Abstract
Siden 1940'erne transmissions elektron mikroskopi (TEM) har leveret biologer med billeder af biologiske materialer ultra-høj opløsning. Men på grund af besværlige og tidskrævende protokoller, der også kræver erfaring i fremstilling af artefakt-fri prøver TEM ikke betragtes som en brugervenlig teknik. Traditionel prøveforberedelse for TEM anvendte kemiske fikseringsmidler til at bevare cellulære strukturer. Højtryks-frysning er cryofixation af biologiske prøver under højt tryk til at producere meget hurtige afkølingshastigheder derved isdannelse, hvilket er skadeligt for integriteten af cellulær ultrastruktur begrænsning. Højtryks-frysning og fryse substitution er i dag de foretrukne metoder til fremstilling af den højeste kvalitet morfologi i harpiks sektioner for TEM. Disse metoder minimere artefakter, der normalt forbindes med konventionel behandling til TEM af tynde sektioner. Efter cryofixation det frosne vand i prøven er erstattet med væskeorganisk opløsningsmiddel ved lave temperaturer, en proces, der kaldes fryse substitution. Frys substitution udføres typisk over flere dage i dedikeret, dyrt udstyr. En nylig innovation tillader at processen være afsluttet i tre timer i stedet for de sædvanlige to dage. Dette sker typisk efterfulgt af flere dage mere med prøveforberedelse, der omfatter infiltration og indstøbning i epoxy før skæring. Her præsenterer vi en protokol der kombinerer højt tryk frysning og hurtig fryse substitution, der gør det muligt for plante prøve fiksering skal udføres inden for timer. Protokollen kan let tilpasses til at arbejde med andre væv eller organismer. Plantevæv er af særlig bekymring på grund af tilstedeværelsen af kulsyreholdige rum og vandfyldte vakuoler, som hindrer isfri frysning af vand. Desuden er processen med kemisk fiksering er især længe i anlæg på grund af cellevægge hindrer indtrængen af kemikalier til dybt i væv. Plantevæv er derfor particcielt udfordrende, men denne protokol er pålidelig og producerer prøver af højeste kvalitet.
Introduction
Vores viden om celle ultrastruktur kommer hovedsageligt fra elektronmikroskopi, som kan opløse detaljer i størrelsesordenen nogle få nanometer 1. Trods bliver så magtfulde i opløsning TEM ikke anses brugervenlig, som prøveforberedelse kræver tidskrævende og besværlige protokoller, og kræver en vis ekspertise fra den praktiserende læge. Traditionel fiksering af prøver har kombineret brugen af aldehyder og osmiumtetroxid før yderligere behandling, der omfatter dehydrering, indstøbning i harpiks og derefter sektionering at producere ultra-tynde sektioner, som derefter farvet med tungmetaller. Men det vides, at kemisk fiksering kan producere artefakter herunder proteinaggregering og tab af lipider 1, og ændringer til membraner, der i sidste ende påvirke flere cellulære rum 2. Disse artefakter er i høj grad tilskrives den langsomme fiksering og dehydrering ved stuetemperatur 3, 4, 5.
6, 7. HPF nedsætter en prøvens temperatur til det flydende nitrogen, under meget højt tryk (210 MPa eller 2,100 bar) i millisekunder. Når gøres ordentligt HPF forhindrer dannelsen af store iskrystaller, der kan forårsage store skader på celle ultrastruktur. HPF kan bruges til at fastsætte prøver på 100-200 um tykkelse ved typiske koncentrationer af biologiske opløste 7. Der er mange anmeldelser på fysik og principperne bag HPF, fx 1, 7, 8.
Efter HPF, prøverne inkuberes ved lav temperatur (-78,5 ° C til -90 &# 176; C) i nærvær af flydende organiske opløsningsmidler, der indeholder kemiske fikseringsmidler som osmiumtetroxid generelt til et par dage. Ved denne lave temperatur, er vandet i prøven erstattes af det organiske opløsningsmiddel, typisk acetone eller methanol, 1, 9. Således er denne proces kaldes fryse substitution (FS). Prøven derefter gradvist opvarmes og i denne periode er fast, normalt med osmiumtetroxid og uranylacetat 9. Tværbinding ved lave temperaturer har den fordel fastsættelse molekyler, som er immobiliseret 1. FS frembringer derfor prøver af høj kvalitet i forhold til dem, der er fastsat ved konventionel kemisk fiksering ved stuetemperatur, navnlig det resulterer i forbedret ultrastrukturelle bevarelse, bedre bevarelse af antigenicitet og reduceret tab af ubundne cellebestanddele 10, 11.
De fleste FS foretages over lange perioder, typisk op til flere dage. Dette er især truE for planter prøver 12, 13, 14. En nylig protokol udviklet af McDonald og Webb reducerer tiden til FS fra flere dage til nogle få timer og 15. I deres hurtige fryse substitution (QFS) procedure, er FS udføres over 3 timer, mens der i de super hurtige FS (SQFS) prøver behandles i 90 minutter. Kvaliteten af prøver fremstillet ved disse metoder kan sammenlignes med dem, der er givet af de traditionelle FS protokoller. Vi har vedtaget den QFS protokol for nedstrøms forarbejdning af plantematerialer prøver efter HPF. Dette har vist sig at spare ikke kun tid, men også penge, som QFS og SQFS anvender fælles laboratorieudstyr i stedet for de dyre kommercielt tilgængelige FS maskiner.
Plantevæv er ofte meget udfordrende at forberede TEM. I gennemsnit planteceller er større end enten bakterier eller dyreceller. Tilstedeværelsen af hydrofobe voksagtig neglebånd, tykke cellevægge, store vandfyldte vakuoler indeholder organiske syrer, hydrolaser og fenol Compounds som kan befinde sig op til 90% af det totale cellevolumen 16, og tilstedeværelsen af tilsat rum alvorligt mindsker varmeledningsevne af systemet 17. Yderligere, når det gælder planter, prøvetykkelsen næsten altid mere end 20 um, grænsen for brug af kemisk fiksering. Ved disse tykkelser, den lave varmeledningsevne af vand forhindrer frysning på mere end -10.000 ° C / sek i centrum af prøven. Denne sats er nødvendig for at undgå at beskadige sekskantede isdannelse (iskrystaller med en lavere tæthed og større end 10 til 15 nm). 8 Tilsammen udgør disse aktuelle udfordringer for både korrekt frysning af prøven og efterfølgende FS. Alligevel cryofixation er den bedste metode til fastsættelse plante prøver. Her er en protokol for HPF-QFS af plante vævsprøver præsenteres. Den fokuserer på den model, arten Arabidopsis thaliana, men har også været anvendt med Nicotiana benthamiana. De typiske resultater viser, at HPF-QFS producerer samples af tilsvarende kvalitet til traditionelle HPF-FS på en brøkdel af tiden. Med passende justeringer, kan denne protokol også anvendes til andre relativt tykke biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: QFS procedure kræver ekstrem omhu og forsigtighed af brugeren, og vi fremhæve disse sikkerhedsforanstaltninger her som forsigtighedsregler og bemærkninger, hvor det er relevant.
1.Forberedelse til HPF Run
- Inden du begynder prøveforberedelse, tænde for højtryks-fryser efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: HPF enhed, der benyttes i denne protokol er et Wohlwend Compact 02 enhed (figur 1A), og det tager cirka 12:59-og-en-halv times opstart procedure før HPF kører kan påbegyndes.- Aktivering af Wohlwend Compact 02 High Pressure Freezer.
- Tænd instrumentet ved at dreje hovedafbryderen fra "0" til "1".
- Slip trykluft til maskinen.
- Slip flydende nitrogen til maskinen.
- Tryk på "SYSTEM tørre op" knappen.
- Efter 30 minutter skal du trykke på "SYSTEM tørre op "igen.
- Tryk på "ON / OFF"-knappen for at tænde instrumentet.
- Tryk på "NITROGENINDHOLD" knappen.
- Lad maskinen køle af i 20 minutter, selv om "DRIVE IN" knappen allerede er tændt op.
- Den "DRIVE IN" knappen lyser.
- Tryk på "DRIVE IN" knappen.
- Tryk på knappen "Auto".
- "System Klar" knappen lyser.
- Placer temperatur-og tryk sonde ind i trykkammeret, og lås den med stiften.
- Tryk på "JET AUTO" knappen. Dette trin kontrollerer, at trykstigning og temperaturfald er som ønsket; hovedsagelig en prøvekørsel. Skarpe fald i temperatur og drastiske stigninger i tryk forventes (Figur 1B).
- Udfør to JET cyklusser.
- Aktivering af Wohlwend Compact 02 High Pressure Freezer.
2. Forberedelse til receiving frosne prøver
- Fyld en isoleret boks med cryovialet holdere med flydende kvælstof (se advarsler), således at indehaverne er helt dækket (Figur 1C).
BEMÆRK: Brug PPE herunder cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende kvælstof. - Anbring det passende antal hætteglas, der indeholder FS medium til aluminum rørholdere i flydende nitrogen (figur 1C). Med denne protokol op til fire diske, der hver indeholder en enkelt prøve kan placeres i en enkelt cryovialet.
BEMÆRK: hætteglas bør mærkes med et skarpt instrument som en diamant spids skriftklog og meget blød blyant.- Til fiksativ i QFS anvende 1% OsO4 og 0,1% uranylacetat i acetone 9. Forbered løsningen i stort volumen, dispensere portioner af 1,5 ml i kryoglas og butik frosset i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Følg sikkerhedsadvarsler til håndtering OsO4 og uranylacetat.
BEMÆRK: OsO4 BEMÆRK: kryoglas anvendes til at holde prøverne for QFS bør have en hård O-ring for at sikre, at rørene forbliver forseglet under QFS at undgå lækage af OsO4.
- Til fiksativ i QFS anvende 1% OsO4 og 0,1% uranylacetat i acetone 9. Forbered løsningen i stort volumen, dispensere portioner af 1,5 ml i kryoglas og butik frosset i flydende nitrogen.
- Forbered gær pasta ved at blande bagegær med et nogenlunde lige så stort volumen 10% methanol med en tandstikker eller andet sådant instrument frem til pastaen er glat. Den gær pasta fungerer som et ekstracellulært kryobeskyttelsesmiddel og bruges til at fylde rummet omkring prøven i prøven luftfartsselskab. Mængden af pasta afhænger af antallet af prøver; for kan blandes 10 prøver eller færre pastaen (1 ml) i et mikrocentrifugerør.
3. Højtryk Indefrysning af prøver
- Tag et blad (eller andet væv) af interesse fra planten og forsigtigt placere den på et stykke Dental voks eller anden skæreflade. Brug en dorn 2,0 mm og ønskede størrelse for at skære en prøve ud af bladet. Håndter prøve forsigtigt med en pincet og arbejde så hurtigt som muligt.
- Arbejde under et dissektionsmikroskop placere bladet disken i 0,2 mm side af type A modellen bærer og dækker fuldstændigt i gær pasta. Kontroller, at disken er helt fyldt, og pastaen er i niveau med kanten af holderen ved at udglatte pastaen med en fin pensel (Figur 2).
- Placer luftfartsselskabet i prøveholderen. Dæk prøven med type B modellen bærer, flad overflade ned.
BEMÆRK: Prøveholderen skal være tørt og ved stuetemperatur. - Tag prøven i prøveholder, indsætte det i maskinen og igangsætte en indefrysning cyklus ved at trykke på "JET AUTO" knappen, der skal udfylde i et sekund eller to.
- Arbejder så hurtigt som muligt, skal du fjerne holderen fra maskinen, og placer spidsen holder Sample i flydende nitrogen i den isolerede kasse oven HPF maskinen. Fordyb spidserne af to par tænger i flydende kvælstof til nedkøling dem.
BEMÆRK: Efter frysning, bør luftfartsselskaberne kun håndteres med flydende nitrogen-afkølet pincet. Varm (stuetemperatur) pincet er ofte årsag til svigt i cryotechniques. - Åbn en cryovialet indeholdende FS mediet, og læg låget på siden af kassen. Ved hjælp af et par af flydende nitrogen-afkølet pincet, forsigtigt fjerne disken fra prøveholderen, der sikrer, at disken er altid i flydende nitrogen eller damp. Arbejde i flydende kvælstof damp, holde FS rør med en forkølet pincet og bruge den anden til at placere holderen i FS hætteglasset. Skru låget på FS hætteglasset igen. Må ikke fælde nogen flydende nitrogen i hætteglasset.
BEMÆRK: Når du overfører prøver at kryoglas for QFS, sikre, at ingen flydende kvælstof er fanget i hætteglas. Flydende nitrogen udvider 700 gange under opvarmning og enhver Trapped flydende nitrogen kan forårsage eksplosioner i løbet af denne tid. - Gentag trin 3.1 til 3.7 indtil alle de ønskede prøver frosset. Flere bladskiver indeholdende den samme type prøve kan placeres i samme hætteglas. Bemærk, at prøven indehaveren skal tørres og bringes til stuetemperatur mellem frysning kørsler. For at gøre dette hurtigt, varme den med en føntørrer, og overvåge dens temperatur ved berøring.
4. Forberedelse til Freeze Udskiftning
- Helt nedsænkes aluminium varmeblokken i flydende nitrogen i 10 minutter, eller indtil boblekogning stopper. Mens dette foregår, placere et lag af tøris (1-2 cm) i bunden af den beholder, der anvendes som FS kammer (figur 3). En beholder, styrofoam eller isspand kan anvendes til FS, sammen med knust tøris og pellets.
- Hurtigt indsætte kryoglas indeholder prøverne sammen med temperaturføleren i de midterste rækker af varmeblokken. Sørg for, at lågene påhætteglas skruet fast på, således at FS medier ikke siver ud under FS. Begynde at optage temperaturen.
- Gør temperatursonde ved at placere et termoelement gennem toppen af en cryovial, så det når bunden af røret. Forsegl låget af røret med harpiks, således at ingen væske kan løbe ud. Fyld røret med 1,5 ml acetone ved begyndelsen af hver QFS løb.
- Brug isolerede cryogloves eller store pincet, udøse al væsken kvælstof fra varmeapparatet blok. Pas på ikke at hælde de kryoglas.
BEMÆRK: Brug PPE herunder cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende kvælstof. - Placer blokken med hætteglassene på lag af tøris i QFS kammer. Sørg for, at blokken er placeret, så rørene liggende horisontalt, men med en svag opadgående hældning. Der bør ikke være nogen lækage, hvis der anvendes de korrekte kryoglas.
- Pak QFS kammer med tøris, således at FS rørene er omfattet, selv om det ikke er nødvendigt atdække toppen af blokken. Sæt låget på kammeret.
5. Hurtig FS
BEMÆRK: Udfør QFS køre i et stinkskab i tilfælde af, at udsivning af OsO4 utilsigtet forekommer på trods af andre forholdsregler.
- Placer QFS kammer på en platform rotationsryster i et stinkskab og rotere ved 125 rpm i 120 minutter. I løbet af denne tid temperaturen af blokken bør stige gradvist til omkring -80 ° C. Agitation sikrer blanding af komponenterne for bedre FS.
BEMÆRK: Placeringen af shakeren i stinkskab og positionen af stinkskabet Døren skal være den samme i hele QFS procedure, og for hver QFS sigt at sikre en ensartet opvarmning af prøver. - Fjern tøris fra kammeret og fortsat omrystning i en time.
BEMÆRK: bør temperaturen stige til omkring -15 ° C til -20 ° C. - Fjern prøver og temperaturføler fra QFS kammeret og placere pårysteapparat ved stuetemperatur i yderligere 10-15 minutter, indtil de har nået stuetemperatur. Stop indspilningen temperaturen.
- Under FS, slukke for HPF maskinen.
- Luk hanen af flydende nitrogen tanken mens HPF maskinen bliver fyldt med nitrogen.
- Tryk på "NITROGENINDHOLD" knappen.
- Vent, indtil den røde "stemplet nedad" light slukkes.
- Tryk på "ON / OFF" knappen.
- Tryk på "SYSTEM tørre op" knappen.
- Skær levering af trykluft til maskinen.
- Efter mindst 12 timer (for at sikre tørring af fugt), slukke for maskinen ved at dreje hovedafbryderen fra "1" til "0".
6. Indlæg FS Processing
- Fjern forsigtigt FS medier med plast overførselspipetter og plads i egnet beholder til giftigt affald.
BEMÆRK: OsO4 og uranylacetat er farlige kemikalierog skal håndteres i stinkskab mens iført egnede personlige værnemidler (PV), herunder lukkede tåede sko, kittel og handsker. - Vask prøverne fire gange med 100% acetone. Saml de to første skylninger og placere i den giftige affaldsbeholder.
- Ved hjælp af fine tænger, fjerne vævsprøver fra indehaverne. Hold prøver våd med acetone, da dette er gjort, og arbejde meget forsigtigt for at undgå at bryde prøver.
BEMÆRK: Det er ikke usædvanligt, og det kan faktisk være nyttigt at have gær pasta falde væk fra prøverne ved dette punkt. Gæren pasta er normalt meget mørkebrun mens bladvæv er stadig grønt. - Saml prøverne i kryoglas indeholdende acetone. Fortsæt med prøveforberedelse (infiltration og forankring) for TEM ifølge sædvanlige protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne nedenfor er opnået ved hjælp af en Wohlwend Compact 02 for HPF (figur 1A). En væsentlig fordel ved dette instrument er brugervenligheden af prøven luftfartsselskaber og dets ejere. Ved brug af andre instrumenter, McDonald anbefaler, at to brugere skal foretage prøveforberedelse og HPF, en tilberedning af prøverne, mens den anden gør indefrysning og overførsel til FS kryohætteglas 9. Den Wohlwend aftryk Men luftfartsselskaber og indehaveren er let nok for en enkelt bruger uafhængigt at manipulere (figur 2A, B, E, F og G). Det bør nævnes dog, at man skal udføre et par prøvekørsler at blive fortrolig med HPF instrumentet, før du arbejder med værdifulde prøver. En erfaren bruger bør være i stand til at løse en række (10 eller flere) prøver i en time. Dog kan de principper, der præsenteres i denne protokol anvendes med en hvilken som helst af de kommercielt tilgængelige HPF maskiner.
Måskeden mest kritiske del af HPF-QFS Proceduren er den prøveforberedelse til tilførsel til prøven luftfartsselskab (figur 2C). Selv om dette måske ikke er intuitiv, det er et skridt i den protokol, hvori forskeren har mest kontrol. HPF Maskinen er robust, og med korrekt brug og vedligeholdelse skal producere de forventede ændringer i tryk og temperatur med lille variation mellem prøverne. Hvis en prøve er dårligt håndteres under forberedelse så ingen andre skridt vil indløse skaden så forvoldt. Plantevæv er forholdsvis let at manipulere under denne fase af processen, da de ikke er dyrket i medium, og deres cellevægge giver cellerne god styrke. Det er dog vigtigt, at prøverne håndteres hurtigt for at undgå ultrastrukturelle ændringer, som resulterer fra fjernelse fra moderplanten og for at begrænse stress og sårede svar. Den mindste eksemplar luftfartsselskab, der kan rumme en prøve bør anvendes til at sikre en effektiv og konsekvent HPF (Figure 2C). Endelig skal modellen bærer fyldes, men ikke overfyldte (figur 2D). Den fyldte prøve bærer let indsættes i HPF maskinen til frysning (figur 2 H og I).
De første skridt i QFS protokol kan være en udfordring for en nybegynder, så det anbefales, at to mennesker skal arbejde sammen, indtil brugerne er fortrolig med proceduren (figur 3A-E). Der bør udvises forsigtighed på alle tidspunkter ved håndtering af flydende nitrogen og fiksativer osmiumtetroxid og uranylacetat. En typisk kurve for temperaturændringer under QFS er vist i figur 2J. Temperaturen stiger hurtigt fra -196 ° C, temperaturen for flydende nitrogen, til omkring -80 ° C. Det er ved temperaturer på omkring -78 ° C til -90 ° C, der fryse substitution menes at forekomme 9. Et udfordrende skridt i QFS protokollen er fjernelsen af tøris efter 2 timers FS. Pådette trin, kan forkert håndtering af prøver producere en stigning i temperaturer. For dette, skal varmeblokken blive hurtigt løftes ud af QFS kammer ved hjælp af en cryoglove og tørisen hurtigt hældt ud i en sekundær beholder.
HPF har været brugt til at fastsætte forskellige plantevæv, herunder Nicotiana benthamiana blade og Arabidopsis blade og embryoner. Det er udfordrende at fastsætte prøver fra modne blade på grund af de store centrale vakuoler de fleste celler. Yngre blade indeholder mindre vakuoler, men trichomes er normalt helt tæt pakket. Tilstedeværelsen af trichomes kan gøre det vanskeligt at pakke prøverne med gær pasta men pleje skal tages for at sikre, at dette er korrekt gjort for at minimere mængden af luft fanget mellem blad overflade og pastaen. Den indespærrede luft vil hæmme varmeoverførsel under HPF og reducere kvaliteten af fiksering. Dette er sandt for enhver prøve.
Efter HPF og QFS prøver kan være forberedt til viEwing under TEM ved at infiltrere og forankring med harpiks. Tynde sektioner af 65-100 nm kan derefter fremstilles ved sektionering. Typiske resultater er vist i figur 4. De viste billeder er alle fra Arabidopsis bladprøver. Plasma membraner er typisk glatte og presset mod cellevæggen, et tegn på god fiksering (figur 4A, C og E). Andre organeller herunder kloroplaster (figur 4A, D, F og H) og thylakoids (figur 4B), mitokondrier (figur 4D og F), Golgi (Figur 4 G) mikrotubuli (figur 4E) og ribosomer (især figur 4C) er også klart synlige og det store centrale vakuoler forblive intakt (figur 4A). Dårlig håndtering under HPF-QFS resulterer i artefakter, herunder iskrystal-induceret skade (figur 4D) og plasmolyse (Figur 4H). Bly bundfald kan også dannes under farvning af sektions (Figur 4F).
Figur 1: Wohlwend Compact 02 High-Pressure Fryser (A) Wohlwend Compact 02 HPF maskine, der anvendes til cryofixation med den tilsluttede computer terminal.. Prøverne indsættes i den forreste del af maskinen (lille cirkel) til frysning. En temperatur kurve kan genereres på computerskærmen for hvert forsøg, som ønsket af brugeren. (B) En typisk temperatur-tryk-kurve for et HPF løb. De gule og lilla linjer repræsenterer temperatur og tryk, hhv. Bemærk de stejle skråninger af de to kurver. Det høje tryk opretholdes i omkring 400 msek. Hvert interval på x-aksen repræsenterer 50 msek. Der blev indsamlet data med EasyScopeII til DSIM12 software. (C) Den isolerede kasse og dæksel anvendes til opbevaring of frosne prøver straks efter frysning kan nemt placeres oven HPF maskine. Det er fyldt med flydende nitrogen. De runde aluminium containere holde kryoglas.
Figur 2: Klargøring vævsprøve til HPF. (A) prøveholder Compact 02 HPF maskine i sin lukkede konfiguration. (B) Prøveholderen er åben. (C) Et blad prøve i 0,2 mm brønd i en type A prøve luftfartsselskab. Den anden side af dette luftfartsselskab er 0,1 mm dyb. (D) Bladet Stikprøven dækkede i gær pasta. Bemærk, at luftfartsselskabet er fuld, men ikke overfyldte. (E) eksempler luftfartsselskab i prøveholderen. (F) Prøven er dækket med type B luftfartsselskab. Denne bærer har en flad overflade, og på den anden side en brønd,er 0,3 mm dyb. Her den flade overflade anvendes til sandwich prøven. (G) Prøveholderen er afsluttet og klar til indføring i HPF maskinen. (H) Åbningen på forsiden af HPF instrumentet i hvilken prøveholderen vil blive indsat til frysning . (I) temperatur og tryk sonde / indehaver indsat i HPF maskinen. (J) En typisk temperatur kurve for en QFS run (data indsamlet med EasyLog softwaren). Temperaturen blev registreret hvert sekund. Spidsen ved begyndelsen af kørslen er på grund af elektronik anvendte probe og afspejler ikke en reel temperaturmåling.
Figur 3:. Udstyr i QFS QFS kan udføres i en isoleret beholder, såsom en Styrofoam box eller en isspand (A) <./ Strong> Et lag af tøris 1-2 cm dybt dækker bunden af QFS kammer, her en styrofoam æske. (B) En ovn blok med 13 mm huller bruges til at huse prøver i løbet af QFS. Temperaturføleren med digital datalogger er placeret i varmeblokken. (C) Efter afkøling varmeblokken i flydende nitrogen prøverne anbringes i blokken, er flydende nitrogen hældt ud, og hele samlingen er placeret i QFS kammer . med tøris (D) Den QFS kammeret er fyldt med tøris, så prøverne er omfattet; der ikke er nogen ulempe at dække hele det varmeblokken med tøris. (E) Boksen er dækket og derefter flyttes på roterende ryster i et stinkskab, hvor prøverne omrøres hele QFS proceduren.
Figur4:.. Arabidopsis blade udarbejdet af HPF-QFS Resultater opnået for prøver udarbejdet af HPF-QFS og afbildet af TEM på en Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) en medium stor forstørrelse billede, der viser en kloroplast (CH) med cellevægge og cytoplasma tilstødende celler. De vakuoler (V) indeholder elektron tæt materiale. Scale bar = 0,5 pm. (B) En høj forstørrelse billede af en chloroplast. Scale bar = 100 nm. (C) En høj forstørrelse billede af cellevæggen mellem hosliggende celler. En forgrenet plasmodesma er synlige (pil). Bemærk den glatte plasmamembranen presses mod cellevæggen af vacuolen. Cytoplasmaet er tæt pakket med ribosomer. V er vakuole. Den tonoplast er glat og kontinuerlig. Scale bar = 200 nm. (D) en lav forstørrelse billede, der viser områder af god fiksering i chloroplasten (CH) nær regioner skader is (stjerne). Skala bar = 0,5 um. (E) en høj forstørrelse billede af en celle wall og mikrotubuli. Scale bar = 100 nm. (F) Billede viser god bevarelse af chloroplaster (CH) og mitochondrier (M). Stor sort bundfald fra farvning sektioner med blycitrat. Scale bar = 1 um. (G) Stor forstørrelse visning af Golgi (GA). Skala bar = 200 nm. (H) er konserveret Dårligt prøve viser mangel på detaljer i kloroplaster og plasmolyse (sort pil). Scale bar = 1 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesen med den protokol, der præsenteres her er meget afhængig af brugeren. Først avanceret forberedelse nødvendig for at sikre, at alle nødvendige materialer er let tilgængelige og i tilstrækkelig mængde til at fuldføre en hel HPF-QFS løb. For det andet skal brugeren arbejde hurtigt, bevæger sig fra trin-for-trin på en effektiv måde, der minimerer prøvehåndtering og derved minimere ændringer i den native tilstand af vævet. Når prøverne fryses og før de er dehydreret er det bydende nødvendigt, at de holdes koldt, så skal man være omhyggelig for at undgå enhver handling, der uforvarende kan varme op prøven, for eksempel håndtering med en behandsket hånd i stedet for pre-afkølet pincet. Hastighed og effektivitet øges med kendskab til protokollen, så praksis kører anbefales før du forsøger at reparere ens prøver af interesse. For det tredje, skal brugeren være opmærksom på farerne ved de kemikalier, der anvendes i FS medium samt farerne ved at arbejde med flydende nitrogen og tøris. Et stinkskab er nødvendig for udarbejdelsen af FS mellemlang og for QFS procedure. For alle andre skridt, de nødvendige personlige værnemidler, herunder handsker, kittel, lukket-toe sko og briller anbefales.
Fordelene ved at bruge cryofixation stedet for kemiske fikseringsmidler ved stuetemperatur til fremstilling af prøver til TEM, herunder planter, har længe været kendt 10. En undersøgelse, der sammenligner ultrastruktur rodspidserne af Nicotiana og Arabidopsis fastsat ved HPF eller kemiske fiksativer fandt, HPF-FS-metoden gav langt overlegne resultater 5. I væv fremstillet af HPF-FS plasmalemma og andre cellulære membraner var glattere, plasmalemma flugtede mod cellevæggen og generelt organeller herunder mikrotubuli var bedre bevaret end når prøverne blev fastsat ved konventionelle metoder. En anden undersøgelse af sojabønner rodknolde konkluderede, at "Kemisk fiksering af bufferet glutaraldehydikke bevare ultrastruktur sojabønner rodknolde i en tilstand, der tillader korrelation mellem struktur og funktion ". Og det fortsætter med at sige, at det eneste tilgængelige alternativ er HPF-FS 2. Plasmodesmata er membranbundne kanaler, der forbinder planteceller til deres naboer, men hvis underkonstruktion er vanskeligt at løse, selv under TEM. Cryofixation ved HPF eller med en propan jet fryser efterfulgt af FS blev valgt frem for kemisk fiksering i undersøgelser med henblik på at belyse de fine detaljer plasmodesmal struktur 18. På trods af disse tidlige resultater TEM undersøgelser af konventionelt fast væv, er stadig normen i plante videnskaber. Dette kan skyldes en simpel tilslutning til traditionelle metoder eller den tilsyneladende uoverkommelige omkostninger HPF-FS udstyr er koblet til den lange præparativ tid for tiden anvendte FS protokoller.
Proceduren for QFS er en nylig innovation fremskynde prøveforberedelse for TEM 15. QFS har væretanvendes til at fremstille hele C. elegans og N. benthamiana blade efter cryofixation 15. Disse er relativt tykke prøver, der skal fastsættes af HPF, og forberedelsen af Nicotiana prøver ved HPF-FS har traditionelt brugt meget lange FS gange 12, 13, 14. For denne protokol har vi brugt blade fra modellen planten Arabidopsis. Begrundelsen for lange FS tider for Nicotiana og andre planteprodukter prøver er, at udvekslingen af opløsningsmidler og vand sandsynligvis vil blive bremset af de store vakuoler i cellerne. Imidlertid forventes det, at afglasning af et godt frosset prøve bør resultere i minimal skade på cellerne (15 og dommere. Deri). Hvis der opstår is skade, det er mest sandsynligt forårsaget af indefrysningen selv og ikke QFS. En endnu kortere protokol for FS er blevet rapporteret 15. Denne super hurtige FS (SQFS) bruger kun 90 min til FS. I denne protokol, er prøverne i varmeblokken roteres ved 100 omdrejninger i fravær af tør jegce uden at dække for SQFS kammer. Dette giver prøver at nå -80 ° C hurtigt. Prøverne derefter fjernet fra varmeblokken og lov til at nå stuetemperatur på vippen. SQFS held har været anvendt til at dehydrere celler dyrket i kultur og E. coli-celler. Vi har endnu ikke forsøgt at bruge SQFS med vegetabilske prøver på grund af tykkelsen af plantevæv.
Protokollen for cryofixing og derefter dehydrering plante prøver ved tandem HPF og QFS repræsenterer en betydelig forbedring i forhold til de nuværende protokoller. Tiden for prøveforberedelse før harpiks infiltration er nu reduceret til et par timer i stedet for flere dage. Ud over at udvikle QFS metode 15, har McDonald også for nylig offentliggjort protokoller for hurtig infiltration af plantevæv med harpiks følgende SQFS uden tøris 19. Plantevæv er normalt langsomt infiltreret med harpiks ved flere lange inkubationer, herunder natten over. Disse nye protocols resultere i endnu kortere prøve sagsbehandlingstider: 6 timer fra at fryse til sektionering. Således i fremtiden, bør kombinationen af HPF-QFS og hurtig infiltration erstatte de nuværende protokoller for forberedelse plante-prøven til TEM. Desuden QFS procedure anvender fælles laboratorieudstyr, der er billig og kan anvendes til flere formål, selv om en kommerciel QFS Kit er i øjeblikket tilgængelig gennem elektronmikroskopi Sciences (http://www.emsdiasum.com). Enten indstilling repræsenterer en enorm besparelse over udgifter til indkøb af en dedikeret fryse substitution enhed, der kan koste langt over $ 50.000.
Det bør bemærkes, at anvendelse af prøver fremstillet af HPF og FS strække sig ud over rutinemæssig TEM-analyse. Prøver fremstillet på denne måde bevarer deres antigenicitet og kan derfor anvendes i antistof-baserede fremgangsmåder, herunder immunoguld mærkning 17, 19. Disse prøver kan også anvendes til avancerede tredimensionale strukturelle analyservia elektron tomografi 20. HPF-FS prøver kan også anvendes med korrelative lys og EM 21, 22. Således fortsatte forbedringer i procedurerne for cryofixing og derefter dehydratiseringsmidler prøver vil være til gavn for en bred vifte af efterforskere, der arbejder i forskellige systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Venlighed og generøsitet Dr. Kent McDonald fra UC Berkeley er meget værdsat. Vi takker en anonym anmelder for meget nyttige forslag. Den Burch-Smith laboratorium understøttes af startfonde fra University of Tennessee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
