Abstract
منذ 1940s انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم توفير علماء الأحياء مع الصور فائقة الدقة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، وبسبب البروتوكولات شاقة وتستغرق وقتا طويلا التي تتطلب أيضا خبرة في إعداد العينات خالية من القطع الأثرية، لا يعتبر TEM تقنية سهلة الاستخدام. إعداد نموذج التقليدي للTEM تستخدم مثبتات كيميائية للحفاظ على الهياكل الخلوية. الضغط العالي التجميد هو cryofixation العينات البيولوجية تحت الضغوط العالية لإنتاج معدلات التبريد سريعة جدا، مما يحد تشكيل الجليد، والتي تضر بسلامة التركيب الدقيق الخلوية. تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد حاليا أساليب اختيار لإنتاج أعلى مستوى من الجودة في التشكل أقسام الراتنج لTEM. هذه الأساليب تقلل من القطع الأثرية التي ترتبط عادة مع المعالجة التقليدية للTEM المقاطع رقيقة. بعد cryofixation يتم استبدال المياه المجمدة في العينة مع السائلالمذيبات العضوية في درجات حرارة منخفضة، وتسمى عملية استبدال التجميد. عادة يتم استبدال تجميد على مدى عدة أيام في مخصص، معدات مكلفة. هناك ابتكار مؤخرا يسمح للعملية أن تكتمل في ثلاث ساعات، بدلا من اليومين المعتادة. وعادة ما يعقب ذلك عدة ايام اخرى لإعداد عينة تشمل التسلل وتضمينها في راتنجات الايبوكسي قبل باجتزاء. هنا نقدم بروتوكول الجمع بين تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد سريع تمكن مصنع تثبيت العينة التي يتعين إنجازها في غضون ساعات. يمكن بسهولة بروتوكول تكييفها للعمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى. الأنسجة النباتية هي التي تثير قلقا خاصا بسبب وجود فراغات الهوائية والحويصلات مملوءة بالماء التي تعيق تجميد الخالية من الجليد من المياه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التثبيت الكيميائية طويلة خاصة في النباتات بسبب جدران الخلايا إعاقة تغلغل المواد الكيميائية إلى أعماق الأنسجة. الأنسجة النباتية هي بالتالي particularly تحديا، ولكن هذا البروتوكول هو موثوق بها وينتج عينات من أعلى مستويات الجودة.
Introduction
لدينا معرفة التركيب الدقيق خلية تأتي أساسا من المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حلها من التفاصيل في حدود بضع نانومتر 1. على الرغم من كونها قوية جدا في قرار TEM لا تعتبر سهلة الاستخدام، وإعداد العينات يتطلب وقتا طويلا وبروتوكولات شاقة، ويتطلب بعض الخبرة من ممارس. تثبيت التقليدي للعينات والجمع بين استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم قبل مزيد من المعالجة التي تشمل الجفاف، والتضمين في الراتنج ومن ثم باجتزاء لإنتاج المقاطع رقيقة جدا أن يتم بعد ذلك ملطخة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فمن المعروف أن التثبيت الكيميائي يمكن ان تنتج القطع الأثرية بما في ذلك تجميع البروتين وفقدان الدهون 1، والتغيرات في الأغشية التي تؤثر في نهاية المطاف عدة مقصورات الخلوية 2. وتنسب هذه القطع الأثرية إلى حد كبير إلى بطء معدل التثبيت والجفاف في درجة حرارة الغرفة 3 و 4 و 5.
"jove_content"> Cryofixation من ارتفاع ضغط التجمد (HPF) يتجنب معظم القطع الأثرية التي تسببها التثبيت الكيميائي. مبدأ cryofixation هو أنه يقلل من درجة التجمد للمياه بنسبة 20 درجة، يبطئ التنوي ونمو بلورات الثلج ويزيد من لزوجة الماء في عينة بيولوجية بحيث المكونات الخلوية ويجمد أساسا 6 و 7. يقلل HPF و درجة حرارة العينة إلى أن من النيتروجين السائل، تحت ضغط عال جدا (210 ميجا باسكال أو 2،100 بار) في ميلي ثانية. عند القيام به بشكل صحيح HPF يمنع تشكيل بلورات الثلج الكبيرة التي يمكن أن تسبب ضررا كبيرا على التركيب الدقيق الخلية. HPF يمكن استخدامها لإصلاح عينات من سمك 100-200 ميكرون في تركيزات نموذجية من المواد المذابة البيولوجية 7. هناك ملاحظات عديدة على الفيزياء والمبادئ الأساسية HPF، على سبيل المثال 1 و 7 و 8.
بعد HPF، يتم تحضين العينات في درجة حرارة منخفضة (-78.5 درجة مئوية إلى -90 و# 176؛ C) في وجود المذيبات التي تحتوي على مثبتات الكيميائية العضوية السائلة مثل رباعي أكسيد الأوزميوم، عموما لبضعة أيام. عند هذه الدرجة المنخفضة، يتم استبدال الماء في عينة من المذيبات العضوية، وعادة الأسيتون أو الميثانول 1، 9. وهكذا، وهذا ما يسمى عملية الاستبدال تجميد (FS). ثم يتم تسخين العينة تدريجيا وخلال هذا الوقت هو ثابت، وعادة مع رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل 9. يشابك في درجات حرارة منخفضة لديه ميزة تحديد الجزيئات التي يتم يجمد 1. لذا FS تنتج عينات عالية الجودة مقارنة بتلك التي تحددها التثبيت الكيميائية التقليدية في درجة حرارة الغرفة، ولا سيما أنه يؤدي إلى تحسين الحفاظ التركيبية، والحفاظ على أفضل استضداد وتقليل فقدان المكونات الخلوية غير منضم 10 و 11.
ويتم معظم FS على مدى فترات زمنية طويلة، وعادة ما تصل إلى عدة أيام. هذا هو ترو خاصةالبريد لمحطات عينات 12، 13، 14. بروتوكول الأخيرة التي وضعتها وماكدونالد ويب يقلل بدرجة كبيرة من الوقت لFS من عدة أيام إلى عدة ساعات 15. في هم سريعة الاستبدال تجميد (QFS) الإجراء، يتم FS خروج أكثر من 3 ساعات، بينما في FS السوبر سريعة تتم معالجة عينات (SQFS) في 90 دقيقة. نوعية العينات التي تنتجها هذه الأساليب هي مماثلة لتلك التي حققها بروتوكولات FS التقليدية. لقد اعتمد بروتوكول QFS لالتجهيز النهائي من عينات النبات بعد HPF. وقد ثبت هذا لتوفير الوقت فحسب، بل أيضا المال، كما QFS وSQFS استخدام معدات المختبرات المشتركة بدلا من آلات مكلفة المتاحة تجاريا FS.
الأنسجة النباتية غالبا ما تكون صعبة للغاية للتحضير لTEM. في المتوسط، الخلايا النباتية هي أكبر من أي الخلايا البكتيرية أو الحيوانية. وجود مسعور بشرة شمعية، جدران الخلايا سميكة، وفجوات مملوءة بالماء كبيرة تحتوي على الأحماض العضوية، hydrolases والفينول جompounds التي قد تشغل ما يصل إلى 90٪ من حجم الخلية الكلي 16، ووجود فراغات الهوائية يقلل بشدة التوصيل الحراري للنظام 17. علاوة على ذلك، في حالة النباتات، سمك العينة يتجاوز دائما ما يقرب من 20 ميكرون، والحد الأقصى لاستخدام التثبيت الكيميائي. في هذه السماكات، وانخفاض التوصيل الحراري من الماء يمنع معدل تجميد أكثر من -10،000 ° C / ثانية في وسط العينة. مطلوب هذا المعدل لتجنب تشكيل ضررا سداسية الجليد (بلورات الثلج بكثافة أقل وأكبر من 10 إلى 15 نانومتر) 8. معا، وهذه التحديات الحالية على حد سواء تجميد السليم للعينة وFS اللاحقة. ومع ذلك، cryofixation هو أفضل طريقة لتحديد العينات النباتية. هنا يتم تقديم بروتوكول للHPF-QFS من عينات الأنسجة النباتية. وهو يركز على الأنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ولكن تم أيضا استخدامها مع نيكوتيانا benthamiana. توضح النتائج النموذجية التي HPF-QFS تنتج ساmples من نوعية مماثلة لالتقليدية HPF-FS في جزء من الوقت. مع التعديلات المناسبة، كما يمكن استخدام هذا البروتوكول للعينات البيولوجية سميكة نسبيا الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الإجراء QFS يتطلب الحذر الشديد والحذر من قبل المستخدم، ونحن تسليط الضوء على هذه احتياطات السلامة هنا كما تنبيهات وملاحظات عند الاقتضاء.
1.Preparation لتشغيل HPF
- قبل البدء في إعداد العينات، تشغيل الثلاجة الضغط العالي باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: وحدة HPF المستخدمة في هذا البروتوكول هو وحدة مدمجة Wohlwend 02 (الشكل 1A)، ويستغرق حوالي ساعة واحدة إلى واحد ونصف الداخلي البدء قبل ان يفوت HPF يمكن أن تبدأ.- تبديل على Wohlwend الاتفاق 02 ارتفاع ضغط الفريزر.
- تشغيل الأداة من خلال تحويل التبديل الرئيسي من "0" إلى "1".
- الافراج عن الهواء المضغوط إلى الجهاز.
- الافراج النيتروجين السائل إلى الجهاز.
- اضغط على زر "SYSTEM تجف".
- بعد 30 دقيقة، اضغط على "التنفسيM تجف "الزر مرة أخرى.
- اضغط على زر "ON / OFF" للتبديل على الصك.
- اضغط على زر "النيتروجين".
- يسمح الجهاز ليبرد لمدة 20 دقيقة حتى لو كان "محرك الأقراص في" زر ومضاءة بالفعل.
- و"محرك الأقراص في" أضواء زر حتى.
- اضغط على "محرك الأقراص في" زر.
- اضغط على زر "AUTO".
- "نظام READY" أضواء زر حتى.
- وضع مسبار درجة الحرارة والضغط داخل غرفة الضغط واقفلها مع دبوس.
- اضغط على زر "AUTO JET". هذه الخطوة الشيكات أن زيادة الضغط وانخفاض درجات الحرارة على النحو المطلوب. أساسا التشغيل التجريبي. ومن المتوقع (الشكل 1B) انخفاض حاد في درجات الحرارة وارتفاع حاد في الضغط.
- تنفيذ اثنين من أكثر دورات JET.
- تبديل على Wohlwend الاتفاق 02 ارتفاع ضغط الفريزر.
2. التحضير لReceiviعينات نانوغرام المجمدة
- ملء صندوق معزول يحتوي على أصحاب cryovial مع النيتروجين السائل (انظر تحذيرات السلامة)، بحيث تتم تغطية حاملي تماما (الشكل 1C).
ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. - وضع العدد المناسب من قارورة تحتوي على المتوسطة FS إلى أصحاب أنبوب الألمنيوم في النيتروجين السائل (الشكل 1C). مع هذا البروتوكول ما يصل إلى أربعة أقراص تحتوي كل منها على عينة واحدة يمكن وضعها في cryovial واحد.
ملاحظة: يجب أن يكون المسمى وقارورة بآلة حادة مثل الكاتب يميل الماس وقلم رصاص لينة جدا.- لتثبيتي خلال QFS استخدام 1٪ أوسو 4 و 0.1٪ خلات اليورانيل في الأسيتون 9. إعداد الحل في حجم كبير، الاستغناء aliquots من 1.5 مل في cryovials وتخزينها مجمدة في النيتروجين السائل.
ملاحظة: اتبع تحذيرات السلامة للتعامل مع أوسو 4 وخلات اليورانيل.
ملاحظة: أوسو 4 ملاحظة: cryovials تستخدم لعقد عينات لQFS ينبغي أن يكون من الصعب يا الدائري لضمان أن تظل أنابيب مختومة خلال QFS لتجنب تسرب أوسو 4.
- لتثبيتي خلال QFS استخدام 1٪ أوسو 4 و 0.1٪ خلات اليورانيل في الأسيتون 9. إعداد الحل في حجم كبير، الاستغناء aliquots من 1.5 مل في cryovials وتخزينها مجمدة في النيتروجين السائل.
- تحضير عجينة عن طريق خلط الخميرة خميرة الخباز مع حجم مساو تقريبا من 10٪ الميثانول مع مسواك أو غيره صك من هذا القبيل حتى عجينة ناعمة. يعمل عجينة الخميرة باعتبارها cryoprotectant خارج الخلية، ويستخدم لملء الفضاء حول العينة في حامل العينة. كمية من معجون يعتمد على عدد من العينات. لمدة 10 عينات أو أقل لصق (1 مل) يمكن أن تكون مختلطة في أنبوب microcentrifuge.
تجميد 3. ارتفاع ضغط العينات
- إزالة ورقة (أو الأنسجة الأخرى) من الاهتمام من المصنع ووضعه برفق على قطعة من DENTAل الشمع أو غيرها من سطح القطع. استخدام لكمة من 2.0 مم أو الحجم المطلوب لخفض عينة من ورقة. التعامل مع العينة بلطف مع زوج من ملقط والعمل في أسرع وقت ممكن.
- تعمل تحت مجهر تشريح، ضع القرص ورقة في الجانب 0.2 ملم من نوع (أ) الناقل العينة وتغطية تماما في معجون الخميرة. تأكد من أن القرص يمتلئ تماما ولصق هو المستوى مع حافة حامل من خلال تخفيف عجينة مع الفرشاة الجميلة (الشكل 2).
- وضع الناقل في حامل العينة. تغطية عينة مع نوع B الناقل العينة، سطح مستو أسفل.
ملاحظة: يجب أن يكون حامل عينة جاف وعند درجة حرارة الغرفة. - أخذ العينة في حامل العينة، أدخله في الجهاز وبدء دورة التجميد عن طريق الضغط على زر "JET AUTO"، الذي ينبغي أن يتم في ثانية أو اثنتين.
- العمل في أسرع وقت ممكن، وإزالة حامل من الجهاز ومكان غيض عقد عصيدةلو في النيتروجين السائل في صندوق معزول على رأس الجهاز HPF. تزج نصائح من اثنين من أزواج من الملقط في النيتروجين السائل لفتور لهم.
ملاحظة: بعد تجميد، يجب التعامل مع الناقلين فقط مع ملقط تبريد النيتروجين السائل. الدافئة (درجة حرارة الغرفة) ملقط وغالبا ما تكون سبب الفشل في cryotechniques. - فتح cryovial تحتوي على وسائل الإعلام FS، ووضع غطاء على جانب منطقة الجزاء. مع المعونة من زوج من ملقط تبريد النيتروجين السائل، وإزالة بلطف القرص من صاحب العينة، وضمان أن القرص هو دائما في النتروجين السائل أو البخار. العمل في بخار النيتروجين السائل، عقد أنبوب FS مع واحد ملقط تبرد قبل واستخدام البعض لوضع حامل في القارورة FS. المسمار غطاء القارورة FS مرة أخرى. لا اعتراض أي النيتروجين السائل في القارورة.
ملاحظة: عند نقل العينات إلى cryovials لQFS، ضمان عدم وجود النيتروجين السائل محاصرين في قارورة. يوسع النيتروجين السائل 700 أضعاف خلال ارتفاع درجات الحرارة وأي في Trappeد النيتروجين السائل يمكن أن يسبب انفجارات خلال هذا الوقت. - كرر الخطوات من 3،1-3،7 حتى يتم تجميد جميع العينات المطلوبة. يمكن وضع أقراص متعددة ورقة تحتوي على نفس نوع العينة في نفس القارورة. لاحظ أن صاحب العينة يحتاج إلى أن تجفف وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة بين أشواط التجمد. للقيام بذلك بسرعة، تسخينها مع مجفف ضربة، ورصد درجة الحرارة عن طريق اللمس.
4. التحضير لتجميد تبديل
- تماما تزج كتلة سخان الألومنيوم في النيتروجين السائل لمدة 10 دقيقة أو حتى يتوقف غليان nucleate. في حين أن هذا يجري، ضع طبقة من الثلج الجاف (1-2 سم) في الجزء السفلي من الحاويات تستخدم غرفة FS (الشكل 3). حاوية الستايروفوم أو دلو الثلج يمكن استخدامها لFS، جنبا إلى جنب مع سحق الثلج الجاف أو الكريات.
- إدراج بسرعة cryovials تحتوي على عينات جنبا إلى جنب مع تحقيق درجة الحرارة في الصفوف الوسطى من كتلة سخان. تأكد من أن أغطية علىوثمل قارورة بإحكام على ذلك أن وسائل الإعلام FS لا يتسرب خلال FS. بدء تسجيل درجات الحرارة.
- جعل التحقيق في درجة الحرارة عن طريق وضع الحرارية من خلال الجزء العلوي من cryovial بحيث تصل إلى أسفل الأنبوب. ختم غطاء أنبوب مع الراتنج بحيث لا تسرب السائل خارج. ملء الأنبوب مع 1.5 مل الأسيتون في بداية كل تشغيل QFS.
- باستخدام cryogloves معزول أو ملقط كبيرة، من اجل الخروج عن النيتروجين السائل من كتلة سخان. والحرص على عدم اجل الخروج من cryovials.
ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. - وضع كتلة تحتوي على قوارير على طبقة من الثلج الجاف في غرفة QFS. تأكد من وضع كتلة بحيث أنابيب يكذبون أفقيا ولكن مع الميل الصاعد الطفيف. ينبغي أن يكون هناك أي تسرب إذا تم استخدام cryovials الصحيحة.
- حزمة غرفة QFS مع الثلج الجاف بحيث يتم تغطية الأنابيب FS، على الرغم من أنه ليس من الضروريتغطية الجزء العلوي من كتلة. وضع غطاء على الغرفة.
5. السريع FS
ملاحظة: إجراء المدى QFS في غطاء الدخان في حالة أن أي تسرب 4 أوسو يحدث عن غير قصد على الرغم من الاحتياطات الأخرى.
- وضع غرفة QFS على منصة دوار شاكر في غطاء الدخان وتناوب على 125 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة. خلال هذا الوقت درجة حرارة كتلة ينبغي أن تزيد تدريجيا إلى حوالي -80 ° C. التحريض يضمن خلط المكونات لFS أفضل.
ملاحظة: وضع شاكر في غطاء الدخان وموقف هود باب الدخان يجب أن تكون هي نفسها في جميع أنحاء الداخلي QFS ولكل QFS تشغيل لضمان الاحترار ثابت من العينات. - إزالة الثلج الجاف من غرفة ومواصلة تهتز لمدة ساعة أخرى.
ملاحظة: درجة الحرارة يجب أن تزيد إلى حوالي -15 ° C إلى -20 ° C. - إزالة العينات ومسبار درجة الحرارة من غرفة QFS وضعها علىشاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة أخرى، حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. إيقاف تسجيل درجات الحرارة.
- خلال FS، وإيقاف آلة HPF.
- إغلاق الصنبور من خزان النتروجين السائل بينما يتم ملء آلة HPF مع النيتروجين.
- اضغط على زر "النيتروجين".
- الانتظار حتى الحمراء "المكبس لأسفل" تطفئ الخفيفة.
- اضغط على "ON / OFF" زر.
- اضغط على زر "SYSTEM تجف".
- قطع إمدادات الهواء المضغوط إلى الجهاز.
- بعد مدة لا تقل عن 12 ساعة (لضمان التجفيف من أي رطوبة)، إيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح الرئيسي من "1" إلى "0".
6. مشاركة FS معالجة
- إزالة بعناية وسائل الإعلام FS مع الماصات البلاستيكية ونقل مكان في الحاوية المناسبة للنفايات السامة.
ملاحظة: أوسو 4 وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطرةوينبغي التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك الأحذية المغلقة الأصابع، معطف المختبر وقفازات. - غسل العينات أربع مرات مع 100٪ الأسيتون. جمع يغسل الأولين ووضع في حاوية النفايات السامة.
- باستخدام ملقط غرامة، وإزالة عينات الأنسجة من أصحاب. الاحتفاظ بعينات الرطب مع الأسيتون كما يتم ذلك، والعمل بلطف شديد لتجنب كسر العينات.
ملاحظة: ليس غريبا وأنه قد يكون في الواقع مفيدة لديك عجينة الخميرة تقع بعيدا عن العينات في هذه المرحلة. معجون الخميرة عادة البني الداكن جدا في حين أن الأنسجة ورقة لا تزال خضراء. - جمع العينات في cryovials تحتوي على الأسيتون. المضي قدما في إعداد العينات (تسلل والتضمين) لTEM وفقا لبروتوكولات المعتادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم الحصول على النتائج المقدمة أدناه باستخدام الاتفاق Wohlwend 02 لHPF (الشكل 1A). واحد الميزة الرئيسية لهذا الصك هو سهولة استخدام ناقلات العينة وحامليها. عند استخدام الأدوات الأخرى، يوصي ماكدونالد أن اثنين من المستخدمين يجب تنفيذ إعداد العينات وHPF، واحدة إعداد العينات في حين أن الآخر لا تجميد ونقل إلى FS cryovials 9. ومع ذلك، فإن Wohlwend العينات الناقلين وحامل من السهل بما فيه الكفاية لمستخدم واحد لمعالجة مستقل (الشكل 2A، B، E، F و G). وتجدر الإشارة إلا أنه ينبغي إجراء محاكمة القليلة يدير لتصبح مألوفة مع الصك HPF قبل العمل مع عينات قيمة. يجب أن يكون ذا خبرة المستخدم قادرا على إصلاح عدة (10 أو أكثر) عينات في ساعة واحدة. ومع ذلك، فإن المبادئ الواردة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع أي من آلات HPF المتاحة تجاريا.
ربماأهم جزء من الإجراء HPF-QFS هو إعداد نموذج لتحميل في الناقل العينة (الشكل 2C). على الرغم من أن هذا قد لا يكون بديهية، هو خطوة في البروتوكول على الباحث الذي لديه معظم السيطرة. آلة HPF هي قوية، ومع الاستخدام السليم والصيانة يجب أن تنتج التغييرات المتوقعة في الضغط ودرجة الحرارة مع اختلاف بسيط بين العينات. إذا تم التعامل معها عينة سيئة أثناء إعداد ثم لن خطوة أخرى تخليص الأضرار الناجمة بذلك. الأنسجة النباتية هي سهلة نسبيا للتلاعب خلال هذه المرحلة من العملية لأنها ليست مثقف في المتوسط وخلايا جدرانها تعطي الخلايا قوة جيدة. إلا أنه من المهم أن يتم التعامل مع العينات بسرعة لتجنب التغيرات التركيبية التي تنتج عن إزالة من النبتة الأم والحد من التوتر وردود اصابة. أصغر الناقل العينة التي يمكن أن تستوعب عينة ينبغي أن تستخدم لضمان HPF فعال وثابت (الشكللدى عودتهم 2C). وأخيرا، ينبغي أن تملأ الناقل عينة ولكن ليس تفيض (الشكل 2D). يتم إدراج الناقل عينة تملأ بسهولة في الجهاز HPF لتجميد (الشكل 2 H و I).
الخطوات الأولى في البروتوكول QFS يمكن أن يكون تحديا للمبتدئين، لذلك فمن المستحسن أن شخصين يجب أن تعمل معا حتى المستخدمين يشعرون بالارتياح لإجراء (الشكل 3A-E). ينبغي توخي الحذر في جميع الأوقات عند التعامل مع النيتروجين السائل ومثبتات رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل. ويرد منحنى نموذجي لتغيرات درجة الحرارة خلال QFS في الشكل 2J. الزيادات في درجة الحرارة بسرعة من -196 درجة مئوية، ودرجة حرارة النيتروجين السائل، إلى حوالي -80 ° C. فمن عند درجة حرارة حوالي -78 درجة مئوية إلى -90 ° C الذي يعتقد استبدال تجميد تحدث 9. خطوة صعبة في بروتوكول QFS هي إزالة الثلج الجاف بعد 2 ساعة من FS. فيهذه الخطوة، سوء العينات يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع في درجات الحرارة. لهذا، ينبغي رفع كتلة سخان بسرعة من الغرفة QFS باستخدام cryoglove والثلج الجاف سكب بسرعة في وعاء الثانوية.
وقد استخدم HPF لإصلاح الأنسجة النباتية المختلفة بما في ذلك أوراق نيكوتيانا benthamiana وأوراق نبات الأرابيدوبسيس والأجنة. فمن تحديا لإصلاح عينات من الأوراق الناضجة بسبب الفجوات مركزية كبيرة لمعظم الخلايا. أوراق تحتوي على فجوات الأصغر سنا أصغر ولكن عادة ما تكون معبأة في الشعيرات الكثيفة جدا. وجود الشعيرات يمكن أن تجعل من الصعب حزمة العينات مع عجينة الخميرة ولكن يجب الحرص لضمان أن يتم ذلك بشكل صحيح لتقليل كمية الهواء المحبوس بين سطح الورقة ولصق. فإن الهواء المحبوس تعوق انتقال الحرارة خلال HPF ويقلل من جودة التثبيت. ينطبق على أي عينة هذا.
بعد قد تكون مستعدة عينات HPF وQFS السادس ليوينغ تحت TEM بواسطة التسلل وتضمينها مع الراتنج. ثم قد يكون مستعدا قبل باجتزاء مقاطع رقيقة من 65-100 نانومتر. وأظهرت نتائج نموذجية في الشكل 4. الصور المبينة لجميع من عينات أوراق نبات الأرابيدوبسيس. أغشية البلازما وعادة ما تكون سلسة وضغطت ضد جدار الخلية، وعلامة على تثبيت جيد (الشكل 4A، C و E). العضيات الأخرى بما في ذلك البلاستيدات الخضراء (الشكل 4A، D، F و H) وthylakoids (الشكل 4B)، الميتوكوندريا (الشكل 4D وF)، جولجي (الشكل 4 G)، الأنابيب الدقيقة (الشكل 4E) وريبوسوم (وخصوصا الشكل 4C) هي أيضا لا تزال فجوات واضحة للعيان والمركزية الكبيرة سليمة (الشكل 4A). سوء المناولة خلال النتائج HPF-QFS في الأعمال الفنية بما في ذلك الضرر الناجم عن وضوح الشمس الجليد (الشكل 4D) وانحلال الجبلة (الشكل 4H). قد تشكل راسب يؤدي أيضا خلال تلطيخ القسمق (الشكل 4F).
الرقم 1: Wohlwend الاتفاق 02-ارتفاع ضغط الفريزر (A) الآلة HPF Wohlwend الاتفاق 02 تستخدم لcryofixation مع محطة الكمبيوتر المرفقة. تندس العينات في الجزء الأمامي من الجهاز (دائرة صغيرة) لتجميد. يمكن إنشاء منحنى درجة الحرارة على شاشة الكمبيوتر لكل شوط، حسب رغبة المستخدم. (B) منحنى الضغط درجة الحرارة إلى نموذجي لتشغيل HPF. الخطوط الصفراء والبنفسجية تمثل درجة الحرارة والضغط، على التوالي. لاحظ المنحدرات الشديدة من كلا المنحنيات. يتم الحفاظ على الضغط العالي لحوالي 400 مللي ثانية. كل فترة على المحور يمثل x 50 مللي ثانية. وقد تم جمع البيانات مع EasyScopeII للبرمجيات DSIM12. (C) مربع معزول وغطاء يستخدم لتخزين سو العينات المجمدة مباشرة بعد التجميد يمكن وضع مريح على رأس آلة HPF. أنها مليئة النيتروجين السائل. حاويات الألمنيوم مستديرة عقد في cryovials.
الشكل 2: تحضير عينة الأنسجة لHPF. (A) حامل عينة للجهاز HPF الاتفاق 02 في تكوينه مغلقة. (B) وحامل العينة مفتوح. (C) عينة ورقة في 0.2 ملم بئر من نوع (أ) الناقل العينة. الجانب الآخر من هذا الناقل هو 0.1 ملم عميق. (D) ورقة عينة المشمولة في عجينة الخميرة. نلاحظ أن الناقل هو الكامل ولكن لا تفيض. (E) الناقل العينة في حامل العينة. (F) العينة تغطي مع الناقل نوع B. هذا الناقل واحد سطح مستو وعلى الجانب الآخر جيدا أنهو 0.3 ملم عميق. هنا يتم استخدام سطح مستو لشطيرة العينة. (G) يتم إغلاق صاحب العينة وجاهزة للإدراج في الجهاز HPF. (H) وفتحة في الجزء الأمامي من الصك إلى HPF التي سيتم إدراجها صاحب العينة لتجميد (I) ودرجة الحرارة والضغط مسبار / حامل إدراجها في آلة HPF. (J) منحنى درجة الحرارة النموذجية لتشغيل QFS (البيانات التي تم جمعها مع برنامج EasyLog). وسجلت درجات الحرارة في كل ثانية. هو ارتفاع في بداية المدى المقرر أن الإلكترونيات لجنة التحقيق استخدمت ولا تعكس قياس درجة الحرارة الحقيقي.
الرقم 3: المعدات المستخدمة في QFS يمكن القيام QFS في أي حاوية معزولة مثل مربع الستايروفوم أو دلو الجليد (A) <./ قوي> طبقة من الجليد الجاف عمق 1-2 سم تغطي الجزء السفلي من الغرفة QFS، هنا مربع الستايروفوم. (B) يستخدم كتلة سخان مع 13 ملم الثقوب لعينات منزل خلال QFS. يتم وضع مسبار درجة الحرارة مع مسجل بيانات الرقمية في كتلة سخان (C) بعد تبريد كتلة سخان في النيتروجين السائل يتم وضع العينات في الكتلة، يسكب النيتروجين السائل خارج، ويتم وضع التجمع بأكمله في غرفة QFS . مع الثلج الجاف (D) يتم تعبئة الغرفة QFS مع الثلج الجاف بحيث يتم تغطية العينات. ليس هناك عيب في تغطية كامل مع سخان كتلة الثلج الجاف. (E) ويغطي هذا المربع ثم انتقل على دوار شاكر في غطاء الدخان حيث يتم تحريكها العينات في جميع أنحاء الداخلي QFS.
الرقم4:. أوراق نبات الأرابيدوبسيس أعدت من قبل HPF-QFS نتائج التي تم الحصول عليها لعينات من HPF-QFS إعدادها وتصويرها بواسطة TEM على زايس الميزان 200 HT FE MC (A) والمتوسطة صورة تضخم عالية تظهر بلاستيدات الخضراء (CH) مع جدران الخلايا و سيتوبلازم الخلايا المجاورة. والفجوات (V) تحتوي على مادة كثيفة الإلكترون. مقياس شريط = 0.5 ميكرون صورة (B) وتضخم عالية من بلاستيدات الخضراء. مقياس بار = 100 نانومتر. (C) صورة التكبير عالية من جدار الخلية بين الخلايا المجاورة. وهناك رابطة هيولية تشعبت هي مرئية (السهم). ملاحظة غشاء البلازما السلس تضغط على جدار الخلية من فجوة. حزمت السيتوبلازم كثيفة مع ريبوسوم. V هو فجوة. وtonoplast على نحو سلس ومستمر. مقياس بار = 200 نانومتر. (D) صورة التكبير المنخفضة تظهر المناطق التثبيت الجيد في بلاستيدات (CH) قرب مناطق الضرر الجليد (النجمة). شريط النطاق = 0.5 ميكرون. (E) وجهة نظر تضخم عالية من خلية ووللتر والأنابيب الدقيقة. مقياس بار = 100 نانومتر. (F) صورة تظهر المحافظة جيد من البلاستيدات الخضراء (CH) والميتوكوندريا (M). راسب أسود كبير هو من تلطيخ المقاطع مع سترات الرصاص. مقياس بار = 1 ميكرون. (G) عرض عالية التكبير من جولجي (GA). مقياس بار = 200 نانومتر. (H) الحفاظ سيئة عينة تبين عدم وجود تفاصيل في البلاستيدات الخضراء وانحلال الجبلة (السهم الأسود). مقياس بار = 1 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نجاح بروتوكول المقدمة هنا يعتمد بشكل كبير على المستخدم. أولا، يتعين إعداد متقدمة لضمان توفير جميع المواد اللازمة متوفرة وبكميات كافية لإكمال كامل المدى HPF-QFS. ثانيا، يجب على المستخدم العمل بسرعة، والانتقال من خطوة إلى خطوة بطريقة فعالة أن يقلل معالجة عينة، وبالتالي التقليل من تغييرات على الدولة الأم من الأنسجة. مرة واحدة يتم تجميد العينات وقبل أن تكون المجففة فمن الضروري أن يتم الاحتفاظ البارد، لذلك يجب توخي الحذر لتجنب أي معالجة التي يمكن أن تصل حرارة العينة عن غير قصد، على سبيل المثال، والتعامل مع يد القفاز بدلا من ملقط تبريد مسبقا. ينصح السرعة وزيادة كفاءة مع الألفة مع بروتوكول، لذلك ممارسة أشواط قبل محاولة إصلاح المرء عينات من الفائدة. ثالثا، يجب أن يظل المستخدم على بينة من مخاطر المواد الكيميائية المستخدمة في المتوسطة FS فضلا عن مخاطر العمل مع النيتروجين السائل والثلج الجاف. غطاء الدخان ضروري لإعداد والمتوسطة FS لإجراء QFS. لجميع خطوات أخرى، ما يلزم من معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القفازات، معطف المختبر، ينصح أحذية مغلقة اصبع القدم ونظارات واقية.
مزايا استخدام cryofixation بدلا من المثبتات الكيميائية في درجة حرارة الغرفة لإعداد العينات للTEM، بما في ذلك النباتات، منذ فترة طويلة معروفة 10. وجدت إحدى الدراسات المقارنة بين التركيب الدقيق للنصائح جذور نبات الأرابيدوبسيس نيكوتيانا وتحددها HPF أو مثبتات كيميائية طريقة HPF-FS أعطى نتائج أفضل بكثير 5. في الأنسجة بواسطة HPF-FS أعدت كان الغشاء الهيولي والأغشية الخلوية الأخرى سلاسة، كان الغشاء الهيولي دافق ضد جدار الخلية، وحفظت عموما العضيات بما في ذلك الأنابيب الدقيقة بشكل أفضل مما كانت عليه عندما تم إصلاحها عينات من الأساليب التقليدية. وخلصت دراسة أخرى من العقد الجذرية فول الصويا أن "التثبيت الكيميائية مخزنة بواسطة غلوتارالدهيدلا يحافظ على التركيب الدقيق من العقد الجذرية فول الصويا في الدولة التي تسمح للارتباط البنية والوظيفة "، وأنها مستمرة في القول بأن البديل الوحيد المتاح هو HPF-FS 2. رابطات هيولية هي قنوات محددة غشاء التي تربط الخلايا النباتية لجيرانهم، ولكن الذي طيدة يصعب حلها حتى في ظل TEM. وقد تم اختيار Cryofixation بواسطة HPF أو مع الفريزر البروبان طائرة تليها FS على تثبيت الكيميائية في الدراسات التي تهدف إلى توضيح التفاصيل الدقيقة للهيكل plasmodesmal 18. على الرغم من هذه النتائج الأولية، والدراسات TEM على الأنسجة الثابتة التقليدية لا تزال هي المعيار في علوم النبات. قد يكون هذا بسبب التزام بسيط للأساليب التقليدية أو إلى تكلفة باهظة على ما يبدو معدات HPF-FS بالإضافة إلى الوقت الطويل تحضيري لبروتوكولات FS المستخدمة حاليا.
إجراءات QFS هو ابتكار حديث في تسريع إعداد العينات للTEM 15. كان QFSالمستخدمة في إعداد كله C. ايليجانس وN. benthamiana يترك بعد cryofixation 15. هذه هي عينات سميكة نسبيا يحدده HPF، وإعداد العينات نيكوتيانا بواسطة HPF-FS استخدمت تقليديا FS طويلة جدا مرة 12 و 13 و 14. لهذا البروتوكول استخدمنا أوراق من نبات نموذج نبات الأرابيدوبسيس. الأساس المنطقي لمرات FS طويلة لنيكوتيانا والعينات النباتية الأخرى هو أن تبادل المذيبات والماء من المرجح أن تباطأ من قبل فجوات كبيرة من الخلايا. ومع ذلك، فمن المتوقع أن devitrification لعينة جيدا المجمدة ينبغي أن يؤدي إلى أضرار قليلة في الخلايا (15 و الحكام. فيه). إذا حدث الضرر الجليد على الأرجح سببه تجميد نفسه وليس QFS. تم الإبلاغ عن بروتوكول حتى أقصر لFS 15. هذا FS فائقة سريعة (SQFS) يستخدم فقط 90 دقيقة لFS. في هذا البروتوكول، ويتم تناوب العينات في كتلة سخان عند 100 دورة في الدقيقة في غياب ط الجافCE دون غطاء غرفة SQFS. وهذا يسمح للعينات لتصل إلى -80 درجة مئوية بسرعة. ثم يتم إزالة عينات من كتلة سخان وسمح للوصول إلى درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز. وقد استخدم بنجاح لSQFS يذوى الخلايا المزروعة في الثقافة وE. خلايا القولونية. ونحن لم تحاول بعد لاستخدام SQFS مع عينات النبات بسبب سماكة الأنسجة النباتية.
بروتوكول لcryofixing ثم التجفيف عينات النبات بواسطة HPF جنبا إلى جنب وQFS يمثل تحسنا كبيرا على البروتوكولات الحالية. يتم تقليل الوقت لتحضير العينة قبل الراتنج تسلل الآن لبضع ساعات بدلا من عدة أيام. بالإضافة إلى تطوير طريقة QFS 15، وماكدونالد كما نشرت مؤخرا على بروتوكولات للتسلل السريع للأنسجة النبات مع الراتنج SQFS التالية دون الجليد الجاف 19. وعادة ما تكون مخترقة الأنسجة النباتية ببطء مع الراتنج قبل عدة حضانات طويلة، بما في ذلك بين عشية وضحاها. هذه بروتو جديدالعواميد تؤدي في أقصر الأوقات تجهيز العينات: 6 ساعة من التجمد إلى باجتزاء. وهكذا في المستقبل، ينبغي الجمع بين HPF-QFS وتسلل السريع استبدال بروتوكولات الحالية لإعداد محطة عينة لTEM. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء QFS يستخدم معدات المختبرات المشتركة التي هي غير مكلفة ويمكن استخدامها لأغراض متعددة، على الرغم من QFS كيت التجارية المتاحة حاليا من خلال العلوم المجهر الإلكتروني (http://www.emsdiasum.com). يمثل إما الخيار وفورات هائلة على تكلفة شراء وحدة الاستبدال تجميد مخصصة التي يمكن أن يكلف ما يزيد على 50،000 دولار.
تجدر الإشارة إلى أن تطبيقات العينات بواسطة HPF إعداد وFS تتجاوز TEM التحليل الروتيني. عينات أعدت بهذه الطريقة تحتفظ استضداد، وبالتالي يمكن استخدامها في النهج القائم على الأجسام المضادة، بما في ذلك وضع العلامات immunogold 17 و 19. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه العينات لتحاليل هيكلية ثلاثية الأبعاد المتقدمةعبر الإلكترون التصوير المقطعي 20. يمكن حتى عينات HPF-FS استخدامها مع ضوء مترابط وEM 21، 22. وهكذا، واصلت التحسن في إجراءات cryofixing ثم عينات التجفيف سوف تكون مفيدة لطائفة واسعة من المحققين العاملين في النظم المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
تحظى بتقدير كبير من اللطف وكرم الدكتور كينت ماكدونالد من جامعة كاليفورنيا في بيركلي. نشكر لمراجع المجهول اقتراحات مفيدة جدا. ويدعم المختبر بورتش سميث صناديق البدء من جامعة تينيسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
