, como os tratos reticulospinais, vestibuloespinais ou rubroespinais pode assumir alguma função. Assim, uma duração tratamento efeito é difícil de detectar, com muitos testes comportamentais no modelo pyramidotomy. Alguns testes de comportamento neste modelo, porém, poderia indicar uma recuperação acelerada cedo após a lesão, o qual está relacionado com um tratamento.
Teste do cilindro Empinar 3,4,23
Com base no teste de criação de cilindro a CST correspondente ao forepaw dominante foi ferido. Os ratos são colocados em um cilindro de plexiglass e comportamento de criação é observado por um período de 3 min. Preinjury houve uma ligeira preferência pelo uso de uma pata, da pata dianteira dominante, durante a exploração vertical (Figura 3A). A lesão afeta o lado dominante e o uso da pata dianteira contralesional diminuiu para 28% em 1 semana Medidas postinjury (repetidas ANOVA, p <0,05; teste post-hoc revelaram animais têm défices significativos na semana 1, 2 e 3, p <0,05, LSD de Fisher). 4 semanas postinjury os animais recuperaram umd usou o membro anterior afetada por 45% das traseiras, e depois de 6 semanas esta foi de 57% (n = 16, média ± erro padrão é mostrado). Camundongos Da mesma forma, Starkey et al. (4), avaliada pelo teste de cilindro para até 42 dias após pyramidotomy e relataram uma diminuição significativa no uso da pata dianteira afetada ao longo de todo o período de testes.
Teste Montoya Staircase 24
Rats exigem pré-treinamento para este teste para aclimatar antes da lesão. Para aumentar a motivação durante os animais sessão de testes são restrição alimentar de 15 g de alimentos por rato na noite anterior. Os ratos privados de alimentos são colocados na escadaria Montoya durante 15 min. Em cada lado, existe uma escada de sete passos, com poços, cada um contendo três peletes. O número total de pelotas recuperados de cada lado são registados. O número de pelotas recuperados com o / forepaw afetados contralesional diminuiu significativamente de 61% para preinjury3% 3 dias postinjury (Figura 3B). A capacidade de recuperar pelotas ainda estava significativamente prejudicada em 4 semanas postinjury com 20% de pelotas recuperados. Ratos mostram um déficit significativo até a semana 8 com apenas 29% das pelotas comido naquele ponto do tempo (medidas repetidas ANOVA p <0,05, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos no lado contralesional em todas as semanas, p <0,05, Fisher LSD). O forepaw ipsilesional é afetada até 1 semana postinjury; no entanto, este recupera até a segunda semana (Medidas repetidas ANOVA p <0,05, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos no dia 3 e Semana 1 na pata dianteira ipsilesional, p <0,05, de Fisher LSD). Os déficits iniciais do forepaw ipsilesional pode ser explicado pela a lesão da porção ipsilateral do trato corticoespinhal executando através da pirâmide cortada, com o surgimento e posterior recuperação.
HorizontalTeste Ladder 25
Rats exigem pré-treinamento para este teste. Rats caminhar três vezes ao longo de um 1 m de comprimento, com espaçamento de escada degrau irregular. Os vídeos são analisados mais tarde em câmera lenta e o número total de pé escorrega e erros para cada pata é quantificado. O gráfico da Figura 3C representa o número total de falhas e lapsos de lado afetado e menos afetados (forepaw + pata traseira), em percentagem do número total de passos dados. Os ratos têm um aumento significativo do número de erros de uma semana postinjury com 10% ou 11% sobre o lado afetado e do lado menos afetado respectivamente. Esse déficit é persistente na / no lado afetado contralesional até a semana 8 com 10% de erros fez, no entanto, deliberar sobre a / lado menos afetado ipsilesional por duas semanas (ANOVA para medidas repetidas, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos em todas as semanas na o lado contralesional e déficits significativos na Semana 1 e 3 no ipsilesionallado, p <0,05, de Fisher LSD).
Testes eletrofisiológicos
Em um terminal eletrofisiológico de set-up o animal foi anestesiado por via intraperitoneal com uretano. Durante todo o procedimento, que foi mantida a 37 ° C ± 1 ° C. Sua região ventral do pescoço, os seus membros anteriores e região torácica foram raspada e desinfectados com iodo matagal. As pirâmides foram expostos como previamente descrito e do nervo radial foi exposto na parte superior do braço por uma abordagem ventral incisão na pele e o músculo peitoral maior. A extremidade distal do nervo radial foi cortado e o nervo foi colocada sobre dois gancho-eléctrodos de prata-fios em um banho de óleo mineral. De qualquer pirâmide foi estimulado com eletrodos bipolares concêntricos em diferentes profundidades com 5 pulsos a 300 Hz e aumento da amplitude de estimulação. As gravações foram sempre feita a partir do nervo radial do braço deficientes (Figura 4).
Anim ilesoals teve uma resposta forte em latências entre 12 a 20 ms de nervo radial quando a pirâmide contralateral foi estimulada (Figura 4B). Estimulação ipsilateral só resulta em activação ocasional (Figura 4C). Os animais que receberam previamente pyramidotomies, no lado contralateral ao braço de gravação não mostram resposta do nervo radial quando o tracto lesionada é estimulada por cima da lesão (Figura 4B '). No entanto, a estimulação das fibras de TCS em que as pirâmides ipsilateral à gravação eléctrodos resultou numa forte activação do nervo radial em comparação com os animais lesionados com 12 semanas postinjury (Figura 4C).
Resultados anatômicos.
Os animais foram sacrificados 10 semanas após a cirurgia de acordo com o Anexo 1 dos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Duas semanas antes, o CST ileso foi traçado com biotiniladodextrano amina (BDA) injecções no córtex motor 26 ipsilateral ao braço deficientes (Figura 1). Isso permite a quantificação de fibras não lesadas, que atravessam a linha média e abastecem a medula espinhal contralesional (Figura 5C, D). Animais não lesadas têm apenas algumas fibras que atravessam a linha média, e que esta aumenta em resposta à lesão. Secções da espinal medula cervical transversa foram marcadas com a proteína quinase C (PKC) gama para avaliar a proporção de desnervação na CST lesionado (Figura 5E) 16. Alternativamente, a integralidade da lesão pode ser avaliada através da injecção de BDA traçador no córtex motor, no lado da lesão ipsilesional pyramidotomy. A falta de rotulagem no contralateral dorsomedial CST ea ipsilateral ventromedial CST fornece evidências de transection unilateral completa.
nt-width = src "4in" = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" />
Figura 1: Diagrama esquemático mostrando o trato corticoespinhal no rato e axotomia unilateral da CST nas pirâmides Top imagem:. Neurônios corticospinais originam nas células piramidais da camada 5 corticais. Amina dextrano biotinilado (representado em verde) é injectado no córtex contralesional duas semanas antes do fim da experiência. Imagem secundária: Os intervalos formam as pirâmides na superfície ventral da medula e na junção raquimedular a maioria dos axónios decussate. Pyramidotomy unilateral é realizada na medula caudal (mostrado em vermelho). Imagem Lower: A maioria dos tratos corticospinais descem nas partes dorsomedial e dorsolateral da medula espinhal. Uma minoria permanece ipsi e corre ventromedially.
"Width =" 1843fig2highres.jpg 500 "/>
Figura 2: Vista ventral do cérebro de rato. As pirâmides são distintos, porque eles são levantadas, convexities paralelas (caixa amarela). As fronteiras das pirâmides são definidos medialmente pela artéria basilar (BAS) sobre a linha média lateralmente e na base da convexidade a meio caminho entre a artéria basilar e a artéria paraolivary (pol) como pode ser visto em (C). Craniotomia é realizada sobre a artéria basilar e laterais estendendo-se até a artéria paraolivary (caixa vermelha na C). Uma pirâmide é cortado perpendicularmente à artéria basilar (linha vermelha em C, é mostrada em corte na amostra A e B). Lesões colocados também caudally perto das artérias vertebrais (vert) será incompleto porque a CST começa a decussate e porque a artéria vertebral é ajustado fora da linha média. (C) Imagem adaptado de "O Sistema Nervoso Rat", de George Paxinos 27. NOTA: Esta figura mostra uma lesão no lado esquerdo das imagens: este é o equipamento do animalht via piramidal porque está deitado de costas. Observe, porém, que o vídeo mostra uma lesão de esquerda via piramidal do animal.
Figura 3:. Os resultados representativos para o teste de criação de cilindro, Montoya escadaria pellet chegando e teste de escada Horizontal Há um déficit motor detectada por todos os testes após a lesão. No entanto, nenhum défice pode ser detectado com o teste do cilindro criação em 4 semanas postinjury, enquanto que os défices sustentada pode ser detectado com o teste em escada Montoya e o teste de escada horizontal até 8 semanas postinjury (n = 16 por grupo, os meios e o desvio padrão são mostrado). Asterisk indica p <0,05 em relação à linha de base preinjury (teste de LSD de Fisher). Por favor, cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Eletrofisiologia avaliação do trato corticoespinhal antes e depois pyramidotomy (A) mostra o set-up para o experimento terminal. Estimulamos as pirâmides com um trem de 5 pulsos em várias profundidades rostral ao site de a lesão e decussation. O trato vermelho é o trato lesionado. Nós gravar a partir do nervo radial no lado contralesional. (B) e (C) mostram exemplos gravados com estimulação ipsilesional ou estimulação contralesional antes ou 12 semanas após pyramidotomy. Estimulações Ipsilesional evocar vários potenciais de ação composto (picos no rastreamento) no nervo radial antes da lesão (B). Estes são abolidos pela lesão e atividade não return dentro de 12 semanas (B '). Estimulação contralesional evoca rara potenciais de ação composto único preinjury (C). 12 semanas após a atividade lesão é aumentado consideravelmente (C '), possivelmente devido à axônios intactos brotando através da linha média e plástico mudanças dentro da medula espinhal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Anatómico avaliação após pyramidotomy (A, B, C, D) amina dextrano biotinilado foi utilizado para rastrear o trato corticoespinhal, injectando-o no córtex motor correspondente à CST não lesionado (ver verde na Figura 1). A medial dorsal, os componentes ventral medial da CST são claramente visíveis (A, medial dorsal parte ampliada em B). (C) e (D) são ampliações de (A) de fibras de germinação através da linha média para a matéria cinzenta do lado desnervado em resposta a um tratamento. Para avaliar o preenchimento das secções transversais da lesão do nível cervical 4 (12 semanas tecido postinjury) foram cortadas e coradas com anticorpos contra PKC gamma (E). A CST no lado esquerdo da imagem é intacto e pode ser visto através da linha média abaulamento para o lado desnervado, presumivelmente devido à desintegração estrutural da dorsal ferido CST.
Discussion
Nós descrevemos o modelo de lesão pyramidotomy. O trato corticoespinhal é cortada ao nível do tronco cerebral. De um ponto de vista técnico, esta cirurgia requer muita cautela e precisão. O tronco cerebral acomoda os centros respiratórios e os centros cardiovasculares em múltiplos núcleos, como o núcleo ambíguo e solitarii incorporado na formação reticular debaixo das pirâmides. Se o corte é feito muito profundo isto pode conduzir a dificuldades respiratórias súbitas, que pode ser fatal. Damos Dopram pouco antes do corte para aumentar a actividade de respiração para evitar uma interrupção súbita respiração. Se a respiração pára, vale a pena a ventilação do animal para os seguintes cinco minutos com oxigênio como ele pode se recuperar. Além disso, os danos para a artéria basilar deve absolutamente ser evitada. Complicações durante os primeiros dias postinjury são: outra hemorragia no tronco cerebral que afeta as funções vitais, perda de peso considerável, diffic respiratória graveulties devido ao deslocamento da traqueia e graves problemas de orientação e equilíbrio do animal, devido à extensa lesão incluindo as azeitonas apenas laterais para as pirâmides. Estas complicações podem ser tratadas como pontos finais e os animais podem ser sacrificados sem dor. Monitorização cuidadosa durante a primeira semana após a cirurgia é essencial. Alimentação suplementar pode ser dado para contrabalançar a perda de peso. Inflamação das vias aéreas (respiração rouca) normalmente se resolve dentro de um a dois dias. Geralmente, os animais mais jovens são mais fáceis de operar como seu pescoço é menos profundo. Além disso, são mais resistentes e têm menos complicações respiratórias.
Ele requer um pouco de prática para alcançar uma lesão completa da CST com um pyramidotomy. Da mesma forma, em dois estudos por Steward et al. 16, que partiu para replicar um antigo experimento por Benowitz et al. 28, relataram as taxas de mortalidade inicialmente elevados e que algumas de suas lesões eram incompletas. Behaviouraldéfices também será variável. Recomendamos que um novo cirurgião realiza muitas cirurgias prática pyramidotomy antes de qualquer experimento completo para testar uma terapia candidato é realizada. Formas de prevenir lesões incompletas estão refazendo o corte com uma agulha hipodérmica certificando-se as fibras corticospinais perto da artéria basilar são cortados, conforme descrito neste protocolo. Outras opções são para aspirar o local da lesão com uma pipeta de sucção de vidro apontado como descrito em Zhou et al., 2003 29. Um arame de tungsténio finos também pode ser usado para cortar o troço 22. Uma alternativa para pyramidotomy é cortar o C3 dorsal cervical CST unilateralmente e, em seguida, para cortar com uma abordagem ventral da parte ventral C2 ipsilesional do CST 18. No entanto, sem dúvida, uma lesão completa não é necessário se o objetivo é estudar a brotação da CST contralesional; se a maioria da pirâmide está lesionado e uma resposta de germinação a partir do lado não lesionado ocorre este pode ser suficiente.
Um dos objectivos do modelo de lesão pyramidotomy é para fazer a ablação de um lado do trato corticoespinhal e utilizar terapias de indução neuroplasticidade para estimular a plasticidade e surgimento das fibras não intacta feridos. Para testar terapias neuro-protectora este modelo não é adequado e outros modelos de lesão tais como lesões contusas deve ser usado. Resultados do pyramidotomies são avaliados na maioria das vezes com o teste comportamental e anatomia. O teste de escada horizontal, o teste de criação de cilindro e teste de escada Montoya são as avaliações comportamentais mais usados. Outros testes descritos na literatura são o pellet atingindo teste, teste de corda de escalada, análise da marcha e da fita adesiva teste 3,17-19. No entanto, os resultados de mais testes comportamentais são apenas frequentemente monitorados até um máximo de 42 dias postlesion 3,4,11,17,18,20-22. A partir de experiências passadas, roedores recuperar a maior função em momentos posteriores sem qualquer intervenção do tratamento. Nós mostramos thao teste t escada horizontal e o teste atingindo Montoya escada sedimento detectar deficiência até um ponto de tempo posterior. Eles podem ser usados para medir a recuperação funcional devido a um tratamento. A integralidade lesão é julgado por coloração gamma PKC (que rotula fibras CST nas colunas dorsal) da medula espinhal ao nível cervical rostral ou eriocromo coloração cyanine de cortes transversais de local da lesão. Amina dextrano biotinilado pode ser injectado no córtex contralesional para avaliar a germinação das fibras intactas através da linha média para a área da espinal medula desnervado.
Em conclusão, o modelo pyramidotomy é bom para a avaliação das capacidades de indução de neuroplasticidade de uma droga para tratamento de lesões do sistema nervoso central se a cirurgia é dominado com sucesso. Ele avalia a plasticidade das fibras intactas. O próximo passo seria a utilização de um modelo mais clinicamente relevantes, tais como lesões contusão para avaliar a capacidade da droga para superar injuri maioreses afetando vários setores.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela International Spinal Research Trust eo Roseiras Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 5 mg/kg twice daily |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Fine Scissors- Tough Cut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Long-toothed Alm retractors | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| cautery system kit | Harvard Instruments | 726067 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Carbon Steel burrs | Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Dopram V-drops | Pfizer | apply 1 drop to tongue | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| gelfoam | Equimedical | EQU705001 | |
| 3-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Scales | Ohaus | NVT3201 | |
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
References
- Lemon, R. N. Descending pathways in motor control. Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).
- Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
- Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
- Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
- Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
- Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
- Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
- Kartje-Tillotson, G., O'Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
- Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
- Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
- Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
- Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
- Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
- Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
- Paxinos, G. The Rat Nervous System. , Academic Press, Inc. (1995).
- Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
- Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).
