Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning av alternativ spleising Under epithelial-Mesenchymale Transition

Published: October 9, 2014 doi: 10.3791/51845
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

Epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) er en utviklings program som driver organ morphogenesis og vev remodeling under embryogenesen. Når unormalt aktivert, fremmer EMT tumometastaser og orgel fibrose 1,2. Overbevisende studier har beskrevet viktigheten av transcriptional regulering under prosessen med EMT, definert av flere transkripsjonsfaktorer som Twist, sneglen, og ZEB, som undertrykker uttrykk for adherens krysset protein E-cadherin, som resulterer i tap av en cobble- stein som epithelial morfologi og gevinst på en spindel-formet mesenchymale fenotype 3-8. Nyere studier gjennom genom-bredt analyse av RNAer avslørte at det eksisterer en gruppe av gener hvis spleising mønstre er forbundet med enten epiteliale eller mesenkymale fenotyper 9,10. Arbeid fra vår lab funksjonelt koblet alternativ spleising og EMT. Ved å studere celleoverflaten adhesjonsmolekylet CD44, vi viste at CD44 alternAtive spleising er strengt regulert i EMT, og enda viktigere, at CD44 spleise isoform bytte årsaks bidrar til EMT 11.

Alternativ spleising representerer en utbredt og konservert modell av genregulering, som opp til 95% av menneskelige multi-ekson gener er alternativt skjøtes 12-14. Ved å generere multiple proteinprodukter fra en enkelt gen, utgjør alternativ spleising en viktig mekanisme for protein diversitet, og legger et lag av kompleksiteten til det humane genom. Som sådan, kan feilregulering av alternativ spleising potensielt føre til dyptgripende biologiske effekter forårsaker menneskelige sykdommer. Faktisk er dokumentert avvikende alternativ spleising i sykdommer i over et tiår 15-25, inkludert nylige funn at mutasjoner i gener som koder for spliceosome maskiner er ofte funnet i myelodysplastisk syndrom 26-28. Derfor er utvikling av pålitelige fremgangsmåter for påvisning av alternativt spleisede isoforms er av stor betydning i studiet av ulike biologiske prosesser, inkludert EMT.

Her gir vi en protokoll for å oppdage endringer i alternativ spleising ved hjelp av en induserbar EMT modell. Metodene for å designe PCR primere og oppdager skjøte isoformer er egnet ikke bare for studier av alternativ spleising under EMT, men også for studier av alternativ spleising i andre biologiske prosesser. Gransker alternativ spleising under EMT er avgjørende for å bedre forstå mekanismene for EMT og tumor metastasering, og dermed legge til rette for utvikling av effektive strategier for å behandle kreft metastasering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture of EMT Induksjon

Merk: EMT kan induseres ved behandling av TGFβ eller ektopisk uttrykk for transkripsjonsfaktorer Twist, sneglen, eller Zeb1 / 2 i epitelceller. Beskrevet i denne protokollen er en induserbar EMT system via uttrykk for Twist-ER fusjonsprotein i udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller (HMLE / Twist-ER, en gave av Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Ved 4-hydroxytamoxifen (TAM) behandling, translocates fusjonsproteinet Twist-ER til kjernen for å drive transkripsjon og resulterer i en full EMT overgang i 12-14 dager 9,11,29. Andre EMT induserbare systemer, for eksempel HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFβ, og MCF10A / TGFβ, kan finnes i våre tidligere publikasjoner 11,30.

  1. Oppretthold HMLE / Kronglete ER celler i serumfrie melke epitelial cellevekst medium (MEGM) i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Passage cellene hver 2-3 dager når de når 80% samløpet. Inkuber cellene med 0,15% trypsin ved 37 ° C i 5-10 min, og deretter inaktivere trypsin med 5% kalveserum / DMEM. Spinn ned celler og resuspender dem i MEGM. Tallerken celler i en ny vevskultur fatet i et forhold på 1 til 4.
  2. Oppløs TAM i etanol for å lage en 200 mM oppløsning. Beskytt TAM mot lys og oppbevares ved -20 ° C. Før bruk, fersk legge TAM i MEGM medier ved en 1: 10,000 fortynning for å lage en endelig konsentrasjon på 20 nM TAM.
  3. For induksjon av EMT, plate 1,6 x 10 6 HMLE / Kronglete ER celler i en 10 cm vev kultur fatet i to eksemplarer. Kultur celler med 20 nM TAM-holdige MEGM medier.
  4. Plate 1.6 x 10 6 HMLE / Kronglete ER celler i en 10 cm tallerken i to eksemplarer og behandle celler med 0,01% etanol som en ikke-TAM-behandlet kontroll.
  5. To dager etter inkubasjon, ta bilder under et lysmikroskop på 10X forstørrelse å registrere morfologiske endringer av celler.
  6. Aspirer mediet fra en tallerken av kontroll eller TAM-behandletceller. Vask celler med kald PBS, og høste celler ved skraping halvparten av platen i RNA lysis buffer for RNA isolering, og den andre halvparten i RIPA-buffer for proteinanalyse.
  7. Passage celler fra kontroll eller TS-behandlede retter ved re-plating 1,6 x 10 6-celler i en 10 cm plate i duplikat. Kontinuerlig behandling av cellene med 20 nM TAM eller kjøretøy.
  8. Gjenta trinn 5 til 7 en gang annenhver dag frem til dag 14, da, TAM-behandlede Twist-ER cellene vise en spindel-formet mesenchymale morfologi, mens placebobehandlede kontrollceller opprettholde brostein lignende epithelial morfologi.

2. Karakterisering av EMT

Merk: En gjennomføring av EMT er angitt med: (1) Celle morfologiske endringer fra et brostein-lignende morfologi epitelial til en spindel-formet fibroblastisk lignende utseende; (2) Tap av E-cadherin lokalisering på celle-celle veikryss; og (3) slås ekspresjon av EMT markører, definert ved tapav epiteliale markører og gevinst på mesenchymale markører.

Celle morfologiske endringer fanges opp av lysmikroskop ved 10x forstørrelse under tidsforløpet av EMT induksjon, er beskrevet i avsnitt 1. Immuno-fluorescence deteksjon av E-cadherin i celle-kryss er beskrevet i denne seksjonen. Ekspresjon av EMT markører blir detektert ved immunoblotting. Vanlige epiteliale markører er E-cadherin, γ-catenin, og occludin, og mesenchymale markører fibronectin, N-cadherin og vimentin. Generelle prosedyrer for immunoblotting er beskrevet i kapittel 4.

  1. På dag 12 av behandlings TAM, frø 1 x 10 5 celler på en 12 mm glass sirkulær dekkglass plassert i en brønn i en 24-brønns plate.
  2. 48 timer etter såing, aspirer medium og vaske celler med forvarmet PBS.
  3. Løs-celler med forvarmet 4% paraformaldehyd i 15 min.
  4. Vask cellene tre ganger med PBS.
  5. Inkuber cellene med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15min ved RT.
  6. Vask cellene tre ganger med PBS.
  7. Inkuber cellene i 5% BSA / PBS i 1 time ved RT for å blokkere ikke-spesifikk binding.
  8. Inkuber cellene med det primære antistoffet E-cadherin i en 1:50 fortynning i 1% BSA / PBS i et fuktet kammer O / N ved 4 ° C. MERK: Området for primære antistoff fortynning er vanligvis mellom 1:50 og 1: 200, og den optimale fortynning for hvert antistoff skal bestemmes eksperimentelt.
  9. Dekanter det primære antistoff og vask cellene tre ganger med PBS.
  10. Inkuber cellene med fluorescent-merket sekundært antistoff i en 1: 500 fortynning i 1 time ved RT. Fra dette trinn, beskytter cellene mot lyse.
  11. Dekanter det sekundære antistoff og vask tre ganger med PBS.
  12. Flekk-celler med 0,1-1 g / ml DAPI eller Hoechst i 10 min.
  13. Vask cellene med PBS tre ganger.
  14. Mount Dekk med en dråpe monteringsmedium, og forsegle dekkglass med neglelakk.
  15. Observere celler og tabilder under en 63X fluorescerende mikroskop.

Beising med ytterligere antistoffer kan utføres for å bekrefte EMT fenotype. For eksempel kan N-cadherin og α-glattmuskel-aktin være farget for mesenchymale fenotype 29,31,32. Omorganisering av cytoskeletal struktur kan overvåkes ved farging celler med phalloidin for F-aktin 11. I tillegg kan celle-analyser for motilitet og celle-død motstand bli utført for å undersøke egenskapene til EMT 11.

3. Påvisning av Splice isoformer Bruke QRT-PCR-analyser

  1. Primer Design
    MERK: Primerpar bør være nøye designet for å forsterke forskjellige spleise isoformer. Exon hoppe, oftest observert alternativ spleising hendelse, vises her som et eksempel for å illustrere strategien primer design. Figur 1A viser en fire-ekson pre-mRNA, med den tredje ekson som en variabel ekson. Inkludering av ekson 3 resultater iproduksjonen av et lengre skjøt isoform, mens hoppe av exon 3 genererer en kortere spleise isoform. Primere trenger å være utformet for å skille exon-3-inkluderes isoform og exon-3-hoppet isoform, og å detektere den totale transkripsjon av dette mRNA.
    1. For påvisning av ekson inkludering, nøye designe en forward primer inne variabelen ekson 3, og en omvendt primer inne i nærheten konstituerende exon 4, noe som åpner for den spesifikke forsterkning av variabel ekson-inkludert isoform. Pass på ikke å designe både forover og bakover primere innenfor samme variabel ekson for å unngå PCR produktene forsterket fra genomisk DNA eller pre-mRNA.
    2. Å spesifikt forsterke ekson hoppe hendelser, design en av primere som spenner over krysset av det konstituerende exon 2 og exon 4 som ellers ville bli ødelagt når variabel ekson 3 er inkludert. Utforme den andre primeren inne i den konstitutive exon 4. Som sådan, er PCR-produktene genereres bare når det variable ekson 3 er excluded og den konstitutive exon 2 og ekson 4 blir deretter sammenføyd.
    3. For å påvise den totale transkripsjoner av genet, designe primere innen to konstitutive eksoner 1 og 2. Således blir PCR produktene amplifisert fra alle isoformer.
    4. Kontroller at smeltetemperaturen (Tm) for alle primere er omtrent 55 ° C, lengden av hver primer er omtrent 18 til 22 nukleotider, og størrelsen av PCR-produkter er mellom 80 og 150 basepar.
  2. RNA ekstraksjon: Pakk RNA ved hjelp av en total RNA isolering kit (se tabell for material).
    1. Samle celler i 350 mL RNA lysis buffer.
    2. Legg 350 pl av 70% etanol til lysatet og blandes godt.
    3. Overfør prøven til RNA rensing kolonnen.
    4. Sentrifuger ved 10000 x g i 1 min og utkast gjennomstrømning.
    5. Vask kolonnen en gang med 500 pl vaskebuffer I RNA og to ganger med vaskebuffer RNA II.
    6. Fjerne rester av RNA vaskebufferII fra kolonnen ved sentrifugering ved maksimal hastighet i 2 min.
    7. Overfør kolonnen inn i et nytt 1,5 ml rør, tilsett 50 ul nuklease-fritt vann ved senteret matrise av kolonnen og eluering av RNA ved sentrifugering ved maksimal hastighet.
  3. Syntese av First-strand cDNA
    1. Bestem konsentrasjonen og kvaliteten av RNA ved UV absorpsjonsmåling. MERK: God kvalitet RNA bør ha en 260 nm / 280 nm absorbans ratio på ca 2,0.
    2. Sett opp revers transkriptase (RT) reaksjoner som inneholder 250 ng total-RNA, 0,05 ug tilfeldig heksamer primer, 50 pmol MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 pl 5 x GoScript buffer, og 1 pl RT enzym i et sluttvolum på 20 pl.
    3. Utfør RT reaksjoner ved 42 ° C i 1 time, etterfulgt av inkubasjon ved 70 ° C i 5 min for å inaktivere enzymet RT.
  4. Real-time PCR
    1. Sett opp 20 mL reaksjoner som består av 10 mL SYBR green mester mix,0,1-1,0 mL cDNA mal, og 5 pmol forover og bakover primere.
    2. Kjør real-time PCR med 40 sykluser av følgende trinn: 95 ° C denaturering i 10 sek, 58 ° C avspenning i 10 sek, og 60 ° C forlengelse for 30 sek. Utfør PCR-reaksjoner i triplikat.
    3. Sjekk dissosiasjon kurver og sørge for at en enkel topp er observert for hver primer sett.
    4. Skaff kvantifisering syklus (Cq) verdier ved å beregne de andre avledede verdier av forsterkning kurver.
    5. Beregn den relative mengde (RQ) av mål-mRNA i induserte prøvene i forhold til uninduced prøven ved hjelp av den "Delta Cq (ΔΔCq) 'Fremgangsmåte som vist ved den følgende formel. Bruk husholdningsgener, slik som GAPDH eller TBP, som en referanse.

Ligning 1
Til mer nøyaktig beregne relative verdier Skjøt isoformer, than bruke av flere referanse gener bør vurderes. Resultatene kan analyseres ved hjelp av en modifisert absoluttverdien kvantifisering metode beskrevet av Pfaffl et al 33,34.

4. Undersøkelse av Splice isoformer på proteinnivå

  1. Samle-celler i 100 ul iskald RIPA-buffer.
  2. Sett lysater på is i omtrent 10 min.
  3. Sentrifuger ved 14000 xg i 10 min ved 4 ° C, og samle supernatanten.
  4. Måle protein konsentrasjon av Bradford-analyser.
  5. Fortynn proteinprøver i SDS loading buffer og laste 20-40 ug av proteiner til 10% SDS-PAGE-geler.
  6. Kjør SDS-PAGE-geler ved 20 mA for 1.5 hr.
  7. Overføring proteiner til PVDF-membraner ved en våt overføringssystem ved 4 ° C i 3 timer ved 85 V. Juster overførings tid i henhold til molekylvekten av målproteiner.
  8. Blokk membran i 5% fettfri melk i 30 min til 1 time ved RT.
  9. Inkuber membran with et primært antistoff ved 4 ° CO / N. Området for primære antistoff fortynning er normalt mellom 1: 200 og 1: 5000, bestemme den optimale fortynning for hvert antistoff eksperimentelt. Fortynningen av antistoffer som brukes i denne protokollen kan bli funnet i "Table av spesifikke reagenser og utstyr".
    1. For å oppdage skjøte isoformer, bruke spesifikke antistoffer som gjenkjenner en bestemt isoform. Alternativt kan du bruke et antistoff som gjenkjenner epitop på det konstituerende ekson koding regionen og oppdage skjøte isoformer samtidig ut fra sine ulike protein størrelser.
    2. På samme tid, overvåke EMT ved immuno for EMT markører. Bruk E-cadherin, γ-catenin, og occludin som epiteliale markører, og fibronectin, N-cadherin og vimentin som mesenchymale markører.
  10. Vask membran tre ganger med TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) ved en 5 minutters intervall.
  11. Inkuber membran med et HRP-konjugert sekundært mauriBody i en 1: 10 000 fortynning i 1 time ved RT.
  12. Vask membran tre ganger med TBS-T i en 5-minutters intervall.
  13. Visual protein med en kjemiluminescens påvisningssystem og utsette membranen for et autoradiografi film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor gir en robust metode for å detektere alternativ spleising under EMT. Representative resultater av CD44 splice isoform svitsjing under Twist-indusert EMT er gitt nedenfor som et eksempel.

Twist-indusert EMT i HMLE / Twist-ER celler ble preget av en overgang fra en brostein som epitelial fenotype til en langstrakt fibroblastic fenotype (figur 2A), fravær av epiteliale markører E-cadherin, γ-catenin og occludin og oppregulering av mesenchymale markører fibronektin, N-cadherin, og vimentin (figur 2B). Videre EMT ble vurdert ved tap av E-cadherin lokalisering ved celle-celle kryss (figur 2C).

Den slått uttrykk for CD44 skjøte isoformer under EMT ble undersøkt av QRT-PCR og immunoblotting. Den human CD44-genet består av ni variable eksoner. Alternativ spleising av CD44 tillater celler til proDuce CD44 varianter (CD44v) som inkluderer minst en variabel ekson, og CD44 standard (CD44s) som er blottet for alle variable eksoner. Figur 3A viser strategien primer design for påvisning av ulike CD44 skjøte isoformer. For påvisning av de ekson-hoppes produkt CD44s, er den fremre primer lokalisert i den konstitutive exon 5, mens den reverse primeren strekker seg på tvers av forbindelsesstedet mellom konstitutive eksoner 5 og 6. For påvisning av CD44v skjøte isoformer som inneholder V5 og V6 variabel eksoner, fremover og bakover primere er utformet innenfor V5 og V6, henholdsvis. Primere for deteksjon av andre CD44 variable ekson-holdige isoformer kan være konstruert ved å bruke den samme strategien. I tillegg er totalt CD44 transkript påvist ved hjelp av forover og revers primere lokalisert i den konstitutive ekson 2 og ekson 3, henholdsvis (figur 3A). Som vist i figur 3B, analyser QRT-PCR-primer utnytte disse settene indikerte en signifikant nedgang i CD44v mRNA og økning i CD44s mRNA etter 14 dager med TAM behandling i Twist-ER-uttrykke HMLE celler. I motsetning til dette, er den totale transkripsjon av CD44 forble uendret i løpet av EMT (figur 3C). I samsvar med resultatene av QRT-PCR, proteinnivå CD44v avtok bemerkelsesverdig, mens ekspresjon av CD44s proteinet var sterkt oppregulert (figur 3D). Derfor ble den store isoform av CD44 forskjøvet fra CD44v til CD44s under EMT prosessen.

Figur 1
Figur 1. Primer utforming. Skjematiske diagrammer som illustrerer plasseringen av primere for påvisning av skjøte isoformer i et ekson-hopper over modellen. De grå boksene representerer konstituerende eksoner, de oransje boksene representerer variable eksoner, og de tynne linjer kobler boksene betegne introner. Primer steder er .indikatorered med piler: sorte piler indikerer primer sett for påvisning av total mRNA, oransje piler indikerer primer sett for å forsterke ekson-inkludert isoformer og blå piler indikerer primer sett for påvisning av ekson-hoppe isoformer.

Figur 2
Figur 2. Induksjon av EMT. (A) bilder fasekontrast (10X) illustrerer morfologiske endringer i HMLE / Kronglete ER celler før (ubehandlet) og etter 14 dager med TAM behandling. (B) immunoblotanalyse av EMT markører i HMLE / Kronglete ER celler før (ubehandlet) og etter 14 dager med behandling TAM. Ved TAM behandling, epiteliale markører E-cadherin, γ-catenin, og occludin ble nedregulert, og mesenchymale markører fibronectin, N-cadherin, og vimentin ble oppregulert. (C) i immun fluorescens bilder (63X) indikerer tap av E-cadherinlokalisering ved celle-celle kryss etter 14 dager med behandling TAM. Grønn farging indikerer at E-cadherin, og DAPI farging (blå) indikerer kjerner. Scale bar = 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Slå av CD44 skjøte isoformer under EMT. (A) Primer design for påvisning av CD44 skjøte isoformer. De grå boksene representerer konstituerende eksoner, de oransje boksene representerer variable eksoner, og de tynne linjer kobler boksene betegne introner. Primer steder er indikert med piler: sorte piler indikerer primer sett for påvisning av CD44 total mRNA, oransje piler indikerer primer sett for å forsterke CD44v5-6 og blå piler indikerer primer sett fordetektering CD44s. (B, C) ​​QRT-PCR-analyse av nivåene av CD44-isoformer under EMT ved hjelp av primere som spesifikt gjenkjenner CD44v inneholdende variable eksoner v5 og v6 (v5 / 6) og CD44s (B), og CD44 total mRNA (C) . De relative uttrykk nivåer av mRNA i Dag 14-celler ble normalisert til korresponderende dag 0 celler i TAM behandlede og ikke-behandlede grupper. Feilfelt angir SEM; n = 3. (D) immunoblotanalyse av CD44 isoformer under TAM-indusert EMT i HMLE / Kronglete ER celler. Nivåer av E-cadherin og N-cadherin ble overvåket for å identifisere EMT status.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremgangsmåten som beskrives her muliggjør påvisning av alternativ spleising i en induserbar EMT modell. Som sådan, dynamiske endringer Skjøt isoform uttrykk kan fanges hele tiden løpet av EMT. Denne metoden har fordeler fremfor bruk av ulike epithelial- eller mesenchymale-representerer cellelinjer for sammenligning av alternativ spleising fordi distinkte genetiske bakgrunn fra un-relaterte cellelinjer kan utilbørlig påvirke alternativ spleising. Imidlertid må den vellykkede induksjon av EMT nøye bekreftet ved hjelp av ulike EMT markører før noen konklusjoner om endringer i alternativ spleising kan trekkes. Videre, i tillegg til Twist-ER-induserbar EMT systemet som er beskrevet her, er andre EMT systemer slik som de indusert av Snail-ER eller TGFβ anbefalt for validering av eksperimentelle funn 11,30.

Koblings Skjøt isoformer under EMT kan påvises i både RNA og proteinnivåer. Splice isoskjema-spesifikke antistoffer er foretrukket for proteinanalyse. Når isoformselektive spesifikke antistoffer ikke er tilgjengelige, kan proteinnivåer Skjøt isoformer fastsettes basert på deres molekylvekt på SDS-PAGE av immunoblotting. Den RNA-nivået i hver isoform kan kvantifiseres ved isoform-spesifikke primere. Ved hjelp av QRT-PCR-analyser, kan folden endringen av hver isoform være følsomt og nøyaktig bestemmes. Spesielt når det eksperimentelle materialer er begrenset, slik som å analysere ekspresjonen av et bestemt spleise isoform i kliniske prøver, gir QRT-PCR-analyse et kvantitativt mål som vil kompensere for den manglende isoform-spesifikke antistoffer for immunohistokjemi.

Metoden som er nevnt her er egnet for påvisning av kjente skjøte isoform endringer under EMT. I tillegg kan denne metoden bli utvidet for studiet av genom-bredt alternativ spleising, og for identifisering av ny spleise isoform veksling under EMT. For å oppnå dette,bruk av en stor-skala teknikk, slik som RNA-sekvensering dypt eller skjøting følsomme mikromatrise-plattformer, kan utføres ved hjelp av RNA isolert fra den induserbare EMT-modellen beskrevet ovenfor. Likevel er QRT-PCR validering av isoformselektive endringer som kreves etter enhver storskala analyse.

Som konklusjon, er alternative spleising dynamisk regulert under EMT, en prosess som er kritisk for embryoutvikling og tumor-metastase. Tatt i betraktning den høye frekvensen av alternativ spleising i det humane genom, er det sannsynlig at reguleringen av alternativ spleising spiller en viktig rolle i mange andre biologiske og patologiske prosesser, inkludert celledifferensiering, vev utvikling, og programmert celledød 35-41. Protokollen er beskrevet heri for påvisning av skjøte isoformer vil være gjeldende for disse andre systemer også.

Ytterligere eksperimentelle modaliteter, slik som spleising reporter minigene assays, kan be brukes til å ytterligere undersøke reguleringsmekanismer av cis virkende elementer og transvirkende faktorer som styrer alternativ spleising 30,42,43. Videre kan den funksjonelle rolle av en bestemt spleise isoform under EMT bli undersøkt ved lyddemping eller ectopically uttrykker det spesifikke isoform og overvåking EMT induksjon i den beskrevne EMT-induserbare system 11..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Tags

Cellular Biology alternativ spleising EMT RNA primer design real time PCR skjøte isoformer
Påvisning av alternativ spleising Under epithelial-Mesenchymale Transition
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C.… More

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter