Summary
שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae כבר מערכת מודל מצוינת לבחינת מנגנונים והשלכות של חוסר יציבות הגנום. המידע שנצבר משמרי מודל זה הוא רלוונטי לאורגניזמים רבים, כולל בני אדם, שכן גורמי תיקון DNA ותגובת הנזק לדנ"א נשמרים גם בין זנים שונים. עם זאת, ס ' cerevisiae עדיין לא היה בשימוש כדי לטפל באופן מלא אם שיעור צבירת מוטציות שינויים עם replicative (mitotic) עלייה בגיל עקב אילוצים טכניים. לדוגמא, מדידות של אורך חיים replicative שמרים באמצעות מיקרומניפולציה כרוכות אוכלוסיות קטנות מאוד של תאים, האוסרות על גילוי של מוטציות נדירות. שיטות גנטיות כדי להעשיר לתאי אמא באוכלוסיות על ידי גרימת מוות של תאי בת פותחו, אבל בגדלים אוכלוסייה עדיין מוגבלים על ידי התדירות שבה מוטציות אקראיות שתתפשרנה מערכות הבחירה להתרחש. הפרוטוקול הנוכחי מנצל sorti המגנטיng של תאי שמרי אמא שכותרתו משטח להשיג מספיק אוכלוסיות גדולות של הזדקנות תאי אם לכמת מוטציות נדירות דרך בחירות פנוטיפי. שיעורי מוטציה, שנמדדו באמצעות בדיקות תנודות, ותדרי מוטציה הוקמו ראשון לתאים צעירים ומשמשים כדי לחזות את תדירות מוטציות בתאי אמא של גילאי replicative שונים. תדרי מוטציה לאחר מכן נקבעו לתאים ממוינים אמא, והגיל של תאי אמא נקבע באמצעות cytometry זרימה על ידי צביעה עם מגיב ניאון שמזהה צלקות ניצן נוצרו על משטחי התא שלהם בעת חלוקת תא. השוואה של תדרי מוטציה חזו מבוססים על מספר חלוקות תא לתדרים בניסוי נצפו עבור תאי אמא של גיל replicative נתון יכולה אז לזהות אם יש הקשורות לגיל שינויים בשער של מוטציות מצטברות. וריאציות של פרוטוקול בסיסי זה מספקות את האמצעים כדי לחקור את ההשפעה של שינויים בפונקציות גן ספציפיים אותנאים סביבתיים ספציפיים על הצטברות מוטציות כדי לטפל במנגנוני חוסר יציבות הגנום בסיסי במהלך הזדקנות replicative.
Introduction
מיקרואורגניזמים, כגון שמרי Saccharomyces cerevisiae, הם מודלים מצוינים לחקירת שיעורי מוטציה, אבל מודלים אלה לא נוצלו במלוא לחקור את ההצטברות של מוטציות במהלך הזדקנות mitotic של תאים. הצטברות מוטציות בגנום הגרעיני כבר שיערו לתרום להזדקנות על ידי וכתוצאה מכך אובדן ההדרגתי של (או וריאציה) פונקציות גן 1. היכולת להשתמש במערכת של חיידקים כדי לחקור את המנגנונים והשלכות של הצטברות מוטציות במהלך ההזדקנות עלול להאיץ את זיהוי של גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על התהליך הזה, משום שמערכות גנטיות קלילה וקל לכימות שינויי פנוטיפי נדירים במיקרואורגניזמים רב. גורמי תיקון דנ"א וחלבוני תגובת נזק לדנ"א נשמרים היטב על פני מינים שונים 2, ודמיון יסודי בהזדקנות האורגניזם זוהה עבור אורגניזמים מגוונים כמו ס ' cerevisiaeיונקי ד 3, שהופכים אותו סביר להניח כי תוצאות שהתקבלו ממחקרים בשמרים יהיו רלוונטיות להזדקנות באורגניזמים רבים.
מחקרים של ההזדקנות בס cerevisiae לעשות שימוש בשני מודלים הזדקנות המודדים הזדקנות כרונולוגית או הזדקנות replicative של תאים. הזדקנות כרונולוגית מאופיינת באובדן ההדרגתי של יכולת קיום באוכלוסיות שמרי תא שנמצאות במצב (שלב נייח) החלוקה הלא בשל דלדול מזין 3. מודל ההזדקנות הכרונולוגי כבר בשימוש על מנת להוכיח כי מוטציות מצטברות עם עלייה בגיל 4, שכן אוכלוסיות תאים גדולות מתקבלות בקלות במודל זה כדי לבצע בחירות פנוטיפי לתאים שעברו מוטציה. במקרה זה, הצטברות מוטציה מופיעה להיות מושפעת מסלולי איתות צמיחה וסטרס חמצונים 5, וכל אחד מהגורמים הללו הוא רלוונטי להבנת הזדקנות אאוקריוטים רב תאיים 3. מודל הזדקנות replicative מנצל divisi סימטריעל בין ס תאים אם ובתה cerevisiae לחקירת הזדקנות המתרחשת עם דורות תא רצופים 3. הזדקנות replicative שמרים כבר נמדדה לעתים קרובות באמצעות מיקרומניפולציה של אוכלוסיות קטנות של אמא ותאי בת, או יותר לאחרונה, באמצעות וידאו מיקרוסקופי של אוכלוסיות קטנות של תאי שמרים במכשירי microfluidic 6,7. גודל אוכלוסייה מוגבל לעשות גישות אלה אינם מתאימים לחקירת הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות המיטוטי אלא אם כן מידע כלל הגנום מתקבל מהתאים בודדים או שינויים גנטיים גבוהה מאוד בתדירות נמדדים 8. רצף הגנום של תאים בודדים מספק ערכות נתונים משמעותיות לחקירת הצטברות מוטציות, אבל יש לי מערכות בחירת פנוטיפי היתרון החשוב של מתן אמצעי למדידת שיעורי מוטציה ללמוד מנגנוני צבירת מוטציה בסיסית. מחקרים כדי לבחון תדרי מוטציה ושיעורים דרך בחירות פנוטיפי בhaploiזני שמרי ד במהלך הזדקנות replicative טרם דווח.
שיעורי מוטציה נפוצה נמדדים באמצעות בדיקות תנודות 9. ערכי תדירות מוטציה משקפים את המספר הכולל של תאי מחסה מוטציה ברצף גן באוכלוסייה. זה כולל תאים בי מוטציות עצמאיות להתרחש וכל צאצאים של אותם תאים שפשוט יורשים מוטציות קיימות מראש. בניגוד לכך, שיעורי מוטציה נמדדו באמצעות בדיקות תנודות מייצגים את מספר המוטציות עצמאיות שזה עתה להתעורר עם כל דור תא. בדיקות אלו בדרך כלל כרוכים בלחסן תרבויות לשכפל רבות בצפיפות תא נמוכה כדי להקטין את הסיכוי של הוספת תאים עם קיימות מראש מוטציות ברצף יעד, גדלו תרבויות לרוויה ליד, וזיהוי תאים שעברו מוטציה על ידי צמיחה במצע סלקטיבי. מספרם של תאים שעברו מוטציה שזוהו באוכלוסיות לשכפל משמש לאחר מכן באחד מכמה מודלים מתמטיים כדי להעריך את המספר שלימוטציות ndependent שעלו במהלך הצמיחה 9. השוואת מספר המוטציות עצמאיות לגודל האוכלוסייה הממוצע מספקת מדד של שיעור המוטציות. בס cerevisiae, תדרים ושיעורי מוטציה לעתים קרובות נמדדו באמצעות גני URA3 וCAN1, מאז מוטציות אובדן של פונקציה בגנים אלה לייצר פנוטיפים לבחירה. אובדן תפקוד URA3 הופך תאים עמידים ל5-fluoroorotic חומצה (5-פואה), מאז החלבון מקודד על ידי URA3 ממיר 5-פואה למולקולה רעילה 10. אובדן התפקוד של CAN1 מאפשר לתאים להפוך לעמידים בפני canavanine, אנלוגי ארגינין רעיל, מאז החלבון מקודד על ידי CAN1 משלוחי ארגינין וcanavanine לתאים 11.
שני אסטרטגיות המיון הגנטיות ופיסיות כבר מועסקות בהצלחה להשיג אוכלוסיות גדולות יותר של ס ' תאי אם cerevisiae כדי להקל על חקירות של הזדקנות replicative. אסטרטגיות גנטיות כוללות גישות חכמות שתבחרנה נגד הישרדות תא בת באוכלוסייה. תכנית העשרת אמא (חבר הפרלמנט האירופי) כרוכה אינדוקציה בטא אסטרדיול ביטוי recombinase Cre רק בתאי בת, שמובילה לשיבוש בתו הספציפי של שני גנים חיוניים שהונדסו כדי להכיל אתרי loxP 12. ניתן לגדל זני חבר הפרלמנט האירופי, בדרך כלל בהיעדר inducer, אלא רק את תאי האם ימשיכו לחלק הבאים אינדוקציה, בעוד שתאי בת יעצרו בM-שלב בדרך כלל במהלך ההתקדמות הראשונה שלהם דרך מחזור 12 התא. בעוד מערכת זו לא נעשתה שימוש כדי ללמוד באופן רחב הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות, זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד אובדן הטרוזיגוטיות, צורה תכופה יחסית של חוסר יציבות הגנום בזני שמרי דיפלואידי, כמו גם שינויים ביוכימיים בתאי אמא של הזדקנות 13,14. באופן דומה, מערכת הכלה arrester כרוך ביטוי בתו הספציפי של ס ' cereviגן siae URA3 15. זני הכלה arrester לגדול בדרך כלל עד 5-פואה מתווספת לבינונית, שבו תאי בת הנקודה להביע URA3 ימותו, ואילו תאי אם ימשיכו לגדול 15. אלה הם מערכות שימושיות להעשרה לתאי אמא, אבל הם תלויים בתחזוקה של פונקציות הגן, המהוות את מערכת הבחירה. מוטציות אקראיות ברכיב אחד או יותר של מערכת הבחירה עלולות לגרום לתאי בת שלהימלט הבחירה ולהתרבות באופן אקספוננציאלי. במהלך פיתוח של זני חבר הפרלמנט האירופי, בגדלים אוכלוסייה מתאימים היו נחושים בדעתו להימנע ממראית העין של תאי בת מוטציה שיכל לברוח הבחירה 12. עם זאת, מגבלה זו בגודל אוכלוסייה פוגעת בזיהוי של צורות נדירות של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות replicative. הגבלה זו על גודל אוכלוסייה ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בזני שמרי דיפלואידי עם שני עותקים של כל גן תורמים למערכת הבחירה, שכן רובמוטציות עלולות להיות רצסיבי 12. עם זאת, שימוש בזני דיפלואידי מגביל את סוגי אירועי מוטאציות שניתן לאתר בקלות בהשוואה לאלו שניתן לאתר בקלות בתאי שמרים הפלואידים.
אסטרטגיות מיון פיזיות כוללות בידוד של תאי אמא עם תא שטח שכותרתו מתאי בת ללא תווית להעשיר לאוכלוסיות גדולות של תאי אמא. התצפית שחלבוני פני השטח תא (דופן תא חלבונים) של ס ' תאי בת cerevisiae מסונתזים חדשים בניצנים נוצל לתייג תאי אמא בלי תיוג תאי הבת שהם מייצרים 16. לדוגמא, אוכלוסייה ראשונית של תאי שמרים שכותרתו על פני השטח שלהם עם ביוטין ניתן לגדל ולאחר מכן מבודדת מתאי הבת שלהם באמצעות microbeads אנטי ביוטין והמגנטי מיון 16 כי תאי הבת שנוצרו על ידי האוכלוסייה הראשונית לא יכילו ביוטין על פני השטח שלהם . וצמיחה סידורימיון מאפשר אוכלוסיות בהדרגה ישנות יותר של תאי אמא שתתקבל וינותחו. הליך זה שמש בהצלחה לבחינת שינויים בפיזיולוגיה של תא וביטוי גנים במהלך הזדקנות replicative של שמרים 13,14,17,18. השיטה הנוכחית מתאים את עצמו תיוג ביוטין זה וטכניקת מיון מגנטית להעשיר עבור תאי אמא עם צורך מדידת ההצטברות של מוטציות שעלולים להיות נדירות או צורות אחרות של חוסר יציבות הגנום assayed באמצעות בחירות פנוטיפי. צמיחה סידורי ומיון פיזי מאפשרים ניתוח של הצטברות מוטציות בתאי אמא בהדרגה מבוגרת, כמו גם באוכלוסיות תאי הבת שלהם. קביעת שיעורי מוטציה לדור מאפשרת תדירות מוטציה צפויה תחושב עבור תאי אמא שעברו מספר מסוים של חלוקות תא. מאחר וערכי תדירות חזו מבוססים על הגידול הצפוי בשל סיבובים נוספים של חלוקת תא, סטיות משמעותיות בmutati נצפהעל תדרים בהשוואה לערכים החזויים לספק ראיות לגיל ספציפי שינויים בשער של מוטציות מצטברות. שימוש בפרוטוקול זה, מכתים ניאון של צלקות ניצן שמתאימות לאתרים של חלוקות תא בתאי אמא בשילוב עם ניתוח על ידי cytometry זרימה יכול לשמש כדי לקבוע את התפלגות הגילים של אוכלוסייה ממוינת ולא ממוינת במהירות. ריאגנטים נוספים ניאון, כגון אלו המשמשים לאיתור מיני חמצן תגובתי, יכולים גם להיות מנוצלים במהלך פרוטוקול זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח יעיל של גיל תלוי שינויים בחוסר יציבות הגנום עם הפוטנציאל למתאם הלקשורות לגיל שינויים פיסיולוגיים תא באורגניזם מודל מתאים ללימוד הגורמים הגנטיים וסביבתיים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות.
Protocol
.1 הכנת מדיה ופתרונות
- לגדל תאים באמצעות תמצית-peptone גלוקוז שמרים (YPD) בינוני עשירה לפרוטוקול הסטנדרטי. הכן 2% bacto-peptone, 1% תמצית שמרים, 2% פתרון גלוקוז למדיום YPD ולהוסיף 2% bacto אגר למדיום מוצק 19. החיטוי לעקר. השתמש בינוני חלופי, במידת צורך, כדי לבדוק את מצב צמיחה מסוים או זן שמרים שעבר מוטציה.
- הפוך בינוני מלא סינטטי מוצק חסר ארגינין עם 60 מ"ג / canavanine L (SC-ARG + canavanine) כדי לבחור עבור מוטנטים עמידים canavanine. הכן פתרון שהוא 0.67% בסיס bacto שמרי חנקן ללא חומצות אמינו, גלוקוז 2%, 0.2% תערובת מוסף שלם בלי ארגינין (תערובת נשירה), וbacto אגר 2% 19. החיטוי וקריר לפני הוספת canavanine מ20 מ"ג / מ"ל פתרון מניות (פילטר מעוקר, מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס) 19.
- הפוך בינוני מלא סינטטי מוצקה המכיל חומצת 5-fluoroorotic (5-פואה). הכן 500מ"ל של פתרון זה הוא 1.34% בסיס bacto שמרי חנקן ללא חומצות אמינו, גלוקוז 4%, 0.4% תערובת מוסף שלם, ו0.2% 5-פואה ומסנן לעקר 19. 500 מ"ל החיטוי של פתרון bacto אגר 4%, בקצרה מגניב, ולאחר מכן לערבב עם הפתרון התזונתי פילטר מעוקר 500 מ"ל. השתמש בתקשורת אלטרנטיבית מתאימה עבור מבחני מוטציה אחרים.
- לתיוג ביוטין, להפוך 500 מ"ל 1x פוספט שנאגרו מלוח פתרון (PBS) המכיל 137 כלוריד מ"מ נתרן, אשלגן כלורי 2.7 מ"מ, dibasic פוספט נתרן 10.14 מ"מ, וdibasic אשלגן זרחה 1.77 מ"מ, pH .8 חנות ב 4 ° C ולשמור על קרח במהלך שימוש.
- הפוך מניית ביוטין 5 מ"מ טרי במים סטריליים, ultrapure.
- כדי להרוות את תיוג ביוטין, להפוך 500 מ"ל של 1x PBS, 100 גליצין מ"מ. לאחסן ב 4 ° C ולשמור על קרח במהלך שימוש.
- תלוי במספרם של תאים המשמשים ומשך הניסוי, להפוך 1-2 L של חיץ חרוז תיוג המכיל 1x PBS, 2 mM EDTA, bovi 0.5%אלבומין בסרום ne. סנן לעקר וחיץ de-גז. לאחסן ב 4 ° C ולשמור על קרח במהלך שימוש.
- הכן פתרון 0.4% trypan הכחול ב1x PBS, לעקר מסנן, ולאחסן ב RT לשימוש במדידות כדאיות תא.
- כרכי Aliquot קטנים (~ 100 μl) של agglutinin נבט חיטה (WGA) המצומד ניאון כדי לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס בנייר הכסף העטוף (או אטום) microcentrifuge צינורות לשימוש בקביעת גיל תא.
.2 קביעת מוטצית דרג ותדר
- להקים שיעור מוטציות בנקודת ההתחלה לכל דור תא באמצעות בדיקות תנודות לתאים שגודל בתנאי תרבות סטנדרטיים. לגדול 7-11 לשכפל 1 מ"ל תרבויות מצפיפות ראשונית של 1,000-5,000 תאים / מ"ל ועד תחילת שלב נייח (~ 10 8 תאים / מ"ל).
- לכל תרבות לשכפל, לדלל תאי 1: 2,000 ולהפיץ 1-4 μl על מדיום הלא סלקטיבי (YPD) כדי לקבוע מושבה יוצרי יחידות / מ"ל. גלולה שנותרה תאים ב ~ 2,400 xg דקות 1 בmicrocentrifuge וגלולים ב100 מים μl להתפשט על גבי מצע סלקטיבי לזהות מוטציות. דגירה צלחות במשך שלושה ימים ב30 מעלות לפני ספירת מושבות (להתאים את זמן דגירה כנדרש על בסיס שיעור צמיחה של תאים).
- לקבוע את מספר המוטציות עצמאיות (מ ') שחלו במשפט המבוססים על מספר מושבות מוטציה (r) המתקבלות על מצע סלקטיבי. השתמש בכלי ההערכה החציונית לאה-Coulson למצוא מ 'על ידי החלפת המספר החציוני של מושבות מוטציה לr בנוסחא הבאה 9. לאחר מכן להחליף ערכים למ 'עד לצד השמאל של המשוואה הוא כמעט אפס.
- כדי לקבוע שיעור מוטציות, לחשב את המספר הממוצע של תאי קיימא התפשטו על מדיום סלקטיבית ראשון על ידי הכפלת מושבה יוצרי יחידות / מ"ל הממוצע של התרבויות לשכפל והנפחתרבות בהתפשטות מ"ל על מדיום סלקטיבית. מחלקים את הערך מ 'מהצעד 2.1.2 על ידי מספר הממוצע של תאי קיימא כדי להשיג את שיעור מוטציות בכל דור תא.
- בנפרד לחשב את מספר תאי קיימא התפשטו על מדיום סלקטיבית לכל תרבות לשכפל במשפט כמתואר בשלב 2.1.3. מחלקים את מספר מושבות מוטציה (r) המתקבלות לתרבות במספר תאי קיימא התפשטו על מדיום סלקטיבית כדי לקבל את תדירות המוטציה. השתמש בממוצע או חציון של תדרי מוטציה הבודדים מהתרבויות לשכפל בשלב 2.1 כתדירות מוטציה בסיסית.
- לבצע מדידות תדר לפני ואחרי תאי תיוג ביוטין (שלבים 3.2 ו3.4) כדי לקבוע אם תוצאות צעד תיוג בכל שינוי בתדירות של מוטציות שצריכות להילקח בחשבון בעת הבדיקה לגיל ספציפי שינויים בהצטברות מוטציות.
.3 תיוג ביוטין
- Streak ס cerevisiae ממניות גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס על מדיום YPD ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 1-3 ימים.
- באמצעות קצה פיפטה סטרילית, תאי העברה מצלחת הפס עד 1 מ"ל (או יותר) של שמירת מים בחשבון ש1-1.5 סנטימטר של חלק גדל בצפיפות של הפס ייתן לי כ 10 8 תאים. לקבוע צפיפות תאים מדויקת באמצעות hemocytometer.
- תווית 10 8 תאים לכל זן (או מצב טיפול) לנקודת איסוף שבה תדירות מוטציה תיקבע או גודל אוכלוסייה מספיק כדי להשיג לפחות 5-10 מושבות מוטציה לדגימה על מצע סלקטיבי (המבוסס על תדירות מוטציה מצעד 2.2). כולל תוספת של 10 8 תאים למדידות בסיס לכל זן / מצב.
- תווית ביוטין על פי נוהל סטנדרטי מהיצרן, למעט להשתמש מניית מגיב ביוטין 5 מ"מ ובעדינות הרוק במהלך דגירה. ספין במשך 5 דקות ב 4 ° C ב 3,000 XG לכל צעדי צנטריפוגה, זהאינס מסתובב בטמפרטורות גבוהות מ -4 מעלות צלזיוס עלול להוביל לאובדן תא גדל. לאחר לשטוף הסופי, להשעות תאים לריכוז של 10 8 / מ"ל תאים שכותרתו במים.
- בדוק יכולת קיום של תאים באמצעות מכתים trypan הכחול. לדלל 10 μl של תאים עם 23 μl מים ו67 μl של .0.4% trypan כחולים ב1x PBS. דגירה של לפחות 40 דקות ב RT לפני הבקיע חי תאים (בלא כתם) ומתים (מוכתמים) באמצעות hemocytometer.
- (7 ראו סעיפים 5, 6, ו) למדוד ערכי בסיס לחוסר יציבות הגנום, גיל תא, ומאפיינים רלוונטיים אחרים.
- העבר את התאים שכותרתו ביוטין ל20 מ"ל של מדיום YPD לכל 10 8 תאים בבקבוק Erlenmeyer (כ 5 x 10 6 תאים / מ"ל). לגדול בתרבות (ים) 16-18 שעה ב20 ° C לצפיפות משוערת של 10 8 מ"ל תאים / (ארבעה עד חמישה דורות תא), אבל לא מאפשר לתאים להגיע שלב נייח. השתמש בזמן דגירה קצר יותר לצמיחה ב30 מעלות צלזיוס. שמור ג שכותרתו ביוטיןאמות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד כמה שעות לפני בנוסף לבינוני, במידת צורך כדי לייעל את העיתוי של התקופה ואוסף הצמיחה.
.4 ביד תיוג ומיון מגנטי
- אחרי שלב הצמיחה, לדלל aliquot של תרבות כדי לקבוע את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C ב 3,000 x גרם. יוצקים את supernatant.
- שטוף תאים על ידי vortexing להשעות גלולה ב30 מ"ל של חיץ חרוז תיוג, אז צנטריפוגה ולשפוך את supernatant כאמור בסעיף 4.1. חזור על לשטוף.
- באופן מלא resuspend תאי חיץ חרוז תיוג 50 μl לכל 10 8 תאים בסך הכל ידי vortexing. הוסף 2 μl חרוזים מגנטיים לכל 10 8 תאים ומערבולת סך הכל בקצרה לערבב. לדגור על קרח למשך 10 דקות, היפוך מעת לעת כדי לערבב (שונה מפרוטוקול באופן מקוון ב http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </>).
- שטוף תאים שלוש פעמים עם 30 מ"ל של חיץ חרוז תיוג.
- הוסף 0.5 מ"ל חיץ חרוז תיוג לכל 10 8 תאים בסך הכל וגלולה בקצרה מערבולת בהגדרה בינונית רק עד שתאי resuspended. יוצקים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל כדי להסיר כל גושי תאים שנותרו. במידת הצורך, לצאת מתאים על קרח למשך 1-2 שעות לפני הטעינה בטור.
- עקוב פרוטוקול המומלץ של היצרן לעמודות מגנטיות כדי לאגד, לשטוף, וelute תאי אמא שכותרתו חרוז המגנטיים. להתאוששות מוגברת של תאים שכותרתו, להשתמש בעמודה אחת לפחות לכל 2 x 10 9 תאים בסך הכל.
- הסר את כל בועות המתרחשות בעת טעינת עמודים, כפי שהם חוסמים את הזרימה. להסיר ולהחליף את הטור על המפריד בין שוטף כדי למנוע מתאים מלהפוך לכוד בין חרוזים (שונה מפרוטוקול באופן מקוון ב http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
- שמור לזרום דרך מצעדים מחייבים וכביסה לאבחון תאים צעירים המיוצרים על ידי תאי האמא, אם תרצה בכך. להתרכז תאים כמתואר בשלב 4.7.
- השתמש במפרידים רב עמודה לעיבוד דגימות מרובות בבת אחת. מספר עמודות Elute של המדגם זהה לאותו צינור האיסוף להפחתת זמן הטיפול ומקטינים את ההפסד של תאים.
- להתרכז תאי אם eluted על ידי צנטריפוגה ב3,000 XG למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. לשאוב את כל אבל 1 מיליליטר חיץ לכל 10 8 שכותרתו תאים ביוטין מקורי. בקצרה מערבולת להשעות תאים שבנותרו חיץ.
- לדלל aliquot של תאים ולהכתים עם trypan הכחול כדי לקבוע את צפיפות התאים וכדאיויות תא באמצעות hemocytometer (ראה שלב 3.5). לחשב את המספר הכולל של תאים התאוששו.
- אם מספרם של התאים הוא גבוה באופן משמעותי מהצפוי, לעבור מדגם elution דרך עמודה נוספת כדי לנסות להסיר את זיהום התאים צעירים.אם מספר התאים הוא נמוך באופן משמעותי מהצפוי, להעביר את הזרימה נשמרה באמצעות מדגם דרך עמודה נוספת כדי לנסות לשפר את התשואה של תאי אמא.
- להשתמש בתאים לניתוח נוסף, כמפורט בסעיפים 5 ו -6 לחלופין, לגדול התאים במרק YPD שוב כדי להגדיל את גיל replicative (שלב 3.7) ובצע על ידי תיוג חרוז ומיון (צעדי 4.1-4.8.1), ללא צריך לחזור על תיוג ביוטין.
.5 קביעת גיל replicative
- ספין תאים למשך 2 דקות בכל XG 5,000 ב RT לכל השלבים בסעיף זה. שים 25 μl של תאים התאוששו (~ 10 8 תאים / מ"ל) לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל 1x PBS. לשאוב את supernatant.
- להפשיר aliquot של WGA-המצומד, מערבולת לערבב, וספין בקצרה לחסל אגרגטים חלבון. להשעות תאי 180 μl 1x PBS ו20 μl של WGA מצומדת למולקולת ניאון לתייג צלקות ניצן על פני השטח של התאי דואר. כסה את צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות בנייר כסף ודגירה עם הנדנדה עדינה ב30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל 1X PBS.
- למיקרוסקופ פלואורסצנטי, שקופיות תווית והר לפרוטוקול סטנדרטי באמצעות סוכן אנטי לדעוך. באופן מלא לרפא שקופיות בחושך (עד כמה ימים) לפני איטום coverslip, כדי למנוע תנועת תא במהלך הדמיה. לספור צלקות ניצן על לפחות 50 תאים לדגימה להשיג מידת נציג של גיל תא. שקופיות חנות לתקופה של עד חודש 1 לצפייה צלקות ניצן, במידת הצורך.
- לחלופין, לקבוע את עוצמת אות הניאון מWGA-המצומד על ידי ביצוע cytometry זרימה בתאים תלויים ב1 מ"ל 1x PBS לאחר הצעד 5.1.2. השתמש בליזר עירור 405 ננומטר ו530 / 30 ננומטר מסנן פליטה עם מסנן מסירה ארוכה 505 ננומטר לWGA-Alexa 488. כלול שליטה בלא כתם לכל נקודת איסוף.
- צלקות ניצן גרף על תאים צעירים ותאי בני נספרים על ידי מיקרוסקופ עלציר y נגד הממוצע הגיאומטרי המנורמל (ממוצע גיאומטרי מוכתם ממוצע גיאומטרי בלא כתם /) של הקרינה WGA-המצומד מאותו אוכלוסיות תאים על ציר x. תקבל את המשוואה של קו מגמה ליניארי למערכת יחסים זו. בניסויים הבאים, להחליף את הממוצע הגיאומטרי המנורמל של עוצמת הקרינה WGA-המצומד של אוכלוסיית תאים לx במשוואה ולפתור עבור y כדי לקבוע את גיל התא הממוצע של מדגם.
תדר .6 מוטציה
- התפשטות מסודרים תאי אם resuspended במאגר מצעד 4.7 על מדיום YPD והבינוני סלקטיבית כמתואר בשלב 2.1.1. השתמש 1 מ"ל של תאי אמא resuspended לתאים בינוניים וספין סלקטיבית בXG 5,000 דקות 1.
הערה: מורחים כמויות גדולות יותר של תאים בדילול מלא על מדיום YPD כתאי עלייה בגיל, כדי לפצות על הגדלת מספרם של תאים שאינם ברי קיימא ומזדקנים באוכלוסיות מבוגרות.- דגירה בינונית YPD וצלחות בינוניות סלקטיבית מצעד 6.1 ב30 מעלות צלזיוס למשך 3 ו -4 ימים, בהתאמה. הגדל את הדגירה זמן עד שבוע לתאים ישנים מאוד או זנים גדלו לאט. לחשב תדירות מוטציה כמתואר בשלב 2.2.
.7 חישוב תדירות מוטציה חזויה לגיל replicative בהתחשב
- חישוב הגידול הממוצע בגיל replicative של התאים שכותרתו ביוטין במהלך הניסוי על ידי הפחתת הגיל הממוצע של אוכלוסיית התאים הראשונית מהגיל הממוצע של תאי אמא מסודרים לסוג הרלוונטי. השתמש בגילי התא מחושבים בשלב 5.2 או צעד 5.2.2.
- הכפל את שיעור המוטציות שהושג בשלב 2.1.3 על ידי העלייה בגיל תא ממוצע מחושב בשלב 7.1. תוסיף ערך זה לתדירות המוטציה הבסיסית לאוכלוסייה הראשונית מחושבת בשלב 2.2 כדי לקבוע את תדירות המוטציה חזתה לתאים של גיל replicative הרלוונטי.
Representative Results
תרשים זרימה באיור 1 מציג את השלבים הכוללים של ההליך, לרבות נקודות שבן שיעורי מוטציה, תדרים, וגיל תא נמדדים. קביעה מדויקת של התדירות וקצב מוטציות (או צורה אחרת של חוסר יציבות הגנום) באוכלוסיות תאים צעירות היא צעד ראשון חשוב, שכן הוא הכרחי לבחירת גודל אוכלוסייה מתאימה לתיוג ומיון מגנטי. ניתן לקבוע ערכי שיעור שימוש בבדיקות תנודות 9. תוצאות דוגמא לזני שמרים ברקע BY4741 הגנטי 20 נבחר למוטציות בגן CAN1 שמקנות עמידות canavanine או מוטציות בגן URA3 שמקנה עמידות ל5-פואה מוצגות באיור 2. תאים גדלו ב20 מעלות צלזיוס במשך נציג ניסויי שיעור, ועל 20 מעלות צלזיוס ו30 מעלות צלזיוס במשך ניסויי תדירות נציג. טמפרטורות אלה שמשו בגלל אוכלוסיות תאים ראשוניות גדלוב30 מעלות צלזיוס גדלו אז ב20 מעלות צלזיוס במשך ניסויי נציג מיון שלאחר מכן. ערכי שיעור ממחקרים עצמאיים היו דומים לאוכלוסייה הראשונית של התאים והתאים לאחר תיוג ביוטין לזן שיש לו את גן CAN1 במיקומו הרגיל בV כרומוזום, כ 32 זוגות kilobase מהטלומרים הזרוע השמאלית (www.yeastgenome.com) ( איור 2 א, עמודים לבנדר). שיעור המוטציות של CAN1 היה גבוה באופן משמעותי באוכלוסיות ראשוניות של זן שמרים שני שיש לה מחיקה של גן CAN1 ממיקומו הרגיל בV כרומוזום והחדרה של CAN1 על הזרוע הימנית של כרומוזום VIII כ 25 זוגות kilobase מהטלומרים 21 (איור 2). תדרי מוטציה בגן CAN1 היו גם להשוות לאוכלוסיות ראשוניות תא ותאים ביוטין שכותרתו בבית או בטמפרטורת צמיחה (Fi2A תרשים, עמודות כחולות). עם זאת, תדרי מוטציה מתקבלים ב20 ° C נמצאו להיות גבוה יותר מתדרי מוטציה ב30 מעלות צלזיוס. כדי לבדוק אם השפעת טמפרטורה זו הייתה מוגבלת לגן CAN1, מדדנו מוטציות בURA3 על ידי בחירה להתנגדות ל5-פואה שימוש זן השמרים שיש CAN1 הוכנס על VIII כרומוזום. זן זה יש גם מחיקה של URA3 מהאתר הרגיל שלו על כרומוזום V והחדרה של URA3 על הזרוע הימנית של כרומוזום VIII כ 40 זוגות kilobase מהטלומרים 21. תדרי מוטציה היו גם גבוהים יותר ב20 מעלות צלזיוס למשך URA3 במיקום כרומוזומליות זה (איור 2 ג). בסך הכל, זה מראה שטמפרטורת צמיחה יכולה להשפיע על תדירות מוטציות, אבל תיוג ביוטין אינו מופיע כדי להשפיע על תדירות מוטציה. לכן, שיעורי מוטציה ותדרים לאוכלוסיות ראשוניות צריכים להיקבע באותו טמפה הצמיחהrature שישמש לסיבובים של צמיחה ומיון. מומלץ לוודא שתיוג ביוטין אינו משפיע על חוסר יציבות הגנום לפני השימוש בפרוטוקול כדי לחקור סוגים אחרים של מוטציות או שחלופי הגנום.
כצפוי, את ערכי שיעור מוטציות שמוצגים באיור 2 א הם פי כמה נמוכים ממדידות התדר המקבילה. הבדל זה מתרחש משום ששיעור מוטציות מודד את המראה של תאים בעלי מוטציות חדשות עם כל סיבוב של חלוקת תא, ואילו אמצעי תדירות המוטציה המספר המצטבר של תאים שעברו מוטציה באוכלוסייה בסוף תקופת הצמיחה. השיעורים ומרווחי ביטחון של 95% לניסויים אלה מראים כי ניתן להשיג תוצאות לשחזור על ידי שימוש בשבע תרבויות לשכפל לכל ניסוי, המהווה את המספר המינימאלי של חזרות הציע לפרוטוקול זה.
ברגע שערכי תדירות וקצב הראשוניים נקבעים, גודל אוכלוסייה צריך להיות CHOsen שמבטיח כי תאים נאותים נמצאים לאחר סבבים רבים של מיון כדי לקבוע באופן מהימן תדרי מוטציה. תיוג אוכלוסייה של 10 8 תאים לכל נקודת זמן שהיא להיות מנותחים במהלך ההזדקנות הוא מתאים כאשר תדרים ושיעורים דומים לאלה שמוצגים באיור 2 א. החלטה זו תלויה גם במידת היעילות שכותרתו אם תאים הם התאוששו אחרי כל סיבוב של מיון. היעילות של התאוששות תאי אמא שכותרתו ניתן להעריך במהירות ובפשטות באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את מספר התאים eluted מהעמודות עבור כל סוג ולבחון מורפולוגיה של תאים. שתי נקודות עיקריות מומחשות על ידי נתוני דוגמא התאוששות יעילות (איור 3 א): המספרים התאוששו של תאים עשויים להופיע גבוהים יותר מהצפוי לאחר הסוג הראשון, ואובדן הדרגתי קטן של תאים צפוי עם מיון המשך. מיל המספר הגבוה מהצפוי של תאים בכמה ניסויים אחרי הסוג הראשון יכולult מהתיוג של ניצנים על תאים באוכלוסייה הראשונית. תא שמרים עם ניצן היה בדרך כלל להיות הבקיע כתא בודד בעת קביעת מספר התאים לתייג עם ביוטין. תיוג של ניצני הווה באוכלוסייה הראשונית, אם כי, היה לאפשר לתאים המתפתחים מבלוטות אלה לגם יישמרו על עמודים במיון. ההשפעה של תופעה זו על הקביעה של התאוששות יעילות תלויה בחלק היחסי של תאי מנוצן באוכלוסיית התא הראשונית. סיבה אפשרית שנייה למספר התא גבוה יותר לאחר המיון של אחד היא שיש נוטה להיות תאי מנוצן גדולים יותר בנקודת הזמן שעשוי להיות השלמת חלוקת תא במהלך המיון זה. כתוצאה מכך, ניצנים גדולים עדיין מחוברים לתאים האם שלהם עשויים להיות מסודרים, אבל אז מופיעים תאים להבדיל כאשר תאי eluted נבחנים. בעוד שחלק מאובדן של תאים הוא ציין עם כל סיבוב של צמיחה ומיון, הפרוטוקול יכול לגרום בשייר אמין של 80-90% מתאים לאחר כל סיבוב של יםOrting. זה שווה את המאמץ כדי לתרגל את ההליך על מנת להבטיח כי 80% או יותר מהתאים שכותרתו הם להיות מבודדים כדי למנוע את הצורך לתייג אוכלוסיית תא ראשונית גדולה שלא לצורך. טיפול בתאים עם לחץ קל לאחר הסוג הראשון (מי חמצן 1 מ"מ מימן במדיום YPD ל30 דקות) לא מנעו התאוששות יעילה של תאים עם סיבובים המשך של צמיחה ומיון, שלא היו חלק משונות בהתאוששות לסוג הראשון שלאחר המתח (איור 3 א).
בדיקה של מורפולוגיה של תאים ואת הכדאיות שימושית גם הן לאישור בידוד מוצלח של תאי אם ולהתאמת דילולים / כרכים משמשים בעת הפצת תאים במדיום הלא סלקטיבי כדי לקבוע את הצפיפות של יחידות מושבה להרכיב. תאי אמא הפכו גדולים יותר ויותר ויותר באופן בלתי סדיר בצורה כפי שהם גילו, בהשוואה לתאי בת (איור 3 ב). דגימות תאי אם לכן צריכה בעיקר מורכבות מגדול, IRRegularly צורת תאים כניסוי מתקדם בכל סיבוב של מיון. הנוכחות של תאים רבים סגלגלים קטנים של צורה קבועה יכולה להעיד כי תאי אמא לא להיות מופרדים במידה מספקת מתאי בת. כדאיות של תאי אמא צריכה בהדרגה גם לרדת עם כל סיבוב של גידול ומיון, אם כי ייתכן שלא יהיה הרבה שינוי במהלך דורות התא הראשונים חמש עד עשרה. מספר התאים מסוגלים מושבות יוצרים יכול להקטין הרבה יותר באופן דרמטי ממספר התאים הנקבעים להיות בת קיימא על ידי צורה כלשהי של צביעה ישירה לשלמות תא, עקב היווצרות של תאים מזדקנים. כאשר כדאיות בשיטת צביעה ישירה ראשונה מתחילה לרדת (כ 80% או פחות), ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילולים וכרכים המשמשים למדידת מושבה להרכיב צפיפויות יחידה בציפייה לירידה דרמטית יותר ביכולת של תאי קיימא ל מושבות טופס (שתיים עד כמה ירידה של פי).
גילאי replicative של אוכלוסיות מיון ואוכלוסיות שליטה צריכים להיקבע לפני נתוני תדירות מוטציה מהתאים האם יכולים להיות מנותחים לגיל ספציפי שינויים בשער של מוטציות מצטברות. זה יכול להיות מושג באמצעות ספירה ידנית של צלקות ניצן על תאי אמא (איור 4) או באמצעות cytometry הזרימה לכמת את האות למגיב צלקת ניצן זיהוי (איור 5). יכולות להיות שכותרתו צלקות נץ עם אות רקע נמוכה יחסית באמצעות conjugates WGA-הניאון (איור 4C). איור 4A מראה כי רוב התאים מהזרימה דרך דוגמאות של הליך מיון אפס או אחד צלקת ניצן. התאים eluted מעמודות הם בעיקר תאים בגיל האם (4B דמויות ו5). בדרך כלל,> 90% מתאי eluted הם תאי אם, אותה ניתן לראות בקלות רבה יותר מcytometry זרימת התוצאה באיור 5. תאים עם יחסית מעט צלקות ניצן (<6) OBTained לאחר יותר משני סיבובים של מיון יכול לייצג תאים מזהמים שאינם מסומן ביוטין שעברו כמה סיבובים של חלוקת תא בסבב של צמיחה הרלוונטי, בניגוד לתאי אמא שמתחלקים לאט מאוד. הווריאציה בגיל תא עשויה להגדיל עם הסיבובים הבאים של מיון אם לא כל התאים באוכלוסייה צומחים באופן אחיד.
אוכלוסיית תא גדולה יותר ניתן להשתמש במהירות רבה יותר על מנת להעריך גיל תא אם קשר לינארי שנוצר בין עוצמות אות WGA-הקרינה ומספר צלקות ניצן לכל תא. בניתוח זה, נורמליזציה של כל עוצמות אות WGA-הקרינה מתבצעת על ידי חלוקת האות של תאים מוכתמים על ידי האות המתקבל לאוכלוסייה המתאימה בלא כתם התא (בתו או אמא) כדי להסביר את הקרינה רקע מוגברת בתאים הישנים. איורים 4 ו ניתוח 5 מופע של אותו אוכלוסיות תאי נציג.ספירה ידנית הוקמה גילאי replicative ממוצע של 0.95 ו11.4 לתא הבת (איור 4 א) ואוכלוסיות תאי אמא (איור 4 ב), בהתאמה. WGA-אותות מנורמלים לשתי אוכלוסיות אלה ושלוש אוכלוסיות נוספות (גילים ממוצע של 3.0, 6.9, ו14.4) היו זממו נגד מספר צלקות ניצן הממוצע לכל אוכלוסייה (איור 5). קשר לינארי זה לאחר מכן ניתן להשתמש באותו הזן וריאגנטים בניסויים עתידיים כדי לקבוע את גיל תא ממוצע מWGA-האות המנורמלת שהושגה באמצעות cytometry זרימה, המאפשר קביעה מהירה ומדויקת של גיל תא. עדיין צריכה להיות כלולות אוכלוסיות בקרה כדי לוודא את יעילות כתמים דומה בין ניסויים.
ההשפעה של גיל על ההצטברות של מוטציות ניתן לטפל פעם אחת הצעדים לפני קבלת ערכי שיעור מוטציות, ביעילות מיון תאים, וקביעת גילאי תא הם השיגו. נוmber נקודות זמן שבו התדירות ניתן לקבוע תלוי בגודלה של אוכלוסיית התא שכותרתו ביוטין ואת מספר התאים שצריכים להתפשט על מצע סלקטיבי כדי להשיג תוצאות אמינות. אם שינויי שיעור מוטציות עם גיל, אז תדרי המוטציה הנצפים עבור הזדקנות תאי אמא צריכים להיות שונים מאלו שנצפו מבוססים אך ורק על סיבובים נוספים של חלוקת תא. השוואה של תדירות המוטציה שנצפתה לתדירות המוטציה חזתה יכולה לזהות הבדלים הקשורים בגיל בשיעור מוטציות מצטברות. כפי שתואר בסעיף 7 לפרוטוקול, ניתן להשיג את התדר חזה מהמוצר של שיעור בסיס המוטציה לאוכלוסיית התא הראשוני והעלייה בגיל replicative של תאי אמא הוסיפו לתדירות המוטציה לאוכלוסייה הראשונית. עליות בתדירות המוטציה CAN1 נצפו עם גיל תא ממוצע עלה במתח עם CAN1 במיקומו הרגיל בV כרומוזום(איור 6 א) ובמתח עם CAN1 על הזרוע הימנית של כרומוזום VIII (איור 6). מאז תדרי המוטציה נצפו עבור תאי אמא באיור 6 א דומים לאו ממש מתחת לתדרים ניבאו, נתונים לא מספקים כל ראיה לשינוי גיל ספציפי בשיעור מוטציות. בניגוד לכך, תדרי מוטציה בתאי אמא של הזן עם CAN1 על כרומוזום השמיני היו גבוהים יותר מהתדרים שחזו (איור 6). שים לב שהתדרים חזו בגרף אינם מופיעים להגדיל מאוד בגלל קנה מידה יומן נאלץ לשמש עבור ציר y בשל העלייה הגדולה בשכיחות מוטציה נצפית. לכן, התוצאות באיור 6B אל לספק ראיות התומכות עליית גיל ספציפי בשיעור של מוטציות מצטברות. ההבדל בתוצאות לערכות נתונים בתרשים 6A ו6B הוא סביר בשל diffe לשכור מקומות הגנומי של CAN1. תצפיות סוגים אלה מספקים נקודה מוצא לפיתוח השערות ללמוד מנגנונים המשפיעים על שיעורי מוטציה גיל תאים ולפתח מודלים להסביר הצטברות מוטציות עם גיל replicative.
איור 1 תרשים זרימה של ההליך הכולל לבחינת הצטברות מוטציה במהלך הזדקנות replicative שמרים. טקסט וחיצים שחורים מצביעים על שלבים עיקריים בהליך. החץ המעוקל משקף כי סבבים נוספים של צמיחה מחודשת ומיון של אותם תאים משמשים לקבלת תאים בהדרגה מבוגרת. חיצים וטקסט סגולים מצביעים על צעדים שבמדידות האמורות נעשו. תדר - תדר.
להעלות / 51,850 / "width =" 51850fig2highres.jpg 400 "/>
איור 2 קביעת תדירות מוטציה ושיעור באוכלוסיות תאים צעירות. () מושבות Mutant נבחרו על ידי הפצת תאים בSC-ARG + בינוני canavanine כדי לבחור עבור מוטציות אובדן של הפונקציה בגן CAN1 והשוואה למספר הכולל של תאי קיימא התפשטו על מדיום סלקטיבית כדי לחשב תדרים / שיעורים. תאים מאוכלוסיות ראשוניות לפני תיוג ביוטין (IP) או לאחר תיוג ביוטין (PB) גדלו באמצעות מדיום YPD מצפיפות ראשונית של 5,000 תאים / מ"ל לרוויה ליד. עמודות לבנדר מצביעות מדידות קצב ועמודות כחולות מייצגות מדידות תדר עשו בטמפרטורות מצויינים (20 מעלות צלזיוס ו30 מעלות צלזיוס). סטים של שבע תרבויות לשכפל גדלו במשך כל ניסוי ושניים לחמישה מחקרים עצמאיים שבוצעו. ערכי שיעור אדם מחושבים לניסויים בלתי תלויים הראו, וברים שגיאה לניסויים אלה מייצגים 95 מרווחי ביטחון% לקבועד באמצעות מחשבון מקוון 22. תדרים מייצגים ממוצעים וסטיות התקן. שיעורי מוטציה (B) CAN1 הושגו ומיוצגים כפי שתוארו לחלק באמצעות מתח עם CAN1 על הזרוע הימנית של VIII כרומוזום. תדרים (C) מוטציה שהושגו בעקבות בחירתה למושבות מוטציה על 5-פואה באמצעות מתח עם גן URA3 ממוקם על הזרוע הימנית של VIII כרומוזום. שיטות היו בדרך אחרת כמו לחלק, וממוצעים וסטיות התקן עבור שלושה או ארבעה משפטים עצמאיים מוצגות.
איור 3 דוגמא מיון היעילות נקבעה על ידי חישוב מספר תאי eluted לאחר כל סיבוב של מיון. המספר הכולל של תאים בכל אוכלוסייה המתחילות לאחר תיוג ביוטין נקבע לאחד, ולא () מספר סך כל תאים הנמצאים בדגימות eluted מכל סיבוב של מיון תא המגנטי היה מחולק על ידי ערכים הראשוניים אלה כדי לקבל את החלק היחסי של תאים שכותרתו. מספרים סלולריים סך הכל נקבעו מספירת תאים המתקבלת באמצעות hemocytometer. עמודות כתומות מייצגות את הממוצע וסטיית התקן עבור שלושה ניסויים בלתי תלויים הבאה הפרוטוקול הסטנדרטי. עמודות כחולים מייצגות את הממוצע וסטיית התקן עבור שני ניסויים בלתי תלויים שבו טופלו תאים עם מי חמצן 1 מ"מ ל30 דקות מייד לאחר מהסוג הראשון. גודל (B) ומורפולוגיה של תאים לאחר תיוג ביוטין (הודעה ביוטין-) ותאי אמא התאושש לאחר הסיבוב השלישי של מיון מגנטי (3 תאי אם סוג) מוצג באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי בהיר שדה ואובייקטיבי 20X. קווים לבנים ברקע הם הקווים שקשרו את הריבועים הקטנים ביותר לעין בhemocytometer סטנדרטית.k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קביעת איור 4: גיל replicative באמצעות ספירת צלקת ניצן ידנית. מיקרוסקופיה Confocal שימשה לספור צלקות ניצן על תאים בודדים שכותרתו עם המצומד WGA-ניאון (עירור ב 488 ננומטר וזיהוי עם לעבור להקת 458/543 ננומטר ו505 מסירה ארוכה ננומטר שילוב מסנן). () ספירת צלקת ניצן ידנית של תאים מהזרימה דרך (תאי בת) הבאה סבב המיון מגנטי (n = 62) השלישי. (ב) סעיפי ניצן ידני צלקת של תאי eluted (תאי אמא) הבא סיבוב שלישי של מיון מגנטי (n = 54). תאי אמא (C) שמרה הבא בסיבוב השלישי של מיון מגנטי צולם באמצעות מטרת טבילת שמן 63X עם זום 3X לאחר מכתים את השנינותחה המצומד WGA-הניאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קביעת איור 5 של גיל replicative באמצעות cytometry זרימה. דוגמאות של 10,000 תאים מוכתמים בהמצומד WGA-ניאון נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות עירור ב 488 ננומטר וזיהוי עם לעבור להקת 530/30 ו505 מערכת סינון מסירה ארוכה. ( היסטוגרמות) המתארות את המספרים של תאים עם עוצמות WGA-הקרינה ספציפיות לאוכלוסיית תאי בת או eluate (תאי אם) לאחר שלושה סבבי מיון מגנטי. אוכלוסיות מתאימות לאלו שנותחו באיור 4. קווים אנכיים כחולים מצביעים על המיקום המתאים עבור רוב dauתאי ghter על ההיסטוגרמה התא האם. (ב) הממוצע הגיאומטרי המנורמל לאות הקרינה של כל אוכלוסייה מוצגת ובשלוש אוכלוסייה נוספת של תאים (גילים ממוצע 3.0, 6.9, ו14.4) היה מחושבים כיחס של הממוצע הגיאומטרי של תאים המוכתמים והממוצע הגיאומטרי של אוכלוסיית תאים בלא כתם המתאים. ערכים אלה הם זממו בהשוואה לממוצע של צלקות ניצן לכל אוכלוסייה (איור 4 ומידע לא מוצג). R 2 הערך עבור קו המגמה של השוואה זו ניתן על הגרף.
איור השוואה .6 בין תדרי מוטציה חזו ונצפו במהלך הזדקנות replicative. תאים עם מוטציות בגן CAN1 נבחרו כמתואר לאיור 2 usinזנים גרם עם CAN1 במיקום הרגיל שלו על כרומוזום V (א) או על הזרוע הימנית של כרומוזום VIII (B). תאים גדלו על מדיום מוצק ב30 מעלות צלזיוס לפני תיוג ביוטין ועל 20 מעלות צלזיוס לאחר מכן. ערכי תדירות נצפים מוצגים עם עמודות כתומות (Obs) ותדרים חזו לתאים בגיל מוצגים בעמודים חומים (Pre). העמודה הראשונה עבור כל גרף מראה את הסטייה הממוצעת והסטנדרטית של תדירות המוטציה הראשונה שלאחר תיוג ביוטין לארבעה ניסויים עצמאיים (PB). מספרים מתחת לעמודות מציינים את מספר צלקות ניצן הממוצע לכל (גיל Cell) אוכלוסייה. ערכים חזויים עצמאיים נקבעו כאמור בסעיף 7 לפרוטוקול באמצעות כל אחד מערכי השיעור הראשוניים שמוצגים באיור 2 א (עמודות IP) ו -2. ערכים העצמאיים עליו הוחלט בממוצע. ערכים נצפים הם באמצעות שלושה ניסויים. ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן.
Discussion
פרוטוקול זה משלב מספר שיטות כדי לאפשר משאבים וגישות זמינים בSaccharomyces מערכת מודל cerevisiae להיות מיושם ביעילות למחקר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. מגוון רחב של מבחני לכמת צורות שונות של חוסר יציבות הגנום באמצעות בחירת פנוטיפי יכול להיות משולב עם מיון מגנטי ללמוד אפשריים ספציפי לגיל שינויים בהצטברות של צורות מסוימות של מוטציות או שחלופי כרומוזום. בעוד גישות רצף הגנום יכולות לספק מידע נוסף על הסוגים הכלליים של שינויים המתרחשים בגנום עם גיל, את היכולת להשתמש במערכות בחירת פנוטיפי להשיג מדידות שיעור מוטציות וכדי לבודד מעדיף סוגים מסוימים של שינויים גנטיים הם יתרונות חשובים ללימוד מכניסטית היבטים של חוסר יציבות הגנום הקשורות להזדקנות. התייעלות קביעת גיל תא והפוטנציאל לבצע מדידות מקבילות של physiologiשינויי קלוריות באמצעות cytometry זרימה לספק אמצעים יעיל כדי לתאם חוסר יציבות הגנום עם שינויים תאיים אחרים בזמן טווחי גיל ספציפיים. קביעת פוטנציאל תלוי גיל שינויים בשיעורים של מוטציות מצטברות דורשת: 1) קביעה מדוקדקת של שיעורים באוכלוסיות תאים צעירים, 2) קביעה מדויקת של גיל תא, ו3) היכולת להעשיר באופן מהימן אוכלוסיות גדולות מספיק של תאי אם למדוד reproducibly חוסר יציבות הגנום בגיל המבוגר. גישה זו מאפשרת למערכת שמרי המודל לתרום להגדרת מנגנונים אחראים לתלוי גיל שינויים בשיעורים ו / או תדרים של חוסר יציבות הגנום בתאי mitotically פעילים שבבסיס. יתר על כן, גורמים גנטיים וסביבתיים ניתן להעריך במהירות לתרומות לחוסר יציבות הגנום תלוי גיל. סופו של דבר, אפיונים אלה יכולים להוביל לפיתוח מודלים המסבירים את האופן שבו מוטציות מצטברות במהלך הזדקנות replicative.
שיטה זו תלויה ביכולת לזהות מוטציות או סוגים אחרים של חוסר יציבות הגנום באמצעות הופעתו של פנוטיפים לבחירה למדידת שיעורים של אירועים כאלה. עם זאת, יצירתיות בעיצוב assay יכולה להרשות להיבטים רבים של חוסר יציבות הגנום להיחקר. לדוגמא, URA3 וגני CAN1 יכולים להיות ממוקמים באתרים גנומיים שונים כדי לבדוק את כל השפעות של מיקום גנטי על תוצאות. חזרה של אללים של גן שאינו פונקציונליים ספציפיים לאללים גן פונקציונליים יכול לבדוק תהליכי מוטציה מסוימים. כמו כן, כניסתה של אללים פעילים מרובים של גן או איגוף גן עם רצפים חוזרים יכולה לשמש כדי לבחון אירועי רקומבינציה דרך שיקום או אובדן של תפקוד גן, בהתאמה. בדיקות תנודות הן הגישה סטנדרטית לקביעת שיעורי אלה אירועי חוסר היציבות הגנום השונים 9. הפרוטוקול נכתב באמצעות האומדן החציוני לאה-Coulson המקובל היטב ופשוט יחסית כדי לקבוע mutaשיעור tion כדי להפוך אותו נגיש יותר לחוקרים מגוונים, למרות ששיטת אומדן סבירות MSS-מקסימום נחשבת הגישה הטובה ביותר לקביעת שיעורי מוטציה 9. אומדן סבירות MSS-המרבי נבדק בעבר בפירוט 9, ויכול לשמש כשיטת חלופית, אבל דורש חישובים מתוחכמים יותר. לחלופין, תוכנה חופשית לחישוב שיעורי מוטציה בשיטה זו הפכה לזמינה 22. קבלת אמצעים לשחזור של שיעורי מוטציה דורשת תשומת לב לכמה היבטים של תכנון ניסוי, כוללים שימוש בתרבויות לשכפל מספיק, ייחסו תרבויות בצפיפות תא נמוכה מספיק ראשונית שעולה גודל אוכלוסייה על ידי כרכי תרבות המתאימים 10,000 פי או יותר, ובחירה, כך שכל אוכלוסייה של תאים ניתן להפיץ על גבי מצע סלקטיבי. לנקודה האחרונה, נוסחה שתוארה לעיל יכולה לשמש כדי להתאים את שיעור מוטציות המבוססות על חלק קטן של טסט התרבותד 9. וריאציה בקצב צמיחה של תרבויות יכולה לסבך את קביעת שיעור מוטציות לשחזור, ואומדן המבוסס על חציון שונה שעשויים להניב תוצאות לשחזור יותר במצבים כאלה תוארו 23 לאחרונה.
היכולת למדוד גיל תא בצורה מדויקת היא גורם נוסף שהוא חשוב לקביעה אם תדרי חוסר יציבות הגנום בתאים ישנים שונים מהערכים הצפויים בשל שיעור האירועים בתאים צעירים. מצאנו כתמי WGA להיות עדיף על calcofluor צביעה לבנה, הן מבחינת רקע וגמישות, מאז WGA זמין מצומדות למולקולות ניאון שונות. גמישות זו יכולה לספק יותר הזדמנויות למדידות בו זמניות של מאפייני תא אחרים עם ריאגנטים ניאון. עבודה ראשונית ליצור מערכת יחסים בין עוצמת האות לצביעת WGA והמספר המתאים של צלקות ניצן על תאים ולאחר מכן יכול להוביל ליותרקביעה מהירה של גיל תא דרך cytometry זרימה. גישה זו גם מאפשרת שימוש בגדלי אוכלוסייה גדולים יותר ממה שאפשר בחן בדרך כלל על ידי מיקרוסקופ לשחזור משופר של מדידות. ניתן אמנם עשו את כל קביעות הגיל באמצעות בדיקה מיקרוסקופית של התאים, אנחנו מרגישים שזרימת גישת cytometry מאפשרת סינון מהיר של גורמים המשפיעים על חוסר יציבות הגנום תלוי גיל.
בנוסף למדידת גיל תא באופן מהימן, שיקול צריך להיות נתון למספר חלוקות תא תאי אמא מותר לעבור עם כל סיבוב של גידול ומיון תאים רצוף. השתמש בגודל קטן יותר ראשוני אוכלוסייה או גדול יותר נפח תרבות יכול לאפשר לתאים לעבור יותר חלוקות תא לפני שהגיע לצפיפות התאים הרצויה. לדוגמא, חוקרים אחרים השתמשו רק בשני סבבי מיון להשיג תאים ישנים מאוד שמרים 16, שבו יש יתרון הברור של קבלת תאים ישנים עם פחות experimeצעדי פתיחות opening סגירות closures. כאשר שוקלים האם להגדיל נפח התרבות כדי לאפשר את התאים כדי להשלים יותר חלוקות תא לפני המיון, יש לזכור את המגבלה על המספר הכולל של תאים שיכולים להיות מעובד בעמודה אחת. השתמש של גדול יותר נפח תרבות עשוי להצריך שימוש בעמודות מרובות כדי למיין אוכלוסיית תא אחד. כמו כן, אם תאים עוברים פחות סיבובים של חלוקת תא בין נקודות מיני / אוסף, אז יש יותר הזדמנויות לצפות חריגות מתדרי מוטציה צפויות בנקודות זמן שונות במהלך תוחלת חיים. לדוגמא, דגימה רק בתחילה ונקודות זמן מאוחר במהלך תוחלת חיים עשויה לייצר נתונים המצביעים על עלייה מתמדת בשכיחות מוטציה, אבל דגימה בזמנים ביניים נוספים במהלך תוחלת חיים עשויים להראות כי עלייה בתדירות מוטציה במהירות ולאחר מכן מישורים. עם זאת, מאז פרוטוקול זה מבודד את תאי אמא ישנים, יש הזדמנות להשיג מדד ישיר יותר של שינויים בשיעורי מוטציה עם גיל. בדיקות תנודות יכולות bדואר מתבצע באמצעות תאי אמא בגילים שונים כדי לקבוע אם שיעור המוטציות יהיה שונה מהשיעור שהושג תוך שימוש בתאים צעירים. בעוד התרבויות לבדיקות תנודות אלה תהפוך לתערובת של תאים זקנים וצעירים כאשר הם גדלים, כל חריגה משיעורים שהושגו החל מתאים צעירים אפשר לייחס לשימוש באוכלוסיית המוצא מבוגר.
היכולת להשיג reproducibly מספיק אוכלוסייה גדולה של תאי אמא של גילאים עד למדוד חוסר יציבות הגנום מדויק היא קריטית להצלחה של גישה זו. בעוד הפרוטוקול מתאר את השימוש במערכת מיון מגנטי מסוימת למטרה זו, קבוצות אחרות שמסודרות על תאי אמא של שמרים עם מערכות חלופיות 14,18 (ראה טבלה של חומרים). מערכות חלופיות כגון צריכה גם לעבוד בשיטה זו, אם כי עשויה להידרש כמה אופטימיזציה של הפרוטוקולים של היצרנים. ללא קשר למערכת הספציפית בשימוש, גודל האוכלוסייה דורשנבדל ד בהתאם לתדר של הסוג של סידור מחדש מוטציה או הגנום שנבחר למחקר. לכל הפחות, חייבת להיות מספיק תאי אם להשיג מושבה מוטציה אחת לפחות לכל אוכלוסייה לחישוב תדירות מוטציה. בפועל, תוצאות יכולות להיות די משתנים ולו רק אפס עד חמש מושבות מוטציה צפויות מגודל האוכלוסייה, ואפילו עלייה קטנה בגודל אוכלוסייה, ולכן כי חמישה עד עשר מושבות מוטציה צפויות, יכול לשפר את שחזור באופן משמעותי. כאשר יוטין תיוג אוכלוסייה מתחילה, התאוששות היעילות עבור כל סוג צריכה להילקח בחשבון כדי לסייע בזיהוי גודל האוכלוסייה המתאים דרוש כדי למדוד תדירות מוטציה בתאי אמא ישנות. עם התאוששות 90% מתאי אם לאחר כל סוג, רק 59% מהאוכלוסייה המקורית היו להיות התאוששו לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון. זה יורד ל ~ התאוששות 33% מהאוכלוסייה המקורית לאחר חמישה סבבים של צמיחה ומיון אם רק 80% מתאי אמא שכותרתו להתאוששed במהלך כל סוג שהוא. מדידה ולמקסם את ההתאוששות היא חיונית כאשר מודדים אירועים בתדירות נמוכים, שכן 2:58 ירידה של פי גודל אוכלוסייה יכולה בקלות להוביל למספרים לא אמינים של מושבות מוטציה לאוכלוסייה.
ישנם מספר רב של אפשרויות להרחבה או שינוי בפרוטוקול זה כדי להשיג הבנה רחבה יותר של חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic. דוגמאות פשוטות כוללות ניתוח איך שינויים בפונקציות גן, שינויים בתקשורת, או שינויי מצב סביבתי אחרים לשנות את ההצטברות של מוטציות עם גיל. שיעורי מוטציה בתאים צעירים עם תפקוד גן שעבר שינוי או במצב המתאים יהיו נמדדו ומשמשים כדי לקבוע אם מוטציות מצטברות באופן שונה מהצפוי על ידי ערכי השיעור ואופן שונה מאשר באוכלוסיות תאי שליטה. אוכלוסיות תאים בנקודות שונות במהלך הזדקנות replicative עלולות להיחשף לגורמי לחץ מסוימים, כגון מיני חמצן תגובתי או סוכנים מזיקים DNA.חשיפה חולפת וקלה לסטרס חמצונים משמעותי לא שינתה את היכולת לבצע מיון תא (איור 3), אבל לחצים קשים יותר עלולים לסבך התאוששות של תאים. ניסויים ראשוניים יהיו צורך לוודא שעדיין יכולים להיות התאוששו תאי אמא ביעילות אחרי לחצים ספציפיים. בנוסף, המאפיינים התאיים של תאי אם מבודדים יכולים להיות מנותחים בפירוט, כוללים רמות של מיני חמצן מגיבים, מורפולוגיה של המיטוכונדריה וvacuolar, ומאפיינים פיסיולוגיים אחרים הקשורים להזדקנות 3. יתר על כן, תאי אמא יכולים להיות אוכלוסייה מתחילה לטיפול או מניפולציה נוסף. מאחר ותאים אם ובתה מופרדים פיזי במהלך ההליך, תאי הבת הם גם עדיין זמינים לניתוח. לדוגמא, שינויים במאפיינים פיסיולוגיים של תאי בת או הירושה סימטרית של מקרומולקולות הפגומה בין שמרי אם ותאי בת
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק R00AG031911 מהמכון הלאומי להזדקנות של המכונים הלאומיים לבריאות לPHM התוכן של מאמר זה אינו משקף בהכרח דעות רשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
- Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
- McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
- Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
- Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
- Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).
- Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
- Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
- Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
- Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
- Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
- Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).
