Abstract
1940의 투과 전자 현미경 (TEM)이 생물학적 물질의 초 고해상도 이미지로 생물을 제공하고 있기 때문이다. 그러나 때문에 또한 잡티 무료 샘플의 준비 경험을 요구 힘들고 시간이 많이 소요되는 프로토콜로, TEM은 사용자 친화적 인 기술로 간주되지 않습니다. TEM 용 샘플 준비 전통적인 셀룰러 구조를 보존하는 화학 고정 제를 사용했다. 고압 동결시켜 세포 미세 구조의 완전성에 불리하다 얼음 형성을 제한하는 매우 빠른 냉각 속도를 생성하기 위해 높은 압력 하에서 생물학적 시료의 cryofixation이다. 고압 냉동 동결 치환은 현재 TEM에 대한 수지 부분에서 최고 품질의 형태를 생산하는 선택의 방법이 있습니다. 이러한 방법은 일반적으로 얇은 부분의 TEM에 대한 기존의 처리와 관련된 유물을 최소화 할 수 있습니다. cryofixation 후 샘플에 얼어 붙은 물이 액체로 대체된다낮은 온도에서 유기 용매, 공정은 동결 치환했다. 동결 대체는 일반적으로 전용, 비용이 많이 드는 장비 며칠 동안 실시한다. 최근의 혁신 대신 보통 이틀, 처리 3 시간에 완료 될 수있다. 이것은 일반적으로 침투와 단면 전에 에폭시 수지에 삽입을 포함 샘플 준비의 더 몇 일 뒤에. 여기에서 우리는 식물 샘플 고정이 시간 내에서 수행 할 수 있도록 고압 동결 빠른 동결 대체를 결합하는 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 쉽게 다른 조직 또는 유기체 작업에 적용 할 수 있습니다. 식물 조직 때문에 물이 얼음이없는 동결을 방해 화난 공간과 물이 채워진 공포의 존재의 특별한 관심사이다. 또한, 화학 물질의 정착 과정은 조직 내 깊은 곳으로 화학 물질의 침투를 방해 셀 벽으로 인해 공장에서 특히 길다. 식물 조직 따라서 partic 아르ularly 도전,이 프로토콜은 신뢰성과 최고 품질의 샘플을 생산하고 있지만.
Introduction
세포 미세 구조에 대한 지식은 몇 나노 미터 (1)의 범위에서 상세 해결할 수 전자 현미경, 주로 온다. 샘플 준비 시간과 노력이 많이 소요된다고 프로토콜을 필요로하며, 실천에서 약간의 전문 지식을 필요로 해상도 TEM에 강력에도 불구하고, 사용자 친화적으로 간주되지 않습니다. 샘플의 전통적인 고정 수지에 삽입 한 후 다음 중금속 묻 얇은 섹션을 생산하는 단면, 탈수가 포함되어 추가 처리 전에 알데히드 및 산화 오스뮴의 사용을 결합했다. 그러나, 화학 고정 궁극적 여러 셀룰러 구획이 멤브레인에 영향을주는 단백질 응집 및 지질 (1)의 손실, 및 변화를 포함 아티팩트를 생성 할 수 있다고 알려져있다. 이러한 아티팩트는 주로 상온 3, 4, 5로 고정 및 탈수 느린 레이트에 기인한다.
7. HPF가 감소, 20도에서 물의 빙점을 낮추는 얼음 결정의 핵 생성 및 성장을 느리게 및 세포 성분이 본질적 6 고정화되도록 생물학적 샘플에서 물의 점도를 증가 시킨다는 것이다 밀리 초 단위로 매우 높은 압력 (210 MPA는 또는 2100 줄)에서 액체 질소의 그것과 샘플의 온도. 제대로 완료되면 HPF 세포 미세 구조에 큰 손상을 일으킬 수 있습니다 대형 얼음 결정의 형성을 방지 할 수 있습니다. HPF는 생체 (7)의 전형적인 용질 농도로 100-200 μm의 두께의 샘플을 고정하기 위해 사용될 수있다. HPF, 예를 들어 1, 7, 8을 기본 수많은 물리학에 대한 리뷰와 원칙이 있습니다.
HPF 후, 샘플은 -90 낮은 온도에서 (-78.5 ° C를 배양일반적으로 몇 일 동안 산화 오스뮴과 같은 액체의 유기 용매를 함유하는 화학 고정 제의 존재 하에서 C) # 176. 이 저온에서, 샘플은 물, 유기 용매, 통상적으로 아세톤, 메탄올 또는 1, (9)에 의해 대체된다. 따라서,이 프로세스가 호출 동결 치환 (FS). 샘플을 서서히 가온하고이 시간 동안 보통 산화 오스뮴과 우라 닐 아세테이트 (9), 고정된다. 저온에서 가교 결합을 고정화 한 분자를 고정하는 장점을 갖는다. FS 따라서이 개선 된 미세 보존 결과 특히 실온에서 기존의 화학 고정에 의해 고정와 비교 우수한 품질, 항원을 더 잘 보존 샘플을 생산하고 언 바운드 세포 성분 10, 11의 손실을 감소시켰다.
대부분의 FS는 일반적으로 몇 일까지 장기간에 걸쳐 수행된다. 이것은 특히 TRU 인식물 시료 12, 13, 14에 대한 전자. 맥도날드와 웹이 개발 한 최신 프로토콜은 크게 몇 시간 15 몇 일에서 FS의 시간을 줄일 수 있습니다. 슈퍼 빠른 FS에서 (SQFS) 샘플 90 분 안에 처리되는 동안 자신의 빠른 동결 치환 (QFS) 절차에서는 FS는 3 시간에 걸쳐 실시된다. 이러한 방법에 의해 생산 된 샘플의 품질은 전통적인 FS 프로토콜에 의해 수득 된 것과 대등하다. 우리는 HPF 후 식물 시료의 하류 처리 QFS 프로토콜을 채택했다. QFS 및 SQFS 대신에 비용이 많이 드는 시판 FS 기계의 일반적인 실험 장비를 사용할 때이 시간뿐만 아니라 돈뿐만 아니라 저장 입증되었습니다.
식물 조직은 종종 TEM을 준비하는 것은 매우 도전이다. 평균적으로, 식물 세포는 세균이나 동물의 세포 하나보다 큰. 소수성 왁스 표피 두꺼운 셀 벽, 유기산, 가수 분해 및 페놀 C를 함유하는 큰 물이 채워진 액포의 존재ompounds 즉 전체 세포 부피 (16)의 90 %까지 점유 할 수 있고, 통기 공간의 존재는 심각한 시스템 (17)의 열 전도성을 감소시킨다. 또한, 식물의 경우, 샘플 두께는 거의 항상 20 μm의 화학적 고정의 사용 한계를 초과한다. 이러한 두께에서, 물의 낮은 열전도율은 시료의 중심에 동결 속도보다 더 -10,000 ° C / sec의 방지한다. 즉, 환율을 손상 육각형 얼음 형성 (낮은 밀도의 얼음 결정 및보다 큰 10-15 나노 미터)를 방지하기 위해 필요 8. 이와 함께 샘플 및 후속 FS 모두 적절한 동결 이러한 본 과제. 그럼에도 불구하고, cryofixation 식물 샘플을 고정하기위한 가장 좋은 방법입니다. 여기에서 식물 조직 샘플의 HPF-QFS위한 프로토콜이 제시된다. 이 모델 종 애기 장대에 초점을 맞추고, 또한 Nicotiana의 benthamiana와 함께 사용되어왔다. 전형적인 결과는 HPF-QFS는 SA를 생성 입증짧은 시간에 전통 HPF-FS에 필적하는 품질의 mples. 적절한 조정으로,이 프로토콜은 또한 다른 비교적 두꺼운 생물학적 시료에 사용될 수있다.
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Protocol
참고 : QFS 절차는 사용자에 의해 극단적 인 관심과주의를 필요로하고 우리는 해당주의 및 참고 사항 여기에 이러한 안전주의 사항을 강조 표시합니다.
HPF 실행에 대한 1. 준비
- 샘플 준비를 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 고압 냉장고의 전원을 켭니다.
NOTE :이 프로토콜에서 사용 HPF 유닛 Wohlwend 컴팩트 부 02 (도 1a)이며, HPF가 실행되기 전에 시작할 수는 시동 절차 1과 시간 반에 약 걸립니다.- Wohlwend 소형 02 고압 냉동고에 전환.
- "1"을 "0"에서 메인 스위치를 돌려 장비에 전환합니다.
- 시스템에 압축 공기를 해제합니다.
- 기계에 액체 질소를 놓습니다.
- 눌러 "SYSTEM DRY UP"버튼을 누릅니다.
- 30 분 후, "SYSTE을 눌러M DRY UP "버튼을 다시.
- 을 눌러 "ON / OFF"버튼을 악기에 전환합니다.
- "질소"버튼을 누릅니다.
- 버튼 "IN DRIVE"가 이미 켜져있는 경우에도 기계가 20 분 동안 식히십시오.
- 최대 버튼에 불이 "IN DRIVE".
- 버튼 "IN DRIVE"를 누릅니다.
- "AUTO"버튼을 누릅니다.
- "SYSTEM READY"버튼을 켜집니다.
- 압력 챔버에 온도와 압력 프로브를 삽입하고 핀을 잠그고.
- "JET의 AUTO"버튼을 누릅니다. 원하는 압력 증가 및 온도 저하가 있음이 확인 단계; 기본적으로 시운전. 온도와 압력의 급격한 증가 샤프 방울 (그림 1B) 예상된다.
- 두 개 더 JET주기를 수행하십시오.
- Wohlwend 소형 02 고압 냉동고에 전환.
Receivi에 대한 2 준비NG 냉동 샘플
- 홀더가 완전히 (그림 1C) 적용되도록 액체 질소와 cryovial 홀더를 포함하는 절연 상자를 채우기 (안전 경고 참조).
주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. - 액체 질소 (그림 1C)에있는 알루미늄 튜브 홀더에 FS 매체를 포함하는 튜브의 적절한 수를 놓습니다. 최대 네 개의 디스크에이 프로토콜을 통해 하나의 샘플을 포함하는 각은 하나의 cryovial에 배치 할 수 있습니다.
참고 : 유리 병이 다이아몬드로 만들어진 학자 및 매우 부드러운 연필 등 뾰족한으로 표시해야합니다.- QFS 동안 정착을 위해 아세톤 구에 1 % OSO 4와 0.1 % 우라 닐 아세테이트를 사용합니다. 액체 질소에 냉동 cryovials 및 저장소에 1.5 ㎖를 분취 량을 분배, 대량의 솔루션을 준비합니다.
참고 : OSO 4 우라 닐 아세테이트를 처리하기위한 안전 경고를 따르십시오.
참고 : OSO 4 NOTE : QFS 용 샘플을 보유하는 데 사용 cryovials은 튜브가 OSO (4)의 누출을 피하기 위해 QFS 동안 밀봉 상태로 유지되도록하여 단단한 O 링을 가져야한다.
- QFS 동안 정착을 위해 아세톤 구에 1 % OSO 4와 0.1 % 우라 닐 아세테이트를 사용합니다. 액체 질소에 냉동 cryovials 및 저장소에 1.5 ㎖를 분취 량을 분배, 대량의 솔루션을 준비합니다.
- 붙여 넣기가 부드럽게 될 때까지 이쑤시개 나 기타 등의 악기 10 % 메탄올의 대략 동일한 볼륨과 빵 효모를 혼합하여 효모 붙여 넣기를 준비합니다. 효모 페이스트 세포 동결 방지제로서 작용하고 캐리어의 시험편 샘플의 주위의 공간을 채우기 위해 사용된다. 페이스트의 양이 샘플의 수에 의존한다; 10 개 이하의 샘플 페이스트 (1 ml)을 마이크로 원심 튜브에 혼합 될 수 위해.
샘플의 3 고압 냉동
- 공장에서 관심의 잎 (또는 다른 조직)를 제거하고 부드럽게 denta의 조각에 배치리터 왁스 또는 다른 절삭면. 잎에서 샘플을 잘라 2.0 mm 또는 원하는 크기의 펀치를 사용합니다. 포셉 한 쌍의 부드럽게 샘플을 처리하고 가능한 한 신속하게 작동합니다.
- 해부 현미경 협력 형 시험편 캐리어 0.2 mm 측면에서 잎 디스크를 배치하고 효모 페이스트를 완전히 커버. 디스크가 완전히 충전되어 있는지 확인하고, 붙여 넣기는 잘 붓 (그림 2)와 붙여 넣기를 부드럽게 처리하여 홀더의 가장자리 수준입니다.
- 시편 홀더 캐리어를 놓습니다. B 형 표본 캐리어 평평한 표면 아래로 샘플을 커버.
주 : 시편 홀더가 건조하고 상온에서해야한다. - 시편 홀더에 샘플을 받아 컴퓨터에 삽입하고 1 ~ 2 초에 완료해야합니다 "JET의 AUTO"버튼을 눌러 냉동 사이클을 시작합니다.
- 가능한 한 빨리 작업 기계에서 홀더를 제거하고 SAMP를 들고 팁을 배치르 HPF 기계의 상단에 절연 상자에 액체 질소로. 그들을 진정 액체 질소에 집게 이쌍의 끝을 담가.
참고 : 동결 후, 항공사는 단 액체 질소 냉각 집게로 처리해야합니다. 따뜻한 (실온) 집게는 종종 cryotechniques에서 실패의 원인입니다. - FS 매체를 포함하는 cryovial를 열고 상자의 측면에 뚜껑을 배치합니다. 액체 질소 냉각 포셉 쌍의 도움으로 부드럽게 디스크가 액체 질소 또는 증기 항상되도록, 시험편 홀더로부터 디스크를 제거. 액체 질소 증기에서 작업 한 사전 냉각 집게 FS 튜브를 잡고 FS 유리 병에 홀더를 배치하는 다른를 사용합니다. 뒷면에있는 FS 유리 병의 뚜껑을 나사. 하지 함정을 유리 병에 액체 질소를 수행합니다.
참고 : QFS에 대한 cryovials에는 액체 질소가 유리 병에 갇혀되지 않도록하기 위해 샘플을 전송. 액체 질소는 온난화와 어떤 trappe 동안 700 배 확대D 액체 질소는이 기간 동안 폭발의 원인이 될 수 있습니다. - 원하는 모든 샘플이 고정 될 때까지 반복 3.7에 3.1 단계를 반복합니다. 샘플의 동일한 유형을 포함하는 다수의 리프 디스크는 동일한 병에 배치 될 수있다. 시편 홀더 건조 및 동결 실행 사이 실내 온도에 가져해야합니다. 신속하게이 작업을 수행하려면, 타격 드라이어로 가열하고, 터치에 의해 그 온도를 모니터링 할 수 있습니다.
프리즈 교체를위한 준비 (4)
- 10 분 동안 완전하게 핵 비등 또는 정지 될 때까지 액체 질소에서 알루미늄 히터 블록 젖어. 이 일이 벌어지고있는 동안, FS 챔버 (그림 3)로 사용되는 용기의 바닥에 드라이 아이스 (1-2 ㎝)의 층을 배치합니다. 스티로폼 용기 또는 얼음 양동이 짓 눌린 드라이 아이스 펠렛 (pellet)와 함께 FS 사용할 수 있습니다.
- 신속 히터 블록의 중간 행에 온도 프로브와 함께 샘플을 함유 cryovials 삽입. 반드시 그의 뚜껑FS 미디어 FS 중에 누출되지 않도록 병 나사로 단단히 조여된다. 온도를 기록 시작합니다.
- 이 튜브의 바닥에 닿을 수 있도록 cryovial의 상단을 통해 열전대를 배치하여 온도 프로브를 확인. 수지 튜브의 뚜껑을되도록 액체가 밖으로 누출 봉쇄. 각 QFS 실행의 시작 부분에 1.5 ㎖의 아세톤 튜브를 입력합니다.
- 절연 cryogloves 또는 큰 집게를 사용하여, 히터 블록으로부터 모든 액체 질소를 부어. cryovials을 부어 않도록주의하십시오.
주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. - QFS 챔버에서 드라이 아이스 층 상 튜브를 함유하는 블록을 놓는다. 블록은 튜브가 수평으로 누워되도록 배치하지만, 약간 위쪽으로 기울기되어 있는지 확인합니다. 올바른 cryovials를 사용하는 경우 누설이 없어야합니다.
- FS 튜브가 적용되도록 그것을 할 필요가 없습니다 만, 드라이 아이스와 함께 QFS 챔버 팩블록의 상단을 포함한다. 챔버의 뚜껑을 놓습니다.
5 빠른 FS
참고 : OSO 4의 누설이 실수로 다른 예방 조치에도 불구하고 발생하는 이벤트에 흄 후드에서 QFS 실행을 수행합니다.
- 흄 후드 플랫폼 회전 진탕 QFS 챔버를 놓고 120 분 동안 125 rpm으로 회전합니다. 이 때 블록의 온도는 약 -80 ° C로 서서히 증가한다. 교반 더 나은 FS에 대한 구성 요소의 혼합을 보장합니다.
참고 : 흄 후드에서 통하고 흄 후드 도어의 위치의 배치는 QFS 절차를 통해 샘플의 일관된 온난화를 확인하기 위해 실행할 때마다 QFS에 대해 동일해야합니다. - 챔버에서 드라이 아이스를 제거하고 다른 시간 진탕 계속합니다.
참고 : 온도가 -15 ° C에서 -20 ° C로 증가 할 전망이다. - QFS 실에서 샘플 및 온도 프로브를 제거하고에 배치또 10 ~ 15 분 동안 실온에서 진탕, 때까지 실온에 도달한다. 온도 기록을 중지합니다.
- FS 동안, HPF 기계의 전원을 끄십시오.
- HPF 기계 질소로 충전되는 동안, 액체 질소 탱크의 수돗물습니다.
- "질소"버튼을 누릅니다.
- 빨간색 "PISTON DOWN"빛이 소멸 될 때까지 기다립니다.
- "ON / OFF"버튼을 누릅니다.
- 눌러 "SYSTEM DRY UP"버튼을 누릅니다.
- 기계에 압축 공기의 공급을 차단.
- 12 시간의 최소 후 (습기의 건조를 보장하는) "0"에서 "1"부터 메인 스위치를 켜서 시스템을 해제.
6 포스트 FS 처리
- 조심스럽게 유독성 폐기물에 대한 적절한 용기에 플라스틱 전송 피펫과 장소 FS의 용지를 제거합니다.
NOTE : OSO 4 및 우라 닐 아세테이트는 위험한 화학 물질폐쇄 발가락 신발, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 한 상태와 흄 후드에서 처리되어야한다. - 워시 샘플 100 % 아세톤 네 번. 처음 두 세척을 수집하고 유독성 폐기물 용기에 넣습니다.
- 미세 핀셋을 사용하여, 홀더로부터 조직 샘플을 제거한다. 이 작업이 완료 될 때 아세톤으로 젖은 샘플을 유지하고 파괴 샘플을 피하기 위해 매우 조심스럽게 작동합니다.
참고 : 그것은 드문 일이 아니다 그것은 실제로 효모 붙여 넣기이 시점에서 멀리 샘플에서 가을이 유용 할 수 있습니다. 잎 조직은 여전히 녹색 동안 효모 페이스트는 일반적으로 매우 어두운 갈색이다. - 아세톤을 함유 cryovials에서 샘플을 수집합니다. 일반적인 프로토콜에 따라 TEM에 대한 샘플 준비 (침투 및 포함)를 진행합니다.
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Representative Results
아래에 제시 결과 HPF에 대한 Wohlwend 소형 02 (그림 1A)를 사용하여 얻어졌다. 이 기기의 하나의 중요한 이점은 표본 담체 및 그 소유자의 사용의 용이함이다. 다른기구를 사용할 때, 맥도날드 두 사용자가 다른 동결을 수행하고 FS에 전송 9 cryovials 동안 샘플을 준비하는 샘플 준비 및 HPF 번을 수행 할 것을 권장한다. 그러나 Wohlwend 캐리어 홀더가 단일 사용자가 독립적으로 (도 2A, B, E, F 및 G)를 조작하기에 충분한 쉽다 견본. 그것은 하나의 몇 가지 시험을 수행해야하지만 언급 가치있는 샘플을 사용하기 전에 HPF 악기에 익숙해 실행해야합니다. 숙련 된 사용자는 시간에 (10 이상) 몇 가지 샘플을 고정 할 수 있어야한다. 그러나,이 프로토콜에 제시된 원리들은 시판 HPF 기계 중 하나로 사용될 수있다.
아마도HPF-QFS 절차의 가장 중요한 부분은 표본 담체 (도 2C)로로드하기위한 샘플 준비이다. 이 직관적하지 않을 수 있지만, 대부분의 연구자가 제어 할 수있는 프로토콜을 통해 공정이다. HPF 기계는 강력하고 적절한 사용 및 유지 보수와 샘플 사이의 작은 변형 압력과 온도에서 예상되는 변화를 생성해야한다. 샘플을 제대로 준비하는 동안 처리되는 경우, 다른 단계는 너무 피해를 구속하지 않습니다. 그들은 배지에서 배양 아니며 그들의 셀 벽 세포 좋은 힘을 줄로 식물 조직은 프로세스의이 단계에서 조작하기 매우 쉽다. 그것은 샘플 부모 식물에서 분리 결과 미세 변화를 피하기 위해, 스트레스 및 상처 반응을 제한하기 위해 신속하게 처리되도록 불구 중요하다. 샘플을 수용 할 수있는 가장 작은 표본 담체도 (HPF 효율적이고 일관성을 보장하기 위해 사용되어야우레의 2C). 마지막으로, 시료 담체가 충전되지만 (도 2d)를 범람되지 않을 것이다. 가득 시편 캐리어는 쉽게 (그림 2 H와 I)을 동결하기위한 HPF 기계에 삽입됩니다.
QFS 프로토콜의 첫 번째 단계는 초보자를위한 도전이 될 수 있으므로 사용자가 절차 (그림 3A-E)에 익숙해 질 때까지 두 사람이 함께 작업하는 것이 좋습니다. 액체 질소 고정 제의 산화 오스뮴 및 우라 닐 아세테이트를 취급 할 경우주의가 항상주의를 기울여야한다. QFS 동안의 온도 변화에 대한 전형적인 곡선은 그림 2J에 표시됩니다. 약 -80 ° C로 급속 -196 ° C, 액체 질소의 온도로부터 온도 증가. 그것은 동결 대체가 구를 발생하는 것으로 생각됩니다 약 -78 ° C -90 ° C의 온도에서이다. QFS 프로토콜에 하나의 도전 단계 FS 2 시간 후에 드라이 아이스를 제거하는 것이다. 에서이 단계는 샘플을 잘못 취급하면 온도에 스파이크를 생성 할 수 있습니다. 이를 위해, 히터 블록은 신속 신속 보조 용기에 부어 cryoglove 및 드라이 아이스를 사용 QFS 챔버 밖으로 상승한다.
HPF는 Nicotiana benthamiana의 잎과 애기 장대 잎과 배아 등 다양한 식물 조직을 고정하는 데 사용되었습니다. 이 때문에 대부분의 세포의 대형 중앙 액포에 성숙한 잎에서 샘플을 해결하기 위해 도전합니다. 어린 잎은 작은 액포를 포함하지만, 상체 (trichome)는 일반적으로 매우 조밀하고 있습니다. 상체 (trichome)의 존재가 곤란 효모 페이스트 샘플을 포장 할 수 있도록하지만, 이것은 적절히 잎 표면과 페이스트 사이에 갇힌 공기의 양을 최소화하기 위해 수행되는 것을 보장하기 위해주의해야 상관있다. 갇힌 공기는 HPF 동안 열 전달을 방해하고 정착의 질을 감소시킬 것이다. 이 모든 샘플에 대한 사실입니다.
HPF와 QFS 샘플은 VI를 준비 할 수있다 후에침투 및 수지를 삽입하여 TEM에서 유잉. 65-100 나노 미터의 얇은 섹션은 다음 단면에 의해 제조 될 수있다. 전형적인 결과는 그림 4에 나타내었다. 표시된 이미지는 애기 장대 잎 샘플에서 모든입니다. 원형질막 일반적 부드럽고 세포벽에 대해 가압되어, 양호한 정착의 기호 (도 4a, C 및 E). 엽록체 (그림 4A, D, F 및 H) 및 틸라코이드 (그림 4B), 미토콘드리아 (그림 4D와 F), 골지체 (그림 4 G), 미세 소관 (그림 4E)와 리보솜 (특히 그림 4C)를 포함한 다른 세포 기관도 있습니다 명확하게 볼 및 대형 중앙 액포는 그대로 (그림 4A) 남아있다. 얼음 결정에 의한 손상 (그림 4D) 및 plasmolysis (그림 4H)을 포함하여 유물의 HPF-QFS 결과 중 불량 처리. 리드 침전물은 또한 섹션의 염색하는 동안 형성 할 수있다의 (그림 4 층).
도 1 : 02 Wohlwend 소형 고압 냉동고 (A) 연결된 컴퓨터 단말과 cryofixation 사용 Wohlwend 컴팩트 02 HPF 기계.. 시료는 냉동 시스템 (작은 원)의 앞에 삽입된다. 사용자가 원하는 온도 곡선은, 각각의 실행에 대해 컴퓨터 스크린 상에 생성 될 수있다. (B) HPF 실행을위한 일반적인 온도 - 압력 곡선. 노란색 및 보라색 라인은 각각, 온도 및 압력을 나타낸다. 두 곡선의 가파른 슬로프를합니다. 높은 압력은 약 400 밀리 초 동안 유지된다. x 축상의 각 간격은 50 밀리 초를 나타낸다. 데이터는 DSIM12 소프트웨어 EasyScopeII으로 수집 하였다. (C) 절연 상자와 커버가 저장 O를 사용즉시 동결 후 F 냉동 샘플을 편리하게 상단 HPF 시스템에 배치 할 수 있습니다. 이 액체 질소로 채워집니다. 라운드 알루미늄 용기는 cryovials를 개최합니다.
그림 2 : HPF를위한 준비 조직 샘플. (A)는 폐쇄 구조의 컴팩트 02 HPF 기용 시험편 홀더. (B) 표본 홀더가 개방된다. (C) 형 시험편 캐리어 0.2 mm 웰에서 리프 샘플. 이 캐리어의 다른 측면은 0.1 mm 깊이이다. (D) 효모 붙여 넣기 덮여 잎 샘플. 캐리어가 가득하지만 넘치는 아닙니다. (E) 시편 홀더에 시료 캐리어. (F) 샘플은 B 형 캐리어 덮여있다. 이 캐리어는 하나의 평평한 표면과 다른 쪽을 잘 갖는다0.3 mm 깊이이다. 여기에 평평한 표면을 샌드위치에 사용되는 샘플입니다. (G) 샘플 홀더가 HPF 기계에 삽입 폐쇄 준비되어 있습니다. (H) HPF 기기의 전면에있는 구멍 시편 홀더 동결에 삽입되기에 HPF 기계에 삽입. (I)의 압력과 온도 프로브 / 홀더. (J) QFS 실행을위한 일반적인 온도 곡선 (EasyLog 소프트웨어가 수집 된 데이터). 온도는 각 초를 기록했다. 프로브의 전자 제품 사용 및 실제 온도 측정을 반영하지 않습니다에 실행의 시작 부분에 스파이크 때문이다.
도 3 :. QFS 사용 장비 QFS 그러한 스티로폼 박스 또는 얼음 통 어떠한 단열 용기에서 수행 될 수있다 (A)를 <./ strong>을 드라이 아이스 1-2센티미터의 깊은 층은 여기 QFS 실의 바닥, 스티로폼 상자를 포함한다. (B) 13mm 구멍 히터 블록은 QFS 동안 집에 샘플로 사용됩니다. 디지털 데이터 로거와 온도 탐침이 히터 블록에 배치된다. (C) 샘플 블록에 배치되어, 액체 질소에 히터 블록을 냉각 한 후, 액체 질소를 부어되며, 전체 어셈블리는 QFS 챔버 내에 배치 . 드라이 아이스 (D)와 QFS 챔버는 샘플이 포함되어 있습니다 그래서 드라이 아이스로 가득; 드라이 아이스와 히터 블록 전체를 덮는 아무런 문제점이 없다. (E) 박스 커버하고 샘플 QFS 과정에 걸쳐 교반되는 흄 후드에서 회전식 진탕 기 상으로 이동된다.
그림4 :.. 애기 장대는 HPF-QFS에 의해 제조 잎 자이스 천칭 자리 200 HT FE MC에 TEM에 의해 HPF-QFS에 의해 제조 군데 샘플 얻은 결과 (A) 세포벽과 엽록체 (CH)를 보여주는 매체 높은 배율의 이미지와 인접한 세포의 세포질. 액포 (V)의 전자 밀도 물질이 포함되어 있습니다. 스케일 바 엽록체의 = 0.5 μm의. (B) 높은 배율의 이미지입니다. 스케일 바 = 100 nm의. (C) 인접 셀 간의 칸막이 벽의 고배율 이미지. 분기 plasmodesma 볼 (화살표)입니다. 액포에 의해 칸막이 벽에 가압 평활 원형질막을 참고. 세포질 밀도가 리보솜들이 즐비합니다. V는 공포이다. tonoplast 부드럽고 연속이다. 스케일 바 = 200 nm의. (D) 얼음 손상 (별표) 지역 근처의 엽록체 (CH)에 잘 고정 영역을 표시 낮은 배율 이미지. 스케일 바 = 0.5 μm의. (E) 셀 월마트의 고배율보기리터와 미세 소관. 엽록체 (CH)과 미토콘드리아 (M)의 좋은 보존을 보여주는 스케일 바 = 100 nm의. (F) 이미지. 큰 검은 침전물을 리드 구연산과 부분 염색에서입니다. 스케일 바 = 1 μm의. 골지 (GA)의 (G) 고배율보기. 스케일 바 = 200 nm의. (H)는 저조한 엽록체와 plasmolysis (검은 색 화살표)에서 세부 사항의 부족을 보여주는 샘플을 보존. 스케일 바 = 1 μm의.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜의 성공은 사용자에 크게 의존한다. 첫째, 고급 준비가 필요한 모든 재료가 쉽게 사용할 수 전체 HPF-QFS 실행을 완료 할 수있는 충분한 양에 있는지 확인해야합니다. 둘째, 따라서 사용자는 조직의 고유 상태의 변경을 최소화 시료 처리를 최소화하는 효율적인 방식으로 공정 간 이동 단계에서 신속하게 작동한다. 샘플은 동결하고 탈수되기 전에주의를 실수로 예를 들어, 샘플을 가열 할 수있는 모든 처리를하지 않도록주의해야합니다 그래서 장갑을 낀 손 대신 사전 냉각 집게로 처리, 그들은 차가운 유지하는 것이 필수적입니다되면. 속도와 프로토콜에 익숙한 효율 증가, 그래서 실제로 실행은 관심의 하나의 샘플을 수정하기 전에하는 것이 좋습니다. 셋째, 사용자는 FS 매체뿐만 아니라, 액체 질소와 드라이 아이스 작업의 위험에 사용되는 화학 물질의 위험에주의를 유지해야. 흄 후드는 FS 매체의 제조 및 QFS 절차 필요하다. 다른 모든 단계는, 장갑, 실험실 코트를 포함하여 필요한 개인 보호 장비, 폐쇄 - 발가락 신발과 고글을 사용하는 것이 좋습니다.
식물, TEM을 위해 샘플을 준비 포함 실온에서 화학 대신 cryofixation 고정 제를 사용하는 장점은, 긴 10 알려져있다. HPF 또는 화학 물질 고정 제에 의해 고정 Nicotiana 및 애기 장대의 뿌리 끝의 미세 구조를 비교 한 연구는 HPF-FS 방법이 훨씬 우수한 결과 5를 준 것으로 나타났습니다. HPF-FS하여 제조 조직 plasmalemma 다른 세포막은 plasmalemma는 셀 벽에 플러시이었다 매끄러운으며, 일반적으로 포함 소기관 미세 소관은 샘플이 더 통상적 인 방법에 의해 고정되었을 때보다 잘 보존되었다. 콩의 뿌리혹의 또 다른 연구는 버퍼 글루 타르 알데히드에 의해 그 "화학 고정을 체결구조와 기능.의 상관 관계를 허용하는 상태에서 대두 루트 결절의 미세 구조를 보존하지 않습니다 "그리고 그것은 사용할 수있는 유일한 대안 HPF-FS 인 말을 계속 2. plasmodesmata를 자신의 이웃에게 식물 세포를 연결하는 막 - 결합 채널이지만, 그 하부에도 TEM하에 해결하는 것은 곤란하다. HPF하거나 FS 다음 프로판 제트 냉동고 Cryofixation는 plasmodesmal 구조 (18)의 미세한 세부 사항을 해명하기위한 연구에서 화학 고정을 통해 선택되었다. 이러한 초기 연구 결과에도 불구하고, 통상적으로 고정 된 조직에 TEM 연구는 여전히 식물 과학 분야의 표준입니다. 이는 전통적인 방법 또는 현재 사용 FS 프로토콜에 대한 긴 예비 시간에 결합 HPF-FS 장비 겉으로는 엄청난 비용에 대한 간단한 준수에있을 수 있습니다.
QFS 절차는 15 일에 대한 TEM 시료 전처리를 최대 속도에서의 최근의 혁신이다. QFS는있다C. 전체를 준비하는 데 사용 엘레 및 N. benthamiana는 cryofixation 15 후 나뭇잎. 이들은 HPF에 의해 고정되는 비교적 두꺼운 샘플이며, HPF-FS 의해 Nicotiana 샘플의 제조는 전통적 회 12, 13, 14 매우 긴 FS를 사용하고있다. 이 프로토콜을 위해 우리는 모델 식물 애기 장대에서 잎을 사용했다. Nicotiana 및 기타 식물 시료 FS 긴 시간에 대한 근거는 용매와 물의 교환 가능성 세포의 큰 액포가 저하 될 것이라는 점이다. 그러나, 잘 고정 된 샘플의 실투가 세포에 최소한의 손상을 초래할 것이 예상된다 (15 및 심판. 내부). 얼음 피해가 발생하는 경우가 대부분 동결 자체가 아닌 QFS에 의해 발생합니다. FS에 대한 더 짧은 프로토콜 15을보고되었다. 이 슈퍼 빠른 FS (SQFS)는 FS 만 90 분을 사용합니다. 이 프로토콜에서, 히터 블록 내의 샘플을 건조 I의 부재하에 100 rpm으로 회전된다SQFS 실을 포함하지 않고 CE. 이 샘플은 -80 ° 빠르게 C에 도달 할 수 있습니다. 샘플은 히터 블록에서 제거 및 로커에 실온에 도달하도록 허용된다. SQFS 성공적으로 문화와 E.에서 자란 세포를 탈수하는 데 사용되었습니다 대장균 세포. 아직 의한 식물 조직의 두께로 식물 샘플 SQFS를 사용하려고 시도하지 않았다.
cryofixing 다음 직렬 HPF와 QFS에 의해 식물 샘플을 탈수 프로토콜은 현재의 프로토콜을 통해 상당한 개선을 나타냅니다. 수지 침투하기 전에 샘플 준비 시간은 이제 대신 며칠의 몇 시간으로 감소된다. QFS 방법 (15)를 개발하는 것 외에도, 맥도날드는 최근 19 드라이 아이스없이 수지 SQFS 다음과 식물 조직의 빠른 침투를위한 프로토콜을 발표 하였다. 식물 조직은 일반적으로 천천히 하룻밤을 포함한 여러 장기 배양 물에 의해 수지로 침투한다. 이 새로운 프로토단면에 냉동에서 6 시간 : COLS도 짧은 샘플 처리 시간을 초래. 따라서 향후, HPF-QFS 신속한 침윤 조합 TEM 용 식물 표본 준비를위한 현재의 프로토콜을 대체한다. QFS 상업용 키트 (http://www.emsdiasum.com) 전자 현미경을 통해 현재 이용 가능한 과학이지만 또한 QFS 절차는 저렴하고 다양한 용도로 사용할 수있는 공통의 실험실 장비를 사용한다. 두 옵션 중 하나 이상 잘 5만달러 비용 수있는 전용 동결 대체 장치를 구입하는 비용에 비해 엄청난 절감 효과를 나타냅니다.
이것은 HPF 의해 제조 샘플의 애플리케이션 및 FS 루틴 TEM 분석을 넘어 확장 주목해야한다. 이러한 방식으로 제조 된 샘플은 자신의 항원 성을 유지하므로 immunogold 라벨링 17, 19를 포함하여, 항체 - 기반 접근법에서 사용될 수있다. 이들 샘플은 또한 향상된 입체 구조 해석을 위해 사용될 수있다전자 단층 촬영 (20)를 통해. HPF-FS 샘플에도 상호 광 및 EM (21, 22)와 함께 사용될 수있다. 따라서, cryofixing 다음 탈수 샘플은 다양한 시스템에서 작업하는 연구자의 다양한에 도움이 될 것입니다 절차 개선을 계속했다.
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Acknowledgments
UC 버클리 박사 켄트 맥도날드의 친절과 관용이 크게 감사합니다. 우리는 매우 유용한 제안에 대한 익명의 검토를 부탁드립니다. 버치 스미스 연구소는 테네시 대학에서 창업 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
