Summary
変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される。
Abstract
出芽酵母は、ゲノム不安定性のメカニズムと影響を調べるための優れたモデル系となっている。 DNA修復およびDNA損傷応答因子が十分に多様な種を超えて保存されているので、この酵母モデルから得られた情報は、ヒトを含む多くの生物に関連しています。しかし、S.サッカロミセス·セレビシエは、まだ完全には技術的な制約のために複製（有糸分裂）、年齢の増加と共に突然変異変化を蓄積する速度かどうかに対処するために使用されていない。例えば、マイクロマニピュレーションを通して酵母複製寿命の測定は、稀な変異の検出を禁止する細胞の非常に小さな集団を伴う。娘細胞の死を誘導することにより、集団における母細胞を濃縮するための遺伝的方法が開発されているが、集団サイズは依然として選択システムを危険にさらすランダム突然変異が発生する頻度によって制限される。現在のプロトコルは、磁気sortiを利用しています表現型の選択を介して稀な突然変異を定量化するために高齢の母親細胞の十分な大きさの集団を得るために表面標識酵母母細胞ngの。変動試験により測定された突然変異率、および突然変異頻度は、最初の若い細胞に対して確立や各種複製年齢の母細胞における突然変異の頻度を予測するために使用される。突然変異頻度は、次に、ソート母細胞のために決定され、母細胞の年齢は、細胞分裂中にそれらの細胞表面上に形成された芽の傷を検出する蛍光試薬で染色してフローサイトメトリーを用いて決定される。実験的に与えられた複製年齢の母細胞について観察された頻度に細胞分裂の数に基づいて予測された突然変異頻度の比較はその後の突然変異の蓄積率の加齢変化があるかどうかを識別することができる。この基本的なプロトコルのバリエーションは、特定の遺伝子機能の変化の影響を調査するための手段を提供するか、または複製老化中にゲノム不安定性のメカニズムに対処するために、突然変異の蓄積上の特定の環境条件。
Introduction
酵母サッカロマイセス·セレビシエなどの微生物は、突然変異率を調査するための優れたモデルであるが、これらのモデルは、完全に細胞の有糸分裂熟成中変異の蓄積を調査するために利用されていない。核ゲノムにおける突然変異の蓄積は、遺伝子機能の1（または変動）進行性の喪失をもたらすことによって老化に寄与することが仮定されている。エージング中に突然変異の蓄積のメカニズムと影響を研究するために微生物系を使用する能力が大幅ため容易遺伝子系および微生物における稀な表現型の変化を定量化が容易で、このプロセスに影響を与える遺伝的および環境的因子の同定を加速する可能性がある。 DNA修復因子およびDNA損傷応答タンパク質は、十分に多様な種2を超えて保存され、そして生物の老化の根本的な類似性は、S.限り多様な生物のために同定されているセレビシエ ANそれは可能性が高いことを作るD哺乳類3は 、酵母における研究から得られた結果は、多くの生物の老化に関係するであろう。
Sに高齢化に関する研究サッカロミセス·セレビシエは加齢による老化や細胞の複製老化を測定する2高齢化のモデルを利用する。加齢による老化に起因栄養枯渇3に非分裂状態（定常期）にある酵母細胞集団における生存能力の進行性の喪失によって特徴付けられる。加齢による老化モデルでは、大きな細胞集団を容易に変異細胞のための表現型選択を行うために、このモデルで得られるので突然変異が、加齢4に蓄積することを実証するために使用されている。この場合には、突然変異の蓄積は、増殖シグナル伝達経路および酸化ストレス5によって影響されるようであり、これらの各要因は、多細胞真核生物3の老化の理解に関連する。複製老化モデルは、非対称ディビジのを悪用S.の間での連続した細胞世代3で発生する老化を調査するためのサッカロミセス·セレビシエ母と娘細胞。酵母複製老化は、多くの場合、マイクロ流体デバイス6,7酵母細胞の小集団のビデオ顕微鏡を通して母と娘細胞、またはより最近では、小集団のマイクロマニピュレーションにより測定された。リミテッド人口のサイズは、全ゲノム情報が単一細胞から得られた、または非常に高い周波数の遺伝的変化は8で測定されていない限り、分裂熟成中の突然変異の蓄積を調査するためのこれらのアプローチはあまり適しています。単一細胞の全ゲノム配列決定は、変異の蓄積を調査するため、実質的なデータセットを提供するが、表現型選択システムは、突然変異の蓄積のメカニズムを研究するために突然変異率を測定する手段を提供するという重要な利点を有する。 haploiにおける表現型の選択を介して突然変異頻度や料金を検討する研究複製老化の間のd個の酵母菌株は、まだ報告されていない。
突然変異率は、一般的に変動試験9を用いて測定される。変異頻度の値は、集団における遺伝子配列における変異を有する細胞の総数を反映する。これは独立した突然変異が発生した細胞単に既存の突然変異を継承するそれらの細胞の任意の子孫を含む。対照的に、変動試験により測定された突然変異率は、新たに、各セルの生成を生じる独立した突然変異の数を表す。これらのテストは、典型的には、標的配列内の既存の変異を有する細胞を添加ほぼ飽和した培養物を増殖し、選択培地上での増殖によって突然変異細胞を同定する可能性を低減するために低細胞密度で、多くの複製培養物を接種することを含む。レプリケート集団で同定された変異体細胞の数は、その後、iの数を推定するために、いくつかの数学的モデルのいずれかで使用されている成長の9時に生まれたndependentの突然変異。平均集団サイズに独立した変異の数を比較して突然変異率の尺度を提供する。 S.でこれらの遺伝子における機能喪失変異は、選択可能な表現型を生成するので、 サッカロミセス·セレビシエ 、突然変異頻度や料金は頻繁に、URA3及びCAN1遺伝子を用いて測定される。 URA3によりコードされたタンパク質は、毒性分子10内に5-FOAに変換するので、URA3機能の喪失は、5 -フルオロオロチン酸（5-FOA）に耐性の細胞をレンダリングします。 CAN1によってコードされるタンパク質が細胞11内にアルギニン及びカナバニンを搬送するので、CAN1の機能の喪失は、細胞がカナバニンに耐性になることができ、有毒なアルギニン類似体。
遺伝的および物理的な両方のソーティング戦略は成功しS.のより大きな集団を得るために使用されている複製老化の調査を容易にするために、 サッカロミセス·セレビシエ母細胞。遺伝的戦略は、集団の中の娘細胞の生存に対して選択する巧妙な手法を含む。母濃縮計画（MEP）loxP部位 12を含むように操作された2つの必須遺伝子の娘特有の混乱につながる唯一の娘細胞におけるCreリコンビナーゼの発現のベータ-エストラジオール誘導を伴う。 MEP株は誘導物質の非存在下では正常に成長させることができますが、母細胞が娘細胞が細胞周期から12彼らの最初の進行の間に、一般的なM期で逮捕する一方、誘導後に分裂していきます。このシステムは広く熟成中の変異の蓄積を研究するために使用されていないが、それは老化母細胞13,14におけるヘテロ接合性の消失、二倍体酵母株におけるゲノム不安定性の比較的頻繁な形態、ならびに生化学的変化を研究するために使用されている。同様に、娘避雷器システムは、Sの娘特異的発現を伴うcereviSIAE URA3遺伝子15。 5-FOAがれるURA3を発現しているポイントの娘細胞が死んでしまう、培地に添加されるまで、母細胞が15を成長させ続けている娘、アレスタ株は、正常に成長。これらは、母細胞を濃縮するための有用なシステムであるが、それらは選択システムを構成する遺伝子機能の維持に依存している。選択システムの1つまたは複数の構成要素におけるランダム変異は、選択を脱出し、指数関数的に増殖する娘細胞を生じる可能性がある。 MEP株の開発中に、適切な集団サイズは選択12を逃れる可能性突然変異娘細胞の出現を回避するために決定した。しかし、人口規模で、この制限は、複製老化の間にゲノム不安定性のまれな形態の検出を損なう。集団サイズに対するこの制限は、部分的にほとんどは、選択システムに貢献する各遺伝子の2つのコピーを二倍体酵母株を用いることによって克服することができ変異はおそらく12劣性となる。しかし、二倍体株の使用を容易に簡単に一倍体酵母細胞中で検出可能なものと比較して検出することができる突然変異事象の種類を制限する。
物理選別戦略は母細胞の大集団を濃縮するために、非標識の娘細胞からの標識細胞表面と母細胞の単離を含む。観察S.の細胞表面タンパク質（細胞壁タンパク質）が出芽は、彼らが16を産生する娘細胞を標識することなく母細胞を標識するために利用されてきた時にセレビシエ娘細胞が新たに合成される。例えば、ビオチンでその表面上に標識した酵母細胞の初期集団を成長させることができ、次いで、初期集団によって生成された娘細胞がその表面にビオチンを含有しないので、抗ビオチンマイクロビーズ、磁気選別16を使用して娘細胞から単離さ。シリアル成長とソートは、母細胞の漸進古い集団が得られ、分析されることを可能にする。この手順は、酵母13,14,17,18の複製老化の間の細胞生理学および遺伝子発現の変化を調べるために首尾よく使用されてきた。現在の方法は、潜在的にまれな変異または表現型の選択を介してアッセイしたゲノム不安定性の他の形態の蓄積を測定する目的で母細胞を濃縮するために、このビオチン標識および磁気選別技術を適応させる。シリアル成長および物理的ソートが漸進的により古い母細胞において、ならびにそれらの娘細胞集団における突然変異の蓄積の分析を可能にする。世代当たりの突然変異率の決定は、予測された変異頻度は、細胞分裂の特定の数を受けた母細胞のために計算されることを可能にする。予測された周波数値に起因観察mutatiにおける細胞分裂のさらなるラウンド、実質的な偏差に増加が予想に基づいていますので予測された値と比較した周波数での変異を蓄積率の年齢別の変更のための証拠を提供しています。このプロトコルを使用して、フローサイトメトリーによって分析と結合した母細胞における細胞分裂の部位に対応芽瘢痕の蛍光染色を迅速にソートされたおよび未選別集団の年齢分布を決定するために用いることができる。このような反応性酸素種を検出するために使用されるもののような付加的な蛍光試薬もまた、このプロトコルの間に使用することができる。全体的に、このプロトコルは、老化関連ゲノム不安定性に影響を与える遺伝的要因と環境要因を研究に非常に適したモデル生物において加齢に伴う細胞生理学的変化との相関の可能性を持つゲノム不安定性における年齢依存性変化の効率的な解析を可能にします。
Protocol
メディアアンドソリューションズの調製
- 酵母エキス - ペプトン - グルコース（YPD）標準プロトコルのための富栄養培地を用いて細胞を成長させる。 2％バクトペプトン、1％酵母エキス、YPD培地、2％グルコース溶液を調製し、固形培地19、2％バクト寒天を追加する。滅菌するオートクレーブ。特定の成長条件または変異酵母株をテストするために、必要に応じて、代わりのメディアを使用してください。
- カナバニン耐性変異株を選択するために、60 mg / Lのカナバニン（SC-argが+カナバニン）とアルギニン不足している固体の合成完全培地を加えます。アルギニン（ドロップアウト·ミックス）のないアミノ酸、2％グルコース、0.2％完全なサプリメント混合せずに0.67％バクト酵母窒素ベース、2％バクト寒天19である溶液を調製する。オートクレーブの前に20 mg / mlのストック溶液（濾過滅菌し、4℃で保存）19からカナバニンを添加することに冷却する。
- 5フルオロオロチン酸（5-FOA）を含む固体合成完全培地を加えます。 500を準備する、アミノ酸を含まない4％グルコース、0.4％完全なサプリメント混合物、及び0.2％の5-FOA 1.34％バクト酵母窒素塩基であり、19をフィルター滅菌溶液を加えた。その後、4％バクト寒天液のオートクレーブ500ミリリットル、涼しい簡潔に、そして500mlのフィルター滅菌栄養液と混合。他の突然変異試験のための適切な代替メディアを使用してください。
- ビオチン標識のために500mlの137 mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10.14 mMのリン酸ナトリウム二塩基、及び4℃で1.77 mMのリン酸カリウム二塩基、pH8のストアを含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を作製し、上に保つ使用中に氷。
- 無菌の超純水に新鮮な5 mMのビオチンのストックを作る。
- ビオチン標識をクエンチするために、1×PBS、100mMグリシンの500ミリリットルを加える。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。
- 使用される細胞および実験の期間の数に応じて、1×PBS、2mMのEDTA、0.5％boviを含むビーズ標識バッファー1-2 Lを作るNE血清アルブミン。フィルター滅菌し、脱ガスバッファ。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。
- 1×PBS中の0.4％トリパンブルー溶液を調製し、フィルターは滅菌し、細胞生存率の測定に使用するためにRTで保存。
- コムギ胚芽凝集素（WGA）の蛍光結合体の一定分量、少量（〜100μl）を細胞齢を決定する際に使用するためにラップ箔（または不透明）マイクロチューブ内に-20℃で保存する。
突然変異率と周波数の2の決定
- 標準的な培養条件下で増殖させた細胞について変動試験を用いて細胞世代あたりのベースライン突然変異率を確立する。成長11への7は、初期の定常期（〜10 8細胞/ ml）のに1,000〜5,000細胞/ mlの初期密度から1ミリリットルの培養物を複製する。
- 各反復文化のために、細胞を1希薄：2000およびコロニー形成単位/ mlに決定するために、非選択培地（YPD）上に1-4μLを広げた。 〜2400 xにおけるペレット残りのセル100μlの水中の微量遠心再懸濁中で1分間gが突然変異体を同定する選択培地上に広げた。 （細胞の増殖速度に基づいて、必要に応じて、インキュベーション時間を調節する）前に、コロニーを計数し、30°Cで3日間培養する。
- 選択培地上で得られた変異コロニー（r）の数に基づいて裁判に発生した独立した変異（M）の数を決定します。 9以下の式におけるRの変異体コロニー数の中央値を代入してMを見つけるためにリー·コールソン中央値推定器を使用してください。式の左辺は実質的にゼロになるまで、そして、mの値を代入します。
- 突然変異率を決定するために、第一の複製培養物及び体積の平均コロニー形成単位/ mlに乗じて選択培地上に広げ、生存細胞の平均数を計算する選択培地上に加えスプレッドの文化の。セル生成あたりの突然変異率を得るために、生存細胞のこの平均数によって、ステップ2.1.2からのm値を割ります。
- ステップ2.1.3で説明したように個別試験では各反復培養用の選択培地上に広げ、生細胞の数を計算する。変異頻度を得るために選択培地上に広げ、生存細胞数で培養について得られた突然変異体コロニー（r）の数を分割する。ベースライン変異頻度としてステップ2.1で複製培養物から個別の突然変異頻度の平均値や中央値を使用してください。
- 突然変異蓄積の年齢別変化をテストする際に考慮する必要があるでしょう変異の頻度の変化での標識工程の結果かどうかを判断するためにビオチン標識細胞（3.2および3.4ステップ）の前と後の周波数測定を行います。
3ビオチン標識
- セントreak S. cerevisiaeの YPD培地上に-80℃でグリセロールストックから1〜3日間30℃でインキュベートする。
- 念頭に置いて水保管の1ミリリットル（またはそれ以上）にストリークプレートからの転送細胞はストリークの厚く成長した部分1〜1.5センチ、約10 8個の細胞を与えることを、滅菌したピペットチップを使用した。血球計数器を用いて正確な細胞密度を決定します。
- ラベル10 8変異頻度が決定されるで収集ポイントごと株（または処理条件）当たりの細胞または（工程2.2からの突然変異頻度に基づいて）選択培地上でのサンプリング当たり少なくとも5〜10の変異体コロニーを得るのに十分な集団の大きさ。歪み/条件あたりのベースライン測定のための追加の10 8細胞を含む。
- メーカーから、5 mMのビオチン試薬のストックを使用して、静かにインキュベーション中に岩を除いて、標準手順に従ってビオチン標識。すべての遠心操作は3,000×gで、4℃で5分間スピンはS4℃よりも高い温度で回転してインスは、増加した細胞の損失につながる可能性があります。最後の洗浄の後、水中10 8標識細胞/ mlの濃度に細胞を懸濁する。
- トリパンブルー染色を用いて細胞の生存率を確認してください。水23μlのおよび1×PBS中の0.4％トリパンブルーの67μlの細胞を10μlに希釈する。血球計数器を使用したライブ（未染色）と死んだ（染色）細胞を獲得する前に、室温で少なくとも40分間インキュベートします。
- ゲノム不安定性、細胞齢、およびその他の関連する特性値のベースラインを測定します（セクション5,6を参照して、図7）。
- 三角フラスコ（約5×10 6細胞/ ml）に10 8個の細胞あたりYPD培地20mlにビオチン標識された細胞を移す。 10 8細胞/ ml（四から五細胞世代）のおおよその密度に培養物（複数可）、20℃で16〜18時間を育てるが、細胞が定常期に到達することはできません。 30℃で成長のためのより短いインキュベーション時間を使用してください。ビオチン標識Cキープ4℃でのエルまでの数時間前に培地に添加する、成長期間及び収集のタイミングを最適化する必要がある場合。
4。ビーズ標識および磁気ソート
- 増殖期の後、血球計を用いて細胞密度を決定するために、培養物のアリコートを希釈する。 3000×gで4℃で5分間の遠心分離により細胞をペレット化。上清を注ぐ。
- その後、ビーズ標識バッファー30ml中でペレットを懸濁させるボルテックス遠心分離し、4.1節のように上清を注ぐことにより、細胞を洗浄。繰り返し洗濯。
- 完全にボルテックスで10 8の全細胞あたり50μlのビーズ標識バッファーで細胞を懸濁します。混合する2μlの10 8の全細胞、ボルテックス簡潔当たりの磁気ビーズを追加します。オンラインプロトコルから変更された（ミックスするために定期的に反転させ、10分間氷上でインキュベートhttp://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>）。
- ビーズ標識バッファー30mlで細胞を3回洗浄する。
- 細胞が再懸濁するばかりまで中程度の設定で10合計8個の細胞あたり0.5ミリリットルビーズ標識バッファと簡単に渦ペレットを追加します。残りの細胞塊を除去するために50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを注ぐ。必要に応じて、カラム上にロードする前に1〜2時間氷上で細胞を残す。
- 磁気カラムは、結合し洗浄し、磁気ビーズで標識された母細胞を溶出するために、製造業者の推奨プロトコルに従ってください。標識細胞の増加、回復のために、2×10 9の全細胞当たり少なくとも1つの列を使用しています。
- 彼らは流れをブロックするように、列をロードするときに発生した気泡を取り除きます。オンラインプロトコルから変更された（ビーズの間に閉じ込められたとなってから細胞を防止するための洗浄の間にセパレータの列を取り外し、交換しhttp://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf）。
- 所望であれば、母細胞によって産生さ若い細胞を分析するための結合工程および洗浄工程のフロースルー保存する。ステップ4.7で説明したように細胞を濃縮する。
- 一度に複数のサンプルを処理するための複数列の区切り文字を使用してください。処理時間削減し、細胞の損失を減少させるために同じコレクションチューブに同じサンプルの複数の列を溶出する。
- 4°Cで5分間3000×gで遠心分離することにより溶出した母細胞を濃縮する。吸引し10 8元のビオチン標識細胞あたりすべてが、1ミリリットルのバッファ。残りのバッファーで細胞を懸濁させる簡単にボルテックスする。
- 細胞のアリコートを希釈し、細胞密度および血球計数器を用いて細胞生存率を決定するためにトリパンブルーで染色し（ステップ3.5参照）。回収された細胞の総数を計算します。
- セルの数が予想よりも実質的に高い場合には、若い細胞を汚染除去しようとする別のカラムに通し、溶出サンプルを渡す。セルの数が予想よりも実質的に低い場合には、母細胞の収率を改善しようとする別の列を介して試料を通して保存流れを通過させる。
- せずに、（4.1-4.8.1ステップ）あるいは、セクション5および6に記載したように、さらなる分析のために細胞を使用し、その複製年齢（ステップ3.7）を増加させ、ビーズ標識によって従うことを再びYPD培養液中で細胞を増殖および並べ替えビオチン標識を繰り返す必要があります。
複製年齢5。決定
- このセクションのすべての手順を室温で5000×gで2分間細胞をスピン。 1.5ミリリットルの遠心管に回収された細胞（〜10 8個/ ml）を25μl入れて、1ミリリットル1×PBSで2回洗浄する。上清を吸引除去する。
- WGA-コンジュゲートのアリコートを解凍し、ボルテックスして混合し、タンパク質凝集体を除去するために短時間スピンする。 180μlの1×PBSおよび目の表面の芽傷を標識するために蛍光分子に結合WGA20μlの中に細胞をサスペンド電子セル。ホイルで1.5ミリリットルの遠心管をカバーし、穏やかに30分間、30℃で揺らしながらインキュベートする。
- 1ミリリットルの1×PBSで3回洗浄する。
- 蛍光顕微鏡、ラベルスライドや抗フェード剤を使用して、標準的なプロトコルごとにマウントします。完全に撮像中に細胞運動を避けるために、カバースリップをシールする前に（数日まで）、暗所でスライドを治す。細胞齢の代表測定値を得るために、サンプルごとに少なくとも50個の細胞に芽傷跡を数える。必要に応じて保存、芽の傷跡を見るために1ヶ月までスライドします。
- あるいは、ステップ5.1.2の後に1×PBS 1mlに懸濁した細胞にフローサイトメトリーを行うことにより、WGA結合体からの蛍光シグナルの強度を決定する。 WGA-アレクサ488用の505 nmのロングパスフィルターと405 nmの励起レーザーと530/30 nmの発光フィルターを使用し、各コレクションのポイントの染色していないコントロールを含めます。
- 上の顕微鏡検査により計数若い細胞と老化した細胞上のグラフ芽の傷跡x軸上の同一の細胞集団からWGA結合体の蛍光の正規化された幾何平均に対するy軸（染色された幾何平均/未染色の幾何平均）。この関係の線形傾向線の式を得る。その後の実験のために、式中のxの細胞集団のWGA-コンジュゲートの蛍光強度の正規化された幾何平均を代入し、サンプルの平均セル年齢を決定するために、yについて解く。
6。変異頻度
- ステップ2.1.1で説明したようにスプレッドをYPD培地および選択培地上にステップ4.7から緩衝液中に再懸濁母細胞を選別した。 1分間5000×gで選択培地とスピン細胞について再懸濁母細胞の1ミリリットルを使用してください。
注：細胞が古い集団における非生存と老化細胞数の増加を補償するために、年齢の増加としてYPD培地上に希釈した細胞のより大きなボリュームを広げる。- YPD培地からの選択培地培養するそれぞれ、3および4日間30℃で6.1ステップ。非常に古い細胞や、ゆっくりと成長している菌株について1週間インキュベーション時間を増やします。ステップ2.2で説明したように突然変異頻度を計算します。
7。与えられた複製年齢に対する予測変異頻度の計算
- 関連するソート用のソート母細胞の平均年齢から、初期の細胞集団の平均年齢を差し引くことにより、実験の過程でビオチン標識細胞の複製時代の平均増加を計算します。ステップ5.2ステップ5.2.2で計算されたセルの年齢を使用してください。
- ステップ7.1で算出した平均細胞齢の増加によってステップ2.1.3で得られた突然変異率を掛けます。関連する複製時代の細胞の予測変異頻度を決定するために、ステップ2.2で計算された初期集団のベースライン変異頻度にこの値を追加します。
Representative Results
図1の流れ図は、突然変異率、周波数、および細胞齢が測定される点を含む手順の全体的なステップを示している。それはラベリングと磁気選別のための適切な人口·サイズを選択する必要があるため、正確周波数と若い細胞集団における変異（またはゲノム不安定性の他の形式）の速度を決定する、重要な最初のステップです。速度値は変動試験9を用いて確立することができる。 5-FOAに対する耐性を付与するURA3遺伝子中のカナバニン耐性または突然変異を付与CAN1遺伝子における突然変異のために選択BY4741の遺伝的背景20内の酵母株のための例示的な結果を図2に示す。細胞は、代表的な20℃で増殖させた。速度実験を、代表周波数実験のための20°Cと30°Cで。最初の細胞集団が増殖するため、これらの温度は、使用された30°Cで、次いで選別実験後続の代表的な20℃で増殖させた。独立した試験の速度値は、染色体Vには通常の場所にCAN1遺伝子を有する株についてのビオチン標識後の初期の細胞集団および細胞について同等であった、左腕のテロメアから約32キロ塩基対（ www.yeastgenome.com ）（ 図2A、ラベンダー列）。 CAN1の突然変異率は、染色体Vとテロメアの染色体VIII約25キロ塩基対の右腕CAN1の挿入時にその通常の位置からCAN1遺伝子の欠失を有する第二の酵母株の初期集団で実質的に高かった21（ 図2B）。CAN1遺伝子変異頻度はまた、いずれかの成長温度での初期細胞集団およびビオチン標識された細胞で同等であった（Fiをグレの2A、青列）。しかし、20°Cで得られた突然変異頻度は30°Cでの突然変異頻度よりも高いことが見出された。この温度効果はCAN1遺伝子に限定されていたかどうかをテストするには、CAN1が染色体VIIIに挿入した酵母菌株を用いて5-FOAに対する耐性について選択することにより、URA3に変異を測定した。この株はまた、染色体V上、通常のサイトからのURA3の削除及び染色体VIIIテロメア21から約40キロ塩基対の右腕へのURA3の挿入を持っています。変異頻度は、この染色体位置（ 図2C）でURA3を20℃でも高かった。全体的に、これは成長温度は突然変異の頻度に影響を与えることができることを示しているが、ビオチン標識は変異頻度に影響を与えるとは思われない。そのため、最初の集団のための突然変異率と周波数が同じ成長テンペで決定する必要がある成長と選別のラウンドのために使用されますrature。これは、ビオチン標識前変異またはゲノム再配列の他の種類を調査するためにプロトコルを使用してゲノム不安定性に影響を及ぼさないことを検証することが望ましい。
予想されるように、 図2Aに示される突然変異率の値は、対応する周波数測定よりも数倍低い。突然変異率は、成長期の終わりに突然変異頻度を測定しながら、集団中の突然変異細胞の累積数を細胞分裂の各ラウンドで新たな変異を有する細胞の出現を測定するため、この違いが生じる。これらの試験のためのレート及び95％信頼区間は、再現可能な結果が反復の最小数は、このプロトコルのために提案され試行時制複製培養物を使用することによって得ることができることを示している。
初期周波数と速度の値が決定されると、母集団のサイズはCHであるべき十分な細胞が確実に突然変異頻度を決定するために仕分け複数ラウンドの後に存在していることを保証しOSEN。周波数および速度は、図2Aに示したものと類似している場合、エージング中に分析される時点あたり10 8細胞の集団を標識することが適当である。この決定は、ソートの各ラウンド後に回収する方法を効率的にラベルされた母細胞に依存します。標識された母細胞の回収効率が迅速かつ簡単に各ソートのカラムから溶出した細胞の数を決定し、細胞の形態を調べるために、血球計数器を用いて評価することができる。二つの主なポイントは、例えば、回収効率データ（ 図3A）で例示される：細胞の回復の数字が最初にソートすると、予想よりも高い表示されることがあり、細胞の小さな進歩的な損失は、継続的なソートと期待されている。最初のソート後にいくつかの実験における細胞のより高い予想より数が高解像度でした初期集団内の細胞上の芽のラベリングからULT。ビオチンで標識する細胞の数を決定する際に芽を有する酵母細胞は、典型的には、単一細胞として採点されるであろう。初期集団に存在する芽の標識化は、しかし、それらの芽から発達細胞はまた、ソート中の列上に保持することができるようになる。回収効率の決定について、この発生の影響は、最初の細胞集団における出芽細胞の割合に依存します。高い細胞数の第二の潜在的な理由は、後のソートつはソート時に細胞分裂を完了することができるこの時点で、より大きな出芽細胞である傾向があることである。その結果、まだ彼らの母細胞に付着し、大きな芽がソートされたが、その後、溶出した細胞を検査した場合と分離して異なる細胞を現れることができる。細胞のある程度の損失は、成長と選別の各ラウンドで観察されているが、プロトコルは、sの各ラウンド後の細胞の80〜90％の信頼性の保持をもたらすことができるオーチング。これは、標識された細胞の80％以上が不必要に大きな初期の細胞集団を標識する必要性を回避するために単離されていることを確認するための手順を実施するための努力の価値がある。最初のソート後のために回復ある程度の変動があったものの最初の並べ替え（30分間YPD培地で1 mMの過酸化水素）の後に軽度のストレスによる細胞の処理は、成長と仕分けの継続的なラウンドでの細胞の効率的な回収を防ぐことはできませんでした応力（ 図3A）。
細胞形態学および生存性の検査はまた、母細胞の正常な単離を確認するため、コロニー形成単位の密度を決定するために、非選択培地上で細胞を拡散するときに使用する希釈液/ボリュームを調整するための両方に有用である。母細胞が娘細胞（ 図3B）と比較して、ますます大きく、彼らの年齢として、より不規則な形状になる。母細胞サンプルは、したがって、主に大規模な、IRRで構成する必要があります実験は、ソートの各ラウンドを通じて進行するにつれてegularly細胞を形。規則的な形状の多数の小さい卵形細胞の存在は、母細胞が十分に娘細胞から分離されていないことを示すことができる。第一五から十細胞世代の間にあまり変化がないかもしれないが、母細胞の生存率も次第に成長し、ソートの各ラウンドで断るべきです。コロニーを形成することができる細胞の数は、老化細胞の形成、細胞の完全性のために直接染色のいくつかの形式で実行可能であると判定されたセルの数よりもはるかに劇的に減少させることができる。直接染色法による生存率は、最初の（約80％以下）が低下し始めるときに、コロニー生存細胞の能力に、より劇的な減少を見越して、単位密度を形成し測定するために使用される希釈液とボリュームを調整する必要があるかもしれないコロニーを形成（数倍の減少への2つ）。
ザ·ソートされた集団と対照集団の複製年代は母細胞から変異頻度データは突然変異を蓄積速度の年齢特異的な変化を分析することができる前に決定する必要がある。これは出芽痕検出試薬（ 図5）のためのシグナルを定量化するために母細胞上の蕾瘢痕の手動計数（ 図4）、またはフローサイトメトリーを介してを介して達成することができる。芽の瘢痕は比較的低いバックグラウンドシグナルは、WGA-蛍光複合体（ 図4C）を用いて標識することができる。 図4Aは、選別手順のサンプルフロースルーからのほとんどの細胞は0または1で出芽痕を有することを示す。カラムから溶出された細胞は、主に高齢者母細胞（ 図4Bおよび5）である。典型的に、>溶出した細胞の90％は、図5にフローサイトメトリーの結果から、より容易に見ることができる母細胞である。細胞を比較的少数の芽の傷跡と（<6）OBTソートつ以上のラウンド後にainedビオチン非常にゆっくりと分裂している母細胞とは対照的に、成長の関連ラウンド中に細胞分裂の数ラウンドを行ったことが標識されなかった細胞を汚染表すことができる。集団内の全ての細胞が均等に成長している場合は、細胞齢の変化は、ソートのその後のラウンドで増加させることができる。
直線関係は、WGA-蛍光信号強度とセル当たり芽瘢痕の数との間に確立された場合、より大きな細胞集団は、細胞齢を評価するために、より迅速に使用することができる。この分析のために、すべてのWGA-蛍光信号強度の正規化は、古い細胞における増加したバックグラウンド蛍光を考慮するために適切な非染色細胞集団（娘または母親）について得られたシグナルによって染色された細胞の信号を分周することによって達成される。4および図同じ代表細胞集団の5は分析。手動カウントはそれぞれ、娘細胞（ 図4A）と母細胞集団（ 図4B）が0.95と11.4の平均年齢複製を設立しました。これら二つの集団および3つの追加の集団（3.0、6.9、および14.4の平均年齢）のための正規化されたWGA-信号は、各集団のための芽の傷跡の平均数（ 図5B）に対してプロットした。この線形関係は、次に細胞齢の迅速かつ正確な決定を可能にする、フローサイトメトリーにより得られた正規化されたWGA信号からの平均細胞齢を決定するために将来の実験で同じ株および試薬と共に使用することができる。コントロール集団は、まだ臨床試験の間に同様の染色効率を検証するために含まれるべきである。
変異の蓄積に対する年齢の影響を効率的に、突然変異率の値を取得細胞を選別し、細胞の年齢が達成される決定の前段階後に対処することができる。ニュー周波数を決定することが可能な時点のmberビオチン標識細胞集団の大きさと信頼性のある結果を得るために、選択培地上に広げされる必要があるセルの数に依存する。加齢に伴って突然変異率の変化は、その後母細胞を老化するため、観察された変異頻度は、単に細胞分裂のさらなるラウンドに基づいて予想されるものと異なるかどうか。予測された変異頻度に観察された突然変異頻度の比較は突然変異を蓄積速度の年齢に関連した差異を識別することができる。プロトコルのセクション7で説明したように、予測された周波数は、最初の細胞集団についてのベースライン突然変異率および初期集団を突然変異頻度に追加母細胞の複製の年齢の増加との積から得ることができる。 CAN1変異頻度の増加は、染色体V上での通常の場所でCAN1と株では増加した平均細胞齢で観察されてきた（ 図6A）および染色体VIII（ 図6B）の右腕CAN1と株では。 図6（a）の母細胞について観察された変異頻度がするか、単に予測した周波数以下に似ているので、データは、突然変異率の年齢別変化のための証拠を提供していない。対照的に、染色体VIIIにCAN1た株の母細胞のための突然変異頻度は、予測された周波数（ 図6B）よりも高かった。対数スケールによる観測された突然変異頻度の大幅な増加にy軸に使用されなければならなかったため、グラフ中の予測頻度はあまり増加しないようであることに注意してください。したがって、 図6Bの結果は、変異を蓄積率の年齢別増加を支持する証拠を提供します。 図6Aおよび図6Bにおけるデータセットの結果の差に起因diffeに起因する可能性が高い CAN1のゲノム位置を借りる。観察これらのタイプの細胞の年齢として突然変異率に影響を与えるメカニズムを研究し、複製年齢とともに突然変異の蓄積を説明するためのモデルを開発するための仮説を開発するための出発点を提供する。
酵母複製老化の間に突然変異の蓄積を調べるための全体的な手順の図1のフロー図。黒のテキストと矢印は、手順の主要なステップを示す。曲がった矢印は同じ細胞の再増殖および並べ替えのさらなるラウンドが次第に古い細胞を得るために使用されていることを反映している。紫矢印とテキストが記載され測定が行われる時の手順を示している。周波数 - 周波数。
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若い細胞集団における突然変異頻度と速度の2の決定図。 （A）突然変異体コロニーをCAN1遺伝子において機能喪失型突然変異を選択し、周波数/速度を計算するために選択培地上に広げ、生存細胞の総数と比較したためにSC-argが+カナバニン培地上で細胞を広げることによって選択した。ビオチン標識（IP）またはビオチン標識（PB）の後に前の初期集団からの細胞はほぼ飽和5,000細胞/ mlの初期密度から、YPD培地を用いて増殖させた。ラベンダー列は、速度測定を示し、青色の列は、指示された温度（20°Cおよび30°C）で行われた周波数測定を表す。 7複製培養のセットは各試行のために増殖させ、二から五の独立した試験が行われた。独立した試験のために計算された個別の速度値が示されており、これらの試験のためのエラーバーは95％信頼区間を決定表すオンライン計算機22を使用してD。周波数は平均と標準偏差を表しています。使用して一部に5-FOA上の突然変異体コロニーの選択後に得られた染色体VIIIの右腕CAN1で株を使用。（C）突然変異頻度を説明されているように、（B）CAN1突然変異率が得られたと表現染色体VIIIの右腕に位置してURA3遺伝子を有する株。方法は、部品Aの場合とそうでない場合であって、3つまたは4つの独立した試験の平均と標準偏差が示されている。
選別の各ラウンドの後に溶出した細胞の数を計算することによって決定され、図3の例選別効率。 （A）ビオチン標識が1に設定された後、各出発集団中の細胞の総数、およびt磁気細胞選別の各ラウンドから溶出したサンプル中に存在する細胞のotal数が標識された細胞の画分を得るためにそれらの初期値で割った。総細胞数は血球計を用いて得られた細胞数から決定した。オレンジ色の列は、標準的なプロトコルを以下の3つの独立した試験の平均値と標準偏差を表す。青色カラムは、細胞を直ちに最初のソート後に30分間1mMの過酸化水素で処理された二つの独立した試験の平均値と標準偏差を表す。ビオチン標識（ポスト-ビオチン）後の細胞及び母細胞の（B）サイズおよび形態標準の明視野顕微鏡および20X対物レンズを用いて示した磁気選別の第三ラウンド（ソート3母細胞）の後に回復した。背景の白い線は、標準的な血球計数器上に表示最小の正方形をバインド線です。K ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
手動の出芽痕カウントを使用して複製時代の図4決定。共焦点顕微鏡は、WGA蛍光コンジュゲートで標識された個別の細胞への芽傷をカウントするために使用された（543分の458 nmのバンドパスで488 nmおよび検出時の励起と505nmのロングパスフィルタの組み合わせ）。磁気ソーティングた（n = 62）の第三ラウンド下記の（A）（娘細胞を通る流れからの細胞の手動出芽痕のカウント）。（B）溶出された細胞の手動出芽痕数（母細胞）は、次の磁気選別の第三ラウンド（N = 54）。（C）母細胞は、ウィットを染色した後、3倍ズームと63X油浸対物レンズを用いて撮影した磁気選別の第三ラウンド以下の保持haのWGA蛍光コンジュ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フローサイトメトリーを使用して複製年齢図5定量 WGA蛍光コンジュゲートで染色した10,000個の細胞のサンプルを530/30バンドパス505ロングパスフィルターセットで488nmの検出での励起を使用したフローサイトメトリーにより分析した。（娘細胞集団または磁気選別の3ラウンド後の溶出液（母細胞）に特異的WGA-蛍光強度を有する細胞の数を示す）ヒストグラム。集団は、 図4で分析したものに相当する。ブルー垂直線はDAUの 大部分に対応する位置を示す母細胞のヒストグラム上ghter細胞。（B）各Aに示す集団、細胞の3つの追加の集団（平均年齢3.0、6.9、および14.4）の蛍光シグナルに対する正規化幾何平均は、幾何平均の比として計算した。染色された細胞と、適切な非染色細胞集団の幾何平均。これらの値はそれぞれの総人口のための芽の瘢痕の平均数と比較した（ 図4、データは示さず）にプロットされている。この比較のトレンドラインについてのR 2値は、グラフ上に与えられている。
予測され、複製老化の間に変異頻度を観察した。図2使うために説明したようにCAN1遺伝子の突然変異を持つ細胞が選択された間に、図6の比較染色体V（A）上での正常な位置にあるか、染色体VIII（B）の右腕CAN1とG株。細胞は、前にビオチン標識し、その後、20℃、30℃、固形培地上で増殖させた。観測された周波数の値は、オレンジ色の列（OBS）と茶色の列（プリ）で示されている高齢者の細胞の予測頻度で表示されます。各グラフのための最初の列は、4つの独立した臨床試験（PB）のためのビオチン標識後の初期突然変異頻度の平均値と標準偏差を示している。列の下の数字は、各集団（細胞齢）のための芽の傷跡の平均数を示している。 図2A（IP列）及び図2（b）に示す初期速度値のそれぞれを使用してプロトコルのセクション7で説明したように独立した予測値を決定した。これらの独立した値は、平均した。観測された値は、3回の試験の平均である。エラーバーは標準偏差を示す。
Discussion
このプロトコルは、リソースを有効にするために複数の方法を組み合わせて、効率的に有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性の研究に適用される出芽酵母モデル系で利用可能に近づく。表現型選択を介してゲノム不安定性の異なる形態を定量化するための多種多様なアッセイは、突然変異または染色体再配列の特定の形態の蓄積を可能年齢特異的な変化を研究するために、磁気選別と組み合わせることができる。全ゲノム配列決定アプローチは年齢とともにゲノムに生じる変化の全体的な種類の詳細な情報を提供できるが、突然変異率の測定値を得るために表現型の選択系を使用すると、優先的に遺伝子変化の特定のタイプを単離する能力は、機構的研究のための重要な利点である加齢に関連するゲノム不安定性の側面。細胞齢とphysiologiの並列測定を行う可能性の決定を合理化フロースルーCALの変化は、フローサイトメトリー、特定の年齢層の間に他の細胞の変化とゲノム不安定性を相関させる効果的な手段を提供する。蓄積変異の率の潜在的な年齢依存性の変化の測定が必要です。1）慎重に若い細胞集団における金利の決定、細胞齢の2）正確な決定、及び3）確実に再現性よく測定するために母細胞の十分に大きな集団を豊かにする機能老後のゲノム不安定性。このアプローチは、酵母モデル系は速度および/または有糸分裂活性細胞におけるゲノム不安定性の周波数の年齢依存性変化の原因基礎となるメカニズムを定義することに貢献することができます。さらに、遺伝的要因と環境要因が急速に年齢依存ゲノム不安定性への寄与について評価することができる。最終的には、これらの特徴付けは、変異が複製老化の間に蓄積される方法を考慮したモデルの開発につながる可能性があります。
この方法は、そのような事象の発生率を測定するために選択可能な表現型の出現を通して突然変異またはゲノム不安定性の他のタイプを検出する能力に依存する。しかし、アッセイデザインにおける創造性を調査するゲノム不安定性の多くの側面を可能にすることができる。例えば、URA3及びCAN1遺伝子は、結果に対するゲノム位置の任意の影響をテストするために異なるゲノムの部位に配置することができる。機能的遺伝子の対立遺伝子に特異的な非機能的遺伝子の対立遺伝子の復帰は、特定の突然変異のプロセスをテストすることができます。また、遺伝子または反復配列を有する遺伝子に隣接する複数の不活性な対立遺伝子の導入は、それぞれ、修復または遺伝子機能の喪失を介して組換え事象を調べるために使用することができる。変動試験は、これらのさまざまなゲノム不安定性事象9の速度を決定するための標準的なアプローチである。プロトコルは牟田を決定するために、十分に受け入れられ、比較的単純リー·コールソン中央値推定器を使用して書かれているション率はMSS-最尤推定法は突然変異率9を決定するための最善のアプローチと考えられているにもかかわらず、多様な研究者にとってよりアクセスしやすくします。 MSS-最尤推定量は、以前に詳細9に概説されており、代替方法として使用することができるが、より高度な計算を必要とする。代替的に、この方法で突然変異率を計算するためのフリーソフトウェア22は使用可能になった。突然変異率の再現性のある措置を得ることは、10,000倍以上で人口規模が大きくなるに十分低い初期細胞密度で培養物を接種すること、十分な反復培養の使用を含む実験計画のいくつかの側面、に注意を必要とし、全体のように、適切な培養容量を選択する細胞の集団は、選択培地上に塗布することができる。後者の点については、前述の式は、培養テスト=の割合に基づいて突然変異率を調整するために使用することができD 9。培養物の増殖速度の変化が再現可能な突然変異率の決定を複雑にすることができ、そのような状況では、より再現性のある結果を生じ得る修飾された中央値に基づく推定器は、最近23に記載されている。
正確細胞齢を測定する能力は、古い細胞におけるゲノム不安定周波数による若い細胞内イベントの発生率が期待値と異なるかどうかを確立するために重要であるもう一つの要因である。私たちは、WGA染色はWGAは、異なる蛍光分子にコンジュゲート利用可能であるので、両方の背景と柔軟性の観点から、白染色をカルコフロールすることが好ましいことを見出した。この柔軟性は、蛍光試薬と他の細胞の特性の同時測定のためのより多くの機会を提供することができる。 WGA染色および細胞上の蕾瘢痕対応する数のための信号強度との関係を確立するための最初の作業は、より多くをもたらすことができるフローサイトメトリーを介して細胞齢を迅速に決定。このアプローチは、典型的には、測定の再現性改良のために顕微鏡で検査されるより大きな集団サイズの使用を可能にする。すべての年代測定は、細胞の顕微鏡検査を通じて行うことができる一方で、私たちは、フローサイトメトリーのアプローチは年齢依存ゲノム不安定性に影響を与える要因の迅速なスクリーニングを容易にすると考えています。
確実にセル年齢を測定することに加えて、考慮事項は、母細胞が細胞を増殖および並べ替えの各連続ラウンドを受けることが許可されている細胞分裂の数を与えられる必要がある。小さい初期集団の大きさ以上の培養液量を使用すると、細胞が所望の細胞密度に到達する前に、より細胞分裂を受ける可能性があります。例えば、他の研究者は、より少ないexperime古い細胞を得る明白な利点を有する非常に古い酵母細胞16を得るために選別つだけのラウンドを使用しているNTALステップ。細胞がソーティングの前にそれ以上の細胞分裂を完了できるように培養液量を増やすかどうかを検討する際、念頭に置いて、単一の列で処理することができる細胞の総数に制限を続ける。より大きな培養容量の使用は、一つの細胞集団をソートする複数の列の使用を必要とすることができる。細胞は、ソート/収集ポイント間の細胞分裂の少ないラウンドを受ける場合も、その後寿命の間に異なる時点で予想される突然変異頻度からの偏差を観察するより多くの機会がある。例えば、製品寿命中のみで、早期のサンプリング及び後期の時点は、データの変異頻度が着実に増加を示したが、すぐに、その後プラトーその突然変異頻度が増加を示す可能性が寿命の間に追加の中間の時間でサンプリングを生成することができる。このプロトコルは古い母細胞を分離するので、年齢とともに突然変異率の変化のより直接的な測定値を得るための機会がある。変動試験は、bの可能性eは、突然変異率は、若い細胞を用いて得られた速度と異なるかどうかを決定するために、異なる年齢の母細胞を用いて行った。彼らが成長するにつれて、これらの変動試験のための培養は古く、若い細胞の混合物となりますが、若い細胞で出発して得率からの逸脱は、古い出発集団の使用に起因する可能性がある。
再現性よく正確にゲノム不安定性を測定するために、高齢者の母細胞の十分な大きさの集団を得る能力は、このアプローチの成功に不可欠です。プロトコルがこの目的のための特定の磁気ソーティングシステムの使用を説明しているが、他のグループは、代替システム14,18（ 材料の表を参照）、酵母母細胞を選別している。製造業者のプロトコルのいくつかの最適化が必要になることができたにもかかわらずこのような代替システムはまた、この方法で動作するはずです。関係なく、使用される特定のシステムの、人口規模が必要ですdは研究のために選択突然変異またはゲノム再編成の種類の周波数によって異なる。最低でも、変異頻度を計算するために、人口あたり少なくとも1つの変異体コロニーを得るために十分な母細胞が存在しなければならない。唯一のゼロ5に対する変異コロニーは人口規模、人口規模の小さな増加から期待されている場合は、五から十突然変異体コロニーが期待されていることを、大幅に再現性を向上させることができますので、実際には、結果は、非常に可変することができます。ビオチン出発集団を標識する場合、各ソートのための回収効率は、古い母細胞における変異頻度を測定するために必要な適切な集団の大きさを特定するために考慮に入れる必要がある。各ソート後の母細胞の90％の回収率では、元の人口のわずか59％の成長と選別の5ラウンド後に回収されることになる。これは〜33％の成長率の5ラウンド後、元の人口の回復とラベルされた母細胞のわずか80％が回復している場合は、ソートに低下各ソート中に編。母集団の大きさの二から三倍の減少が簡単に人口あたりの突然変異体コロニーの信頼性の低い数字につながる可能性があるため、低周波イベントを測定する際の測定と回復を最大化することは非常に重要です。
上の拡張または有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性のより広い理解を得るために、このプロトコルを変更するための多数のオプションがあります。簡単な例としては、遺伝子機能、メディアの変更、またはその他の環境条件の変化の変化は年齢とともに変異の蓄積を変える方法を分析することを含む。改変された遺伝子機能又は適切な条件で若い細胞のための突然変異率を測定し、対照細胞集団に比べて異なった速度値により予測と比べて変異が異なって蓄積するかどうかを決定するために使用される。複製老化中の異なる点での細胞集団は、そのような活性酸素種またはDNA損傷剤のような特定のストレス要因にさらされる可能性があります。 A酸化ストレスに対する一過性の軽度の曝露は、実質的に細胞選別（ 図3）を実行する機能には変わりはありませんでしたが、厳しいストレスは、細胞の回復を複雑にするかもしれない。予備実験は、母細胞はまだ特定のストレスの後に効率的に回収できることを確認することが必要であろう。さらに、単離された母細胞の細胞特性は、活性酸素種、ミトコンドリアおよび液胞形 態、及び3を老化と関連している他の生理学的特性のレベルを含む、詳細に分析することができた。また、母細胞は、さらなる処理または操作のための出発集団であってもよい。母と娘細胞が物理的手順の間に分離されているので、娘細胞は、依然として、分析のために用意されています。例えば、娘細胞または酵母母と娘細胞との間の損傷を受けた巨大分子の非対称継承の生理学的特性の変化
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、この記事の内容は、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を反映するものではないPHMに国立衛生研究所の国立老化研究所からの助成金R00AG031911によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
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