Introduction
상피 - 간엽 전환 (EMT)의 배 발생시 기관의 형태 형성 및 조직 리모델링을 구동하는 발달 프로그램입니다. 비정상적으로 활성화되면, EMT는 종양 전이 및 장기 섬유화 1,2를 촉진한다. 강제적 인 연구 cobble-의 유실있는 adherens 접합 단백질 E-카드 헤린의 발현을 억제 그러한 트위스트, 달팽이 및 ZEB 여러 전사 인자,,,로 정의, EMT 과정에서 전사 조절의 중요성을 설명 하였다 상피 형태와 스핀들 모양의 중간 엽 표현형 3-8의 이득과 같은 돌. RNA를 게놈 차원의 분석을 통해 최근의 연구 접합 패턴 상피 또는 중간 엽 표현형 9, 10 중 하나와 관련된 유전자의 그룹이 존재하는 것으로 나타났습니다. 우리가 실험실에서 작업 기능적 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)와 EMT 연결. 세포 표면 부착 분자 CD44을 연구함으로써 CD44의 altern 시연극상의 접합이 긴밀하게 EMT 동안 규제하고, 더 중요한 것은, 인과 적으로 전환하는 CD44 스플 라이스 이소 11 EMT에 기여한다.
대안 12-14을 접합하는 인간의 다중 엑손 유전자의 95 %까지로 대체 접합은 유전자 조절의 광범위하고 보존 모델을 나타냅니다. 단일 유전자로부터 다중 단백질 제품을 생성함으로써, 대안적인 스 플라이 싱은 인간 게놈에 또 다른 층의 복잡성을 추가 단백질 다양성 필수기구를 구성한다. 따라서, 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 조절 이상이 잠재적으로 인간의 질병을 일으키는 원인이 심오한 생물학적 효과가 발생할 수 있습니다. 사실, 질병에서 벗어난 대안으로 연결할 수는 spliceosome 기계를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 일반적으로 골수 형성 이상 증후군 26 ~ 28에서 발견되는 최근의 연구 결과를 포함, 10 년 이상 15 ~ 25에 설명되어 있습니다. 따라서, 다르게 스 플라이 싱 된 난의 검출을위한 신뢰성있는 방법을 개발soforms는 EMT 등 다양한 생물학적 과정의 연구에 매우 중요하다.
여기서 우리는 유도 EMT 모델을 사용하여 대체 스 플라이 싱의 변화를 검출하는 프로토콜을 제공한다. 스플 라이스 이소 폼을 PCR 프라이머를 설계 및 검출하기위한 방법이 EMT 대체 스 플라이 싱 동안의 연구뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에서 대체 스 플라이 싱의 연구뿐만 아니라 적합하다. EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 더 조사하면, 따라서 암 전이를 치료하기위한 효과적인 전략의 개발을 촉진 EMT 및 종양 전이의 메커니즘을 이해하기 위해 필수적이다.
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Protocol
EMT 유도의 1 세포 배양
참고 : EMT는 TGFβ의 치료 또는 상피 세포에서 전사 인자 트위스트, 달팽이, 또는 Zeb1 / 2의 이소성 발현에 의해 유도 될 수있다. 불후의 인간의 유방 상피 세포 (HMLE / 트위스트 - ER 박사는 J 양의 선물, UCSD) 9,11,29의 트위스트 - ER 융합 단백질의 발현을 통해 유도 EMT 시스템은이 프로토콜에 설명한다. 4 hydroxytamoxifen (TAM) 처리시, 융합 단백질 트위스트-ER은 12-14일 9,11,29에 전체 EMT 전환에 전사 및 성과를 위해 핵 옭. 같은 HMLE / 달팽이-ER, HMLE / TGFβ 및 MCF10A / TGFβ 등의 추가 EMT 유도 시스템은 이전 출판물 11,30에서 찾을 수 있습니다.
- 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 무 혈청 유방 상피 세포 성장 매체 (MEGM)에서 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 유지한다. 통로 세포는 2-3 일마다 그들은 80 %의 합류에 도달하면. 5 % 혈청 / DMEM과 트립신을 비활성화 한 후 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 0.15 % 트립신으로 세포를 품어합니다. 세포를 스핀 다운 및 MEGM에서 그들을 재현 탁. 1 내지 4의 비율로 새로운 조직 배양 접시에 접시 세포.
- 200 μM 솔루션을 만들기 위해 에탄올에 TAM을 녹인다. -20 ° C에서 빛과 상점에서 TAM를 보호합니다. 20 nM의 TAM의 최종 농도를 희석하기 위해 10,000 : 사용 전에 갓 1에서 MEGM 매체를 추가로 TAM.
- EMT의 유도를 들어, 중복에 10cm 조직 배양 접시에 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 접시. 20 nM의 TAM 함유 MEGM 미디어와 문화 세포.
- 중복에 10cm 접시에 플레이트 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포와 비 TAM 처리 제어와 같은 0.01 % 에탄올로 치료 세포.
- 두 일 배양 한 후, 세포의 형태 학적 변화를 기록하기 위해 10 배 배율의 광학 현미경 사진을 찍을.
- 제어 또는 TAM 처리의 한 접시에서 매체를 기음세포. RNA 분리 및 단백질 분석 RIPA 버퍼 내의 다른 절반 RNA 용해 완충액 플레이트의 절반을 폐기하여 차가운 PBS와 세포 및 세포 수확을 씻는다.
- 중복에 10cm 접시에 재 도금 1.6 × 10 6 세포에 의한 제어 또는 TAM 처리 된 요리에서 통과 세포. 연속 20 nM의 TAM 또는 차량 세포를 취급합니다.
- 반복 차량 처리 된 대조군 세포는 조약돌 모양의 상피 세포 형태를 유지하는 반면, 어떤 시간에, TAM 처리 트위스트 - ER 세포, 방추형 중간 엽 형태를 보여, 14 일까지 5 회 매일 7 단계를 반복합니다.
EMT의 2 특성
참고 : EMT의 완료가로 표시됩니다 : 스핀들 모양의 섬유 모세포와 같은 외관 조약돌 모양의 상피 형태에서 (1) 셀 형태 학적 변화; (2) 세포 - 세포 접합에서 E-cadherin의 현지화 패, 손실에 의해 정의 EMT 마커 및 (3) 식 스위치,상피 마커 및 중간 엽 마커의 이득.
세포 형태 학적 변화는이 절에 설명되어 세포 접합부에서 E-cadherin의 제 1 면역 형광 검출에 설명, EMT 유도의 시간 경과시 10 배 배율의 광학 현미경에 의해 캡처됩니다. EMT 마커의 발현은 발현 수준에 의해 검출된다. 일반적인 상피 마커는 E-cadherin의, γ-catenin이, 그리고 occludin, 그리고 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴을 포함한다. 면역 블로의 일반 절차는 4 절에 설명되어 있습니다.
- TAM 처리, 시드 24 - 웰 플레이트에 넣고 잘 12mm 원형 유리 커버 슬립에 1 × 105 세포에서 12 일.
- 미리 예열 PBS와 시드, 흡인 매체 및 세척 세포 후 48 시간.
- 15 분 동안 미리 예열 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
- PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
- 15 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 부화RT에서 분.
- PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
- 비특이적 결합 차단 RT에서 1 시간 동안 5 % BSA / PBS에서 세포를 배양한다.
- 4 ° C에서 1:50 희석 1 %의 BSA / 가습 챔버 O에서 PBS / N에 차 항체 E-cadherin의와 세포를 품어. 참고 : 차 항체의 희석 범위는 1:50 일 사이에 일반적입니다 : 200, 각 항체에 대한 최적의 희석은 실험적으로 결정되어야한다.
- 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다.
- 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1에 형광 표지 된 이차 항체와 세포를 품어. 에서이 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다.
- 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 3 회 씻는다.
- 를 10 분 동안 0.1 g / ㎖ DAPI 또는 훽스트와 얼룩 셀.
- PBS로 3 회 세포를 씻어.
- 마운트 매니큐어와 장착 매체의 드롭 및 밀봉 된 커버로 된 커버.
- 세포를 관찰하고 수행63X 형광 현미경 이미지.
추가 항체로 염색하는 EMT 표현형을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, N-cadherin의 및 α-평활근 액틴은 중간 엽 표현형 29,31,32 스테인드 할 수 있습니다. 골격 구조의 개편은 F-액틴 11 phalloidin으로 세포를 염색하여 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 세포 운동성 및 세포 사멸에 대한 저항성 분석법 EMT (11)의 특성을 조사하기 위해 수행 될 수있다.
QRT-PCR 분석 실험을 사용하여 검출 스플 라이스 동종의 3
- 프라이머 디자인
NOTE : 프라이머 쌍은 신중 구별 동종 접합을 증폭하도록 설계되어야한다. 스킵 엑손, 가장 일반적으로 관찰 대안 접합 이벤트, 프라이머 디자인 전략을 설명하기 위해 예로서 여기에 도시되어있다.도 1a는 가변 엑손로서 제 엑손으로, 네 엑손 사전의 mRNA를 도시한다. 엑손의 포함 3 결과엑손 3의 스킵 반면 긴 스플 라이스 이소 형의 생산은, 스플 라이스 짧은 이소 형을 생성한다. 프라이머는 엑손-3-이소 포함하고 엑손-3-이소 스킵를 구별하고,이 전체의 mRNA 전 사체를 검출하도록 설계 될 필요가있다.- 엑손 개재물의 검출을 위해, 신중하게 가변 엑손 포함 이소 형의 비 증폭을 허용 변수 엑손 3 및 인근 항시 엑손 4 내부 역방향 프라이머 안에 순방향 프라이머를 설계한다. 순방향 설계 및 게놈 DNA 또는 전-mRNA의 PCR 증폭에서 제품을 피하기 위하여 동일한 변수 엑손 내의 역방향 프라이머하지 않도록주의.
- 특히 엑손 건너 뛰는 이벤트, 디자인을 증폭하려면 변수 엑손 3가 포함 된 경우, 그렇지 않으면 파괴 될 것이다 구성 적 엑손 2 엑손 4의 교차점에 걸쳐 프라이머 중 하나. 이와 같이 항시 적 엑손 4 안에 다른 프라이머를 설계, PCR 제품 변수 엑손 3 exclud 때만 생성된다ED 및 엑손 2, 엑손 사이어서 서로 결합 항시.
- , 유전자의 전체 전 사체를 검출이 항시 엑손 1 및 2에서 프라이머를 설계하기 때문에, PCR 생성물은 모든 아형에서 증폭된다.
- 반드시 모든 프라이머에 대한 융해 온도 (TM)는 약 55 ° C, 각 프라이머의 길이는 약 18-22 뉴클레오타이드이다 확인하고, PCR 생성물의 크기는 80 내지 150 염기쌍이다.
- RNA 추출 (재료의 표 참조) 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다.
- 350 ㎕의 RNA의 용해 완충액에 세포를 수집한다.
- 해물을 70 % 에탄올 350 μl를 첨가하고 잘 섞는다.
- RNA 정제 컬럼에 샘플을 전송합니다.
- 1 분 및 폐기의 흐름을 통해 10,000 XG에 원심 분리기.
- RNA의 세척 버퍼 II 회 RNA 세척 버퍼 I의 500 μL와 배의 열을 씻으십시오.
- 잔류 RNA 세척 버퍼를 제거2 분 동안 최대 속도에서 원심 분리에 의해 컬럼으로부터 II.
- , 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 열을 이동시켜 열 행렬의 중심에 50 μL 클레아없는 물을 첨가하고 최대 속도로 원심 분리하여 RNA를 용출시킨다.
- 첫 번째 가닥의 cDNA 합성
- UV 흡수 측정에 의한 농도와 RNA의 품질을 결정합니다. 참고 : 좋은 품질의 RNA는 약 2.0의 260 나노 미터 / 280 nm의 흡광도 비율을 가지고 있어야합니다.
- 20 μL의 최종 볼륨에서 250 NG 총 RNA, 0.05 μg 랜덤 헥사 머 프라이머, 50 pmol의 MgCl2를, 10 pmol의의의 dNTP, 2 ㎕의 5 × GoScript 버퍼, 1 μL RT 효소를 포함하는 역전사 효소 (RT) 반응을 설정합니다.
- RT 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 70 ° C에서 배양 한 다음 1 시간, 42 ° C에서 RT 반응을 수행합니다.
- 실시간 PCR
- 10 μL의 SYBR 녹색 마스터 믹스로 구성되어 20 ㎕의 반응을 설정,0.1 ~ 1.0 ㎕의 cDNA를 템플릿, 5 pmol의 앞으로 및 역방향 프라이머.
- 다음 단계의 40주기 실시간 PCR을 실행하여 95 ° C 변성을 10 초, 10 초 동안 58 ° C 어닐링, 30 초 동안 60 ° C의 확장을 위해. 세중에서 PCR 반응을 수행합니다.
- 해리 곡선을 확인하고 하나의 피크가 각각의 프라이머 세트에 대한 관찰되어 있는지 확인합니다.
- 증폭 곡선의 이차 미분 값을 계산하여 정량화 사이클 (Cq와) 값을 얻습니다.
- '델타 델타 Cq와 (ΔΔCq)'다음의 화학식으로 나타낸 바와 같이 방법을 사용하여 유도되지 않은 샘플과 비교하여 샘플에서 유도 된 대상의 mRNA의 상대적 양 (RQ)를 계산한다. 참고로, 같은 GAPDH 또는 TBP 등의 하우스 키핑 유전자를 사용합니다.
더 정확하게 스플 라이스 동종의 상대 값을 계산하려면 t그는 고려되어야 여러 참조 유전자의 사용합니다. 결과 Pfaffl 외 33,34 설명 변성 절대치 정량 방법을 사용하여 분석 할 수있다.
단백질 수준에서 스플 라이스 동종의 4 시험
- 100 ㎕의 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 세포를 수집합니다.
- 약 10 분 동안 얼음에 해물을 설정합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리하고, 상층 액을 수집합니다.
- 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정한다.
- SDS 로딩 버퍼에 단백질 시료를 희석하고 10 % SDS-PAGE 젤에 단백질의 20 ~ 40 μg을로드합니다.
- 1.5 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE 젤을 실행합니다.
- 85 V.에서 3 시간 동안 4 ° C에서 젖은 전송 시스템에서 PVDF 멤브레인에 전송 단백질은 목적 단백질의 분자량에 따라 전송 시간을 조정합니다.
- 30 분 실온에서 1 시간에 5 % 무 지방 우유에 차단 막.
- 막 위스콘신 품어4 ° CO / N에 차 항체를 일. (200)와 1 : 5000, 실험적 각 항체에 대한 최적의 희석을 결정 차 항체 희석의 범위는 일반적으로 (1) 사이에있다. 이 프로토콜에서 사용되는 항체의 희석은 "특정 시약 및 장비의 테이블"에서 찾을 수있다.
- 스플 라이스 아형을 검출하기 위해, 특히 특정한 이소 형을 인식하는 항체를 사용한다. 대안 적으로, 구성 적 코딩 엑손 영역의 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 서로 다른 크기의 단백질을 기반으로 동시에 접합 아형을 검출한다.
- 동시에, EMT 마커에 대한 발현 수준에 의해 EMT를 모니터링 할 수 있습니다. 중간 엽 마커로 사용하여 E-cadherin의, γ-catenin이, 상피 마커로 occludin 및 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴.
- 5 분 간격으로 TBS-T (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, 산도 7.4)로 세척 막 세 번.
- HRP-결합 된 보조 개미와 멤브레인을 품어실온에서 1 시간 동안 만 희석 : 1 ibody.
- 5 분 간격으로 TBS-T로 세척 막 세 번.
- 화학 발광 검출 계와 단백질을 시각화하고 오토 라디오 그래피 막에 막을 노출.
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Representative Results
상술 한 절차는 EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 검출하는 강력한 방법을 제공한다. 트위스트에 의한 EMT 동안 CD44 스플 라이스 이소 전환의 대표적인 결과는 예를 들어 다음과 같습니다.
HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 트위스트에 의한 EMT는 가늘고 긴 섬유 모세포 표현형 상피 표현형 같은 자갈 돌에서 전환 (그림 2A), 상피 마커 E-cadherin의, γ-catenin이와 occludin과의 부재에 의해 특징했다 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴 (그림 2B)의 상향 조절. 또한, EMT는 세포 - 세포 접합 (그림 2C)에서 E-cadherin의 현지화의 손실에 의해 평가되었다.
EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 전환 표현은 QRT-PCR과 면역 블로에 의해 조사 하였다. 인간 CD44 유전자는 구 변수 엑손으로 구성되어 있습니다. CD44의 대체 접합 프로에 셀 수 있습니다적어도 하나의 가변 엑손, 모든 변수 엑손의 결여이다 CD44 표준 (CD44s)를 포함 줄 이도록 CD44 변이체 (CD44v는).도 3a는 다양한 CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인 전략을 도시한다. 역방향 프라이머는 V5 및 V6 변수를 함유 CD44v 클로우 아형을 검출하기위한 구성 적 엑손 5와 6 사이의 접합부에 걸쳐있는 동안 엑손 - 스킵 제품 CD44s의 검출을 위해, 정방향 프라이머는 항시 엑손 5에 위치하고 엑손, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 V5 및 V6 내에 설계된다. 다른 CD44 가변 엑손 - 함유 동종의 검출을위한 프라이머가 동일한 전략을 사용하여 설계 될 수있다. 또한, 총 CD44 성적 증명서 앞으로의 사용과 구성 적 엑손 2 엑손 3 각각 (그림 3A)에있는 역방향 프라이머를 검출한다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, QRT-PCR을 다음의 프라이머 세트를 이용하여 CD의 유의 한 감소를 나타 분석44V의 mRNA와 트위스트 - ER 발현 HMLE 세포에서 TAM 치료 14 일 후 CD44s mRNA의 증가. 대조적으로, CD44의 전체 성적은 EMT (그림 3C) 동안 변화가 없었다. CD44s 단백질의 발현이 크게 (도 3d)를 상향 조절 하였다 반면 QRT-PCR의 결과와 일치, CD44v 단백질의 수준은 현저하게 감소 하였다. 따라서, CD44의 주요 이소 형이 EMT 과정에서 CD44s에 CD44v 어긋나 있었다.
그림 1 프라이머 디자인. 엑손 스키핑 모델에서 스 플라이 싱 이소 검출 용 프라이머의 위치를 설명하기위한 개략도. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치는 indicat 아르화살표로 에드 : 검은 색 화살표는 전체의 mRNA를 검출하기위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 엑손 포함 이소을 증폭하기위한 프라이머 세트를 나타내며, 파란색 화살표는 엑손 스키핑 동종를 검출하기위한 프라이머 세트를 나타냅니다.
EMT의 2 유도 그림. (A) 위상 콘트라스트 이미지 (10 배)이 전 (치료) HMLE / 트위스트 - ER 세포의 형태 학적 변화를 설명하고 TAM 치료 14 일 후. (B) 면역 블롯 전에 HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 EMT 마커 분석 (치료) 및 TAM 치료 14 일 후. TAM 처리, 하향 조절 하였다 상피 마커 E-카드 헤린, γ-카테닌, 및 occludin 및 간엽 마커 피브로넥틴, N-카드 헤린 및 멘틴에 상향 조절되었다. (C) 면역 형광 이미지 (63X) E-카드 헤린의 손실을 나타내는TAM 치료 14 일 후 세포 - 세포 접합에서 현지화. 그린 염색은 E-cadherin의를 표시하고, DAPI 염색 (파란색) 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 그림 3 스위치. (A) CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치를 화살표로 표시됩니다 : 검은 색 화살표가 CD44 총 mRNA의 검출을위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 CD44v5-6을 증폭 프라이머 세트를 표시하고 파란색 화살표를위한 프라이머 세트를 나타냅니다CD44s 검출. (B, C) 즉 CD44v 가변 엑손의 V5 및 V6 (V5가 / 6) 및 CD44s (B), 및 CD44 전체의 mRNA를 함유하는 검출 EMT는 프라이머를 사용하는 동안 CD44 이소 형의 수준 QRT-PCR 분석 (C) . 일에서의 mRNA의 상대적 발현 수준은 14 세포는 TAM의 공 세포 치료 해당 일 및 처리하지 않은 그룹에 정상화되었다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다; N = HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 TAM에 의한 EMT 동안 CD44 이소 형의 3 (D) 면역 블롯 분석. E-카드 헤린 및 N-카드 헤린의 수준은 EMT 상태를 파악하기 위해 모니터링되었다.
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Discussion
여기에 설명 된 절차를 유도 EMT 모델에서 스 플라이 싱의 검출을 가능하게한다. 스플 라이스 이소 형의 발현의 이러한 동적 변화가 EMT의 시간 경과에 걸쳐 캡처 할 수있다. UN 관련 세포주 구별 유전 배경 부당 대체 스 플라이 싱에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 방법은 다른 스 플라이 싱의 비교를위한 상이한 epithelial- 또는 간엽-나타내는 세포주의 사용에 이점을 갖는다. 그러나, EMT의 성공적인 유도 신중하게 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 변화에 어떤 결론을하기 전에 다양한 EMT 마커를 그릴 수 있습니다 사용하여 확인해야합니다. 또한, 여기에 설명 된 트위스트 - ER-유도 EMT 시스템에 추가하여, 이러한 달팽이-ER 또는 TGFβ에 의해 유도 된 것과 같은 다른 EMT 시스템은 실험 결과 11,30의 검증을 위해 사용하는 것이 좋습니다.
EMT 동안 동종 접합의 스위칭 모두 RNA 및 단백질 수준에서 검출 할 수있다. 스플 라이스 이소형태 - 특이 항체는 단백질 분석을 위해 바람직하다. 이소 형 - 특이 항체를 사용할 수없는 경우에는, 스플 라이스 동종의 단백질 수준을 면역 블 롯팅에 의해 SDS-PAGE에 자신의 분자량에 기초하여 결정될 수있다. 각각의 이소 형의 RNA 수준은 이소 형 - 특이 적 프라이머로 정량화 될 수있다. QRT-PCR 분석을 사용하여 각 이소 형의 배 변화는 민감하고 정확하게 측정 할 수 있습니다. 실험 재료와 같은 임상 검체에서 특정 스플 라이스 이소 형의 발현을 분석하기로 한정 될 때, 특히, QRT-PCR 분석은 면역 조직 화학에 대한 이소 형 - 특이 항체의 부족을 보상 할 정량적 측정 값을 제공한다.
여기에 언급 된 방법은 EMT 동안 공지 스플 라이스 이소 변화의 검출에 적합하다. 또한,이 방법은 게놈 전체의 대체 스 플라이 싱의 연구 및 EMT 동안 신규 한 접합 이소 스위칭의 식별을 위해 확장 될 수있다. 이를 위해서는그러한 깊은 시퀀싱 RNA 스 플라이 싱 또는 민감한 마이크로 어레이 플랫폼으로서 대규모 기법의 사용은, 상기 유도 EMT 모델로부터 분리 RNA를 사용하여 수행 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이소 변경 QRT-PCR 유효성 검사는 대규모 분석 다음이 필요합니다.
결론적으로, 대안적인 스 플라이 싱은 동적 EMT, 배아 발생 및 종양 전이를위한 중요한 과정 중에 조절된다. 인간 게놈에서 대체 스 플라이 싱의 고주파를 고려할 때 대체 스 플라이 싱의 조절은 세포 분화, 조직 개발, 프로그램 된 세포 사멸 35-41 포함하여 많은 다른 생물학적, 병리학 적 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 스플 라이스 동종의 검출을 위해 본원에 기재된 프로토콜뿐만 아니라 이러한 다른 시스템에 적용 할 수있을 것이다.
이러한 접합 기자 minigene 분석 등의 추가 실험 양식, 수 b전자는 더 시스 행동 요소와 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing) 30,42,43를 제어 트랜스 작용 요인의 규제 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, EMT 동안 특정 스플 라이스 이소의 기능적 역할은 침묵 또는 ectopically 특정 이소을 표현하고 설명 EMT 유도 시스템 (11)에 EMT 유도를 모니터링하여 조사 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
| CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1,000 dilution |
| E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
| γ-Catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1,000 dilution |
| Occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
| Fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5,000 dilution |
| N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2,000 dilution |
| Vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
| GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10,000 dilution |
| Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |
References
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- Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
- Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
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- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
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