Abstract
1940'larda transmisyon elektron mikroskobu (TEM), biyolojik malzemelerin ultra-yüksek çözünürlüklü görüntüler biyologlara vermektedir beri. Ancak, çünkü aynı zamanda artifakttan ücretsiz numune hazırlama deneyimi talep zahmetli ve zaman alıcı protokoller, TEM kullanıcı dostu bir tekniği olarak kabul edilmez. TEM için numune hazırlanması geleneksel hücresel yapıları korumak için kimyasal tespit kullanılır. Yüksek basınçlı dondurma, bu şekilde selüler genel yapının bütünlüğüne zarar verir buz oluşumunu kısıtlayan çok hızlı soğutma oranlarının, elde etmek için yüksek basınç altında, biyolojik numunelerin cryofixation olan. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurularak ikame şu TEM için reçine bölümlerde yüksek kalitede morfolojisini üretmek için tercih edilen yöntemlerdir. Bu yöntemler, genellikle ince kesitlerin TEM için geleneksel işlemler ile bağlantılı etkilerini en aza indirmek. Cryofixation sonra numunenin donmuş suyun sıvı ile değiştirilirDüşük sıcaklıklarda bir organik çözücü, bir ikame olarak adlandırılan bir süreç, dondurularak. Freeze ikame tipik adanmış, pahalı ekipman birkaç gün içinde yapılır. Yeni bir yenilik yerine her zamanki iki gün, işlem üç saat içinde tamamlanması sağlar. Bu, tipik olarak süzülmesini ve kesit önce epoksi reçineleri gömme içeren örnek hazırlama birkaç gün daha fazla takip eder. Burada bitki örneğinin tespit saat içinde gerçekleştirilebilir sağlayan yüksek basınçlı donmayı ve hızlı dondurma ikamesi birleştiren bir protokol mevcut. Protokol kolayca, diğer dokular ya da organizmalar ile çalışmak için adapte edilebilir. Bitki dokuları, çünkü su buzsuz dondurma engel gaz alanları ve suyla doldurulmuş vakuollerin varlığında özel bir endişe vardır. Buna ek olarak, kimyasal sabitleme süreci, doku içinde derine kimyasal maddelerin penetrasyonunu engelleyen hücre duvarları dolayı, bitkiler içerisinde, özellikle uzun. Bitki dokuları, bundan dolayı parçacık halinde olan, taahhüde zorlu, bu protokol, güvenilir ve yüksek kalitede örnekleri üretir ama.
Introduction
Hücre ultrastrüktürü bilgilerimiz birkaç nanometre 1 aralığında ayrıntıları çözebilir elektron mikroskobu, ağırlıklı olarak geliyor. Numune hazırlama zaman alıcı ve zahmetli protokolleri gerektirir ve uygulayıcısı bazı uzmanlık gerektirir gibi çözünürlükte TEM kadar güçlü olmasına rağmen, kullanıcı dostu olarak kabul edilmez. Numunelerin Geleneksel tespit reçine içinde yerleştirilmesi ve daha sonra, ağır metaller ile boyanır ultra-ince kesitlerin kesit, dehidratasyon içerir, ilave işlemden önce aldehit ve ozmiyum tetroksit kullanımını birleştirmektedir. Ancak, kimyasal sabitleme sonuçta çeşitli hücresel bölmeleri 2 etkileyecek zarlarında protein toplama ve lipidlerin 1 kaybı ve değişiklikleri içeren eserler üretebilir bilinmektedir. Bu eserler büyük ölçüde oda sıcaklığında 3, 4, 5, fiksasyon ve dehidratasyon yavaş hızı atfedilir.
7. HPF bir azalır, 20 derece, suyun donma noktasını düşüren buz kristallerinin çekirdeklenme ve büyüme yavaşlar ve hücresel bileşen, esasen 6 immobilize edilir, böylece bir biyolojik numunede suyun viskozitesini arttırdığına olduğu milisaniye olarak çok yüksek basınçlı (210 MPa veya 2100 bar) altında sıvı azot edilene numunesinin sıcaklık. Düzgün yapılmazsa HPF hücre ultrastrüktürdeki büyük zarar verebilir büyük buz kristallerinin oluşumunu önler. HPF biyolojik çözünen 7 tipik konsantrasyonları, 100-200 um kalınlığında örnekleri saptamak için kullanılabilir. HPF, örneğin 1, 7, 8 yatan sayısız fizik yorum ve ilkeler vardır.
HPF sonra numuneler -90 ve düşük bir sıcaklıkta (-78.5 ° C enkübe edilirGenellikle birkaç gün boyunca osmiyum tetroksit gibi bir organik çözücü içeren sıvı kimyasal tespit, mevcudiyetinde ° C); 176.. Bu düşük sıcaklıkta, numunedeki su, organik bir çözücü, tipik olarak, aseton veya metanol 1, 9 ile değiştirilir. Bu yüzden, bu işlem olarak adlandırılır dondurularak ikamesi (FS) göstermektedir. Numune, daha sonra yavaş yavaş ısıtılır ve bu süre içinde genellikle ozmiyum tetroksit ve uranil asetat 9 ile sabitlenir. Düşük sıcaklıklarda çapraz bağlama molekülleri 1 hareketsiz sabitleme avantajına sahiptir. FS bu yüzden geliştirilmiş bir ince yapı korunmasını sağlar, özellikle oda sıcaklığında, geleneksel kimyasal tespiti ile tespit kıyasla üstün kaliteli, antijenisite daha iyi korunması örneklerini üreten ve bağlanmamış hücre bileşenlerinin 10, 11 kaybının azaltılması.
En FS tipik olarak birkaç güne kadar, çok uzun süreler boyunca gerçekleştirilir. Bu durum, özellikle bir trubitkilerin örnekleri 12, 13, 14 e. McDonald ve Webb tarafından geliştirilen yeni bir protokol ölçüde birkaç saat 15 birkaç gün FS süresini azaltır. Süper hızlı FS (SQFS) numuneler 90 dakika içinde işlenirken onların hızlı dondurma ikamesi (QFS) prosedürde, FS, 3 saat boyunca gerçekleştirilir. Bu yöntemlerle üretilen örneklerin kalitesi geleneksel fs protokolleri ile elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir olan. Biz HPF sonra bitki örneklerinin sonraki işlemlerde QFS protokolü kabul etmiştir. QFS ve SQFS yerine pahalı piyasada mevcut FS makineleri ortak laboratuvar ekipman kullanımı gibi bu zaman ama para değil, sadece kazanmak için kanıtlanmıştır.
Bitki dokusu sık sık TEM hazırlanmak için çok zorlu. Ortalama olarak, bitki hücreleri, bakteri ya da hayvan hücreleri ya da daha büyüktür. Hidrofobik balmumsu üstderi, kalın hücre duvarları, organik asitler, hidrolazlar ve fenolik içeren büyük c suyla doldurulmuş vaküollerin varlığıiyodu olduğu gibi toplam hücre hacmi 16% 90 kadar işgal edebilir ve hava ile temas yerlerin bulunması ciddi sistemin 17 ısı iletkenliği azalır. Bundan başka, bitkilerin durumunda, örnek kalınlığı hemen hemen her zaman 20 um, kimyasal sabitleme amaçlı limiti aşar. Bu kalınlıktaki, suyun düşük ısı iletkenliği, numunenin merkezinde bir dondurma oranı en fazla -10.000 ° C / saniye önler. Bu oran zarar altıgen buz oluşumunu (daha düşük bir yoğunluğa sahip buz kristalleri ve daha büyük 10-15 nm) kaçınmak için gerekli olan 8. Birlikte, numune ve sonraki FS hem uygun donma bu mevcut sorunlar. Bununla birlikte, cryofixation bitki örneklerinin tespiti için en iyi yöntemdir. İşte bitki doku örneklerinin HPF-QFS için bir protokol sunulmuştur. Bu modeli türleri Arabidopsis thaliana'nın odaklanır, ama aynı zamanda Nicotina benthamiana'nın ile kullanılmıştır. Tipik sonuç HPF-QFS sa ürettiğini göstermektedirzamanın bir kısmını geleneksel HPF-FS karşılaştırılabilir kalitede örnek olarak şunlar verilebilir. Uygun düzenlemeler ile, bu protokol, aynı zamanda, nispeten kalın, diğer biyolojik örnekler için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: QFS prosedür kullanıcı tarafından aşırı özen ve dikkat gerektirir ve biz uygulanabilir Dikkatler ve Notlar gibi burada bu güvenlik önlemlerini vurgulayın.
HPF Run için 1.Preparation
- Numune hazırlama başlamadan önce, üreticinin yönergeleri izleyerek yüksek basınçlı dondurucuda açın.
NOT: Bu protokolde kullanılan BBA birimi Wohlwend Kompakt 02 ünite (Şekil 1A) ve HPF başlaması için çalışır önce start-up prosedürünün bir-ve-bir buçuk saat yaklaşık bir sürer.- Wohlwend Kompakt 02 Yüksek Basınç Dondurucu Açma.
- "1" den "0" ana şalteri çevirerek aracı çalıştırınız.
- Makineye basınçlı hava bırakın.
- Makineye sıvı nitrojen bırakın.
- Basın "SİSTEM KURU YUKARI" düğmesine basın.
- 30 dakika sonra, "sisteminin gelişmesini basınM KURU YUKARI "butonuna tekrar.
- Basın "ON / OFF" düğmesine enstrüman açmak için.
- "AZOT" düğmesine basın.
- Düğmesinin "IN DRIVE" zaten yaktı olsa bile makine 20 dakika soğumasını bekleyin.
- Yukarı düğmesine ışıkları "IN DRIVE".
- Düğmesinin "IN SÜRÜCÜ" tuşuna basın.
- "AUTO" tuşuna basınız.
- "SİSTEM HAZIR" düğmesi yanar.
- Basınç odasına, sıcaklık ve basınç sensörünün ve pimle kilitlemek.
- "JET AUTO" düğmesine basın. Arzu edildiği gibi basınç artışı ve sıcaklık azalması olduğunu kontrol eder Bu adım; aslında bir deneme. Sıcaklık ve basınç keskin bir artış gösterdiği keskin damlası (Şekil 1B) beklenmektedir.
- Iki JET döngüleri yürütmek.
- Wohlwend Kompakt 02 Yüksek Basınç Dondurucu Açma.
Receivi 2. Hazırlıkng Donmuş numuneler
- Sahipleri tamamen (Şekil 1C) kaplıdır, böylece sıvı nitrojen ile kriyotüpe sahiplerine içeren yalıtılmış kutusu doldurun, (Güvenlik Uyarılarını bakınız).
NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil. - Sıvı azot (Şekil 1C) olarak alüminyum tüp yuvalarına FS orta içeren flakon uygun sayıda yerleştirin. Dört diskler için bu protokol ile tek bir örnek içeren her bir tek cryovial yerleştirilebilir.
NOT: Şişeler elmas uçlu kâtip ve çok yumuşak kurşun kalem gibi keskin bir aletle ile etiketlenmiş olmalıdır.- QFS esnasında sabitleyici aseton 9% 1 OsO 4 ve% 0.1 uranil asetat kullanır. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve cryovials deposuna 1,5 ml hacimde dağıtılması, büyük hacimde çözelti hazırlayın.
NOT: OSO 4 ve Uranil asetat işleme için Güvenlik Uyarılarını izleyin.
NOT: OsO 4 NOT: QFS için örnek tutmak için kullanılan cryovials tüpler OSO 4 sızmasını önlemek için QFS sırasında mühürlü kalmasını sağlamak için sert bir O-ring olmalıdır.
- QFS esnasında sabitleyici aseton 9% 1 OsO 4 ve% 0.1 uranil asetat kullanır. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve cryovials deposuna 1,5 ml hacimde dağıtılması, büyük hacimde çözelti hazırlayın.
- Hamur pürüzsüz olana kadar bir kürdan veya diğer bir araç ile,% 10 metanol, kabaca eşit hacimde fırıncı mayası karıştırılarak maya hamurunu hazırlayın. Maya macun, hücre dışı bir dondurarak saklama koruyucusu gibi hareket eder ve numune taşıyıcıya numune etrafında alanı doldurmak için kullanılır. Macunun miktarı numune sayısına bağlıdır; 10 numune veya daha az macun (1 mi), bir mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırılmıştır de kullanılabilir.
Örneklerinin 3. Yüksek basınçlı Donma
- Bitkinin ilgi çekici bir yaprak (veya başka doku) çıkarın ve yavaşça Denta bir parça üzerine yerleştirinl balmumu veya diğer kesme yüzeyi. Yapraktan dışarı bir örnek kesmek için, 2.0 mm ya da istenilen büyüklükte bir zımba kullanarak. Forseps bir çift ile hafifçe örnek Kulp ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çalışır.
- Bir mikroskop altında çalışarak, A Tipi numune taşıyıcı 0.2 mm yan yaprak disk yerleştirmek ve maya macun tamamen kapsamaktadır. Disk tamamen dolu olduğundan emin olun ve hamur ince bir fırça (Şekil 2) ile macun düzleştirilir tutucunun kenarı ile aynı seviyededir.
- Numune tutucu içindeki taşıyıcı yerleştirin. Tip B numune taşıyıcı, düz bir yüzeye aşağı örnek örtün.
NOT: örnek tutucu Kuru ve oda sıcaklığında olmalıdır. - , Numune tutucu örnek alın makineye takın ve bir veya iki saniye içinde tamamlanacaktır "JET OTO" düğmesine basarak bir donma döngüsü başlatmak.
- Mümkün olduğunca çabuk Çalışma, makineden tutucusunu çıkarın ve samp tutan ucu yerleştirinle HPF makinesinin üzerinde yalıtılmış bir kutu ile sıvı azot içine. Bunların soğuk sıvı azot içinde forseps iki çift ipuçları bırakın.
NOT: dondurulduktan sonra, taşıyıcılar sadece sıvı azot soğutmalı forseps ile ele alınmalıdır. Sıcak (oda sıcaklığı) forseps sık cryotechniques başarısızlık nedenidir. - FS ortamı ihtiva eden bir cryovial açın ve kutunun yan kapağı yerleştirin. Sıvı nitrojen soğutmalı bir çift forseps yardımıyla yavaşça disk sıvı azot ya da buharında sürekliliği garanti altına, örnek tutucudan dışarı diski çıkarın. Sıvı azot buharında çalışan, bir ön-soğutulmuş forseps ile FS tüpü tutmak ve FS flakon tutucu yerleştirmek için diğer kullanın. Geri FS şişenin kapağını takın. Değil kapanı şişe içinde herhangi bir sıvı azot yapın.
NOT: QFS için cryovials herhangi bir sıvı azot şişelerde tuzak olduğundan emin olmak için numuneler aktarılması. Sıvı azot ısınma ve herhangi Trappe sırasında 700 kat genişletird sıvı azot, bu süre içinde patlamasına yol açabilir. - İstenen tüm numuneleri dondurulmamalıdır kadar tekrarlayın 3,1-3,7 adımları. Örneğin aynı türünü içeren birden fazla yaprak diskleri maddesi aynı şişe içinde yerleştirilebilir. Örnek tutucu kurutuldu ve dondurma çalışmalar arasında, oda sıcaklığına getirildi gerektiğini not edin. Hızlı Bunu yapmak için, bir fön makinesi ile ısıtın ve dokunma ile onun sıcaklığını izlemek.
Freeze Değişiklik 4. Hazırlık
- Tamamen 10 dakika boyunca ya da çekirdek kaynama duruncaya kadar sıvı azot içinde alüminyum ısıtıcı blok bırakın. Bu devam ederken, FS odası (Şekil 3) olarak kullanılan kabın alt kuru buz (1-2 cm) 'lik bir tabaka yerleştirin. Plastik bir kap veya buz kovası ezilmiş kuru buz veya topaklar ile birlikte, FS için kullanılabilir.
- Hızlı bir şekilde ısıtıcı bloğun orta satırlar halinde sıcaklık probu ile birlikte numuneleri içeren cryovials yerleştirin. Emin olun ki üzerinde kapaklarıFS medya FS sırasında akmaması böylece flakon sıkıca vidalanır. Sıcaklığı kaydetmeye başlarsınız.
- Bu tüpün alt kısmını ulaşacak şekilde, bir dondurarak saklama viali üst kısmından, bir termokupl yerleştirerek sıcaklık probu olun. Reçine ile tüpün kapağını böylece hiçbir sıvı sızıntısı üzerinden sıkıca kapatın. Her QFS çalışma başında 1.5 ml aseton ile tüp doldurun.
- Yalıtımlı cryogloves veya büyük forseps kullanarak, ısıtıcı blok tüm sıvı nitrojen dökmek. Kriyotüplerin dışarı dökmek için değil dikkat edin.
NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil. - QFS bölmesi içinde kuru buz tabakası üzerine şişeleri içeren blok yerleştirin. Blok tüpler yatay yalan böylece yerleştirilmiş ama hafif yukarı doğru eğim ile emin olun. Doğru cryovials kullanıldığında, herhangi bir sızıntı olmalıdır.
- FS tüpler sahiptir, böylece gerekli olmamasına rağmen, kuru buz ile QFS haznesi paketibloğun üst kapağı. Oda üzerindeki kapağı yerleştirin.
5. Hızlı FS
NOT: OSO 4 bir kaçak yanlışlıkla başka önlemlere rağmen meydana durumunda bir davlumbaz QFS çalıştırması yapın.
- Bir çeker ocak içinde, bir eklemli döner bir karıştırıcı üzerinde QFS odasına yerleştirin ve 120 dakika boyunca 125 rpm'de döndürün. Bu süre boyunca, bloğun sıcaklığı, yaklaşık -80 ° C'ye kadar yavaş yavaş artırmalıdır. Ajitasyon daha FS bileşenlerinin karışma sağlar.
NOT: Bir çeker ocak içinde karıştırıcı ve bir davlumbaz kapı pozisyonuna yerleştirilmesi QFS uygulama boyunca numune tutarlı ısınma sağlamak için çalıştıkları her QFS için aynı olmalıdır. - Odasından kuru buz çıkarın ve bir saat daha çalkalamaya devam edilir.
Not: sıcaklığı yaklaşık -15 ° C ila -20 ° C'ye kadar artmalıdır. - QFS odasından örnekleri ve sıcaklık probu çıkarın ve üzerine yerleştirinBaşka bir 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı, dek oda sıcaklığına ulaşır. Sıcaklığını Kaydı durdur.
- FS sırasında, HÖF makineyi kapatın.
- HPF makine nitrojen ile doldurulur esnasında sıvı azot tankın musluğu kapatın.
- "AZOT" düğmesine basın.
- Kırmızı "PİSTON AŞAĞI" ışık sönene kadar bekleyin.
- "ON / OFF" tuşuna basınız.
- Basın "SİSTEM KURU YUKARI" düğmesine basın.
- Makineye basınçlı hava kaynağını kapatmak için kullanılır.
- 12 saat sonra en az, (herhangi bir nem kurumasını sağlamak için) "0", "1" den ana şalteri çevirerek makineyi kapatın.
6. Post FS İşleme
- Dikkatle zehirli atıklar için uygun bir konteynere plastik transferi pipetler ve yer ile FS ortamı çıkarın.
NOT: OsO 4 ve Uranil asetat tehlikeli kimyasallardırkapalı-parmaklı ayakkabı, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek ve davlumbaz ele alınmalıdır. - Yıkama numuneler% 100 aseton ile dört kez. İlk iki yıkar toplayın ve zehirli atık konteynerine yerleştirmek.
- Ince forseps kullanarak, sahiplerinden doku örneklerini kaldırmak. Bu yapıldığı gibi aseton ile ıslak örnekleri tutmak ve kırma örnekleri önlemek için çok hafifçe çalışır.
NOT: Bu sıradışı değildir ve aslında maya paste bu noktada uzak örneklerinden düşmek için yararlı olabilir. Yaprak dokusu hala yeşil iken maya macun genellikle çok koyu kahverengi. - Aseton içeren cryovials örnekleri alınmalıdır. Her zamanki protokollere göre TEM için numune hazırlama (infiltrasyon ve gömme) ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda sunulan sonuçlar HPF için bir Wohlwend İlkeler 02 (Şekil 1A) kullanılarak elde edilmiştir. Bu aletin önemli bir avantajı, numune taşıyıcılar ve taşıyıcılarıyla kullanım kolaylığıdır. Diğer aletleri kullanırken, McDonald iki kullanıcı diğer dondurulması yapar ve FS transfer 9 cryovials ederken örneklerini hazırlamakta numune hazırlığı ve HPF, bir yürütmek gerektiğini önerir. Ancak, Wohlwend taşıyıcılar ve tutucu bir tek kullanıcının bağımsız (Şekil 2A, B, E, F ve G) işlemek için yeterince kolay numune. Bu bir-bir kaç deneme yapmak gerektiğini ancak söz değerli örnekleri ile çalışmaya başlamadan önce HÖF belgeye aşina olmaya çalışır olmalıdır. Deneyimli bir kullanıcı bir saat (10 veya daha fazla) birkaç örnek düzeltmek gerekir. Bununla birlikte, bu protokolde yer alan ilkelerin ticari olarak temin edilebilen HPF makineleri herhangi biri ile kullanılabilir.
BelkiHPF-QFS prosedürünün en önemli parçası numune taşıyıcı (Şekil 2C) yüklenmek için örnek hazırlıktır. Bu sezgisel olmayabilir rağmen, araştırmacı en kontrole sahip olduğu protokolde adımdır. HPF makinesi sağlam ve doğru kullanımı ve bakımı ile örnekler arasında küçük farklılıklar ile basınç ve sıcaklık beklenen değişiklikleri üretmek gerekir. Örnek bir kötü hazırlanması sırasında ele kesilirse başka hiçbir adım böylece neden olduğu hasarı ödemesi yapacak. Bunlar bir ortam içinde kültürlenir değildir ve bunların hücreleri duvarları hücreleri iyi mukavemet vermek gibi bitki dokuları İşlemin bu aşamasında işlemek için oldukça kolaydır. Bu numuneler ana bitkiden uzaklaştırılması sonucu ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek ve stres ve yaralama yanıtları sınırlamak için hızla ele alınmasını yine de önemlidir. Bir örnek ağırlayacak küçük numune taşıyıcı (Şekil verimli ve tutarlı YGF sağlamak için kullanılmalıdırure 2C). Son olarak, numune taşıyıcı doldurulmuş fakat (Şekil 2B) taşan edilmelidir. Doldurulan numune taşıyıcının kolayca (Şekil 2, H ve I) için dondurma HPF makinesinin içine sokulması.
QFS protokolde ilk adımlar, yeni başlayanlar için zor olabilir, bu yüzden kullanıcıların prosedürü (Şekil 3A-E) ile rahat edene kadar iki kişinin birlikte çalışması gerektiğini tavsiye edilir. Sıvı azot ve fiksatifler osmiyum tetroksit ve uranil asetat taşıma dikkatli her zaman dikkat edilmelidir. QFS sırasında sıcaklık değişimine için tipik bir eğri Şekil 2J gösterilmiştir. Yaklaşık -80 ° C'ye kadar hızlı bir şekilde -196 ° C'de, sıvı azot sıcaklığı ısı yükselmeleri gerçekleşebilir. Donma ikame 9 meydana geldiğine inanılmaktadır yaklaşık -78 ° C ila -90 ° C arasındaki sıcaklıklarda yer almaktadır. QFS protokol bir zorlu aşama FS 2 saat sonra kuru buz çıkarılmasıdır. AtBu adım, örneklerin ilgilenmedikleri sıcaklıklarda ani bir artış üretebilir. Bunun için, ısıtıcı blok hızlı hızlı bir şekilde ikinci bir kap içine döküldü ve bir cryoglove kuru buz kullanılarak QFS bölmenin üzerinden kaldırılmalıdır.
HPF Nicotiana benthamiana yapraklarından ve Arabidopsis yaprakları ve embriyolar da dahil olmak üzere, çeşitli bitki dokularını düzeltmek için kullanılmıştır. Nedeniyle çoğu hücrelerin geniş bir merkezi vaküol olgun yapraklardan örnekleri düzeltmek için zordur. Genç yapraklar küçük vakuoller içeren ancak trikomlardır genellikle oldukça yoğun paketlenmiştir. Trikonların varlığı zor maya hamur ile örnekleri paketi yapmak ama bu düzgün yaprak yüzeyi ve macun arasında sıkışıp hava miktarını en aza indirmek için yapılır emin olmak için dikkat edilmesi gerekiyor olabilir. Sıkışan hava HPF'li sırasında ısı transferini engeller ve tespitin kalitesini düşürecektir. Bu, herhangi bir numune için de geçerlidir.
HPF QFS örnekleri vi hazırlanabilir sonrasızmakta ve reçine ile gömerek TEM altında Ewing. 65-100 nm ince kesitler daha sonra bölümlere ayrılması suretiyle hazırlanabilir. Tipik sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. Gösterilen resimler Arabidopsis yaprağı örneklerinin hepsi. Plazma membranlar olarak yumuşak ve hücre duvarına karşı bastırılır, iyi tespit işareti (Şekil 4A, B ve E). Kloroplastlar (Şekil 4A, D, F ve H) ve Thylakoid'in (Şekil 4B), mitokondri (Şekil 4D ve F), golgi (Şekil 4 G), mikrotübül (Şekil 4E) ve ribozom (özellikle Şekil 4C) de dahil olmak üzere diğer organellere de vardır açıkça görülebilir ve büyük vakuoller merkezi sağlam (Şekil 4A) kalır. Buz kristali bağlı hasara (Şekil 4D) ve plazmoliz (Şekil 4H) dahil olmak üzere eserler HPF-QFS sonuç sırasında kötü işleme. Kurşun çökelti bölümü de boyama sırasında oluşabileceks (Şekil 4F).
Şekil 1: Wohlwend Kompakt 02 Yüksek Basınçlı Dondurucu (A) bağlı bir bilgisayar terminali ile cryofixation için kullanılan Wohlwend kompakt 02 HPF makinesi.. Numuneler dondurma için makinesi (küçük daire) ön yerleştirilir. Kullanıcı tarafından arzu edilen bir sıcaklık eğrisi, her deney için bilgisayar ekranında oluşturulabilir. (B) HPF seferi için tipik bir sıcaklığa basınç eğrisini. , Sarı ve kırmızı çizgi sırasıyla sıcaklık ve basınç temsil eder. Her iki eğrilerinin dik yamaçları unutmayın. Yüksek basınç, yaklaşık 400 ms boyunca korunur. X ekseni üzerinde her aralığı 50 msn temsil eder. Veri DSIM12 yazılımı için EasyScopeII ile toplanmıştır. (C) yalıtılmış kutusu ve kapak depolama o için kullanılanhemen donma sonra f donmuş numuneler uygun üst HÖF makinede yerleştirilebilir. Bu sıvı nitrojen ile doldurulur. Yuvarlak alüminyum kaplar cryovials tutun.
Şekil 2: HPF için hazırlanıyor doku örneği. (A), kapalı olduğu konfigürasyonlarda, kompakt 02 BBA makinesi için numune tutucu. (B), örnek tutucu açıktır. (C) Tip bir numune taşıyıcı 0,2 mm kuyuda bir yaprak örneği. Bu taşıyıcının diğer tarafı 0,1 mm derinliğindedir. (D) maya hamur kaplı yaprak örneği. Taşıyıcı dolu ama taşan olmadığı unutulmamalıdır. (E) numune tutucu içindeki numune taşıyıcı. (F) örneği, B tipi bir taşıyıcı ile kaplanır. Bu taşıyıcı madde, bir düz yüzeyi ve diğer tarafta bir kuyu olduğu0.3 mm derinliğindedir. Burada düz bir yüzey sandviç kullanılan örnek. (G), numune taşıyıcı HPF makinesi içine yerleştirilmesi için kapalı ve hazır. (Y) HPF aletin ön delik örnek tutucu dondurma eklenir içine HPF makinesinin içine sokulması. (I) 'in ısı ve basınç sensörü / tutucu. (J), bir QFS çalıştırmak için tipik bir sıcaklık eğrisi (EasyLog yazılımı ile toplanan veriler). Sıcaklık her saniye kaydedildi. Probun elektronik ikinci ve gerçek bir ısı ölçümü yansıtmamaktadır için çalışma başında başak kaynaklanmaktadır.
Şekil 3:. QFS kullanılan ekipmanlar QFS gibi plastik bir kutu ya da bir buz kovası gibi herhangi bir izolasyonlu bir kap içinde gerçekleştirilebilir (A) <./ Strong> kuru buz 1-2 cm derinliğinde bir tabakası burada QFS odasının alt, bir styrofoam kutu kapsar. (B), 13 mm delikleri olan bir ısıtıcı blok QFS sırasında ev numuneleri için kullanılır. Dijital veri kayıt cihazı ile Sıcaklık sondası ısıtıcı blok içinde saklanır. (C) örnekleri bloğunda yerleştirilmiş sıvı azot içinde ısıtıcı blok soğutulduktan sonra sıvı azot dökülür ve bu düzeneğin tamamı, QFS bölmesi içine yerleştirilir, . kuru buz (D) QFS oda örnekler sahiptir, böylece kuru buz ile doldurulur; kuru buz ile tüm bloğu kaplayan ısıtıcı için bir dezavantajı vardır. (D) kutusunun kaplandı ve daha sonra numuneler QFS işlem boyunca çalkalanır, bir çeker ocak içinde, döner bir karıştırıcı üzerinde taşınır.
Şekil4:.. Arabidopsis HPF-QFS tarafından hazırlanan yaprak Zeiss Terazi 200 HT FE MC TEM HPF-QFS tarafından hazırlanan ve görüntülü örneklerinden elde edilen sonuçlar (A) hücre duvarları ile bir kloroplast (CH) gösteren bir orta yüksek büyütmeli görüntü ve komşu hücrelerin sitoplazma. Vakuoller (V) elektron yoğun bir malzeme içerir. Ölçek çubuğu kloroplasta = 0.5 mikron. (B) yüksek büyütme görüntü. Ölçü bar = 100 nm. (C) komşu hücreler hücre duvarının yüksek ölçüde büyütülmüş görüntüsü. Dallanmış plasmodesma görünür (ok). Vakuol ile hücre duvarına bastırılarak düz plazma membranını edin. Sitoplazma yoğun ribozomlarla doludur. V vaküoldür. Tonoplast düzgün ve süreklidir. Ölçek bar = 200 nm. (D) buz hasar (yıldız) bölgeleri yakın kloroplast (CH) iyi tespitin alanlarını gösteren düşük büyütme görüntü. Ölçü bar = 0.5 um. (E), bir hücrenin Wal açısından yüksek ölçüde büyütülmüş görünüşüdürl ve mikrotübül. Kloroplastlar (CH) ve mitokondri (M) iyi bir şekilde korunması gösteren Ölçü bar = 100 nm. (F) Görüntü. Büyük siyah çökelek kurşun sitrat ile bölümleri boyama değil. Ölçek çubuğu = 1 mikron. Golgi (GA) (G) Yüksek büyütme görünümü. Ölçek bar = 200 nm. (H) Kötü kloroplastlara ve plazmoliz (siyah ok) detayların eksikliği gösteren örnek korudu. Ölçek çubuğu = 1 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokolün başarısı kullanıcıya büyük ölçüde bağlıdır. İlk olarak, gelişmiş hazırlık gerekli tüm maddeler kolaylıkla edinilebilir ve bütün bir HPF-QFS çalıştırmak tamamlamak için yeterli miktarda olmasını sağlamak için gereklidir. İkinci olarak, kullanıcı ve böylece doku yerli durumda değişiklikleri en aza indirerek, örnek işlemlerine en aza indiren bir verimli bir şekilde adım-adım için hareket, hızlı bir şekilde çalışmalıdır. Örnekleri dondurulmuş ve kurutulmuş olmadan önce bakım istemeden örneğin, örnek ısıtır herhangi bir işleme önlemek için alınması gereken bu yüzden bir eldivenli elin yerine önceden soğutulmuş forseps ile taşıma, soğuk tutulması şarttır kez. Hız ve protokol ile aşinalık ile verimliliği artırmak, böylece uygulama çalışır ilgi kişinin örnekleri düzeltmek başlamadan önce önerilir. Üçüncü olarak, kullanıcı FS ortamı yanı sıra sıvı azot ve kuru buz ile çalışan tehlikeleri kullanılan kimyasalların tehlikeleri farkında kalmalıdır. Bir çeker ocak FS ortamının hazırlanması ve QFS işlemi için gereklidir. Diğer tüm adımlar için, eldiven, laboratuvar kat dahil gerekli kişisel koruyucu ekipmanlar, kapalı burunlu ayakkabı ve gözlük tavsiye edilir.
Bitkiler, TEM için numune hazırlamak da dahil olmak üzere, oda sıcaklığında kimyasal tespit yerine cryofixation kullanılmasının avantajları, uzun bir 10 bilinmektedir. HPF veya kimyasal fiksatif ile sabit Nicotiana'da ve Arabidopsis kök ipuçları ultrastrüktürel karşılaştıran bir çalışmada HPF-FS yöntemi çok daha üstün sonuçlar 5 verdiğini bulundu. HPF-FS tarafından hazırlanan dokusunda plazmalemma ve diğer hücresel membranlar plazmalemma hücre duvara gömme idi, pürüzsüz, ve genellikle de dahil olmak üzere organellere mikrotübülüsler iyi örnekleri geleneksel yöntemlerle sabit zaman daha korundu. Soya kök nodüllerinin bir başka çalışmada tamponlu glutaraldehit tarafından bu "Kimyasal tespit sonucunayapısı ve fonksiyonu. ilişkisine müsaade bir devlet soya kök nodül ultrastrüktürel korumak değildir "Ve bu sadece alternatif HPF-FS olduğunu söylemeye devam ediyor 2. Plasmodesmata komşularına bitki hücresinin zara-bağlı kanallar vardır, ama olan alt da TEM ile çözmek için zordur. HPF veya FS tarafından izlenen bir propan jet dondurucu ile cryofixation plasmodesmal yapı 18 ince ayrıntıları tanıtılması amaçlanmıştır çalışmalarda kimyasal tespiti üzerine seçildi. Bu erken bulgulara rağmen, geleneksel sabit dokular TEM çalışmaları halen bitki bilimleri norm vardır. Bunun nedeni, geleneksel yöntemlere uygun olarak veya halihazırda kullanılan FS protokolleri için, uzun bir süre hazırlayıcı bağlanmış HPF-FS ekipman görünüşte maliyetlidir için basit bir bağlılık olabilir.
QFS için prosedür TEM 15 için numune hazırlama hızlandırmak son yeniliktir. QFS olmuşturTüm C. hazırlamak için kullanılan elegans ve N. benthamiana cryofixation 15 sonra bırakır. Bu HPF ile tespit edilecek olan numuneler, nispeten kalın ve HPF-FS ile Nicotina örneklerinin hazırlanması Geleneksel olarak katı 12, 13, 14 çok uzun FS kullanmıştır. Bu protokol için biz model bitkisi, Arabidopsis yapraklarını kullandım. Nicotiana ve diğer bitki örnekleri için uzun FS kez mantık çözücülerin ve suyun muhtemel değişimi, hücrelerin büyük vakuoller yavaşlatılabilir olduğudur. Bununla birlikte, iyi dondurulmuş bir numune donuklaştırma hücrelere en az hasara neden gerektiği tahmin edilmektedir (15 ve ref. Olarak). Buz hasar oluşursa büyük olasılıkla kendini dondurma olup QFS kaynaklanır. FS için bile kısa protokol 15 bildirilmiştir. Bu süper hızlı FS (SQFS) FS için sadece 90 dakika kullanır. Bu protokolde, ısıtıcı blok numuneleri kuru i yokluğunda 100 rpm'de döndürüldüğüSQFS odasını örten olmadan ce. Bu numuneler -80 ° C'yi hızla ulaşmasını sağlar. Numuneler daha sonra ısıtıcı blok kaldırılır ve dengesiz üzerinde oda sıcaklığına ulaşmasına izin verilmiştir. SQFS başarılı bir şekilde kültür ve E. coli 'de yetiştirilen hücreler kurutmak için kullanılmıştır E. coli hücreleri. Henüz nedeniyle bitki dokularının kalınlığına bitki örnekleri ile SQFS kullanmaya teşebbüs değil.
Cryofixing ve daha sonra bir tandem HPF ve QFS ile bitki örnekleri dehidrasyon için protokol, mevcut protokoller üzerinde önemli bir gelişmeyi temsil eder. Reçine sızması önce numune hazırlama için zaman yerine artık birkaç gün birkaç saat indirgenir. QFS yöntemi 15 geliştirmenin yanı sıra, McDonald yakın zamanda kuru buz 19 olmadan reçine aşağıdaki SQFS ile bitki dokularının hızlı infiltrasyon için protokoller yayınladı. Bitki dokuları, genellikle gece boyunca yavaş yavaş da dahil olmak üzere çok sayıda uzun inkubasyon ile reçine ile infiltre edilmiştir. Bu yeni protokesit için dondurma 6 saat: sütunlar bile kısa bir örnek işleme süreleri sonuçlanır. Böylece gelecekte, HPF-QFS ve hızlı sızma kombinasyonu TEM için bitki numune hazırlık için geçerli protokolleri değiştirmeniz gerekir. Ticari QFS Kiti (http://www.emsdiasum.com) Elektron Mikroskobu Sciences yoluyla şu anda mevcut olmasına rağmen, ek olarak, QFS prosedür, ucuz olması ve farklı amaçlar için kullanılabilecek ortak bir laboratuar ekipmanı kullanır. Her iki seçenek de üzerinde 50.000 $ mal olabilir özel bir dondurma ikame birimi satın alma maliyeti üzerinde çok büyük bir tasarruf temsil eder.
Bu HPF hazırlanan örneklerin uygulamaları ve FS rutin TEM ile analiz ermeyen not edilmelidir. Bu şekilde hazırlanan numuneler antijenitelerini korurlar ve bu nedenle de immünolojik etiketleme 17, 19 dahil olmak üzere, antikor bazlı yaklaşımlar da kullanılabilir. Bu numuneler de, gelişmiş üç boyutlu yapı analizi için kullanılabilmektedirelektron tomografisi 20 üzerinden. HPF-FS numuneleri bile karşılıklı ışık ve EM 21, 22 ile birlikte kullanılabilir. Böylece, cryofixing ve daha sonra dehidrasyon örnekleri farklı sistemlerde çalışan araştırmacılar çeşitli yararlı olacaktır için prosedürler iyileştirmeler devam etti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UC Berkeley Dr Kent McDonald iyilik ve cömertlik büyük takdir. Biz çok yararlı önerileri için anonim bir eleştirmen teşekkür ederim. Burch-Smith laboratuvar Tennessee Üniversitesi'nden start-up fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
