Abstract
Uma vez que a microscopia eletrônica de transmissão de 1940 (TEM) tem vindo a fornecer os biólogos com imagens ultra-alta resolução de materiais biológicos. No entanto, por causa de protocolos trabalhosas e demoradas, que também exigem experiência na preparação de amostras, sem efeitos artificiais, TEM não é considerado uma técnica de fácil utilização. Preparação de amostras para TEM tradicional usado fixadores químicos para preservar estruturas celulares. Congelamento de alta pressão é o criofixação de amostras biológicas sob pressões elevadas para produzir velocidades de arrefecimento muito rápido, restringindo, assim, a formação de gelo, o que é prejudicial para a integridade da ultra-estrutura celular. Congelamento de alta pressão e congelamento de substituição é o método de escolha para produzir a morfologia mais alta qualidade em seções de resina para TEM. Estes métodos minimizar os artefatos normalmente associadas com o processamento convencional para TEM de seções finas. Após criofixação a água congelada nas amostras é substituído por líquidosolvente orgânico a temperaturas baixas, de um processo chamado de substituição congelamento. Substituição por congelação é tipicamente levada a cabo ao longo de vários dias em dedicado, equipamento dispendioso. Uma inovação recente permite que o processo seja concluído em três horas, em vez dos habituais dois dias. Isso normalmente é seguida por vários dias de preparação da amostra, que inclui infiltração e inclusão em resinas epóxi antes do corte. Aqui apresentamos um protocolo que combina congelamento de alta pressão e rápida substituição de congelamento que permite fixação amostra da planta a ser realizado em poucas horas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para trabalhar com outros tecidos ou organismos. Tecidos de plantas são de interesse especial devido à presença de espaços gaseificadas e vacúolos cheios de água, que possam impedir o congelamento livre de gelo de água. Além disso, o processo de fixação química é especialmente longa em plantas devido às paredes celulares que impedem a penetração dos produtos químicos para dentro dos tecidos profundos. Tecidos de plantas são, por conseguinte, particcularmente difícil, mas este protocolo é confiável e produz amostras de alta qualidade.
Introduction
Nosso conhecimento da ultra-estrutura celular vem principalmente de microscopia eletrônica, que pode resolver detalhes da ordem de alguns nanômetros 1. Apesar de ser tão poderosa na resolução TEM não é considerado user-friendly, como a preparação da amostra requer protocolos laboriosos demorado e, e exige algum conhecimento do praticante. Fixação tradicional das amostras foi combinado o uso de aldeídos e tetróxido de ósmio antes de processamento adicional, que inclui a desidratação, a incorporação em resina e, em seguida, o corte para produzir cortes ultra-finos que são depois coradas com metais pesados. No entanto, é sabido que a fixação química pode produzir artefactos, incluindo a agregação da proteína e a perda de lípidos 1, e muda-se para membranas que, em última instância afectam vários compartimentos celulares 2. Esses artefatos são em grande parte atribuída à baixa taxa de fixação e desidratação à temperatura ambiente 3, 4, 5.
6, 7. HPF diminui um temperatura da amostra com a de azoto líquido, sob uma pressão muito elevada (210 MPa ou 2100 bar), em milissegundos. Quando feito corretamente HPF impede a formação de grandes cristais de gelo que podem causar grandes danos à ultra-estrutura celular. HPF pode ser utilizado para fixar as amostras de espessura de 100-200 uM para concentrações típicas de solutos biológicos 7. Existem inúmeros comentários sobre a física e os princípios subjacentes HPF, por exemplo, 1, 7, 8.
Após HPF, as amostras são incubadas a uma temperatura baixa (-78,5 ° C a -90 &# 176; C) na presença de solventes orgânicos líquidos contendo fixadores químicos como o tetróxido de ósmio, geralmente durante alguns dias. A esta temperatura baixa, a água na amostra é substituída pelo solvente orgânico, tipicamente acetona ou metanol a 1, 9. Assim, este processo é chamado de substituição congelamento (FS). A amostra é, em seguida, aqueceu-se gradualmente e, durante esse tempo é fixo, geralmente com tetróxido de ósmio e acetato de uranilo 9. A reticulação a baixas temperaturas tem a vantagem de fixar moléculas que são imobilizadas 1. FS, por conseguinte, produz amostras de qualidade superior em comparação com as fixadas por fixação química convencional à temperatura ambiente, em particular, que resulta em melhor preservação ultraestrutural, melhor preservação da antigenicidade e perda de componentes celulares não ligadas 10, 11 reduzida.
A maioria dos FS é realizada durante períodos de tempo longos, tipicamente até vários dias. Isto é particularmente true para as plantas amostras 12, 13, 14. Um protocolo recente desenvolvido por McDonald e Webb reduz grandemente o tempo de FS de alguns dias a algumas horas e 15. Em seu procedimento rápido congelamento de substituição (QFS), FS é realizada ao longo de 3 horas, enquanto nos FS super-rápidas (SQFS) amostras são processadas em 90 minutos. A qualidade das amostras produzidas por estes métodos é comparável aos produzidos por protocolos tradicionais FS. Adotamos o protocolo QFS para processamento posterior de amostras de plantas depois de HPF. Isto tem provado para salvar não apenas tempo, mas também dinheiro, como QFS e SQFS usar equipamentos de laboratório comum, em vez das caras máquinas FS disponíveis no mercado.
Tecidos vegetais são frequentemente muito difícil de se preparar para TEM. Em média, as células vegetais são maiores do que a utilização de células bacterianas ou animais. A presença da cutícula cerosa hidrofóbico, paredes celulares espessas, de grandes vacúolos cheios de água contendo ácidos orgânicos, hidrolases e fenólico compounds que podem ocupar cerca de 90% do volume total da célula 16, e a presença de espaços gaseificadas diminui severamente a condutividade de calor do sistema 17. Além disso, no caso de plantas, a espessura da amostra quase sempre superior a 20 um, o limite para a utilização da fixação química. A estas espessuras, a baixa condutividade térmica da água impede uma taxa de congelamento mais de -10.000 ° C / s no centro da amostra. Essa taxa é necessária para evitar a formação de gelo hexagonal prejudicial (cristais de gelo com uma menor densidade e maior do que 10 a 15 nm) 8. Juntos, estes apresentam desafios para ambos congelação adequada da amostra e FS subsequentes. No entanto, criofixação é o melhor método para a fixação de amostras de plantas. Aqui, um protocolo de HPF-QFS de amostras de tecido de plantas é apresentada. Centra-se na Arabidopsis thaliana espécies modelo, mas também tem sido usado com Nicotiana benthamiana. Os resultados demonstram que os típicos HPF-QFS produz samples de qualidade comparável às tradicionais HPF-FS em uma fração do tempo. Com ajustes apropriados, este protocolo pode também ser utilizado para outras amostras biológicas relativamente espessas.
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Protocol
NOTA: O procedimento QFS requer extremo cuidado e cautela por parte do utilizador e destacamos estas precauções de segurança aqui como Precauções e Notas, onde aplicáveis.
1.Preparation para HPF Run
- Antes de iniciar a preparação da amostra, ligar o congelador de alta pressão, seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: A unidade HPF utilizado neste protocolo é um Wohlwend Compact 02 unidade (Figura 1A), e leva cerca de uma a uma hora e meia de procedimento de inicialização antes HPF funciona pode começar.- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
- Ligue o instrumento, girando a chave principal de "0" para "1".
- Solte o ar comprimido para a máquina.
- Libertar azoto líquido para a máquina.
- Pressione o botão "SYSTEM secar".
- Após 30 minutos, pressione o botão "SYSTEM botão novamente secar ".
- Pressione o botão "ON / OFF" para ligar o instrumento.
- Pressione o botão "NITROGENADA".
- Deixe a máquina esfriar por 20 minutos, mesmo que o "drive in" botão já se iluminou.
- O "drive in" botão acende-se.
- Pressione o "drive in" botão.
- Pressione o botão "AUTO".
- O "sistema de READY" botão acende-se.
- Colocar a sonda de temperatura e pressão na câmara de pressão e bloqueá-lo com o pino.
- Pressione o botão "JATO AUTO". Este passo verifica se o aumento de pressão e diminuição da temperatura são como desejado; essencialmente um ensaio. Quedas acentuadas de temperatura e fortes aumentos na pressão são esperados (Figura 1B).
- Realizar mais dois ciclos do JET.
- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
2 Preparação para ReceiviAmostras congeladas ng
- Encha uma caixa térmica contendo titulares cryovial com nitrogênio líquido (ver Advertências de segurança), de modo que os titulares estão completamente cobertos (Figura 1C).
NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. - Inserir o número apropriado de frascos contendo o meio de FS dentro dos suportes de tubos de alumínio em azoto líquido (Figura 1C). Com este protocolo de até quatro discos, contendo cada um uma única amostra pode ser colocada num frasco de congelação.
NOTA: Os frascos devem ser rotulados com um instrumento afiado como um escriba com ponta de diamante e lápis muito macio.- Para fixador durante QFS usar 1% OsO 4 e 0,1% acetato de uranila em acetona 9. Preparar a solução em grande volume, dispensar alíquotas de 1,5 ml em criotubos e armazenamento congeladas em azoto líquido.
NOTA: Siga Avisos de segurança para lidar com OsO 4 e acetato de uranila.
NOTA: OSO4 NOTA: As criotubos utilizados para conter amostras para QFS deve ter um anel de vedação de disco para assegurar que os tubos de permanecer selada durante QFS para evitar fugas de OsO4.
- Para fixador durante QFS usar 1% OsO 4 e 0,1% acetato de uranila em acetona 9. Preparar a solução em grande volume, dispensar alíquotas de 1,5 ml em criotubos e armazenamento congeladas em azoto líquido.
- Prepare levedura pasta misturando fermento de padeiro com um volume aproximadamente igual de 10% de metanol com um palito ou outro instrumento até que a massa esteja lisa. A pasta de levedura actua como um agente crioprotector extracelular e é utilizado para preencher o espaço em torno da amostra no suporte de amostras. A quantidade de pasta depende do número de amostras; para 10 amostras ou menos o colar (1 ml) pode ser misturado em um tubo de microcentrífuga.
Congelamento 3 de alta pressão de Amostras
- Remover uma folha (ou outro tecido) de interesse a partir da planta e gentilmente colocá-lo em um pedaço de dental cera ou outra superfície de corte. Usar um perfurador de 2,0 mm ou tamanho desejado para cortar uma amostra para fora da folha. Pega da amostra suavemente com um par de pinças e trabalhar tão rapidamente quanto possível.
- Trabalhando sob um microscópio de dissecação, coloque o disco de folha no lado de 0.2 mm de Tipo A transportadora amostra e cobrir completamente em levedura colar. Certifique-se de que o disco está completamente cheia e a pasta está nivelada com o bordo do suporte, por meio de alisamento para a pasta com um pincel fino (Figura 2).
- Inserir o suporte, por o suporte da amostra. Cobrir a amostra com o porta-espécime do tipo B, a superfície plana voltada para baixo.
NOTA: O suporte de amostra deve ser seco e em temperatura ambiente. - Tome amostra no porta amostra, insira-o em máquina e iniciar um ciclo de congelamento, pressionando o botão "JATO AUTO", que deve ser concluída em um ou dois segundos.
- Trabalhando tão rapidamente quanto possível, remover o suporte da máquina e coloca o bico prende o SAMPle em azoto líquido na caixa térmica na parte superior da máquina HPF. Mergulhe as pontas dos dois pares de fórceps no nitrogênio líquido para refrigerar-los.
NOTA: Após o congelamento, as operadoras só devem ser manipulados com pinças refrigerado a nitrogênio líquido. Quentes (temperatura ambiente) fórceps são muitas vezes a causa da falha em técnicas de criofixação. - Abrir um criotubo contendo os meios FS, e colocar a tampa no lado da caixa. Com o auxílio de uma pinça refrigerados a nitrogênio líquido, retire delicadamente o disco do suporte da amostra, garantindo que o disco está sempre em nitrogênio líquido ou vapor. Trabalhando no vapor de nitrogênio líquido, mantenha o tubo FS com um fórceps pré-resfriado e use a outra para colocar o suporte do frasco FS. Feche a tampa do frasco FS novamente. Não qualquer armadilha de azoto líquido no recipiente.
NOTA: Ao transferir as amostras para criotubos para QFS, garantir que nenhum nitrogênio líquido é preso nos frascos. O nitrogênio líquido se expande 700 vezes durante o aquecimento e qualquer Trapped nitrogênio líquido pode causar explosões durante este tempo. - Repita os passos 3.1 a 3.7 até que todas as amostras desejados estão congeladas. Vários discos foliares contendo o mesmo tipo de amostra pode ser colocada no mesmo frasco. Note-se que o suporte da amostra deve ser seca e levada até à temperatura ambiente entre os funcionamentos de congelamento. Para fazer isso rapidamente, aquecê-lo com um secador de cabelo, e monitorar sua temperatura pelo toque.
4 Preparação para Freeze Substituição
- Imergir completamente o bloco aquecedor de alumínio em azoto líquido durante 10 minutos ou até cessar ebulição nucleada. Enquanto isto acontece, colocar uma camada de gelo seco (1-2 cm) no fundo do recipiente utilizado como câmara de FS (Figura 3). Um recipiente de isopor ou balde de gelo pode ser utilizado para o FS, juntamente com gelo seco ou grânulos esmagados.
- Insira rapidamente os criotubos contendo as amostras, juntamente com a sonda de temperatura nas fileiras do meio do bloco aquecedor. Certifique-se de que as tampas dofrascos são firmemente aparafusado para que a mídia FS não vazar durante FS. Começar o registo da temperatura.
- Fazer a sonda de temperatura, colocando um termopar através da parte superior de um frasco de congelação de modo a que ele atinge o fundo do tubo. Selar a tampa do tubo com a resina de modo a que não há fugas de líquido para fora. Encher o tubo com 1,5 ml de acetona, no início de cada ciclo de QFS.
- Usando cryogloves isolados ou grandes pinças, derramar todo o nitrogênio líquido a partir do bloco de aquecimento. Tome cuidado para não derramar as criotubos.
NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. - Colocar o bloco contendo os frascos sobre a camada de gelo seco na câmara QFS. Certifique-se de que o bloco é colocado de modo que os tubos são deitado na horizontal, mas com uma ligeira inclinação para cima. Não deve haver nenhum vazamento se os criotubos corretos são utilizados.
- Embalar a câmara QFS com gelo seco, para que os tubos são cobertos FS, embora não seja necessáriocobrir o topo do bloco. Coloque a tampa da câmara.
5. rápida FS
NOTA: Execute o QFS corrida em um exaustor no caso de qualquer vazamento de OSO4 ocorre inadvertidamente apesar de outras precauções.
- Coloque câmara QFS num agitador rotativo plataforma em um exaustor e rodar a 125 rpm para 120 min. Durante este tempo a temperatura do bloco deve aumentar gradualmente até cerca de -80 ° C. A agitação assegura a mistura dos componentes para uma melhor FS.
NOTA: O posicionamento do agitador no exaustor de fumos e a posição do porta hotte deve ser o mesmo em todo o processo e para cada QFS QFS executados para assegurar o aquecimento consistente de amostras. - Remover o gelo seco a partir da câmara e continuar agitando por mais uma hora.
NOTA: a temperatura deve aumentar para cerca de -15 ° C a -20 ° C. - Retirar as amostras e sonda de temperatura da câmara de QFS e colocar noagitador à temperatura ambiente durante mais 10-15 minutos, até que eles atinjam a temperatura ambiente. Pare a gravação da temperatura.
- Durante FS, desligue a máquina HPF.
- Feche a torneira do tanque de nitrogênio líquido, enquanto a máquina HPF está sendo preenchido com nitrogênio.
- Pressione o botão "NITROGENADA".
- Espere até que os vermelhos "pistão para baixo" apaga luz.
- Pressione o botão "ON / OFF".
- Pressione o botão "SYSTEM secar".
- Cortar o fornecimento de ar comprimido para a máquina.
- Após um mínimo de 12 horas (para garantir a secagem de qualquer umidade), desligar a máquina rodando o interruptor principal de "1" para "0".
6 Pós FS Processing
- Retire cuidadosamente a mídia FS com pipetas de transferência de plástico e coloque no recipiente apropriado para lixo tóxico.
NOTA: OsO 4 e acetato de uranila são produtos químicos perigosose deve ser tratado na hotte enquanto usava equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo sapatos-toed fechado, jaleco e luvas. - Lavar as amostras quatro vezes com 100% de acetona. Coletar as duas primeiras lavagens e coloque no recipiente de lixo tóxico.
- Usando uma pinça fina, retire as amostras de tecido dos titulares. Manter as amostras molhado com acetona como isso é feito, e trabalhar com muito cuidado para evitar quebra de amostras.
NOTA: Não é incomum e pode ser realmente útil para ter a pasta de levedura cair longe das amostras neste momento. A pasta de levedura é normalmente castanha muito escura, enquanto o tecido da folha ainda está verde. - Coletar as amostras em criotubos contendo acetona. Prosseguir com a preparação da amostra (infiltração e incorporação) para TEM acordo com os protocolos usuais.
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Representative Results
Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando um Wohlwend Compact 02 para HPF (Figura 1A). Uma das principais vantagens deste instrumento é a facilidade de utilização dos portadores de amostra e os seus suportes. Ao usar outros instrumentos, McDonald recomenda que dois usuários devem realizar a preparação de amostras e HPF, uma preparação das amostras, enquanto o outro faz o congelamento ea transferência para o FS criotubos 9. No entanto, o espécime Wohlwend operadoras e suporte são fáceis o suficiente para um único usuário para manipular de forma independente (Figura 2A, B, E, F e G). Refira-se no entanto que se deve realizar alguns testes para se familiarizar com o instrumento HPF antes de trabalhar com amostras valiosas. Um usuário experiente deve ser capaz de corrigir vários (10 ou mais) amostras em uma hora. No entanto, os princípios apresentados neste protocolo pode ser utilizado com qualquer das máquinas HPF disponíveis comercialmente.
Talveza parte mais crítica do processo de HPF-QFS é a preparação da amostra para o seu carregamento no transporte de espécimes (Figura 2C). Embora isto possa não ser intuitivo, é o passo no protocolo através do qual o pesquisador tem o maior controle. A máquina HPF é robusto, e com o uso e manutenção adequada deve produzir as mudanças esperadas na pressão e temperatura com pouca variação entre as amostras. Se a amostra é pouco movimentado durante a preparação, então nenhum outro passo vai resgatar o dano que daí decorre. Tecidos de plantas são bastante fáceis de manipular durante esta fase do processo uma vez que não são cultivadas em meio e suas paredes celulares das células dão uma boa resistência. No entanto, é importante que as amostras são tratadas rapidamente para evitar alterações ultra-estruturais que resultam da remoção da planta-mãe e para limitar o stress e respostas ferindo. O menor transporte de espécimes que pode acomodar uma amostra deve ser usado para assegurar HPF eficiente e consistente (Figure 2C). Finalmente, o transporte de espécimes deve ser preenchido, mas não transbordando (Figura 2D). O transportador é facilmente cheio amostra inserida na máquina de congelação HPF (Figura 2 H e I).
Os primeiros passos para o protocolo QFS pode ser um desafio para um iniciante, por isso recomenda-se que duas pessoas devem trabalhar juntos até que os usuários se sentem confortáveis com o procedimento (Figura 3A-E). Cuidados devem ser tomados em todos os momentos ao manusear nitrogênio líquido eo tetróxido de ósmio e fixadores uranyl acetato. Uma curva típica de alterações de temperatura durante o QFS é mostrado na Figura 2J. A temperatura aumenta rapidamente a partir de 196 ° C, a temperatura do azoto líquido, a cerca de -80 ° C. É a temperaturas de cerca de -78 ° C a -90 ° C que se crê que a substituição ocorra congelamento 9. Um passo desafiadora no protocolo QFS é a remoção do gelo seco, após 2 horas de FS. NoNesta etapa, manuseio incorreto das amostras pode produzir um aumento nas temperaturas. Para isso, o bloco de aquecimento deve ser rapidamente retirado da câmara através de um QFS cryoglove e o gelo seco rapidamente derramada num recipiente secundário.
HPF tem sido usado para corrigir vários tecidos de plantas, incluindo folhas de Nicotiana benthamiana e folhas de Arabidopsis e embriões. É um desafio para fixar as amostras de folhas maduras, devido às grandes vacúolos centrais da maioria das células. Folhas mais jovens contêm vacúolos menores, mas os tricomas são geralmente muito densamente. A presença de tricomas pode tornar difícil para embalar as amostras com levedura colar, mas é preciso ter cuidado para garantir que isso seja feito corretamente para minimizar a quantidade de ar aprisionado entre a superfície foliar eo colar. O ar preso irá impedir a transferência de calor durante HPF e reduzir a qualidade da fixação. Isto é verdadeiro para qualquer amostra.
Depois de amostras HPF e QFS pode ser preparado para viEwing sob o TEM infiltrando e incorporação com resina. Finas de 65-100 nm pode então ser preparado por corte. Os resultados típicos são mostrados na Figura 4. As imagens apresentadas são de amostras de folhas de Arabidopsis. As membranas plasmáticas são tipicamente lisas e pressionado contra a parede celular, um sinal de boa fixação (Figura 4A, C e E). Outros organelos, incluindo cloroplastos (Figura 4A, D, F e H) e tilacóides (Figura 4B), nas mitocôndrias (Figura 4D e F), de Golgi (Figura 4 L), os microtúbulos (Figura 4E) e ribossomas (especialmente a Figura 4C) são também vacúolos claramente visíveis eo grande centrais permanecem intactos (Figura 4A). Manuseio inadequado durante resultados HPF-QFS em artefatos, incluindo danos induzida por cristais de gelo (Figura 4D) e plasmólise (Figura 4H). Precipitado chumbo também podem se formar durante a coloração da secçãos (Figura 4F).
Figura 1: A Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer (A) A máquina Wohlwend Compact 02 HPF usado para criofixação com o terminal de computador conectado.. As amostras são inseridas na parte dianteira da máquina (pequeno circulo) por congelação. A curva de temperatura pode ser gerado no ecrã do computador para cada ensaio, como desejado pelo utilizador. (B) Uma curva de pressão com temperatura típica para uma corrida HPF. As linhas amarelas e púrpura representam a temperatura e de pressão, respectivamente. Observe as encostas íngremes de ambas as curvas. A alta pressão é mantida durante cerca de 400 ms. Cada intervalo no eixo dos x representa 50 ms. Os dados foram coletados com EasyScopeII para software DSIM12. (C) A caixa de isolamento e cobertura utilizados para o armazenamento of amostras congeladas imediatamente após o congelamento pode ser convenientemente colocado em cima da máquina de HPF. Ela está cheia de nitrogênio líquido. Os recipientes de alumínio redondo segurar os criotubos.
Figura 2: Preparar amostra de tecido para HPF. (A) O suporte de amostra para a máquina Compact 02 HPF em sua configuração fechada. (B) O titular da amostra está aberta. (C) Uma amostra de folha no poço 0.2 mm de um tipo A transportadora espécime. O outro lado desta transportadora é de 0,1 mm de profundidade. (D) A amostra folha coberta de levedura colar. Note-se que o veículo é completo, mas não de transbordamento. De (E) O transporte de espécimes no suporte da amostra. (F) A amostra é coberta com o portador do tipo B. Este transportador tem uma superfície plana e, por outro lado de um poço queé de 0,3 mm de profundidade. Aqui, a superfície plana é utilizada para sanduíche da amostra. (G) O suporte de amostra é fechado e pronto para inserção na máquina HPF. (H) O orifício na parte da frente do instrumento HPF em que o suporte de amostras vai ser inserido por congelação . (I), A sonda de temperatura e de pressão / suporte inserido na máquina HPF. (J) A curva de temperatura típica para uma corrida QFS (dados recolhidos com software EasyLog). A temperatura foi registrada a cada segundo. O pico no início da corrida é devido aos componentes eletrônicos da sonda utilizada e não reflete uma medição de temperatura real.
Figura 3:. Equipamento utilizado no QFS QFS pode ser realizada em qualquer recipiente isolado, tais como uma caixa de Styrofoam ou um balde de gelo (A) <./ Forte> A camada de gelo seco, 1-2 cm de profundidade cobre a parte inferior da câmara de QFS, aqui uma caixa de poliestireno expandido. (B) Um bloco de aquecimento com 13 furos de mm é utilizado para amostras de casa durante QFS. A sonda de temperatura com o registador de dados digital é colocado no bloco de aquecimento. (C) Depois de se arrefecer o bloco aquecedor em azoto líquido, as amostras são colocadas no bloco, o azoto líquido é derramado, e todo o conjunto é colocado na câmara de QFS . com o gelo seco (D) A câmara QFS está cheio de gelo seco, para que as amostras são cobertas; não há nenhuma desvantagem para a cobertura do bloco aquecedor inteiro com gelo seco. de (E) A caixa é coberta e, em seguida, transferida para o agitador rotativo em um exaustor onde as amostras são agitadas durante todo o procedimento QFS.
Figura4.:. Arabidopsis folhas preparado por HPF-QFS Os resultados obtidos para as amostras preparadas por HPF-QFS e fotografada por TEM em um Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) A imagem média alta ampliação mostrando um cloroplasto (CH) com paredes celulares e citoplasma das células adjacentes. Os vacúolos (V) contêm material elétron denso. Scale bar = 0,5 imagem m. (B) A alta ampliação de um cloroplasto. Barra de escala = 100 nm. (C) Uma imagem de alta ampliação da parede celular entre as células adjacentes. Um plasmodesma ramificada é visível (seta). Note-se a membrana do plasma suave pressionada contra a parede da célula, o vacúolo. O citoplasma é densamente embalado com ribossomos. V é vacúolo. O tonoplast é suave e contínua. Barra de escala = 200 nm. (D) Uma imagem de baixa ampliação mostrando as áreas de boa fixação no cloroplasto (CH), perto de regiões de dano de gelo (asterisco). Barra de escala = 0,5 micron. (E) uma vista de alta ampliação de uma célula wall e os microtúbulos. Barra de escala = 100 nm. (F) Imagem que mostra a boa preservação dos cloroplastos (CH) e mitocôndrias (M). Grande precipitado negro é de coloração seções com citrato de chumbo. Escala da barra = 1 um. (L) Alto, ampliação de Golgi (GA). Barra de escala = 200 nm. (H) mal conservadas exemplo mostrando falta de detalhes nos cloroplastos e plasmólise (seta preta). Escala da barra = 1 um.
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Discussion
O sucesso do protocolo aqui apresentado depende fortemente do utilizador. Em primeiro lugar, a preparação avançada é necessária para garantir que todos os materiais necessários estão prontamente disponíveis e em quantidade suficiente para completar uma corrida HPF-QFS. Em segundo lugar, o utilizador deve trabalhar rapidamente, passando de passo-a-passo de uma forma eficiente que minimiza o manuseamento das amostras, minimizando, assim, alterações no estado do tecido nativo. Uma vez que as amostras são congeladas e antes que eles são desidratados, é imperativo que eles sejam mantidos frio, por isso deve ser tomado cuidado para evitar qualquer manipulação que podem, inadvertidamente, aquecer a amostra, por exemplo, a manipulação com a mão enluvada, em vez de fórceps pré-resfriada. Velocidade e aumentar a eficiência com a familiaridade com o protocolo, por isso corridas de prática são recomendados antes de tentar corrigir as amostras de uma de interesse. Em terceiro lugar, o utilizador tem de permanecer consciência dos perigos dos produtos químicos utilizados no meio de FS, assim como os perigos de trabalhar com azoto líquido e gelo seco. Um exaustor de fumos é necessário para a preparação do meio de FS e para o procedimento de QFS. Para todas as outras etapas, o equipamento de protecção individual necessário, incluindo luvas, jaleco, sapatos fechados e óculos de proteção são recomendados.
As vantagens da utilização de criofixação em vez de fixadores químicos à temperatura ambiente para a preparação de amostras para TEM, incluindo plantas, há muito que são conhecidos 10. Um estudo comparando a ultra-estrutura das pontas das raízes de Nicotiana e Arabidopsis fixos por HPF ou fixadores químicos descobriram que o método HPF-FS deu resultados muito superiores 5. No tecido preparado por HPF-FS membrana plasmática e outras membranas celulares eram mais suave, a membrana plasmática foi liberado contra a parede celular e, geralmente, organelas, incluindo os microtúbulos estavam mais preservados do que quando as amostras foram fixadas por métodos convencionais. Outro estudo de nódulos radiculares de soja concluiu que "a fixação química por tamponadonão preserva a ultra-estrutura de nódulos radiculares das plantas em um estado que permite a correlação da estrutura e função. "E continua a dizer que a única alternativa disponível é HPF-FS 2. Plasmodesmata são canais ligados à membrana que conectam células vegetais para os seus vizinhos, mas cuja infra-estrutura é difícil de resolver, mesmo sob TEM. Criofixação por HPF ou com um freezer jato de propano seguido por FS foi escolhido em detrimento de fixação química em estudos que visam elucidar os detalhes da estrutura plasmodesmal 18. Apesar destes resultados iniciais, os estudos sobre os tecidos TEM convencionalmente fixos ainda são a norma em Ciências da planta. Isto pode ser devido a uma aderência simples de métodos tradicionais ou ao custo proibitivo de equipamento aparentemente HPF-FS acoplado ao longo do tempo preparativa para protocolos actualmente utilizados FS.
O procedimento para QFS é uma recente inovação para acelerar a preparação de amostras para TEM 15. Foi QFSutilizado para preparar a totalidade C. elegans e N. benthamiana sai depois criofixação 15. Estas são amostras relativamente espessas para serem fixados por HPF, e preparação de amostras de Nicotiana por HPF-FS tem tradicionalmente usado FS muito longos tempos 12, 13, 14. Para este protocolo que usamos folhas da planta modelo Arabidopsis. A base racional para tempos longos para FS Nicotiana e outras amostras de plantas é que a permuta de solventes e água que provavelmente ser retardado pelos grandes vacúolos das células. No entanto, espera-se que uma amostra de desvitrificação bem congelado deve resultar em danos mínimos para as células (15 e refs. Aí). Se ocorrer dano de gelo é provavelmente causado pelo próprio congelamento e não o QFS. Um protocolo ainda mais curto para o FS tem sido relatada 15. Este super rápidas FS (SQFS) utiliza apenas 90 min para o FS. Neste protocolo, as amostras no bloco aquecedor são girados a 100 rpm, na ausência de i secace, sem cobrir a câmara SQFS. Isto permite que as amostras de atingir -80 ° C, rapidamente. As amostras são, em seguida, removido do bloco de aquecimento e deixou-se atingir a temperatura ambiente no agitador. SQFS tem sido utilizado com sucesso para desidratar as células crescidas em cultura e E. As células de E. coli. Ainda não tentaram utilizar SQFS com amostras de plantas devido à espessura dos tecidos da planta.
O protocolo para cryofixing e depois desidratar as amostras de plantas por HPF tandem e QFS representa uma melhoria significativa sobre os protocolos actuais. O tempo de preparação da amostra antes da infiltração agora resina é reduzida a algumas horas, em vez de vários dias. Além de desenvolver o método QFS 15, McDonald também protocolos para a infiltração rápida dos tecidos vegetais com resina seguintes SQFS publicado recentemente sem gelo seco 19. Tecidos de plantas são geralmente lentamente infiltrado com resina por várias incubações longas, incluindo durante a noite. Estes novos protocols resultar em tempos mais curtos de processamento de amostras: 6 horas de congelar até a corte. Assim, no futuro, a combinação de HPF-QFS e infiltração rápida deve substituir protocolos atuais para a preparação planta amostras para TEM. Além disso, o procedimento QFS utiliza equipamentos de laboratório comum, que é barato e pode ser usado para várias finalidades, embora um Kit QFS comercial está disponível através de Microscopia Eletrônica de Ciências (http://www.emsdiasum.com). Qualquer opção representa uma enorme economia sobre o custo de aquisição de uma unidade de substituição congelamento dedicado que pode custar mais de US $ 50.000.
Deve notar-se que as aplicações de amostras preparadas por HPF e FS ultrapassam análise TEM rotina. As amostras preparadas desta forma reter a sua antigenicidade e, por conseguinte, podem ser utilizados em abordagens baseadas em anticorpos, incluindo imuno rotulagem 17, 19. Estas amostras também podem ser utilizados para análises estruturais tridimensionais avançadavia tomografia eletrônica de 20. Amostras HPF-FS pode ser usado até mesmo com luz correlativo e EM 21, 22. Assim, as melhorias continuou nos procedimentos para cryofixing e, em seguida, as amostras de desidratação será benéfico para uma grande variedade de investigadores que trabalham em diversos sistemas.
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Acknowledgments
A bondade ea generosidade do Dr. Kent McDonald da UC Berkeley são muito apreciados. Agradecemos a um revisor anônimo para sugestões muito úteis. O laboratório de Burch-Smith é apoiado por fundos de arranque da Universidade de Tennessee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
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