Abstract
מאז מיקרוסקופ האלקטרונים ההילוכים 1940s (TEM) היה לספק ביולוגים עם תמונות רזולוציה גבוהה במיוחד של חומרים ביולוגיים. ובכל זאת, בגלל פרוטוקולים מייגע וגוזל זמן שגם דורשים ניסיון בהכנת דגימות נטול חפץ, TEM אינו נחשב טכניקה ידידותית למשתמש. הכנת מדגם מסורתית לTEM משמשת fixatives הכימי לשימור מבנים הסלולר. הקפאה בלחץ גבוהה היא cryofixation של דגימות ביולוגיות תחת לחצים גבוהים כדי לייצר שיעורי קירור מהירים מאוד, ובכך מגביל את היווצרות קרח, שהוא מזיק לשלמות ultrastructure הסלולרי. הקפאה בלחץ גבוהה ותחלופת הקפאה כרגע שיטות בחירה להפקת המורפולוגיה באיכות הגבוהה ביותר בסעיפי שרף עבור TEM. שיטות אלו למזער את החפצים קשורים בדרך כלל עם עיבוד קונבנציונלי לTEM של חלקים דקים. לאחר cryofixation המים קפואים במדגם מוחלפים בנוזלממס אורגני בטמפרטורות נמוכות, תהליך הנקרא חילוף הקפאה. החלפת הקפאה מבוצעת בדרך כלל על פני כמה ימים בציוד ייעודי, יקר. חידוש האחרון מאפשר לתהליך להסתיים בשלוש שעות, במקום שני הימים הרגילים. זה ואחריו בדרך כלל על ידי עוד כמה ימים של הכנת מדגם הכוללת חדירה והטבעה בשרף אפוקסי לפני חתך. כאן אנו מציגים פרוטוקול שילוב הקפאה בלחץ גבוה ותחלופת הקפאה מהירה המאפשרת קיבוע מדגם צמח כדי להיות מושלם בתוך שעות. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לעבודה עם רקמות או אורגניזמים אחרים. רקמות צמח הן בעלי עניין מיוחד בגלל הנוכחות של חללי סודה ווקואולות מלא מים המונעים הקפאת קרח חינם של מים. בנוסף, התהליך של קיבוע כימי הנו ארוך במיוחד בצמחים בשל קירות תא המעכבים את החדירה של הכימיקלים לעמוקים בתוך הרקמות. רקמות צמח ולכן particularly מאתגר, אך פרוטוקול זה הוא אמין ומייצר דגימות באיכות הגבוהה ביותר.
Introduction
הידע של ultrastructure התא שלנו מגיע בעיקר ממיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יכולה לפתור את הפרטים בטווח של ננומטרים ספורים 1. למרות היותו כל כך חזק בTEM רזולוציה אינו נחשב ידידותי למשתמש, כהכנת מדגם דורשת זמן רב ופרוטוקולים מייגע, ודורשת מומחיות כלשהי מהרופא. קיבעון מסורתי של דגימות יש בשילוב השימוש באלדהידים וtetroxide אוסמיום לפני עיבוד נוסף הכולל התייבשות, הטבעה בשרף ולאחר מכן חתך לייצר חלקים דקים במיוחד שלאחר מכן מוכתמים במתכות כבדות. עם זאת, ידוע כי קיבעון כימי יכול לייצר חפצים כוללים צבירת חלבון ואובדן של שומני 1, ושינויים בממברנות שסופו של דבר משפיעים על מספר תאים סלולריים 2. ממצאים אלה מיוחסים במידה רבה לקצב האיטי של קיבעון והתייבשות בטמפרטורת חדר 3, 4, 5.
"Jove_content"> Cryofixation על ידי לחץ גבוה הקפאה (HPF) נמנע מרוב החפצים שנגרמו על ידי קיבוע כימי. עיקרון cryofixation הוא שזה מוריד את נקודת הקיפאון של מים על ידי 20 מעלות, מאיטה את ההתגרענות והצמיחה של גבישי קרח ומגביר את הצמיגות של מים בדגימה ביולוגית, כך שמרכיבים הסלולר בעצם הם משותקים 6, 7. HPF יורד של מדגם טמפרטורה לזו של חנקן נוזלי, בלחץ גבוה מאוד (210 מגפ"ס או 2,100 בר) באלפיות שני. כאשר נעשה כראוי HPF מונע היווצרות של גבישי קרח גדולים שיכול לגרום נזק גדול לultrastructure תא. HPF ניתן להשתמש כדי לתקן את הדגימות של 100-200 עובי מיקרומטר בריכוזים טיפוסיים של מומסים ביולוגיים 7. ישנם מספר רב של ביקורות על הפיזיקה ועקרונות שבבסיס HPF, למשל 1, 7, 8.
לאחר HPF, דגימות מודגרת בטמפרטורה נמוכה (-78.5 ° C ל -90 &# 176; C) בנוכחות fixatives הנוזל האורגני ממס המכיל חומר כימי כמו tetroxide אוסמיום, בדרך כלל לכמה ימים. בטמפרטורה נמוכה זו, המים במדגם הוא הוחלף על ידי הממס האורגני, בדרך כלל אצטון או מתנול 1, 9. לפיכך, תהליך זה נקרא החלפת הקפאה (FS). המדגם אז חימם בהדרגה ובמשך הזמן הזה הוא קבוע, בדרך כלל עם tetroxide אוסמיום וuranyl אצטט 9. יש crosslinking בטמפרטורות נמוכות היתרון של תיקון מולקולות שהם משותקים 1. FS לכן מייצר דגימות באיכות מעולה בהשוואה לאלו שנקבעו על ידי קיבוע כימי קונבנציונלי בטמפרטורת חדר, במיוחד שזה גורם לשימור ultrastructural משופר, שימור טוב יותר של antigenicity והפחית את ההפסד של רכיבים מאוגדים סלולריים 10, 11.
רוב FS מתבצע על פני תקופות זמן ארוכות, בדרך כלל עד מספר ימים. הדבר נכון במיוחד Truדואר עבור דגימות צמחים 12, 13, 14. פרוטוקול האחרון שפותח על ידי מקדונלד 'ס והווב מקטין באופן משמעותי את הזמן לFS מכמה ימים לכמה שעות 15. בהליך שלהם מהיר תחלופה הקפאה (QFS), FS מתבצע מעל 3 שעות, ואילו בFS סופר מהיר דגימות (SQFS) מעובדות ב90 דקות. האיכות של דגימות המיוצרות על ידי שיטות אלה היא דומה לאלה שהניבו על ידי פרוטוקולי FS מסורתיים. אנחנו אימצנו את פרוטוקול QFS לעיבוד במורד הזרם של דגימות צמח לאחר HPF. זה הוכיח עצמו כדי להציל את לא רק זמן אלא גם כסף, כQFS וSQFS להשתמש בציוד מעבדה משותף במקום מכונות FS הזמינות מסחרי יקרות.
רקמות צמח הן לעתים קרובות מאוד מאתגרות כדי להתכונן לTEM. בממוצע, תאי צמח הם גדולים יותר מאשר כל אחד תאי חיידקים או בעלי חיים. הנוכחות של ציפורן הידרופובי שעווה, קירות תא עבים, וקואולות מלא מים גדולים המכילה חומצות, hydrolases אורגני ופנוליות גompounds שעשוי לכבוש עד 90% מכלל נפח התא 16, ואת הנוכחות של חללי סודה קשה מקטינה את מוליכות חום של המערכת 17. יתר על כן, במקרה של צמחים, עובי המדגם כמעט תמיד עולה על 20 מיקרומטר, המגבלה לשימוש בקיבוע כימי. בעוביים אלה, מוליכות החום הנמוכה של מים מונעים שיעור הקפאה יותר מ -10000 ° C / sec במרכז המדגם. השיעור שנדרש כדי למנוע היווצרות מזיקה משושה קרח (גבישי קרח עם צפיפות נמוכה יותר וגדולות יותר מ10 עד 15 ננומטר) 8. יחד, אתגרי הווה אלה לשתי ההקפאה הנכונה של המדגם וFS שלאחר מכן. יחד עם זאת, cryofixation היא השיטה הטובה ביותר לתיקון דגימות צמח. הנה פרוטוקול לHPF-QFS של דגימות רקמת צמח מוצג. הוא מתמקד בthaliana ארבידופסיס מיני מודל, אלא גם נוצל בעבר עם benthamiana Nicotiana. התוצאות האופייניות להוכיח כי HPF-QFS מייצרת samples באיכות דומה לHPF-FS המסורתי בשבריר של הזמן. עם התאמות נכונים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור דגימות ביולוגיות עבות יחסית אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הליך QFS דורש טיפול קיצוני וזהירות על ידי המשתמש ואנו מדגישים אמצעי בטיחות אלה כאן כהתראות והערות היכן שאפשר.
1.Preparation לHPF הפעלה
- לפני שיתחיל בהכנת מדגם, להפעיל את המקפיא בלחץ גבוה הבאים הוראות יצרן.
הערה: יחידת HPF שימוש בפרוטוקול זה היא יחידת Wohlwend הקומפקטי 02 (איור 1 א), וזה לוקח בערך אחד חלקים וחצי שעות של הליך הזנק לפני HPF פועל יכול להתחיל.- מיתוג בלחץ גבוה Wohlwend הקומפקטי 02 מקפיא.
- הפעל את המכשיר על ידי סיבוב המתג הראשי מ" 0 "ל" 1 ".
- לשחרר אוויר דחוס למכונה.
- לשחרר חנקן נוזלי למכונה.
- לחץ על הכפתור "SYSTEM מתייבש".
- לאחר 30 דקות, לחץ על "התוכנה לM מתייבש "כפתור שוב.
- לחץ על לחצן "ON / OFF" כדי לעבור על המכשיר.
- לחץ על לחצן "חנקן".
- לאפשר להתקן להתקרר למשך 20 דקות גם אם "DRIVE IN" כפתור כבר האיר.
- "לנהוג ב" אורות עד כפתור.
- לחץ על "הכונן ב" כפתור.
- לחץ על לחצן "AUTO".
- אורות הכפתור "מערכת המוכן" עד.
- הנח את הבדיקה הטמפרטורה ולחץ לתוך תא הלחץ ולנעול אותו עם הסיכה.
- לחץ על לחצן "AUTO JET". בדיקות בשלב זה, כי הגידול בלחץ והירידה בטמפרטורה הם כרצוי; בעצם הרצה. ירידות חדות בטמפרטורה ועלייה חדה בלחץ צפויים (איור 1).
- לבצע עוד שני מחזורי JET.
- מיתוג בלחץ גבוה Wohlwend הקומפקטי 02 מקפיא.
2 הכנה לReceiviדוגמאות ng קפואים
- מלא תיבה מבודדת המכילה בעלי cryovial עם חנקן נוזלי (ראה אזהרות בטיחות), כך שהמחזיקים מכוסים לחלוטין (תרשים 1C).
הערה: השתמש PPE כולל cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול בחנקן נוזלי. - מניחים את המספר המתאים של בקבוקונים המכילים את מדיום FS לתוך מחזיקי צינור אלומיניום בחנקן הנוזלי (איור 1 ג). עם פרוטוקול זה עד ארבעה דיסקים המכיל כל אחד מדגם יחיד יכול להיות ממוקם בcryovial אחד.
הערה: הבקבוקונים צריכים להיות מסומנים עם מכשיר חד כמו סופר שקצהו יהלומים ועיפרון רך מאוד.- למקבע במהלך QFS להשתמש 1% 4 Oso ו0.1% אצטט uranyl באצטון 9. הכן את הפתרון בנפח גדול, לוותר aliquots של 1.5 מ"ל לתוך cryovials וחנות קפוא בחנקן נוזלי.
הערה: בצע את אזהרות בטיחות לטיפול ב4 Oso ויצטט uranyl.
הערה: 4 Oso הערה: cryovials נהג להחזיק דגימות לQFS צריכה O-טבעת קשה כדי להבטיח שהצינורות נשארים אטומים במהלך QFS כדי למנוע דליפה של 4 Oso.
- למקבע במהלך QFS להשתמש 1% 4 Oso ו0.1% אצטט uranyl באצטון 9. הכן את הפתרון בנפח גדול, לוותר aliquots של 1.5 מ"ל לתוך cryovials וחנות קפוא בחנקן נוזלי.
- הכן שמרים להדביק על ידי ערבוב שמרי אופה עם נפח שווה פחות או יותר של מתנול 10% עם קיסם או מכשיר אחר מסוג זה עד שהעיסה חלקה. השמרים להדביק פועל כcryoprotectant תאי, והוא משמש כדי למלא את החלל סביב המדגם במנשא הדגימה. כמות הדבק תלויה במספר הדגימות; ל10 דוגמאות או פחות רסק (1 מ"ל) יכולות להיות מעורבות בצינור microcentrifuge.
הקפאת .3 לחץ גבוה של דוגמאות
- הסר עלה (או רקמות אחרות) של ריבית מהמפעל ובעדינות מניח אותו על פיסת Dentaשעוות l או משטח חיתוך אחר. השתמש אגרוף של 2.0 מ"מ או גודל רצוי לחתוך מדגם מתוך העלה. ידית המדגם בעדינות עם זוג המלקחיים ולעבוד מהר ככל האפשר.
- העבודה תחת מיקרוסקופ לנתח, הכנס את הדיסק עלה בצד 0.2 מ"מ של סוג מנשא דגימה ולכסות לחלוטין בשמרים להדביק. ודא שהדיסק מתמלא לחלוטין ולהדביק הוא רמה עם שפתו של בעל על ידי החלקה החוצה להדביק עם מכחול דק (איור 2).
- מניחים את המנשא בבעל הדגימה. כסה את המדגם עם מוביל דגימת סוג B, המשטח שטוח למטה.
הערה: בעל הדגימה צריך להיות יבש ובטמפרטורת חדר. - קח לדוגמא בבעל דגימה, להכניס אותו לתוך מכונה וליזום מחזור הקפאה על ידי לחיצה על הכפתור "AUTO JET", שאמורה להשלים בשנייה או שתיים.
- עבודה מהר ככל האפשר, להסיר את בעל מהמכונה ומניח את הקצה מחזיק sample לתוך חנקן נוזלי בתיבה מבודדת בחלק העליון של המכונה HPF. לטבול את קצות שני זוגות מלקחיים בחנקן הנוזלי כדי לצנן אותם.
הערה: לאחר הקפאה, יש לטפל בנישאים רק עם מלקחיים מקוררים חנקן נוזליים. מלקחיים חמים (בטמפרטורת חדר) הם לעתים קרובות הסיבה לכישלון בcryotechniques. - פתח cryovial המכיל תקשורת FS, והנח את המכסה בצד של הקופסה. בעזרת זוג מלקחיים מקורר חנקן נוזליים, להסיר בעדינות את התקליטור מבעל הדגימה, על מנת להבטיח כי הדיסק תמיד בחנקן או אדים נוזליים. העבודה באדי החנקן הנוזלי, להחזיק את צינור FS עם אחד מלקחיים מקוררים מראש ולהשתמש האחרים כדי למקם את המחזיק בבקבוקון FS. להבריג את המכסה של בקבוקון FS על גב. אל מלכודת כל חנקן נוזלי בבקבוקון.
הערה: בעת העברת דגימות לcryovials לQFS, להבטיח כי לא חנקן נוזלי הוא לכוד בתוך הבקבוקונים. חנקן נוזלי מרחיב 700 פי במהלך התחממות וכל Trappeחנקן נוזלי ד יכול לגרום לפיצוצים בתקופה זו. - חזור על שלבים 3.1-3.7 עד שכל הדגימות הרצויות קפואות. דיסקי עלה מרובים המכילים את אותו הסוג של מדגם יכולים להיות ממוקמים באותו הבקבוקון. שים לב שבעל הדגימה צריך להיות מיובש והביא לטמפרטורת חדר בין ריצות הקפאה. כדי לעשות זאת במהירות, לחמם אותו במכת מייבש, ולפקח על הטמפרטורה שלו על ידי מגע.
.4 הכנה לחילוף הקפאה
- לגמרי לטבול את בלוק דוד האלומיניום בחנקן נוזלי ל10 דקות או עד שמפסיק רתיחת nucleate. אמנם זה קורה, מקום שכבה של קרח יבש (1-2 סנטימטר) בחלק התחתון של המכל משמש כחדר FS (איור 3). מיכל קלקר או דלי קרח יכול לשמש לFS, יחד עם קרח יבש כתוש או כדורים.
- במהירות להכניס את cryovials המכיל דגימות יחד עם הבדיקה הטמפרטורה לשורות אמצע רחוב דוד. הקפד שהמכסים עלבקבוקונים דפוקים בחוזקה, כך שהתקשורת FS לא תדלוף החוצה במהלך FS. תתחיל להקליט את הטמפרטורה.
- הפוך הבדיקה הטמפרטורה על ידי הצבת תרמי דרך החלק העליון של cryovial כך שהוא מגיע לחלק התחתון של הצינור. לאטום את המכסה של הצינור עם שרף כך שאין דליפות נוזל החוצה. מלא את הצינור עם 1.5 מ"ל אצטון בתחילת כל סיבוב QFS.
- , באמצעות cryogloves מבודד או מלקחיים גדולים לשפוך את כל החנקן הנוזלי מבלוק דוד. יש להיזהר שלא לשפוך את cryovials.
הערה: השתמש PPE כולל cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול בחנקן נוזלי. - מניחים את הגוש המכיל בקבוקונים על גבי השכבה של קרח יבש בתא QFS. ודא הבלוק ממוקם כך שהצינורות שוכבים במאוזן אבל עם הטיה קלה כלפי מעלה. לא צריך להיות שום דליפה אם cryovials הנכון משמש.
- לארוז קאמרי QFS עם קרח יבש, כך שצינורות FS מכוסים, אם כי זה לא הכרחי ללכסות את החלק העליון של הבלוק. מניחים את המכסה על החדר.
.5 המהיר FS
הערה: בצע את ריצת QFS במנדף במקרה שכל דליפה של 4 Oso בטעות מתרחשת למרות אמצעי זהירות אחרות.
- הנח קאמרי QFS על שייקר סיבובי פלטפורמה במנדף ולסובב ב125 סל"ד 120 דקות. במהלך תקופה זו הטמפרטורה של הבלוק צריכה להגדיל בהדרגה עד כ -80 מעלות צלזיוס. התסיסה מבטיחה ערבוב של הרכיבים עבור FS טוב יותר.
הערה: המיקום של שייקר במנדף ואת המיקום של דלת מנדף צריכה להיות זהה לאורך כל הליך QFS ועבור כל QFS לרוץ כדי להבטיח התחממות של דגימות עולה בקנה אחד. - הסר את הקרח היבש מהאולם ולהמשיך רעד במשך שעה נוספת.
הערה: הטמפרטורה צריכה להגדיל לכ -15 ° C ל-20 מעלות צלזיוס. - הסר את הדגימות ובדיקת טמפרטורה מתא QFS ומניח עלשייקר בטמפרטורת חדר למשך עוד דקות 10-15, עד שהם מגיעים לטמפרטורת חדר. לעצור את הקלטת הטמפרטורה.
- במהלך FS, לכבות את המכונה HPF.
- סגור את הברז של מיכל החנקן הנוזלי ואילו המכונה HPF הוא ממלא בחנקן.
- לחץ על לחצן "חנקן".
- חכה עד אדום מכבה אור "בוכנה DOWN".
- לחץ על "ON / OFF" כפתור.
- לחץ על הכפתור "SYSTEM מתייבש".
- ניתק את אספקת אוויר דחוס למכונה.
- לאחר מינימום של שעה 12 (כדי להבטיח ייבוש של כל לחות), לכבות את המכונה על ידי סיבוב המתג הראשי מ" 1 "ל" 0 ".
.6 הודעה FS עיבוד
- מוציא בזהירות את תקשורת FS עם טפטפות העברת פלסטיק ומניחים במכל המתאים לפסולת רעילה.
הערה: 4 Oso ויצטט uranyl הם כימיקלים מסוכניםויש לטפל במנדף בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כוללים נעליים סגורות אצבעות, חלוק מעבדה וכפפות. - לשטוף דגימות ארבע פעמים עם אצטון 100%. לאסוף את שתי שטיפות הראשונות ולמקם במכל הפסולת הרעיל.
- בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את דגימות רקמה מבעלי. שמור דגימות רטובות עם אצטון כזה נעשה, ולעבוד מאוד בעדינות כדי למנוע דגימות שבירה.
הערה: אין זה יוצא דופן וזה יכול להיות ממש שימושי יש השמרים להדביק נופלים מהדגימות בשלב זה. השמרים להדביק הוא בדרך כלל בצבע חום כהה מאוד ואילו רקמת העלה היא עדיין ירוקה. - לאסוף את הדגימות בcryovials המכיל אצטון. להמשיך בהכנת מדגם (חדירה והטבעה) לTEM על פי פרוטוקולים המקובלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות המוצגות להלן התקבלו באמצעות Wohlwend קומפקטי 02 לHPF (איור 1 א). אחד יתרונות עיקריים של מכשיר זה הוא הקלות של שימוש בנישאי הדגימה והמחזיקים בו. בעת שימוש במכשירים אחרים, מקדונלד 'ס ממליץ ששני משתמשים צריכים לבצע את הכנת המדגם וHPF, אחד הכנת הדגימות ואילו השני עושה ההקפאה והעברה לFS cryovials 9. עם זאת, Wohlwend דגימת ספקים ובעל הם קלים מספיק עבור משתמש יחיד כדי לתפעל באופן עצמאי (איור 2 א, B, E, F ו G). יש לציין עם זאת כי יש לבצע כמה מבחנים שנערך ללהכיר את מכשיר HPF לפני העבודה עם דגימות יקרות. משתמש מנוסה צריך להיות מסוגל לתקן כמה (10 או יותר) דגימות בשעה. עם זאת, העקרונות שהוצגו בפרוטוקול זה ניתן להשתמש עם כל אחת ממכונות HPF הזמינות המסחרית.
אוליהחלק הקריטי ביותר של הליך HPF-QFS הוא הכנת המדגם לטעינה לתוך מנשא הדגימה (איור 2 ג). למרות שזה לא יכול להיות אינטואיטיבי, זה הצעד בפרוטוקול אשר לחוקר יש רוב השליטה. המכונה HPF היא איתנה, ועם שימוש ותחזוקה נאותים צריך לייצר את השינויים הצפויים בלחץ וטמפרטורה עם וריאציה קטנה בין דגימות. אם מדגם הוא טיפל בצורה גרועה במהלך הכנה אז לא צעד אחר יהיה לגאול את הנזק שנגרם כך. רקמות צמח הן די קלים לתמרן בשלב זה של התהליך כפי שהם לא בתרבית בינונית וקירות תאיהם לתת תאי כוח טוב. חשוב בכל זאת כי דגימות מטופלות במהירות כדי למנוע שינויי ultrastructural הנובעים מהסרתן מצמח ההורה ולהגביל את לחץ ותגובות פצעו. מוביל הדגימה הקטן ביותר שיכול להכיל מדגם יש להשתמש כדי להבטיח HPF יעיל והעקבי (איור2C יור). לבסוף, מוביל הדגימה צריך להיות מלא, אבל לא עולה על גדותיו (איור 2 ד). מוביל הדגימה מולא מוכנס בקלות לתוך המכונה HPF להקפאה (H איור 2 ואני).
הצעדים הראשונים בפרוטוקול QFS יכולים להיות מאתגרים עבור מתחילים, ולכן מומלץ ששני אנשים צריכים לעבוד יחד עד שהמשתמשים מרגישים בנוח עם ההליך (איור 3A-E). יש להקפיד בכל העת בעת טיפול בחנקן נוזלי ויצטט tetroxide אוסמיום fixatives וuranyl. עקומה אופיינית לשינויי טמפרטורה במהלך QFS מוצגת באיור 'י 2. הטמפרטורה עולה במהירות מ-196 ° C, הטמפרטורה של חנקן נוזלי, כ -80 מעלות צלזיוס. זה בטמפרטורות של C סביב -78 ° C ל -90 ° שתחלופת הקפאה הוא האמינה להתרחש 9. צעד מאתגר אחת בפרוטוקול QFS הוא הסר של קרח יבש לאחר 2 שעות של FS. בצעד זה, שימוש לא נכון בדוגמאות יכול לייצר עלייה חדה בטמפרטורות. לשם כך, בלוק החימום צריך להיות הרים במהירות אל מחוץ לתא QFS באמצעות cryoglove והקרח היבש נשפכו במהירות לתוך מיכל המשני.
HPF נעשה שימוש כדי לתקן רקמות צמח שונות, כוללים עלים Nicotiana benthamiana ועלים ארבידופסיס ועוברים. זה מאתגר כדי לתקן דגימות מעלים בוגרים בשל וקואולות המרכזית הגדולה של רוב התאים. עלים צעירים להכיל וקואולות קטנה יותר, אך trichomes בדרך כלל די צפוף עמוסים. הנוכחות של trichomes יכולה לעשות את זה קשה לארוז את הדגימות עם שמרים להדביק אך יש להקפיד על מנת להבטיח שזה נעשה כראוי כדי למזער את כמות האוויר שנלכד בין משטח העלה ואת רסק. האוויר שנלכד יעכב העברת חום במהלך HPF ולהפחית את האיכות של קיבעון. זה נכון לגבי כל מדגם.
לאחר דגימות HPF וQFS עשויות להיות מוכנות לviיואינג תחת TEM על ידי חדירה והטבעה עם שרף. חלקים דקים של 65-100 ננומטר עשויים אז להיות מוכנים על ידי חתך. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 4. התמונות המוצגות הן כל מדגימות העלים ארבידופסיס. ממברנות פלזמה הן בדרך כלל חלק ולחץ על קיר התא, סימן לקיבעון טוב (איור 4 א, C, E). אברונים אחרים, כוללים כלורופלסטים (איור 4 א, D, F, H) וthylakoids (איור 4), מיטוכונדריה (איור 4D ו F), Golgi (איור 4 G), microtubules (איור 4E) וריבוזומים (במיוחד איור 4C) גם וקואולות ברורה לעין וגדולה המרכזית תישאר (איור 4 א) בשלמותה. טיפול לקוי בתוצאות HPF-QFS בחפצים לרבות נזק הנגרם על ידי גביש קרח (איור 4D) וplasmolysis (איור 4H). משקע עופרת עלול להיווצר במהלך ההכתמה של סעיףים (איור 4F).
איור 1: Wohlwend הקומפקטי 02 לחץ גבוהה מקפיא המכונה HPF Wohlwend הקומפקטי 02 משמשת לcryofixation עם מסוף המחשב המחובר ().. דוגמאות מוכנסות לתוך החלק הקדמי של המכונה (העיגול הקטן) להקפאה. עקומת טמפרטורה יכולה להיות שנוצרה על מסך המחשב לכל ריצה, כרצוי על ידי המשתמש. (B) עקומת לחץ לטמפרטורה אופיינית לריצת HPF. הקווים הצהובים וסגולים מייצגים את הטמפרטורה ולחץ, בהתאמה. שים לב למדרונות התלולים של שני העקומות. בלחץ הגבוה נשמר לאלפית -400. כל מרווח על ציר x מייצג 50 אלפיות שני. הנתונים נאספו עם EasyScopeII לתוכנת DSIM12. (C) התיבה והכיסוי מבודדים המשמשים לאחסון of דגימות קפואות מייד לאחר ההקפאה יכולות להיות ממוקמות במקום נוח על גבי המכונה HPF. הוא מלא עם חנקן נוזלי. מכולות האלומיניום העגולות להחזיק cryovials.
איור 2: דגימת רקמת הכנה לHPF. מדגם עלה בבאר 0.2 מ"מ של סוג מנשא דגימת בעל הדגימה למכונת HPF הקומפקטי 02 בתצורה הסגורה שלה (). (ב) בעל הדגימה הוא פתוח. (C). הצד השני של מוביל זה הוא 0.1 מ"מ עמוק. (D) מדגם העלה מכוסה בשמרים להדביק. שים לב שהספק הוא מלא אבל לא עולה על גדותיו. (E) מוביל הדגימה בבעל הדגימה. (F) המדגם מכוסה בסוג B הספק. יש מנשא זה משטח אחד שטוח ובצד האחר גם שהוא 0.3 מ"מ עמוק. הנה המשטח השטוח משמש לכריך המדגם. (G) בעל המדגם סגור ומוכן להכנסה לתוך המכונה HPF. (H) פתח בחלק הקדמי של מכשיר HPF שלתוכו בעל הדגימה יוכנס להקפאה . (I) הבדיקה הטמפרטורה ולחץ / בעל מוכנס לתוך המכונה HPF. עקומה אופיינית טמפרטורה לריצת QFS (נתונים שנאספו עם תוכנת EasyLog) (J). טמפרטורה נרשמה בכל שנייה. ספייק בתחילת הריצה הוא עקב האלקטרוניקה של החללית משמשת ואינה משקפת מדידת טמפרטורה אמיתית.
איור 3:. ציוד המשמש בQFS QFS יכולה להתבצע בכל מיכל מבודד כגון תיבת קלקר או דלי קרח () <./ Strong> שכבה עמוקה סנטימטר יבש קרח 1-2 מכסה את החלק התחתון של חדר QFS, כאן תיבת קלקר. (ב) בלוק דוד עם 13 חורי מ"מ משמש לדגימות בית במהלך QFS. הבדיקה הטמפרטורה עם אוגר נתונים דיגיטלי ממוקמת בבלוק דוד. (C) לאחר קירור בלוק דוד בחנקן נוזלי הדגימות ממוקמות בבלוק, החנקן הנוזלי נשפך, וכל ההרכבה ממוקמת בתא QFS . עם הקרח היבש (D) קאמרי QFS מלאה בקרח יבש, כך שהדגימות מכוסות; אין חסרון למכסה את כל גוש התנור עם קרח יבש. (E) התיבה מכוסה ולאחר מכן עברה על שייקר הסיבובי במנדף בי הדגימות נסערים לאורך כל הליך QFS.
איור4:.. ארבידופסיס עלים שהוכן על ידי HPF-QFS תוצאות שהושגו עבור דגימות שהוכנו על ידי HPF-QFS וצלמו על ידי TEM על Zeiss Libra 200 HT FE MC () תמונה בהגדלה גבוהה בינונית מראה הכלורופלסט (CH) עם קירות תא ו הציטופלסמה של תאים סמוכים. וקואולות (V) מכילה חומר אלקטרונים צפוף. סרגל קנה מידה = 0.5 תמונת מיקרומטר. הגדלה גבוהה (B) של הכלורופלסט. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (C) תמונה בהגדלה גבוהה של דופן התא בין תאים סמוכים. Plasmodesma מסועף גלוי (חץ). הערה קרום הפלזמה החלקה נלחץ אל קיר התא על ידי vacuole. ציטופלסמה היא ארוזה בצפיפות עם ריבוזומים. V הוא vacuole. Tonoplast הוא חלק ורציף. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (ד ') תמונה בהגדלה נמוכה מראה אזורים של קיבעון טוב בהכלורופלסט (CH) ליד האזורים של נזק קרח (כוכבית). סרגל קנה מידה = 0.5 מיקרומטר. תצוגת הגדלה גבוהה של תא וול (E)l וmicrotubules. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. תמונה (F) מראה שימור טוב של כלורופלסטים (CH) ומיטוכונדריה (M). משקע שחור גדול הוא מהכתמת חלקים עם ציטרט להוביל. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. תצוגה (G) בהגדלה גבוהה של Golgi (GA). סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (H) גרוע השתמר מדגם מראה חוסר הפרטים בכלורופלסטים וplasmolysis (חץ שחור). סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה של הפרוטוקול המובא כאן תלויה במידה רבה על המשתמש. ראשית, נדרשת הכנה מתקדמת, כדי להבטיח כי כל חומרים הדרושים הם זמינים ובכמות מספיקה להשלמת כל ריצת HPF-QFS. שנית, המשתמש חייב לעבוד במהירות, נע מצעד לצעד בצורה יעילה הממזערת טיפול מדגם, ובכך ממזערים את השינויים במדינה האם של של הרקמה. ברגע שדגימות קפואות ולפני שהם מיובשים זה הכרחי שהם יישמרו קרים, כך יש להקפיד להימנע מכל טיפול שיכול בטעות לחמם את המדגם, למשל, טיפול ביד עטוית כפפה במקום מלקחיים מקוררים מראש. ריצות מהירות ועליית יעילות עם היכרות עם הפרוטוקול, כך בפועל מומלצות לפני שאנסה לתקן את הדגימות של אחד של עניין. שלישית, המשתמש חייב להישאר מודע לסכנות של הכימיקלים המשמשות במדיום FS, כמו גם את הסכנות של עבודה עם חנקן נוזלי וקרח יבש. מנדף הוא הכרחי עבור ההכנה של מדיום FS ולהליך QFS. לכל צעדים האחרים, ציוד מגן האישי הנדרש כולל כפפות, מעבדה, טיח, נעליים סגורות הבוהן ומשקפי מומלצות.
היתרונות של שימוש בcryofixation במקום fixatives הכימי בטמפרטורת חדר להכנת דגימות לTEM, כוללים צמחים, כבר זמן רב ידועים 10. מחקר אחד השוואת ultrastructure של טיפים שורש של Nicotiana וארבידופסיס הקבועים על ידי HPF או fixatives הכימי מצא כי שיטת HPF-FS נתנה הרבה תוצאות מעולה 5. ברקמה שהוכנה על ידי HPF-FS plasmalemma וממברנות תאים אחרים היו חלקים יותר, plasmalemma היה סומק על קיר התא, וmicrotubules בדרך כלל אברונים כולל טובים יותר נשתמר מאשר כאשר דגימות קבועות בשיטות קונבנציונליות. מחקר נוסף של גושי שורש סויה הגיע למסקנה כי "קיבעון כימי על ידי glutaraldehyde נאגראינו משמר את ultrastructure של גושי שורש סויה במצב המאפשר את ההתאמה של מבנה ותפקוד. "וזה ממשיך לומר כי החלופה זמינה היחידה היא HPF-FS 2. Plasmodesmata ערוצי קרום הנכנס שמתחברים לתאי צמח לשכניהם, אך מסד שקשה לפתור אפילו תחת TEM. Cryofixation ידי HPF או עם מקפיא סילון פרופאן ואחרי FS נבחר על קיבעון כימי במחקרים שמטרתם הבהרת הפרטים הקטנים של מבנה plasmodesmal 18. למרות ממצאים המוקדמים אלה, מחקרי TEM על רקמות קבועות קונבנציונלי עדיין הנורמה במדעי צמח. זה יכול להיות בגלל דבקות פשוטה לשיטות מסורתיות או לעלות לכאורה מונעת מציוד HPF-FS מצמידים את זמן ההכנה של הארוך לפרוטוקולי FS המשמשים כיום.
הליך QFS הוא חידוש האחרון בזירוז הכנת מדגם ל15 TEM. QFS כברמשמש להכנה כל C. elegans ונ ' benthamiana משאיר אחרי cryofixation 15. אלה הם דוגמאות עבות יחסית להיות קבוע על ידי HPF, והכנת דגימות Nicotiana ידי HPF-FS השתמשה FS ארוך מאוד באופן מסורתי פעמים 12, 13, 14. לפרוטוקול זה השתמשנו עלים מצמח המודל ארבידופסיס. הרציונל לפעמי FS ארוכות לNicotiana ודגימות צמח אחרים הוא שחילופי ממסים ומים עלולים להיות האטה על ידי vacuoles הגדול של התאים. עם זאת, צפוי כי devitrification של מדגם קפוא היטב צריך לגרום לניזק מינימאלי לתאים (15 ושופטים. בו). אם נזק הקרח מתרחש הוא סביר ביותר שנגרם על ידי ההקפאה עצמו ולא QFS. פרוטוקול קצר עוד יותר לFS דווח 15. FS זה סופר מהיר (SQFS) משתמש רק 90 דקות לFS. בפרוטוקול זה, הדגימות בבלוק דוד מסובבות ב100 סל"ד בהעדר אני יבשCe ללא כיסוי תא SQFS. הדבר זה מאפשר לדגימות להגיע -80 מעלות במהירות c. לאחר מכן הדגימות יוסרו מבלוק דוד ואפשרו להגיע טמפרטורת חדר על כיסא הנדנדה. SQFS שמש בהצלחה ללייבש תאים גדלים בתרבית וא תאי coli. עדיין לא ניסיתי להשתמש בSQFS עם דגימות צמח בשל העובי של רקמות הצמח.
הפרוטוקול לcryofixing ולאחר מכן להתייבשות דגימות צמח על ידי HPF טנדם וQFS מהווה שיפור משמעותי על פני פרוטוקולים הנוכחיים. הזמן להכנת מדגם לפני חדירת שרף כעת מצטמצם לכמה שעות במקום כמה ימים. בנוסף לפיתוח שיטת QFS 15, מקדונלד 'ס גם פרסמה לאחרונה פרוטוקולים לחדירה מהירה של רקמות צמח עם SQFS הבא השרף בלי קרח יבש 19. רקמות צמח בדרך כלל חדרו באיטיות עם שרף על ידי מספר incubations הארוך, כוללים לילה. פרוטו החדש אלהcols לגרום לזמני עיבוד מדגם קצרים עוד יותר: 6 שעות מהקפאה לחתך. כך בעתיד, שילוב של HPF-QFS וחדירה מהירה צריך להחליף פרוטוקולים הנוכחיים להכנת מפעל מדגם עבור TEM. בנוסף, הליך QFS משתמש בציוד מעבדה משותף שהוא זול וניתן להשתמש בו למטרות רבות, למרות שערכת QFS מסחרית זמינה כיום דרך המדעים מיקרוסקופית אלקטרונים (http://www.emsdiasum.com). כך או אופציה מהווה חיסכון עצום על עלות רכישת יחידת החלפת הקפאה ייעודית שיכול לעלות גם מעל 50,000 $.
יש לציין כי היישומים של דגימות שהוכנו על ידי HPF וFS להרחיב מעבר ניתוח TEM שגרה. דגימות שהוכנו באופן זה לשמור על antigenicity ולכן יכולות לשמש בגישות המבוסס על נוגדן, כוללים תיוג immunogold 17, 19. גם דגימות אלה עשויות לשמש לניתוחים מבניים תלת ממדים מתקדמיםבאמצעות טומוגרפיה של אלקטרון 20. דגימות HPF-FS יכולות גם לשמש עם אור גומל ו21 EM, 22. לפיכך, המשיך שיפורים בנהלים לcryofixing ולאחר מכן דגימות התייבשות תהיה מועילות למגוון רחב של חוקרים, שעבדו במערכות מגוונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
החסד ונדיבותו של ד"ר קנט מקדונלד 'ס של אוניברסיטת ברקלי בקליפורניה הם מאוד מוערכים. אנו מודים למבקר אנונימי להצעות מועילות מאוד. המעבדה ברץ-סמית נתמכת על ידי קרנות הזנק מאוניברסיטת טנסי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
