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Biology

Combinando clasificación magnética de las células madre y las pruebas de fluctuación para analizar la inestabilidad del genoma Durante mitótico Aging Cell en Published: October 16, 2014 doi: 10.3791/51850
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

Las tasas de mutación en células de Saccharomyces cerevisiae jóvenes medidos a través de pruebas de fluctuación se utilizan para predecir las frecuencias de mutación de células madre de diferentes edades replicativa. Clasificación magnética y citometría de flujo sirven entonces para medir las frecuencias de mutación real y la edad de las células madre para identificar cualquier desviación de las frecuencias de mutación predichos.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae ha sido un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos y consecuencias de la inestabilidad del genoma. La información obtenida de este modelo de levadura es relevante para muchos organismos, incluyendo los seres humanos, ya que los factores de respuesta de reparación del ADN y daño en el ADN son bien conservadas a través de diversas especies. Sin embargo, S. cerevisiae aún no se ha utilizado para tratar completamente si la tasa de acumulación de mutaciones cambios con el aumento de replicativa (mitótica) edad debido a limitaciones técnicas. Por ejemplo, las mediciones de la levadura vida replicativa mediante micromanipulación implican muy pequeñas poblaciones de células, las cuales prohíben la detección de mutaciones raras. Métodos genéticos para enriquecer a las células madre en las poblaciones mediante la inducción de la muerte de las células hijas se han desarrollado, pero los tamaños de población todavía están limitados por la frecuencia con que se producen las mutaciones al azar que comprometen los sistemas de selección. El protocolo actual se aprovecha de sorti magnéticang de células madre de levadura marcada con la superficie para obtener grandes poblaciones suficientes de envejecimiento de las células madre para cuantificar mutaciones raras mediante selecciones fenotípicas. Las tasas de mutación, medidos a través de pruebas de fluctuación, y las frecuencias de mutación se establecieron por primera vez para las células jóvenes y se utilizan para predecir la frecuencia de mutaciones en las células madre de varias edades replicativa. Frecuencias de mutación se determinan entonces para las células madre ordenados, y la edad de las células madre se determina mediante citometría de flujo por tinción con un reactivo fluorescente que detecta cicatrices brote formadas en sus superficies celulares durante la división celular. Comparación de las frecuencias de mutación predichos basándose en el número de divisiones celulares a las frecuencias observadas experimentalmente para las células madre de una edad replicativa dada a continuación, puede identificar si hay cambios relacionados con la edad en la tasa de acumulación de mutaciones. Las variaciones de este protocolo básico proporcionan los medios para investigar la influencia de las alteraciones en las funciones de genes específicos ocondiciones ambientales específicas sobre acumulación de mutaciones para hacer frente a los mecanismos de inestabilidad del genoma subyacente durante el envejecimiento replicativo.

Introduction

Microorganismos, tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae, son excelentes modelos para la investigación de las tasas de mutación, pero estos modelos no se han utilizado plenamente para investigar la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento mitótico de las células. La acumulación de mutaciones en el genoma nuclear ha planteado la hipótesis de contribuir al envejecimiento por lo que resulta en pérdida progresiva de la (o variación) en funciones de los genes 1. La capacidad de utilizar un sistema microbiano para estudiar los mecanismos y consecuencias de la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento podría acelerar en gran medida la identificación de factores genéticos y ambientales que influyen en este proceso, debido a los sistemas genéticos fáciles y la facilidad de la cuantificación de los cambios fenotípicos raras en microorganismos. Factores de reparación del ADN y proteínas de respuesta al daño de ADN están bien conservadas a través de especies diversa 2, y las similitudes fundamentales en el envejecimiento del organismo se han identificado para organismos tan diversos como S. cerevisiae und mamíferos 3, por lo que es probable que los resultados obtenidos a partir de estudios en levaduras serán relevantes para el envejecimiento en muchos organismos.

Los estudios sobre el envejecimiento en S. cerevisiae hacer uso de dos tipos de envejecimiento que miden el envejecimiento cronológico o envejecimiento replicativo de las células. Envejecimiento cronológico se caracteriza por la pérdida progresiva de la viabilidad de las poblaciones de células de levadura que se encuentran en un (fase estacionaria) que no se dividen estado debido a agotamiento de los nutrientes 3. El modelo de envejecimiento cronológico se ha utilizado para demostrar que las mutaciones se acumulan con el aumento de la edad de 4, ya que las poblaciones de células grandes se obtienen fácilmente en este modelo para realizar selecciones fenotípicos para células mutantes. En este caso, la acumulación de mutación parece estar influenciada por las vías de señalización de crecimiento y estrés oxidativo 5, y cada uno de estos factores es relevante para la comprensión de envejecimiento en eucariotas multicelulares 3. El modelo de envejecimiento replicativo explota la divisi asimétricaen entre S. madre e hija células cerevisiae para la investigación de envejecimiento que se produce con sucesivas generaciones de células 3. Levadura envejecimiento replicativo menudo se ha medido a través de micromanipulación de las pequeñas poblaciones de la madre y las células hijas, o, más recientemente, a través de la microscopía de vídeo de las pequeñas poblaciones de células de levadura en dispositivos de microfluidos 6,7. Tamaño de las poblaciones limitadas hacen que estos enfoques poco adecuados para la investigación de la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento mitótico menos que la información de todo el genoma se obtiene a partir de células individuales o cambios genéticos muy alta frecuencia se miden 8. Secuenciación de todo el genoma de las células individuales proporciona conjuntos de datos sustanciales para investigar la acumulación de mutaciones, pero los sistemas de selección fenotípicos tienen la importante ventaja de proporcionar un medio de medición de las tasas de mutación para estudiar los mecanismos de la acumulación de mutaciones subyacente. Los estudios para examinar las frecuencias de mutación y tarifas a través de selecciones fenotípicos en haploiaún no se han reportado d cepas de levadura durante el envejecimiento replicativo.

Las tasas de mutación se miden comúnmente mediante pruebas de fluctuación 9. Los valores de la frecuencia de mutación reflejan el número total de células que albergan una mutación en una secuencia de gen en una población. Esto incluye células en las que se producen mutaciones independientes y cualquier progenie de las células que heredan las mutaciones simplemente pre-existentes. Por el contrario, las tasas de mutación medidos a través de pruebas de fluctuación representan el número de mutaciones independientes que recién surgen con cada generación celular. Estas pruebas implican típicamente la inoculación de muchos cultivos replicados en bajas densidades celulares para reducir la probabilidad de que la adición de células con mutaciones preexistentes en una secuencia diana, el cultivo de las culturas a cerca de la saturación, y la identificación de células mutantes por crecimiento en medio selectivo. Los números de células mutantes identificados en las poblaciones replicadas se utilizan entonces en uno de varios modelos matemáticos para estimar el número de imutaciones ndependent que surgieron durante el crecimiento 9. Comparando el número de mutaciones independientes para el tamaño promedio de la población proporciona una medida de la tasa de mutación. En S. cerevisiae, las frecuencias de mutación y las tasas se miden con frecuencia utilizando los genes URA3 y CAN1, ya que la pérdida de función de las mutaciones en estos genes producen fenotipos seleccionables. Pérdida de la función URA3 hace que las células resistentes a 5-fluoroorótico ácido (5-FOA), ya que la proteína codificada por URA3 convierte 5-FOA en una molécula tóxica 10. La pérdida de función de CAN1 permite que las células se vuelven resistentes a canavanina, un análogo de arginina tóxico, ya que la proteína codificada por CAN1 transporta arginina y canavanina en las células 11.

Ambas estrategias de clasificación genéticos y físicos se han empleado con éxito para obtener poblaciones más grandes de S. células madre cerevisiae para facilitar las investigaciones del envejecimiento replicativo. Estrategias genéticas incluyen enfoques inteligentes que seleccionan contra la supervivencia celular hija en una población. El programa de enriquecimiento de la madre (MEP) implica-beta estradiol inducción de la expresión de la recombinasa Cre sólo en células hijas, lo que lleva a la interrupción-hija específica de dos genes esenciales que fueron diseñados para contener sitios loxP 12. MEP cepas pueden cultivarse normalmente en la ausencia del inductor, pero sólo las células madre continúan dividiéndose después de la inducción, mientras que las células hijas se arresto en la fase M típicamente durante su primera progresión a través del ciclo celular 12. Aunque este sistema no se ha utilizado ampliamente para estudiar la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento, se ha utilizado para estudiar la pérdida de heterocigosidad, una forma relativamente frecuente de inestabilidad del genoma en las cepas de levadura diploides, así como cambios bioquímicos en las células madre envejecimiento 13,14. Del mismo modo, el sistema hija-descargador implica la expresión-hija específica de la S. cerevigen siae URA3 15. Cepas Hija-pararrayos crecen normalmente hasta 5-FOA se añade al medio, en el que las células que expresan el punto hija URA3 morirán, mientras que las células madre continúan creciendo 15. Estos son sistemas útiles para enriquecer en células madre, pero dependen de mantenimiento de las funciones de los genes que constituyen el sistema de selección. Mutaciones al azar en uno o más componentes del sistema de selección podrían dar lugar a células hijas que escapan a la selección y proliferan exponencialmente. Durante el desarrollo de las cepas del MEP, tamaños apropiados de población estaban decididos a evitar la aparición de células hijas mutantes que podrían escapar de la selección 12. Sin embargo, este límite de tamaño de la población pone en peligro la detección de formas raras de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento replicativo. Esta restricción en el tamaño de la población podría ser parcialmente superada por la utilización de cepas de levadura diploide con dos copias de cada gen que contribuye al sistema de selección, ya que la mayoríamutaciones serían probablemente recesiva 12. Sin embargo, el uso de cepas diploides limita los tipos de eventos mutacionales que se pueden detectar fácilmente en comparación con aquellos que pueden detectarse fácilmente en células de levadura haploides.

Las estrategias de clasificación físicas incluyen el aislamiento de células madre con una superficie de la célula marcada de las células hijas no marcados para enriquecer para grandes poblaciones de células madre. La observación de que las proteínas de la superficie celular (proteínas de la pared celular) de S. células hijas cerevisiae están recién sintetizados en ciernes ha sido explotada para marcar las células madre sin etiquetar las células hijas que producen 16. Por ejemplo, una población inicial de células de levadura en su superficie marcadas con biotina se puede cultivar y luego aislado a partir de sus células hijas usando microperlas anti-biotina y clasificación magnética 16 porque las células hijas generadas por la población inicial no contienen biotina en su superficie . Crecimiento de serie yclasificación permite que las poblaciones progresivamente mayores de las células madre que se obtienen y analizan. Este procedimiento ha sido utilizado con éxito para examinar los cambios en la fisiología celular y la expresión génica durante el envejecimiento replicativo de levadura 13,14,17,18. El método actual se adapta este marcaje con biotina y la técnica de clasificación magnética para enriquecer en células madre con el propósito de medir la acumulación de mutaciones potencialmente raras u otras formas de inestabilidad del genoma ensayadas a través de selecciones fenotípicas. El crecimiento de serie y la clasificación física permiten el análisis de la acumulación de mutaciones en células madre progresivamente mayores, así como en sus poblaciones de células hijas. Determinación de las tasas de mutación por generación permite una frecuencia de mutación predicha que se calcula para las células madre que han sido sometidos a un número determinado de divisiones celulares. Dado que los valores de frecuencia previstas se basan en el aumento esperado debido a rondas adicionales de la división celular, las desviaciones sustanciales en los Mutati observadosen las frecuencias en comparación con los valores previstos proporcionar evidencia de cambios específicos de la edad en la tasa de mutaciones que se acumulan. Usando este protocolo, la tinción fluorescente de las cicatrices del brote que corresponden a los sitios de divisiones celulares en las células madre, junto con el análisis por citometría de flujo se puede utilizar para determinar rápidamente la distribución de edad de las poblaciones clasificadas y sin clasificar. Reactivos fluorescentes adicionales, tales como los utilizados para la detección de especies reactivas del oxígeno, también se pueden utilizar durante este protocolo. En general, este protocolo permite el análisis eficiente de los cambios dependientes de la edad en la inestabilidad del genoma con el potencial de correlación con los teléfonos cambios fisiológicos relacionados con la edad en un organismo modelo muy adecuado para el estudio de los factores genéticos y ambientales que influyen en la inestabilidad del genoma relacionadas con el envejecimiento.

Protocol

1 Preparación de Medios y Soluciones

  1. Se cultivan las células utilizando extracto de levadura-peptona-glucosa (YPD) medio rico para el protocolo estándar. Prepare una bactopeptona 2%, extracto de levadura al 1%, solución de glucosa al 2% para el medio YPD y añadir 2% bacto-agar de medio sólido 19. Autoclave para esterilizar. Utilizar un medio alternativo, si es necesario, para probar una condición de crecimiento particular o cepa de levadura mutante.
  2. Hacer medio completo sintético sólido que carece arginina con 60 mg / L canavanina (SC-arg + canavanina) para seleccionar mutantes resistentes a canavanina. Preparar una solución que es 0,67% de base de nitrógeno Bacto-levadura sin aminoácidos, 2% de glucosa, 0,2% de mezcla completa y sin suplemento de arginina (mezcla de deserción), y 2% de Bacto-agar 19. Autoclave y fresco antes de añadir canavanina de una solución madre 20 mg / ml (esterilizada por filtro, se almacena a 4 ° C) 19.
    1. Hacer medio completo sintético sólido que contiene ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). Preparar 500ml de una solución que es 1,34% de base de nitrógeno Bacto-levadura sin aminoácidos, 4% de glucosa, 0,4% de mezcla completa suplemento, y 0,2% 5-FOA y el filtro de esterilizar-19. Autoclave de 500 ml de una solución de Bacto-agar 4%, enfriar brevemente, y luego mezclar con la solución nutritiva esterilizada por filtración de 500 ml. Utilice los medios de comunicación alternativa apropiada para otros ensayos de mutación.
  3. Para marcaje con biotina, hacer 500 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM, 10,14 mM de fosfato de sodio dibásico, y 1,77 mM de fosfato potásico dibásico, pH 8. Almacenar a 4 ° C y seguir de hielo durante el uso.
  4. Hacer un 5 mM biotina de stock fresca en agua ultrapura estéril.
  5. Para saciar el etiquetado biotina, hacer 500 ml de PBS 1x, glicina 100 mM. Almacenar a 4 ° C y mantener en hielo durante el uso.
  6. Dependiendo del número de células usadas y duración del experimento, hacer 1-2 L de tampón bead-etiquetado que contiene 1x PBS, EDTA 2 mM, 0,5% bovialbúmina de suero ne. Filtro esterilizar y buffer-gas de. Almacenar a 4 ° C y mantener en hielo durante el uso.
  7. Prepare una solución de 0,4% de tripano azul en 1x PBS, esterilizar el filtro, y se almacena a temperatura ambiente para su uso en mediciones de viabilidad celular.
  8. Pequeños volúmenes alícuota (~ 100 l) de una aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado fluorescente para almacenar a -20 ° C en papel de aluminio envuelto (u opacos) tubos de microcentrífuga para su uso en la determinación de la edad celular.

2. Determinación de la mutación sobre tarifas y frecuencias

  1. Establecer una tasa de mutación de línea de base por generación celular mediante pruebas de fluctuación para las células cultivadas en condiciones normales de cultivo. Grow siete a once replican 1 ml de cultivos de una densidad inicial de 1.000-5.000 células / ml a la fase estacionaria temprana (~ 10 8 células / ml).
    1. Para cada cultura réplica, diluir las células 1: 2000 y se extendió 1-4 l en un medio no selectivo (YPD) para determinar formadoras de colonias-unidades / ml. Pellet células restantes en ~ 2400 xg durante 1 min en una microcentrífuga y resuspender en 100 l de agua a la extendió sobre medio selectivo para identificar mutantes. Incubar las placas durante tres días a 30 ° C antes del recuento de colonias (ajustar el tiempo de incubación, según sea necesario basado en la tasa de crecimiento de las células).
    2. Determinar el número de mutaciones independientes (m) que se produjeron en el ensayo basado en el número de colonias mutantes (r) obtenidos en medio selectivo. Utilice el estimador de la mediana Lea-Coulson encontrar m sustituyendo la mediana del número de colonias mutantes para r en la fórmula siguiente 9. Entonces sustituir valores para m hasta que el lado izquierdo de la ecuación es prácticamente cero.
      Ecuación 1
    3. Para determinar la tasa de mutación, primero calcular el número medio de células viables se propaga en medio selectivo multiplicando el promedio de colonias que forman unidades / ml de los cultivos replicados y el volumende la cultura en la propagación ml en medio selectivo. Divida el valor m de la etapa 2.1.2 por este número promedio de células viables para obtener la tasa de mutación por generación de células.
  2. Individualmente calcular el número de células viables se propaga en medio selectivo para cada cultivo replicar en un ensayo como se describe en el paso 2.1.3. Divida el número de colonias mutantes (r) obtenidos para una cultura por el número de células viables se propaga en medio selectivo para obtener la frecuencia de mutación. Utilizar la media o la mediana de las frecuencias de mutación individuales de los cultivos replicados en el paso 2.1 como una frecuencia de mutaciones basales.
  3. Hacer mediciones de frecuencia antes y después de las células de etiquetado biotina (pasos 3.2 y 3.4) para determinar si los resultados del paso de etiquetado de cualquier cambio en la frecuencia de las mutaciones que tendrán que ser considerados cuando las pruebas de cambios específicos de la edad en la acumulación de mutaciones.

3. biotina etiquetado

  1. Streak S. cerevisiae de un stock de glicerol a -80 ° C en medio YPD y se incuba a 30 ° C durante 1-3 días.
  2. Con una punta de pipeta estéril, células de transferencia de la placa de la racha de 1 ml (o más) de mantenimiento de agua en cuenta que 1 a 1,5 cm de una parte densamente crecido de la racha darán aproximadamente 10 8 células. Determinar la densidad celular exacta usando un hemocitómetro.
  3. Etiqueta 10 8 células por cepa (o condición de tratamiento) por punto de recogida en el que se determina la frecuencia de mutación o un tamaño de población suficiente para obtener al menos 5-10 colonias mutantes por muestreo en medio selectivo (basado en la frecuencia de mutación de la etapa 2.2). Incluya un adicional de 10 8 células para mediciones de referencia por cepa / condición.
  4. Etiqueta de biotina de acuerdo con el procedimiento estándar del fabricante, excepto usar un 5 mM reactivo biotina de stock y agite con cuidado durante la incubación. Girar durante 5 min a 4 ° C a 3.000 xg durante todas las etapas de centrifugación, sInce girar a temperaturas superiores a 4 ° C puede conducir a una mayor pérdida de células. Después del lavado final, suspender las células a una concentración de 10 8 etiquetados células / ml en agua.
  5. Comprobar la viabilidad de las células por medio de tinción con azul tripán. Diluir 10 l de células con 23 l de agua y 67 l de 0,4% de azul de tripano en 1x PBS. Incubar durante al menos 40 minutos a temperatura ambiente antes de anotar en directo las células (sin teñir) y muertos (teñidos) usando un hemocitómetro.
  6. Medir los valores de referencia para la inestabilidad del genoma, la edad celular, y otras características relevantes (ver secciones 5, 6 y 7).
  7. Transferencia de células marcadas con biotina a 20 ml de medio YPD por 10 8 células en un matraz Erlenmeyer (aproximadamente 5 x 10 6 células / ml). Cultivar la cultura (s) desde 16 hasta 18 horas a 20 ° C a una densidad aproximada de 10 8 células / ml (cuatro a cinco generaciones de células), pero no permiten que las células lleguen a la fase estacionaria. Utilice un tiempo de incubación más corto para el crecimiento a 30 ° C. Mantenga marcado con biotina cells a 4 ° C hasta por varias horas antes de la adición al medio, si es necesario para optimizar el calendario de los períodos de crecimiento y recolección.

4. bolas de etiquetado y clasificación magnética

  1. Después de la fase de crecimiento, se diluye una alícuota del cultivo para determinar la densidad de células utilizando un hemocitómetro. Precipitar las células por centrifugación durante 5 min a 4 ° C a 3000 x g. Vierta el líquido sobrenadante.
  2. Lavar las células mediante agitación a suspender el sedimento en 30 ml de tampón de grano-etiquetado, a continuación, la centrifugación y vertiendo sobrenadante como en la sección 4.1. Repita lavado.
  3. Totalmente resuspender las células en 50 l de tampón cuenta-etiquetado por 10 8 células totales por agitación. Añadir 2 l perlas magnéticas por 10 8 células totales y agitar brevemente para mezclar. Incubar en hielo durante 10 min, invirtiendo periódicamente para mezclar (modificado a partir de un protocolo de línea en http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
  4. Lavar las células tres veces con 30 ml de tampón de cordón de etiquetado.
  5. Añadir 0,5 ml de tampón de grano-etiquetado por 10 8 células totales y agitar brevemente pellet en posición media sólo hasta que se vuelven a suspender las células. Vierta a través de un filtro de células de 40 m en un tubo de 50 ml para eliminar los grumos de células restantes. Si es necesario, dejar las células sobre hielo durante 1-2 horas antes de la carga en la columna.
  6. Siga el protocolo recomendado por el fabricante para las columnas magnéticas para unirse, se lavan, y se eluyen las células madre del grano marcado magnéticos. Para una mayor recuperación de células marcadas, utilizar por lo menos una columna por 2 x 10 9 células totales.
    1. Eliminar las burbujas que se producen cuando la carga de las columnas, ya que bloquear el flujo. Retire y vuelva a colocar la columna en el separador entre lavados para evitar que las células queden atrapados entre los granos (modificado a partir de un protocolo de línea en http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. Guardar fluir a través de la unión y lavado pasos para analizar las células jóvenes producidos por las células madre, si se desea. Concentrar las células como se describe en el paso 4.7.
    3. Utilice separadores de varias columnas para procesar múltiples muestras a la vez. Eluir múltiples columnas de la misma muestra en el mismo tubo de recogida para reducir el tiempo de manipulación y disminuir la pérdida de las células.
  7. Concentrado células madre eluidas por centrifugación a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar todos menos 1 ml de tampón por 10 8 células marcadas con biotina originales. Vortex brevemente a suspender las células en tampón restante.
  8. Diluir una alícuota de células y se tiñe con azul de tripano para determinar la densidad celular y la viabilidad celular usando un hemocitómetro (ver paso 3.5). Calcular el número total de células recuperadas.
    1. Si el número de células es sustancialmente mayor de lo esperado, pasar la muestra de elución a través de otra columna para tratar de eliminar la contaminación de las células jóvenes.Si el número de células es sustancialmente menor de lo esperado, pasar el flujo de salvado a través de muestra a través de otra columna para tratar de mejorar el rendimiento de las células madre.
  9. Usar células para profundizar el análisis, como se describe en las secciones 5 y 6 Alternativamente, crecer las células en caldo YPD de nuevo para aumentar su edad replicativa (paso 3.7) y seguir por medio del etiquetado y clasificación del grano (pasos 4.1-4.8.1), sin el que tenga que repetir el etiquetado biotina.

5. Determinación de replicativa Edad

  1. Haga girar las células durante 2 minutos a 5000 xg a temperatura ambiente durante todos los pasos en esta sección. Ponga 25 l de células recuperadas (~ 10 8 células / ml) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y lavar dos veces con 1 ml de PBS 1x. Aspirar el sobrenadante.
    1. Descongelar una alícuota de WGA-conjugado, vortex para mezclar y girar brevemente para eliminar los agregados de proteínas. Suspender las células en 180 l de 1x PBS y 20 l de WGA conjugados a una molécula fluorescente para etiquetar cicatrices brote en la superficie de lcélulas e. Cubra el tubo de centrífuga de 1.5 ml con papel de aluminio y se incuba con agitación suave a 30 ° C durante 30 min.
    2. Lavar tres veces con 1 ml de 1X PBS.
  2. Para la microscopía fluorescente, etiqueta se desliza y montar según el protocolo estándar utilizando un agente anti-fade. Curar completamente los portaobjetos en la oscuridad (hasta unos pocos días) antes de sellar el cubreobjetos para evitar el movimiento celular durante la formación de imágenes. Número de cicatrices Bud en al menos 50 células por muestra para obtener una medida representativa de la edad celular. Diapositivas para almacenaje de hasta 1 mes para ver las cicatrices del brote, si es necesario.
    1. Alternativamente, determinar la intensidad de la señal fluorescente de la WGA-conjugado mediante la realización de citometría de flujo en células suspendidas en 1 ml de PBS 1x después de la etapa 5.1.2. Utilice un láser de excitación 405 nm y 530/30 nm filtro de emisión con un filtro de paso largo de 505 nm WGA-Alexa 488 Incluir un control sin teñir para cada punto de recogida.
  3. Cicatrices gráficas brote en células jóvenes y células envejecidas contadas por microscopía en laeje y contra la media geométrica normalizada (media geométrica manchado / media geométrica sin teñir) de la fluorescencia WGA-conjugado de los mismos poblaciones de células en el eje x. Obtener la ecuación de una línea de tendencia lineal de esta relación. Para los experimentos posteriores, sustituir la media geométrica normalizada de la intensidad de fluorescencia WGA-conjugado de una población de células para x en la ecuación y resuelve para y para determinar la edad promedio de células de una muestra.

6. Mutación Frecuencia

  1. Spread ordenadas células madre se volvieron a suspender en tampón de la etapa 4.7 en medio YPD y medio selectivo como se describe en el paso 2.1.1. Usar 1 ml de células madre para células resuspendidas medianas y centrifugado a 5000 xg selectivos durante 1 min.
    NOTA: Corre volúmenes más grandes de células diluidas en medio YPD como células aumentan en edad para compensar el aumento de número de células no viables y senescentes en poblaciones de más edad.
    1. Incubar medio YPD y las placas de medio selectivopaso 6.1 a 30 ° C durante 3 y 4 días, respectivamente. Aumentar el tiempo de incubación hasta una semana para las células muy viejos o cepas de crecimiento lento. Calcular la frecuencia de mutación tal como se describe en el paso 2.2.

7. Cálculo prevista Mutación de frecuencia para una Edad replicativa Dada

  1. Calcular el promedio de aumento en la edad replicativa de las células marcadas con biotina en el transcurso del experimento restando el promedio de edad de la población celular inicial a partir de la edad media de las células madre ordenados para el tipo pertinente. Utilice las edades celulares calculados en el paso 5.2 o paso 5.2.2.
  2. Multiplicar la tasa de mutación obtenida en la etapa 2.1.3 por el aumento de la edad celular promedio calculado en el paso 7.1. Añadir este valor a la frecuencia de mutación de línea de base para la población inicial calculada en el paso 2.2 para determinar la frecuencia de mutación predicha para las células de la edad replicativa relevante.

Representative Results

Un diagrama de flujo de la Figura 1 muestra los pasos generales del procedimiento, incluyendo los puntos en los que se miden las tasas de mutación, frecuencias, y la edad celular. La determinación precisa de la frecuencia y la tasa de mutaciones (o otra forma de inestabilidad del genoma) en poblaciones de células jóvenes es un primer paso importante, ya que es necesario para la elección de un tamaño de población apropiada para el etiquetado y la clasificación magnética. Valores de frecuencia se pueden establecer mediante pruebas de fluctuación 9. Ejemplo de resultados para las cepas de levadura en el fondo genética BY4741 20 seleccionado por mutaciones en el gen CAN1 que confieren resistencia a la canavanina o mutaciones en el gen URA3 que confieren resistencia a 5-FOA se muestran en la Figura 2. Células fueron cultivadas a 20 ° C durante representante experimentos de tarifas, y a 20 ° C y 30 ° C para los experimentos de frecuencias representativas. Se utilizaron estas temperaturas debido a las poblaciones de células iniciales cultivana 30 ° C y luego se cultivaron a 20 ° C para los posteriores experimentos representativos de clasificación. Valores de frecuencia de los ensayos independientes fueron comparables para la población inicial de células y las células después del marcaje con biotina para una cepa que tiene el gen CAN1 en su ubicación normal en el cromosoma V, aproximadamente 32 pares de kilobases del telómero del brazo izquierdo ( www.yeastgenome.com ) ( Figura 2A, columnas de lavanda). La tasa de mutación de CAN1 fue sustancialmente mayor en las poblaciones iniciales de una segunda cepa de levadura que tiene una deleción del gen CAN1 de su ubicación normal en el cromosoma V y una inserción de CAN1 en el brazo derecho del cromosoma VIII aproximadamente 25 pares de kilobases del telómero 21 (Figura 2B). frecuencias de mutación del gen CAN1 también fueron comparables para las poblaciones de células iniciales y las células marcados con biotina, ya sea en la temperatura de crecimiento (Fi2A figura, columnas azules). Sin embargo, las frecuencias de mutación obtuvieron a 20 ° C resultaron ser más alta que las frecuencias de mutación a 30 ° C. Para probar si este efecto de la temperatura se limitó al gen CAN1, que mide las mutaciones en URA3 mediante la selección para la resistencia a 5-FOA usando la cepa de levadura que tiene CAN1 insertado en el cromosoma VIII. Esta cepa también tiene una deleción de URA3 de su sitio normal en el cromosoma V y una inserción de URA3 en el brazo derecho del cromosoma VIII aproximadamente 40 pares de kilobases del telómero 21. Frecuencias de mutación también fueron superiores a 20 ° C durante URA3 en esta ubicación cromosómica (Figura 2C). En general, esto demuestra que la temperatura de crecimiento puede afectar a la frecuencia de mutaciones, pero marcaje con biotina no parece afectar a la frecuencia de mutación. Por lo tanto, las tasas de mutación y frecuencias para las poblaciones iniciales necesitan ser determinados en la misma tempe crecimientoratura que se utilizará para las rondas de crecimiento y de clasificación. Es aconsejable verificar que el etiquetado biotina no influye en la inestabilidad del genoma antes de usar el protocolo para investigar otros tipos de mutaciones o reordenamientos del genoma.

Como era de esperar, los valores de tasa de mutación que se muestran en la Figura 2A son varias veces inferiores a las mediciones de frecuencia correspondientes. Esta diferencia se produce porque la tasa de mutación mide la aparición de células con nuevas mutaciones con cada ronda de división celular, mientras que las medidas de frecuencia de mutación el número acumulado de células mutantes en la población al final del periodo de crecimiento. Las tarifas y los intervalos de confianza del 95% para estos ensayos muestran resultados reproducibles que se pueden obtener mediante el uso de siete cultivos replicados por ensayo, que es el número mínimo de repeticiones sugiere para este protocolo.

Una vez que se determinan los valores iniciales de frecuencia y tasa, un tamaño de la población debe ser chosen que asegura que las células adecuadas están presentes después de varias rondas de clasificación para determinar confiablemente las frecuencias de mutación. Etiquetado de una población de 10 8 células por punto de tiempo que se va a analizar durante el envejecimiento es apropiado cuando las frecuencias y las tasas son similares a los mostrados en la Figura 2A. Esta decisión también depende de la eficiencia con la etiqueta células madre se recuperan después de cada ronda de clasificación. La eficiencia de la recuperación de células madre etiquetados se puede evaluar de forma rápida y simplemente utilizando un hemocitómetro para determinar el número de células eluidas de las columnas para cada especie y para examinar la morfología celular. Dos puntos principales se ilustran mediante los datos de eficiencia de ejemplo de recuperación (Figura 3A): los números recuperados de células pueden aparecer más alta de lo esperado después de la primera clase, y una pequeña pérdida progresiva de las células se espera que con la clasificación continua. La mayor de lo esperado número de células en algunos experimentos después de la primera clase podían resULT desde el etiquetado de los brotes en las células en la población inicial. Una célula de levadura con un bastoncillo normalmente se obtuvo como una única célula cuando se determina el número de células para etiquetar con biotina. Etiquetado de los brotes presentes en la población inicial, sin embargo, sería permitir que las células que se desarrollan a partir de los brotes también ser retenido en las columnas durante la clasificación. La influencia de esta ocurrencia en la determinación de la eficiencia de recuperación depende de la fracción de las células injertadas en la población celular inicial. Una segunda razón potencial para el número de células más alta después de especie es que tiende a ser más grandes células injertadas en este punto de tiempo que pueden estar completando la división celular durante la clasificación. Como resultado, grandes cogollos permanecen atados a sus células madre pueden ser ordenados, pero luego se presentaban como células diferenciadas cuando se examinan las células eluidas. Mientras que algunos pérdida de células se observa con cada ronda de crecimiento y la clasificación, el protocolo puede resultar en la retención fiable de 80-90% de las células después de cada ronda de sorting. Vale la pena el esfuerzo de practicar el procedimiento para garantizar que el 80% o más de las células marcadas se están aisladas para evitar la necesidad de etiquetar un tamaño excesivamente grande población celular inicial. El tratamiento de las células con un estrés leve después de la primera clase (1 mM de peróxido de hidrógeno en medio YPD durante 30 min) no impidió la recuperación eficiente de células con rondas continuas de crecimiento y la clasificación, aunque había cierta variabilidad en la recuperación de la primera clase después el estrés (Figura 3A).

Inspección de la morfología celular y la viabilidad son también útiles tanto para confirmar el aislamiento con éxito de células madre y para ajustar las diluciones / volúmenes utilizados cuando propagación de las células en un medio no selectivo para determinar la densidad de unidades formadoras de colonias. Las células madre se vuelven cada vez más grandes y más de forma irregular a medida que envejecen, en comparación a las células hijas (Figura 3B). Por tanto, las muestras de células madre deben consistir principalmente de los grandes, irrcélulas en forma de egularly como el experimento progresa a través de cada ronda de clasificación. La presencia de muchas pequeñas células ovales de forma regular podría indicar que las células madre no están siendo una distancia adecuada de las células hijas. La viabilidad de las células madre también debe declinar progresivamente con cada ronda de cultivo y selección, aunque puede que no haya mucho cambio durante los nueve y cincuenta y cinco primeras generaciones de células. El número de células capaces de colonias que forman puede disminuir mucho más dramáticamente que el número de células que se determinan para ser viable por alguna forma de tinción directa para la integridad de la célula, debido a la formación de células senescentes. Cuando la viabilidad mediante un método de tinción directa primero comienza a disminuir (aproximadamente 80% o menos), puede ser necesario ajustar las diluciones y los volúmenes utilizados para medir las densidades de la unidad de formación de colonias en previsión de una disminución más drástica en la capacidad de las células viables para forman colonias (una de dos a varias veces disminución).

Eledades replicativa de las poblaciones ordenados y control de las poblaciones necesitan ser determinados antes de los datos de frecuencia de mutación de las células madre se pueden analizar los cambios específicos de la edad en la tasa de mutaciones que se acumulan. Esto se puede lograr a través de recuento manual de las cicatrices del brote sobre las células madre (Figura 4) o por medio de citometría de flujo para cuantificar la señal para el reactivo de detección cicatriz brote (Figura 5). Bud cicatrices pueden marcarse con relativamente baja señal de fondo usando WGA-conjugados fluorescentes (Figura 4C). Figura 4A muestra que la mayoría de las células del flujo a través de las muestras del procedimiento de clasificación tienen cero o una yema cicatriz. Las células eluidas de las columnas son en su mayoría células madre de edad (Figuras 4B y 5). Típicamente,> 90% de las células eluidas son células madre, que pueden ser vistos más fácilmente de la citometría de flujo resultado en la Figura 5. Las células con relativamente pocas cicatrices Bud (<6) obtobjetivó después de más de dos rondas de clasificación podría representar células contaminantes que no fueron etiquetados biotina que se sometió a unas cuantas rondas de división celular durante la ronda correspondiente de crecimiento, a diferencia de las células madre que se dividen muy lentamente. La variación en la edad célula puede aumentar con las siguientes rondas de clasificación si no todas las células en la población están creciendo de manera uniforme.

Una población de células más grande puede ser utilizado con mayor rapidez para evaluar la edad celular si se establece una relación lineal entre la intensidad de la señal de fluorescencia WGA-y el número de cicatrices brote por célula. Para este análisis, la normalización de todas las intensidades de señal de fluorescencia WGA-se lleva a cabo dividiendo la señal de las células teñidas por la señal obtenida para la población de células sin teñir adecuada (hija o madre) para tener en cuenta el aumento de fluorescencia de fondo en las células de más edad. Figuras 4 y 5 muestran el análisis de las mismas poblaciones celulares representativas.El conteo manual establece las edades replicativa promedio de 0,95 y 11,4 para la célula hija (Figura 4) y las poblaciones de células madre (Figura 4B), respectivamente. WGA-señales normalizadas para estas dos poblaciones y las tres poblaciones adicionales (edades promedio de 3,0, 6,9, y 14,4) se representaron frente a la cantidad promedio de cicatrices brote para cada población (Figura 5B). Esta relación lineal puede ser utilizado con la misma cepa y los reactivos en futuros experimentos para determinar la edad promedio de células de la WGA-señal normalizada obtenida a través de citometría de flujo, lo que permite la determinación rápida y precisa de la edad celular. Poblaciones de control todavía se deben incluir para verificar la eficiencia de coloración similar entre los ensayos.

La influencia de la edad sobre la acumulación de mutaciones puede ser tratado una vez que los pasos anteriores de la obtención de valores de tasa de mutación, de manera eficiente la clasificación de células, y la determinación de las edades de células se llevan a cabo. El number de puntos de tiempo en el que la frecuencia puede ser determinada depende del tamaño de la población celular marcado con biotina y el número de células que necesitan ser propagado en medio selectivo para obtener resultados fiables. Si los cambios de tasa de mutación con la edad, entonces las frecuencias de mutación observados para el envejecimiento de las células madre deben diferir de los esperados con base únicamente en rondas de división celular. Comparación de la frecuencia de mutación observado que la frecuencia de mutación predicha puede identificar las diferencias relacionadas con la edad en la tasa de acumulación de mutaciones. Como se describe en la sección 7 del protocolo, la frecuencia predicha puede obtenerse a partir del producto de la tasa de mutación de referencia para la población inicial de células y el aumento de la edad replicativa de las células madre añadidas a la frecuencia de mutación de la población inicial. Los aumentos en la frecuencia de mutación CAN1 se han observado con el aumento de la edad promedio de células en una cepa con CAN1 en su ubicación normal en el cromosoma V(Figura 6A) y en una cepa con CAN1 en el brazo derecho del cromosoma VIII (Figura 6B). Dado que las frecuencias de mutación observada para las células madre en la figura 6A son similares o algo inferior a las frecuencias previstas, los datos no proporcionan ninguna evidencia de un cambio específico de la edad en la tasa de mutación. En contraste, las frecuencias de mutación de las células madre de la cepa con CAN1 en el cromosoma VIII fueron mayores que las frecuencias predichas (Figura 6B). Tenga en cuenta que las frecuencias predichas en el gráfico no parecen aumentar mucho porque una escala logarítmica tuvo que ser utilizado para el eje y, debido al gran incremento en la frecuencia de mutación observada. Por lo tanto, los resultados en la Figura 6B proporcionan evidencia que apoya un aumento específico de la edad en la tasa de acumulación de mutaciones. La diferencia en los resultados para los conjuntos de datos en la Figura 6A y 6B es probable debido a la dife alquilar localizaciones genómicas de CAN1. Este tipo de observaciones proporcionan un punto de partida para el desarrollo de hipótesis para estudiar los mecanismos que afectan a las tasas de mutación como la edad las células y desarrollar modelos para explicar la acumulación de mutaciones con la edad replicativa.

Figura 1
Figura 1 Diagrama de flujo del procedimiento general para el examen de la acumulación de mutaciones durante la levadura envejecimiento replicativo. Texto Negro y las flechas indican los principales pasos del procedimiento. La flecha curvada que refleja rondas adicionales de rebrote y la clasificación de las mismas células se utilizan para obtener células progresivamente mayores. Flechas y el texto púrpuras indican los pasos en que se realizan las mediciones indicadas. Freq - frecuencia.

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Figura 2 Determinación de la frecuencia de la mutación y la tasa de las poblaciones de células jóvenes. (A) colonias mutantes fueron seleccionados por propagación de las células en SC-arg + medio canavanina para seleccionar para la pérdida de función de las mutaciones en el gen CAN1 y en comparación con el número total de células viables se diseminó sobre medio selectivo para calcular frecuencias / tarifas. Las células de poblaciones iniciales antes de marcaje con biotina (IP) o después de marcaje con biotina (PB) se cultivaron utilizando medio YPD a partir de una densidad inicial de 5000 células / ml a cerca de la saturación. Columnas lavanda indican mediciones de la frecuencia y columnas azules representan las mediciones de frecuencia efectuadas a las temperaturas indicadas (20 ° C y 30 ° C). Conjuntos de siete cultivos replicados fueron cultivadas para cada ensayo y se realizaron cuatro y cincuenta y ocho ensayos independientes. Valores individuales de la tarifa calculada para ensayos independientes se muestran, y las barras de error para estos ensayos representan intervalos de confianza del 95% determinanD usando una calculadora en línea 22. Las frecuencias representan medias y desviaciones estándar. Tasas (B) de mutación CAN1 obtenidos y representados como se describe en la Parte A utilizando una cepa con CAN1 en el brazo derecho del cromosoma VIII. Frecuencias (C) Mutación obtenidos tras la selección de colonias mutantes en 5-FOA utilizando una cepa con el gen URA3 situado en el brazo derecho del cromosoma VIII. Los métodos eran de otra manera como para la parte A, y los medios y las desviaciones estándar para tres o cuatro ensayos independientes se muestran.

Figura 3
Figura 3. Ejemplo eficacia en la clasificación determinado por el cálculo del número de células eluidas después de cada ronda de clasificación. (A) El número total de células en cada población de partida después de marcaje con biotina se fijó a uno, y el t otal número de células presentes en las muestras eluidas de cada ronda de clasificación de células magnético se dividió por esos valores iniciales para obtener la fracción de células marcadas. El número de células totales se determinaron a partir de los recuentos de células obtenidas utilizando un hemocitómetro. Orange columnas representan la media y la desviación estándar de tres ensayos independientes siguiendo el protocolo estándar. Columnas azules representan la media y la desviación estándar para dos ensayos independientes en los que las células fueron tratadas con peróxido de hidrógeno 1 mM durante 30 min inmediatamente después de la primera especie. (B) Tamaño y morfología de las células después de marcaje con biotina (post-biotina) y células madre recuperado después de la tercera ronda de clasificación magnética (especie 3 células madre) se muestra mediante microscopía de campo claro estándar y un objetivo de 20X. Líneas blancas en los fondos son las líneas que delimiten los cuadrados más pequeños visibles en un hemocitómetro estándar.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Determinación de la edad replicativo utilizando el recuento manual de cicatriz brote. La microscopía confocal se utiliza para contar las cicatrices del brote sobre las células individuales etiquetados con un conjugado de WGA-fluorescente (excitación a 488 nm y detección con paso de banda 458/543 nm y 505 nm pase largo combinación de filtros). (A) Manual conteos cicatriz brote de células del flujo a través de (células hijas) tras la tercera ronda de clasificación magnética (n = 62). (B) brote Manual conteos cicatriz de células eluidas (células madre) después de la tercera ronda de clasificación magnética (n = 54). (C) células madre mantengan tras la tercera ronda de clasificación magnética fotografiado usando un objetivo de inmersión en aceite de 63X con zoom de 3 aumentos después de teñir el ingenioha conjugado WGA-fluorescente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Determinación de la edad replicativa usando citometría de flujo. Muestras de 10.000 células teñidas con un conjugado fluorescente WGA-se analizaron por citometría de flujo usando excitación a 488 nm y detección con un paso de banda de 530/30 y 505 de largo conjunto de filtro de paso. (A ) Histogramas que representan el número de células con intensidades específicas WGA-fluorescencia para una población de células hija o el eluato (células madre) después de tres rondas de clasificación magnética. Poblaciones corresponden a los analizados en la Figura 4. Líneas verticales azules indican la posición correspondiente para la mayoría de la Daucélulas ghter en el histograma de células madre. (B) La media geométrica normalizada para la señal de fluorescencia de cada población se muestra en A y tres población adicional de células (promedio de edades 3,0, 6,9, y 14,4) se calculó como la relación de la media geométrica de Las células teñidas y la media geométrica de la población de células sin teñir adecuada. Estos valores se representan gráficamente en comparación con el número medio de cicatrices brote para cada población total (Figura 4 y datos no presentados). Se da el valor R 2 para la línea de tendencia de esta comparación en el gráfico.

Figura 6
Figura 6 Comparación entre las frecuencias de mutación predichos y observados durante el envejecimiento replicativo. Las células con mutaciones en el gen CAN1 se seleccionaron como se describe para la Figura 2 usincepas G con CAN1 en su ubicación normal en el cromosoma V (A) o en el brazo derecho del cromosoma VIII (B). Las células se cultivaron en medio sólido a 30 ° C antes de su marcaje con biotina y a 20 ° C a partir de entonces. Valores de frecuencia observados se muestran con columnas de color naranja (OBS) y frecuencias previstas para células envejecidas se muestran con columnas marrones (PRE). La primera columna para cada gráfico muestra la media y la desviación estándar de la frecuencia de mutación inicial después de marcaje con biotina durante cuatro ensayos independientes (PB). Números por debajo de las columnas indican el número promedio de cicatrices brote para cada población (Cell Edad). Valores pronosticados independientes se determinaron como se describe en el apartado 7 del protocolo de uso de cada uno de los valores de velocidad inicial que se muestran en la Figura 2A (columnas IP) y 2B. Estos valores independientes fueron en promedio. Los valores observados son medio de tres ensayos. Las barras de error indican la desviación estándar.

Discussion

Este protocolo combina múltiples métodos para permitir que los recursos y enfoques disponibles en los Saccharomyces cerevisiae sistema modelo para ser aplicado de manera eficiente para el estudio de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular mitótico. Una amplia variedad de ensayos para cuantificar las diferentes formas de inestabilidad del genoma a través de la selección fenotípica se podría combinar con clasificación magnética para estudiar posibles cambios específicos de la edad en la acumulación de formas particulares de mutaciones o reordenamientos cromosómicos. Mientras que los enfoques de secuenciación de todo el genoma podrían proporcionar más información acerca de los tipos generales de cambios que se producen en un genoma con la edad, la capacidad de utilizar sistemas de selección fenotípicos para obtener mediciones de la tasa de mutación y para aislar preferencialmente tipos específicos de cambios genéticos son ventajas importantes para estudiar mecanicista aspectos de la inestabilidad del genoma relacionado con el envejecimiento. Racionalizar la determinación de la edad celular y el potencial para hacer las mediciones paralelas de physiologicambios Cal por medio de citometría de flujo proporcionan medios eficaces para correlacionar la inestabilidad del genoma con otros cambios celulares durante los intervalos de edad. Determinación de los posibles cambios dependientes de la edad en las tasas de acumulación de mutaciones requiere: 1) la determinación de las tasas de cuidado en poblaciones de células jóvenes, 2) la determinación precisa de la edad celular, y 3) la capacidad para enriquecer de forma fiable suficientemente grandes poblaciones de células madre para medir de forma reproducible la inestabilidad del genoma en la vejez. Este enfoque permite que el sistema modelo de levadura de contribuir a la definición de los mecanismos subyacentes responsables de los cambios dependientes de la edad en los tipos y / o frecuencias de la inestabilidad del genoma en células en mitosis. Por otra parte, los factores genéticos y ambientales pueden ser evaluados rápidamente para las contribuciones a la inestabilidad del genoma dependiente de la edad. En última instancia, estas caracterizaciones podrían conducir al desarrollo de modelos que dan cuenta de la manera en que las mutaciones se acumulan durante el envejecimiento replicativo.

Este método depende de la capacidad para detectar mutaciones o otros tipos de inestabilidad del genoma a través de la aparición de fenotipos seleccionables para medir las tasas de tales eventos. Sin embargo, la creatividad en el diseño del ensayo puede permitir que muchos aspectos de la inestabilidad del genoma para ser investigados. Por ejemplo, el URA3 y genes CAN1 se pueden colocar en diferentes sitios genómicos para probar cualquier influencia de la localización genómica en los resultados. Reversión de alelos de genes no funcionales específicas para funcionales alelos de genes podría probar particulares procesos de mutación. Además, la introducción de múltiples alelos inactivos de un gen o que flanquean un gen con secuencias de repetición podría ser utilizado para examinar los eventos de recombinación mediante la restauración o la pérdida de la función del gen, respectivamente. Pruebas de fluctuación son el enfoque estándar para la determinación de las tasas de estos diversos eventos de inestabilidad del genoma 9. El protocolo está escrito utilizando el Lea-Coulson estimador de la mediana bien aceptada y relativamente sencillo determinar mutatasa ción para hacerla más accesible a los diversos investigadores, a pesar de que el método MSS-máximo estimador de probabilidad se considera el mejor método para la determinación de las tasas de mutación 9. El estimador de máxima verosimilitud MSS-ha sido revisado anteriormente en detalle 9, y se puede utilizar como un método alternativo, pero requiere cálculos más sofisticados. Como alternativa, el software libre para el cálculo de las tasas de mutación con este método se ha puesto a disposición 22. La obtención de medidas reproducibles de las tasas de mutación requiere la atención sobre algunos aspectos del diseño experimental, incluyendo el uso de cultivos replicados suficientes, la inoculación de cultivos a suficientes densidades celulares iniciales bajos que tamaño de la población se incrementa en volúmenes de cultivo de 10.000 veces o más, y que eligen adecuadas para que la totalidad población de células se puede propagar en un medio selectivo. Para el último punto, la fórmula descrita anteriormente se puede utilizar para ajustar la tasa de mutación basado en la fracción de la cultura tested 9. La variación en la tasa de crecimiento de cultivos puede complicar la determinación de una tasa de mutación reproducible, y un estimador basado en el medio modificado que puede producir resultados más reproducibles en tales situaciones Recientemente se ha descrito 23.

La capacidad de medir con precisión la edad celular es otro factor que es importante para establecer si las frecuencias de la inestabilidad del genoma en las células viejas son diferentes de los valores esperados debido a la tasa de eventos en células jóvenes. Hemos encontrado tinción WGA ser preferible calcoflúor tinción blanco, tanto en términos de fondo y la flexibilidad, ya que WGA está disponible conjugado a diferentes moléculas fluorescentes. Esta flexibilidad puede proporcionar más oportunidades para las mediciones simultáneas de otras características de las células con reactivos fluorescentes. El trabajo inicial de establecer una relación entre la intensidad de la señal para la tinción de Ventajas de Windows Original y el número correspondiente de las cicatrices del brote en las células puede entonces conducir a una másdeterminación rápida de la edad celular a través de citometría de flujo. Este enfoque también permite el uso de tamaños de las poblaciones más grandes de lo que sería normalmente examinadas por microscopía para mejorar la reproducibilidad de las mediciones. Mientras que todas las determinaciones de edad se podrían hacer a través del examen microscópico de las células, que sentimos que la citometría de flujo enfoque facilita la rápida detección de los factores que influyen en la inestabilidad del genoma dependiente de la edad.

Además de medir la edad de células de forma fiable, la consideración debe darse a la cantidad de divisiones celulares células madre se les permite someterse con cada ronda sucesiva de crecer y clasificación de células. El uso de un tamaño de la población inicial más pequeña o un volumen de cultivo más grande podría permitir que las células se someten a más divisiones celulares antes de llegar a la densidad celular deseada. Por ejemplo, los investigadores han utilizado sólo dos rondas de clasificación para obtener muy viejas células de levadura 16, que tiene la ventaja evidente de la obtención de las células viejas con menos Experimepasos NTAL. Al considerar la posibilidad de aumentar el volumen de cultura para permitir que las células se completan más divisiones celulares antes de la clasificación, tenga en cuenta el límite del número total de células que se pueden procesar en una sola columna. El uso de un volumen de cultivo más grande puede requerir el uso de múltiples columnas para ordenar una población celular. Además, si las células se someten a un menor número de rondas de división celular entre los puntos de clase / colección, entonces hay más oportunidades de observar las desviaciones de las frecuencias de mutación que se espera en los puntos de tiempo distintos durante la vida útil. Por ejemplo, el muestreo sólo en principios y finales de los puntos de tiempo durante la vida puede producir datos que indican un aumento constante en la frecuencia de mutación, pero el muestreo en los momentos intermedios adicionales durante la vida pueden mostrar que aumenta la frecuencia de mutación rápida y luego estancarse. Sin embargo, ya que este protocolo aísla las células madre viejas, hay una oportunidad de obtener una medida más directa de los cambios en las tasas de mutación con la edad. Pruebas de fluctuación podría abe realizó usando células madre de diferentes edades para determinar si la tasa de mutación será diferente de la tasa obtenida usando células jóvenes. Mientras que las culturas de estas pruebas de fluctuación se convertirán en una mezcla de células viejas y jóvenes a medida que crecen, cualquier desviación de las tasas obtenidas a partir de células jóvenes podrían atribuirse a la utilización de una población de partida más.

La capacidad para obtener de forma reproducible una gran población suficiente de células madre de edad para medir con precisión la inestabilidad del genoma es esencial para el éxito de este enfoque. Aunque el protocolo describe el uso de un sistema de clasificación magnética particular, para este propósito, otros grupos han clasificado las células madre de levadura con sistemas alternativos 14,18 (véase la Tabla de Materiales). Tales sistemas alternativos también deben trabajar con este método, aunque algunos optimización de los protocolos de los fabricantes podría ser requerida. Independientemente del sistema específico utilizado, el tamaño de la población requiered difiere dependiendo de la frecuencia del tipo de mutación o reordenamiento del genoma elegido para el estudio. Como mínimo, debe haber suficientes células madre para obtener al menos una colonia mutante por población para calcular una frecuencia de mutación. En la práctica, los resultados pueden ser bastante variables si se espera que sólo cero a cinco colonias mutantes del tamaño de la población, e incluso un pequeño aumento en el tamaño de la población, por lo que se espera de cinco a diez colonias mutantes, puede mejorar mucho la reproducibilidad. Cuando biotina etiquetado de una población de partida, la eficiencia de recuperación para cada especie necesita ser tenido en cuenta para ayudar a identificar el tamaño de la población apropiada necesario medir la frecuencia de mutación en las células madre de edad. Con un 90% de recuperación de células madre después de cada especie, sólo el 59% de la población original se recuperó después de cinco rondas de crecimiento y la clasificación. Esto se reduce a ~ 33% de recuperación de la población original después de cinco rondas de crecimiento y la clasificación si sólo el 80% de las células madre marcadas se recuperecado durante cada clase. La medición y maximizar la recuperación es crucial cuando se mide acontecimientos de baja frecuencia, ya que de dos a tres veces disminución en tamaño de la población podría conducir fácilmente a los números de poco fiables de colonias mutantes por población.

Hay numerosas opciones para ampliar o modificar este protocolo para obtener una comprensión más amplia de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular mitótico. Ejemplos simples incluyen el análisis de cómo las alteraciones en las funciones de genes, los cambios de medios, u otros cambios de condición ambiental alteran la acumulación de mutaciones con la edad. Las tasas de mutación para las células jóvenes con la función del gen alterado o en la condición apropiada se miden y utilizan para determinar si las mutaciones se acumulan de manera diferente de lo previsto por los valores de frecuencia y de manera diferente que en las poblaciones celulares de control. Las poblaciones de células en diferentes puntos durante el envejecimiento replicativo podrían estar expuestos a factores de estrés específicos, tales como especies reactivas de oxígeno o agentes que dañan el ADN. Aexposición transitoria y leve a estrés oxidativo no alteró sustancialmente a la capacidad para llevar a cabo clasificación de células (Figura 3), pero más severas tensiones puede complicar la recuperación de las células. Experimentos preliminares serían necesarias para verificar que las células madre aún se pueden recuperar de manera eficiente después de tensiones específicas. Además, las características celulares de las células madre aisladas podrían ser analizados en detalle, incluyendo los niveles de especies reactivas de oxígeno, la morfología mitocondrial y vacuolar, y otras características fisiológicas que se asocian con el envejecimiento 3. Además, las células madre pueden ser una población de partida para un tratamiento adicional o manipulación. Dado que las células madre y la hija están separados físicamente durante el procedimiento, las células hijas también están todavía disponibles para el análisis. Por ejemplo, los cambios en las características fisiológicas de las células hijas o la herencia asimétrica de macromoléculas dañadas entre la madre de levadura y células hijas S. sistema modelo cerevisiae que se aplicará de manera eficiente a la investigación de los mecanismos responsables de la acumulación de cambios genéticos durante el envejecimiento celular mitótico.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta obra fue financiada en parte por subvención R00AG031911 del Instituto Nacional del Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud para PHM El contenido de este artículo no reflejan necesariamente la posición oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 100 mg
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 25 columns suitable for QuadroMACS separator
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976 Separator Only
QuadroMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-051 Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm BD Biosciences 352340 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146 Powder, filtering after dissolving important to remove particulates
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 Life Technologies W11261 Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930 10 ml, other antifade reagents could also be used

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Combinando clasificación magnética de las células madre y las pruebas de fluctuación para analizar la inestabilidad del genoma Durante mitótico Aging Cell en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Patterson, M. N., Maxwell, P. H.… More

Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).

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