Summary
Mutationsrater hos unge Saccharomyces cerevisiae celler målt gennem udsvings- test bruges til at forudsige mutationsfrekvenser til mor celler i forskellige replikative aldre. Magnetisk sortering og flowcytometri anvendes derefter til måling af faktiske mutationsfrekvenser og alder mor celler for at identificere eventuelle afvigelser fra forudsagte mutationsfrekvenser.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae har været en fremragende model system til at undersøge mekanismerne og konsekvenserne af genom ustabilitet. Oplysninger indhentet fra denne gær model er relevant for mange organismer, herunder mennesker, da DNA-reparation og DNA skade responset faktorer er godt bevaret på tværs af forskellige arter. Men S. cerevisiae er endnu ikke blevet brugt til at rette op på, om satsen for at akkumulere mutationer ændringer med stigende replikativt (mitotiske) alder på grund af tekniske begrænsninger. For eksempel målinger af gær replikativ levetid gennem mikromanipulation tale om meget små populationer af celler, som forbyder påvisning af sjældne mutationer. Er blevet udviklet genetiske metoder til at berige for mor celler i populationer ved at inducere død datter celler, men bestandsstørrelser er stadig begrænset af den hyppighed, hvormed tilfældige mutationer, der kompromitterer udvælgelsessystemerne forekomme. Den nuværende protokol udnytter magnetisk Sorting af overflade-mærkede gær mor celler for at opnå tilstrækkeligt store populationer af aldrende mor celler til at kvantificere sjældne mutationer gennem fænotypiske markeringer. Mutationsrater målt gennem udsvings- tests, og mutationsfrekvenser er først for unge celler og anvendes til at forudsige hyppigheden af mutationer i mor celler af forskellige replikative aldre. Mutationsfrekvenser bestemmes derefter for sorterede mor celler og alder af moderen celler bestemmes ved hjælp af flowcytometri ved farvning med et fluorescerende reagens, der registrerer bud ar dannet på deres celleoverflader under celledeling. Sammenligning af forudsagte mutationsfrekvenser baseret på antallet af celledelinger til frekvenserne eksperimentelt observeret for mor celler af en given replikativt alder kan derefter identificere, om der er aldersrelaterede ændringer i hastigheden af akkumulerende mutationer. Variationer af denne grundlæggende protokol giver mulighed for at undersøge indflydelsen af ændringer i specifikke gen-funktioner ellersærlige miljøforhold mutation ophobning at behandle mekanismer underliggende genom ustabilitet under replikation ældning.
Introduction
Mikroorganismer, såsom gæren Saccharomyces cerevisiae, er gode modeller til undersøgelse mutationsrater, men disse modeller ikke er blevet fuldt udnyttet til at undersøge akkumuleringen af mutationer i mitotisk ældning af celler. Mutation akkumulering i det nukleare genom er blevet antaget at bidrage til aldring ved resulterer i progressivt tab af (eller variation i) genfunktioner 1. Evnen til at bruge et mikrobielt system til at studere de mekanismer og konsekvenserne af mutation ophobning under aldring kunne i høj grad fremskynde identifikation af genetiske og miljømæssige faktorer, der påvirker denne proces, på grund af letkøbte genetiske systemer og den lethed at kvantificere sjældne fænotypiske ændringer i mikroorganismer. DNA-reparation faktorer og DNA skade responset proteiner er godt bevaret på tværs af forskellige arter 2, og de grundlæggende ligheder i organismal aldring er blevet identificeret for organismer så forskellige som S. cerevisiae end pattedyr 3, hvilket gør det sandsynligt, at de fremkomne resultater fra undersøgelser i gær vil være relevante for ældning i mange organismer.
Undersøgelser af befolkningens aldring i S. cerevisiae gør brug af to aldrende modeller, der måler kronologisk ældning eller replikativ ældning af celler. Kronologisk aldring er kendetegnet ved den gradvise tab af levedygtighed i gær cellepopulationer, der er i en ikke-delende tilstand (stationær fase) på grund af næringsstof udtynding 3. Den kronologiske aldring model er blevet brugt til at vise, at mutationer akkumuleres med stigende alder 4, da store cellepopulationer nemt opnås i denne model til at udføre fænotypiske valg til mutant celler. I dette tilfælde vises mutation ophobning at blive påvirket af vækst-signalveje og oxidativt stress 5, og hver af disse faktorer er relevante for forståelsen aldring i flercellede eukaryoter 3. Den replikative aldring Modellen udnytter den asymmetriske divisipå mellem S. cerevisiae mor og datter celler til undersøgelse aldring, der opstår med hinanden cellegenerationer 3. Gær replikativt aldring er ofte blevet målt gennem mikromanipulering af små bestande af mor og datter celler, eller mere for nylig, gennem video mikroskopi af små populationer af gærceller i mikrofluidenheder 6,7. Begrænset bestandsstørrelser gøre disse tilgange dårligt egnet til undersøgelse mutation akkumulering ved mitotisk ældning, medmindre der opnås hel-genom oplysninger fra enkelte celler eller meget høj frekvens genetiske ændringer måles 8. Hele-genom sekventering af enkelte celler giver betydelige datasæt til undersøgelse mutation akkumulering, men fænotypisk selektion systemer har den vigtige fordel, at tilvejebringe et middel til måling mutationsrater at undersøge mekanismerne bag mutation akkumulering. Undersøgelser for at undersøge mutationsfrekvenser og priser gennem fænotypiske markeringer i haploid gærstammer under replikativ aldring er endnu ikke blevet rapporteret.
Mutationsrater almindeligvis målt ved hjælp udsvingsbånd test 9. Mutationsfrekvens værdier afspejler det samlede antal celler, der huser en mutation i et gen-sekvens i en population. Dette omfatter celler, i hvilke uafhængige mutationer forekommer og afkom af disse celler, der blot arver allerede eksisterende mutationer. I modsætning hertil mutationsrater målt gennem udsvingsbånd test repræsenterer antallet af uafhængige mutationer, der nyligt opstår med hver celle generation. Disse tests omfatter typisk inokulering mange replikatkulturer ved lave celledensiteter for at reducere sandsynligheden for at tilføje celler med præ-eksisterende mutationer i en målsekvens, der vokser kulturerne til nær mætning, og identificere mutante celler ved vækst på selektivt medium. Antallet af mutant celler er identificeret i de replikere populationer anvendes derefter i et af flere matematiske modeller til at estimere antallet af Independent mutationer, der opstod under væksten 9. Sammenligning af antallet af uafhængige mutationer til den gennemsnitlige befolkning størrelse giver et mål for mutationen sats. I S. cerevisiae er mutationsfrekvenser og priser ofte målt ved anvendelse af URA3 og can1 gener, eftersom tab af funktion mutationer i disse gener producerer selekterbare fænotyper. Tab af URA3 funktion gør celler resistente over for 5-fluororotsyre (5-FOA), idet proteinet kodet af URA3 omdanner 5-FOA i et toksisk molekyle 10. Tab af funktion CAN1 tillader celler at blive resistente over for canavanin, et giftigt arginin-analog, idet proteinet kodet af CAN1 transporterer arginin og canavanin i celler 11.
Både genetiske og fysiske sortering strategier er blevet anvendt med succes til at opnå større bestande af S. cerevisiae mor celler til at lette undersøgelser af replikation ældning. Genetiske strategier omfatter smarte metoder, der vælger imod datter celleoverlevelse i en population. Moderen berigelse (MEP) involverer beta-østradiol induktion af Cre-rekombinase-ekspression kun i afledte celler, hvilket fører til datter-specifik forstyrrelse af to essentielle gener, der er manipuleret til at indeholde loxP sites 12. MEP-stammer kan dyrkes normalt i fravær af inducer, men kun moderen celler vil fortsætte med at opdele efter induktion, mens datter celler vil standse ved M-fase typisk i deres første progression gennem cellecyklus 12. Selv om dette system ikke har været anvendt til bredt at studere mutationer akkumulering ved aldring, er det blevet anvendt til at undersøge tab af heterozygositet, en relativ hyppig form for genom ustabilitet i diploide gærstammer, samt biokemiske ændringer i aldrende mor celler 13,14. Tilsvarende datter-arrester system indebærer datter-specifikke ekspression af S. cereviSIAE URA3 gen 15. Datter-arrester stammer vokse normalt indtil 5-FOA tilsættes til mediet, på hvilket tidspunkt datterceller udtrykker URA3 vil dø, mens mor celler fortsætter med at vokse 15. Disse er nyttige systemer til at berige for mor celler, men de afhænger af vedligeholdelse af genet funktioner, der udgør udsøgningssystemet. Tilfældige mutationer i en eller flere komponenter af markeringen systemet kan resultere i døtreceller der undslipper udvælgelse og formere sig eksponentielt. Under udviklingen af MEP stammer passende befolkningstal størrelser var fast besluttet på at undgå forekomsten af mutant datter celler, der kan slippe markeringen 12. Men denne grænse i befolkningens størrelse kompromitterer påvisning af sjældne former for genom ustabilitet under replikation ældning. Denne begrænsning af befolkningens størrelse delvist kunne overvindes ved hjælp af diploide gærstammer med to kopier af hvert gen bidrager til udvælgelsen systemet, da de flestemutationer ville sandsynligvis være recessive 12. Imidlertid er anvendelsen af diploide stammer begrænser de typer af mutationsbegivenheder, som let kan påvises i forhold til dem, der let kan påvises i haploide gærceller.
Fysiske sortering strategier omfatter isolering af mor-celler med en mærket celle overflade fra umærkede døtreceller at berige for store bestande af mor celler. Den iagttagelse, at celleoverfladeproteiner (cellevægsproteiner) S. cerevisiae datterceller er nyligt syntetiseret under knoppefyldte er blevet udnyttet til at mærke mor celler uden mærkning af datterceller, som de producerer 16. For eksempel kan en første population af gærceller er mærket på deres overflade med biotin dyrkes og isoleres derefter fra deres datterceller celler under anvendelse af anti-biotin mikroperler og magnetisk sortering 16 fordi datter celler frembragt af den oprindelige population ikke vil indeholde biotin på deres overflade . Seriel vækst ogsortering tillader progressivt ældre populationer af mor celler, der skal indhentes og analyseres. Denne procedure er blevet anvendt med succes til at undersøge ændringer i celle fysiologi og genekspression under replikation ældning af gær 13,14,17,18. Den nuværende metode tilpasser denne biotinmærkning og magnetisk sortering teknik til at berige for mor celler med det formål at måle akkumulering af potentielt sjældne mutationer eller andre former for genom ustabilitet analyseret gennem fænotypiske markeringer. Seriel vækst og fysisk sortering tillade analyse af mutation ophobning i progressivt ældre mor celler, såvel som i deres datter cellepopulationer. Bestemmelse af mutationsrater per generation giver en forudsagt mutationsfrekvens skal beregnes for mor celler, der har undergået et bestemt antal celledelinger. Da forudsagte frekvens værdier er baseret på den forventede stigning skyldes yderligere runder af celledeling, betydelige afvigelser i de observerede Mutatiom frekvenser i forhold til de forudsagte værdier giver dokumentation for alders-specifikke ændringer i hastigheden af akkumulerende mutationer. Ved hjælp af denne protokol, kan fluorescerende farvning af opløbet ar, der svarer til steder med celledelinger på mors celler kombineret med analyse ved flowcytometri bruges til hurtigt at bestemme aldersfordelingen af sorterede og usorterede befolkninger. Yderligere fluorescerende reagenser, såsom dem, der anvendes til påvisning af reaktive oxygenarter, kan også anvendes i denne protokol. Samlet set denne protokol muliggør effektiv analyse af aldersbetingede ændringer i genom ustabilitet med potentiale for korrelation til aldersrelaterede celle fysiologiske ændringer i en model organisme, som er velegnede til at studere de genetiske og miljømæssige faktorer, der påvirker aldersrelaterede genom ustabilitet.
Protocol
1. Fremstilling af medier og løsninger
- Dyrk celler under anvendelse af gærekstrakt-pepton-glukose (YPD) rigt medium for standardprotokol. En 2% bacto-pepton, 1% gærekstrakt, 2% glucoseopløsning til YPD-medium og tilsæt 2% bacto-agar til fast medium 19. Autoklave at sterilisere. Brug et alternativt medium, hvis det er nødvendigt, for at teste en bestemt vækstbetingelser eller mutant gærstamme.
- Gør fast syntetisk komplet medium uden arginin med 60 mg / L canavanin (SC-arg + canavanin) at selektere for canavanin resistente mutanter. Forbered en løsning, der er 0,67% bacto-gærnitrogenbase uden aminosyrer, 2% glucose, 0,2% komplet supplement blanding uden arginin (frafald mix), og 2% bacto-agar 19. Autoklave og afkøles før tilsætning af canavanin fra 20 mg / ml stamopløsning (filtersteriliseret, opbevaret ved 4 ° C) 19.
- Gør fast syntetisk komplet medium indeholdende 5-fluororotinsyre (5-FOA). Forbered 500ml af en opløsning, som er 1,34% Bacto-gærnitrogenbase uden aminosyrer, 4% glucose, 0,4% komplet supplement blanding og 0,2% 5-FOA og filter-sterilisere 19. Autoklave 500 ml af en 4% bacto-agaropløsning, kold kort, og derefter blandes med 500 ml filtersteriliseret næringsopløsningen. Brug egnet alternative medier til andre mutationsanalyser.
- Til biotinmærkning, at 500 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) indeholdende 137 mM natriumchlorid, 2,7 mM kaliumchlorid, 10,14 mM natriumphosphat dibasisk og 1,77 mM dibasisk kaliumphosphat, pH 8. Opbevar ved 4 ° C og holde på is under brug.
- Lav en frisk 5 mM biotin lager i sterile, ultrarent vand.
- Til at slukke biotinmærkning, lave 500 ml 1x PBS, 100 mM glycin. Opbevar ved 4 ° C og opbevar på is under brug.
- Afhængig af antallet af celler og varighed af eksperimentet gøre 1-2 L af perle-mærkning buffer indeholdende 1x PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine serumalbumin. Filtersteriliser og de gas-buffer. Opbevar ved 4 ° C og opbevar på is under brug.
- Forbered en 0,4% trypanblå løsning i 1x PBS Filtersteriliser, og opbevares ved stuetemperatur til brug i cellelevedygtighedsassays målinger.
- Alikvote små volumener (~ 100 ul) af en hvedekimagglutinin (WGA) fluorescerende konjugat opbevares ved -20 ° C i folie indpakkede (eller uigennemsigtig) mikrocentrifugerør til anvendelse ved bestemmelse celle alder.
2. Bestemmelse af Mutation Vurder og frekvens
- Etablere en baseline mutation sats per celle generation hjælp udsvings- test for celler dyrket under standard dyrkningsbetingelser. Grow 7-11 replikere 1 ml kulturer fra en indledende densitet af 1.000-5.000 celler / ml til tidlig stationær fase (~ 10 8 celler / ml).
- For hvert replikat kultur fortyndes cellerne 1: 2.000 og spredes 1-4 pi på ikke-selektivt medium (YPD) for at bestemme kolonidannende-enheder / ml. Træpiller resterende celler på ~ 2.400 xg i 1 min i en mikrocentrifuge og resuspender i 100 ul vand spredes på selektivt medium for at identificere mutanter. Pladerne inkuberes i tre dage ved 30 ° C før tælle kolonier (justere inkubationstid efter behov baseret på væksthastighed af celler).
- Bestem antallet af uafhængige mutationer (m), der fandt sted i forsøget baseret på antallet af mutantkolonier (R) opnået på selektivt medium. Brug Lea-Coulson median estimator at finde m ved at erstatte det mediane antal mutantkolonier for r i nedenstående formel 9. Derefter erstatte værdier for m indtil den venstre side af ligningen er næsten nul.
- For at bestemme mutationsrate først beregne det gennemsnitlige antal levedygtige celler spredt på selektivt medium ved at multiplicere den gennemsnitlige kolonidannende-enheder / ml af replikatkulturer og mængdenkultur i ml spredt på selektivt medium. Fordel m værdi fra trin 2.1.2 dette gennemsnitlige antal levedygtige celler for at opnå mutationen pr celle generation.
- Individuelt beregne antallet af levedygtige celler spredes på selektivt medium til hvert replikat kultur i en retssag, som beskrevet i trin 2.1.3. Divider antallet af mutante kolonier (r) opnået for en kultur med antallet af levedygtige celler spredt på selektivt medium for at opnå mutationsfrekvensen. Brug gennemsnittet eller medianen af de enkelte mutationsfrekvenser fra replikatkulturer i trin 2.1 som udgangspunkt mutationshyppighed.
- Gør frekvens målinger før og efter biotinmærkning celler (trin 3.2 og 3.4) for at afgøre, om mærkningen trin resulterer i en ændring i frekvensen af mutationer, der vil skulle overvejes, når der testes for alders-specifikke ændringer i mutation ophobning.
3. biotinmærkning
- Streak S. cerevisiae fra et glycerol-lager ved -80 ° C på YPD-medium og inkuberes ved 30 ° C i 1-3 dage.
- Ved hjælp af en steril pipettespids, overføre celler fra Udstrygningspladeteknikken til 1 ml (eller mere) af vand holde sig for øje, at 1-1,5 cm et tykt dyrket del af stribe vil give cirka 10 8 celler. Bestem nøjagtige celletæthed ved hjælp af et hæmocytometer.
- Label 10 8 celler pr stamme (eller behandling tilstand) pr indsamling punkt, hvor Mutationsfrekvensen vil blive fastlagt eller en befolkning tilstrækkelig størrelse til at opnå mindst 5-10 mutantkolonier pr prøvetagning på selektivt medium (baseret på mutation frekvens fra trin 2.2). Medtag yderligere 10 8 celler til baseline målinger pr stamme / tilstand.
- Biotinmærke ifølge standardprocedure fra producenten, undtagen bruge en 5 mm biotin reagens lager og forsigtigt rocke under inkubation. Spin 5 min ved 4 ° C ved 3.000 x g i alle centrifugeringstrin, siden spinding ved temperaturer højere end 4 ° C, kan føre til øget celletab. Efter den sidste vask, suspendere cellerne til en koncentration på 10 8 mærkede celler / ml i vand.
- Kontroller levedygtigheden af celler under anvendelse af trypanblåt-farvning. Fortyndes 10 pi celler med 23 pi vand og 67 pi 0,4% trypanblåt i 1x PBS. Der inkuberes i mindst 40 minutter ved stuetemperatur, før at lave levende (ufarvede) og døde (bejdset) celler ved hjælp af et hæmocytometer.
- Måle baseline værdier for genom ustabilitet, celle alder, og andre relevante karakteristika (se afsnit 5, 6 og 7).
- Overførsel biotin-mærkede celler til 20 ml YPD-medium pr 10 8 celler i en Erlenmeyer-kolbe (ca. 5 x 10 6 celler / ml). Grow kultur (er) 16-18 timer ved 20 ° C til en omtrentlig densitet på 10 8 celler / ml (4-5 celle generation), men ikke tillader cellerne at nå stationær fase. Brug en kortere inkubationstid for vækst ved 30 ° C. Hold biotin-mærket calen ved 4 ° C i op til flere timer før tilsætning til mediet, hvis det er nødvendigt for at optimere timingen af vækstperioden og samling.
4. Bead Mærkning og Magnetic Sortering
- Efter vækstfasen fortyndes en alikvot af kulturen til at bestemme celletætheden ved hjælp af et hæmocytometer. Pelleter cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 4 ° C ved 3.000 x g. Hæld supernatanten.
- Vask cellerne ved hvirvelbehandling at suspendere pellet i 30 ml perle-mærkning puffer, derefter centrifugering og hælde supernatanten som i afsnit 4.1. Gentag vask.
- Fuldt resuspender celler i 50 ul perle-mærkning buffer pr 10 8 totale celler ved hvirvelblanding. Tilsæt 2 pi magnetiske perler pr 10 8 totale celler og vortex kortvarigt at blande. Der inkuberes på is i 10 min, invertere jævne mellemrum for at blande (modificeret fra en online protokol på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
- Vask cellerne tre gange med 30 ml perle-mærkning buffer.
- Tilsæt 0,5 ml perle-mærkning buffer pr 10 8 totale celler og kortvarigt vortex pellet på mellemlang indstilling lige indtil cellerne resuspenderes. Hæld gennem et 40 um cellefilter i et 50 ml rør til at fjerne eventuelle resterende celleklumper. Hvis det er nødvendigt, skal du lade cellerne på is i 1-2 timer før lastning på kolonnen.
- Følg producentens anbefalede protokol for de magnetiske søjler til at binde, vaske, og elueres magnetisk perle-mærkede mor celler. For øget inddrivelse af mærkede celler, skal du bruge mindst én kolonne per 2 x 10 9 totale celler.
- Fjern eventuelle bobler der opstår, når du lægger kolonner, da de vil blokere flow. Fjern og udskift kolonnen separator mellem vask for at forhindre celler i at blive fanget mellem perlerne (modificeret fra en online protokol på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
- Medmindre strømme igennem fra bindende og vasketrin til at analysere unge celler produceret af moderen celler, hvis det ønskes. Koncentrat celler som beskrevet i trin 4.7.
- Brug multi-kolonne separatorer til behandling af flere prøver på en gang. Eluerer flere kolonner af den samme prøve i den samme samling røret for at reducere håndtering af tid og reducere tab af celler.
- Koncentrer eluerede mor celler ved centrifugering ved 3000 x g i 5 min ved 4 ° C. Aspirér al men 1 ml buffer pr 10 8 originale biotin-mærkede celler. Vortex kortvarigt at suspendere cellerne i resterende buffer.
- Fortyndes en alikvot af celler og plette med trypanblåt for at bestemme celletætheden og cellelevedygtighed under anvendelse af et hæmocytometer (se trin 3.5). Beregn det samlede antal celler inddrives.
- Hvis antallet af celler er væsentlig højere end forventet, passere eluering prøven gennem en anden kolonne til at forsøge at fjerne kontaminerende unge celler.Hvis antallet af celler er væsentligt lavere end forventet, passerer den gemte strømmen gennem prøven gennem en anden kolonne for at forsøge at forbedre udbyttet af mor-celler.
- Brug celler til yderligere analyser, som beskrevet i punkt 5 og 6. Alternativt kan dyrke cellerne i YPD bouillon igen for at øge deres replikation alder (trin 3.7) og følg med perle mærkning og sortering (trin 4.1-4.8.1), uden nødvendigt at gentage biotinmærkning.
5. Bestemmelse af Replikativ Alder
- Spin celler i 2 minutter ved 5000 xg ved stuetemperatur i alle trin i dette afsnit. Put 25 pi genvundne celler (~ 10 8 celler / ml) i et 1,5 ml centrifugerør og vaskes to gange med 1 ml 1x PBS. Aspirer fra supernatanten.
- Optø en portion af WGA-konjugat, til vortex blandes, og spin kortvarigt at fjerne proteinaggregater. Suspender celler i 180 pi 1x PBS og 20 ul WGA konjugeret til et fluorescerende molekyle til at mærke bud ar på overfladen af the celler. Dæk 1,5 ml centrifugerør med folie og inkuberes under forsigtig vipning ved 30 ° C i 30 minutter.
- Der vaskes tre gange med 1 ml 1X PBS.
- For fluorescerende mikroskopi, label dias og montere pr standardprotokol anvendelse af et anti-fade middel. Fuldt helbrede dias i mørke (op til et par dage) før forsegling dækglas for at undgå celle bevægelse under billedbehandling. Tæl BUD ar på mindst 50 celler pr prøve at opnå en repræsentativ måling af celle alder. Store dias for op til 1 måned for visning opløbet ar, hvis det er nødvendigt.
- Alternativt bestemme intensiteten af det fluorescerende signal fra WGA-konjugat ved at udføre flowcytometri på celler suspenderet i 1 ml 1x PBS efter trin 5.1.2. Brug en 405 nm excitation laser og 530/30 nm emission filter med en 505 nm lang aflevering filter til WGA-Alexa 488. Medtag en ufarvet kontrol for hvert indsamlingssted.
- Graf bud ar på unge celler og alderen talte celler ved mikroskopi påy-aksen mod den normaliserede geometriske gennemsnit (bejdset geometrisk middelværdi / ufarvet geometrisk middelværdi) af WGA-konjugat fluorescens fra de samme cellepopulationer på x-aksen. Opnå ligningen for en lineær tendens linje for dette forhold. For efterfølgende eksperimenter, erstatte det normaliserede geometriske gennemsnit af WGA-konjugat fluorescens intensiteten af en celle population for x i ligningen og løse for y for at bestemme den gennemsnitlige celle alder af en prøve.
6. Mutationsfrekvensen
- Spread sorteret mor celler resuspenderet i puffer fra trin 4.7 på YPD-medium og selektivt medium som beskrevet i trin 2.1.1. Brug 1 ml resuspenderet mor celler til selektivt medium og spin-celler ved 5.000 xg i 1 min.
BEMÆRK: Spred større mængde fortyndede celler på YPD-medium som celler øges i alder for at kompensere for et stigende antal ikke-levedygtige og senescentceller i ældre befolkningsgrupper.- Inkuber YPD-medium og selektivt medium plader fratrin 6.1 ved 30 ° C i 3 og 4 dage. Stigning inkubationstid på op til en uge for meget gamle celler eller langsomt voksende stammer. Beregn mutationsfrekvens som beskrevet i trin 2.2.
7. Beregning af Predicted mutationsfrekvens for en given Replikativ Alder
- Beregn den gennemsnitlige stigning i replikativ alder biotinmærkede celler i løbet af forsøget ved at trække den gennemsnitlige alder af den oprindelige celle populationen fra den gennemsnitlige alder for de sorterede mor celler til den pågældende slags. Anvender cell aldre beregnet i trin 5.2 eller trin 5.2.2.
- Multiplicer mutationsrate opnået i trin 2.1.3 ved stigning i den gennemsnitlige celle alder beregnet i trin 7.1. Læg denne værdi til baseline mutation frekvens for den oprindelige befolkning beregnet i trin 2.2 for at bestemme den forudsagte mutationshyppighed for celler i de relevante replikativt alder.
Representative Results
Et rutediagram i figur 1 viser de overordnede trin i proceduren, herunder de punkter, hvor mutationsrater, frekvenser, og celle alder måles. Præcist bestemme hyppigheden og antallet af mutationer (eller anden form for genom ustabilitet) i unge cellepopulationer er et vigtigt første skridt, da det er nødvendigt for at vælge en passende indbyggertal til mærkning og magnetisk sortering. Bedøm værdier kan etableres ved hjælp af udsvingsbånd test 9. Eksempel resultater for gærstammer i BY4741 genetisk baggrund 20 udvalgt til mutationer i CAN1-genet, der bibringer canavanin resistens eller mutationer i URA3-genet, som giver resistens over for 5-FOA, er vist i figur 2. Celler blev dyrket ved 20 ° C for repræsentativ rate eksperimenter, og ved 20 ° C og 30 ° C for repræsentativ hyppighed eksperimenter. Disse temperaturer blev brugt, fordi indledende cellepopulationer voksetved 30 ° C blev derefter dyrket ved 20 ° C i de efterfølgende repræsentative sortering eksperimenter. Bedøm værdier fra uafhængige forsøg var sammenlignelig for den indledende cellepopulation og celler efter biotinmærkning til en stamme, der har CAN1 genet ved dens normale placering på kromosom V, cirka 32 kilobasepar fra venstre arm telomer ( www.yeastgenome.com ) ( Figur 2A, lavendel kolonner). Mutationen på CAN1 var væsentligt højere i indledende populationer af en anden gær-stamme, der har en deletion af CAN1 genet fra dens normale placering på kromosom V og en insertion af CAN1 på højre arm af kromosom VIII cirka 25 kilobasepar fra telomer 21 (figur 2B). CAN1 gen mutationsfrekvenser var også sammenlignelige for indledende cellepopulationer og biotin mærkede celler ved enten vækst temperatur (Figur 2A, blå søjler). Imidlertid mutationsfrekvenser opnået ved 20 ° C blev fundet at være højere end mutationsfrekvenser ved 30 ° C. For at teste, hvorvidt denne temperatur virkning blev begrænset til CAN1 genet, målte vi mutationer i URA3 ved selektion for resistens over for 5-FOA hjælp gærstammen, der har CAN1 indsat på kromosom VIII. Denne stamme har også en sletning af URA3 fra sin normale sted på kromosom V og en indsættelse af URA3 på den højre arm af kromosom VIII cirka 40 kilobasepar fra telomer 21. Mutationsfrekvenser var også højere ved 20 ° C i URA3 på dette kromosomale sted (figur 2C). Samlet set viser dette, at væksttemperatur kan påvirke frekvensen af mutationer, men biotinmærkning synes ikke at påvirke mutationsfrekvens. Derfor mutationsrater og frekvenser til indledende befolkninger skal fastsættes på samme vækst temperatur, der skal bruges for runder af vækst og sortering. Det er tilrådeligt at kontrollere, at biotinmærkning ikke påvirker genom ustabilitet før anvendelse af protokollen til at undersøge andre typer af mutationer eller genom omlejringer.
Som forventet mutation rate værdier er vist i figur 2A er flere gange lavere end de tilsvarende frekvens målinger. Denne forskel forekommer, fordi mutationsrate måler forekomsten af celler med nye mutationer med hver runde af celledeling, mens mutation frekvens måler den samlede antal mutante celler i populationen i slutningen af vækstperioden. Satserne og 95% konfidensintervaller for disse forsøg viser, at reproducerbare resultater kan opnås ved hjælp af syv replikatkulturer per forsøg, hvilket er det mindste antal gentagelser foreslået til denne protokol.
Når den første frekvens og sats værdier bestemmes, bør en bestandsstørrelse være lmOsen, der sikrer, at tilstrækkelige celler er til stede efter flere runder af sortering til pålideligt bestemme mutationsfrekvenser. Mærkning af en befolkning på 10 8 celler pr tidspunkt, der skal analyseres under aldring er passende, når frekvenser og priser svarer til dem, der er vist i figur 2A. Denne beslutning også afhænger af, hvor effektivt mærket mor celler udvindes efter hver runde af sortering. Effektiviteten af udvinding mærkede mor celler kan hurtigt og enkelt evalueres ved hjælp af et hæmocytometer at bestemme antallet af celler elueret fra søjlerne for hver art og undersøge cellemorfologi. To hovedpunkter er illustreret ved de data, eksempelvis inddrivelse effektivitet (figur 3A): de genvundne antal celler kan forekomme højere end forventet efter den første slags, og der forventes en lille progressiv tab af celler med fortsat sortering. Den højere end forventet antal celler i nogle eksperimenter efter den første slags kunne resULT fra mærkning af knopper på celler i den oprindelige befolkning. En gærcelle med en knop vil typisk blive scoret som en enkelt celle ved fastsættelsen af antallet af celler til at mærke med biotin. Mærkning af knopper til stede i den oprindelige befolkning, selv om, vil gøre det muligt for celler, der udvikler fra disse knopper til også bevares på søjler under sorteringen. Indflydelsen af denne hændelse på bestemmelse af genopretning effektivitet afhænger af den del af knopskudte celler i den oprindelige cellepopulation. En anden mulig grund til højere celletal efter art er, at der er en tendens til at være mere store knopskudte celler på dette tidspunkt, som kan udfylde celledeling under sortering. Som følge heraf kan store knopper stadig er knyttet til deres mor celler sorteres, men derefter vises som adskilte celler, når de eluerede celler er undersøgt. Mens nogle tab af celler observeret med hver runde af vækst og sortering kan protokollen medføre pålidelig tilbageholdelse af 80-90% af cellerne efter hver runde af filtreOrting. Det er en indsats for at praktisere proceduren for at sikre, at 80% eller flere af de mærkede celler isoleres for at undgå behovet for at mærke et uhensigtsmæssigt stort indledende cellepopulation værd. Behandling af celler med en mild stress efter den første slags (1 mM hydrogenperoxid i YPD-medium i 30 min) ikke forhindre en effektiv inddrivelse af celler med fortsatte runder af vækst og sortering, selvom der var nogle variation i bedring for første sortering efter stress (figur 3A).
Inspektion af cellemorfologi og levedygtighed er også nyttige både for bekræftelse vellykket isolering af mor celler og til at justere de fortyndinger / anvendte mængder ved spredning celler på ikke-selektivt medium til at bestemme tætheden af kolonidannende enheder. Mother celler bliver stadigt større og mere uregelmæssigt formet som de bliver ældre, i forhold til datterceller celler (figur 3B). Moderen celleprøver bør derfor primært bestå af store, IRRegularly formede celler som eksperimentet skrider frem gennem hver runde af sortering. Tilstedeværelsen af mange små ovale celler af regelmæssig form kunne indikere, at mor celler ikke bliver tilstrækkeligt adskilt fra datterceller. Levedygtigheden af mor celler bør også gradvist falde med hver runde af voksende og sortering, selv om der kan ikke være meget forandring i løbet af de første fem til ti celle generationer. Antallet af celler, der er i stand til at danne kolonier kan falde meget mere dramatisk end antallet af celler, der er bestemt til at være levedygtig af en form for direkte farvning for celleintegritet, på grund af dannelse af senescentceller. Når levedygtighed ved direkte farvning metode først begynder at falde (ca. 80% eller mindre), kan det være nødvendigt at justere fortyndinger og mængder, der anvendes til at måle kolonidannende enhed tætheder i forventning om en mere dramatisk fald i evnen af de levedygtige celler til danner kolonier (en to til flere gange fald).
Denreplikative aldre de sorterede befolkninger og kontrol befolkninger skal fastlægges inden mutation frekvens data fra mor celler kan analyseres for alders-specifikke ændringer i hastigheden af akkumulerende mutationer. Dette kan ske ved manuel optælling af opløbet ar på mor-celler (figur 4) eller ved flowcytometri at kvantificere signalet til opløbet ar detektionsreagens (figur 5). Bud ar kan mærkes med en forholdsvis lav baggrund signal ved hjælp af WGA-fluorescerende konjugater (figur 4C). 4A viser, at de fleste celler fra strømmen gennem prøver af sorteringsproceduren har nul eller en knop ar. Cellerne elueret fra søjler er for det meste alderen mor-celler (figur 4B og 5). Typisk> 90% af eluerede celler er mor-celler, som kan ses lettere fra flowcytometri resultat i figur 5. Celler med relativt få bud ar (<6) OBTained efter mere end to runder af sortering kunne repræsentere kontaminerende celler, der ikke var biotin-mærket, der er blevet et par runder af celledeling i den pågældende runde af vækst, i modsætning til mor-celler, der deler sig meget langsomt. Variationen i celle alder kan øges med efterfølgende runder af sortering, hvis ikke alle celler i populationen vokser ensartet.
En større cellepopulation kan anvendes mere hurtigt at evaluere celle alder, hvis der etableres et lineært forhold mellem WGA-fluorescens signalintensiteter og antallet af bud ar per celle. Til denne analyse normalisering af alle WGA-fluorescens signalintensiteter opnås ved at dividere det signal, farvede celler af det opnåede signal for passende ufarvet cellepopulation (datter eller mor) for at tage højde for øget baggrundsfluorescens i ældre celler. Figur 4 og 5 viser analyse af de samme repræsentative cellepopulationer.Manuel optælling etableret gennemsnitlige replikative alderen 0,95 og 11,4 for datteren celle (figur 4A) og mor cellepopulationer (figur 4B), hhv. Normaliserede WGA-signaler for disse to befolkninger og de tre yderligere populationer (gennemsnitsalder på 3,0, 6,9 og 14,4) blev plottet mod det gennemsnitlige antal opløbet ar for hver population (figur 5B). Denne lineære sammenhæng kan derefter anvendes med den samme stamme og reagenser i fremtidige eksperimenter for at bestemme gennemsnitlig cellestørrelse alder fra det normaliserede WGA-signal opnået ved flowcytometri, giver en hurtig og nøjagtig bestemmelse af celle alder. Kontrolforanstaltninger befolkninger skal stadig medtages for at kontrollere lignende farvning effektivitetsgevinster mellem forsøg.
Indflydelsen af alder på akkumulation af mutationer kan løses, når de tidligere trin for at opnå mutationsrate værdier, effektivt sortering celler og bestemme celle aldre er gennemført. NUmber af tidspunkter, hvor frekvensen kan bestemmes, afhænger af størrelsen af biotin-mærkede cellepopulation og antallet af celler, der skal spredes på selektivt medium for at opnå pålidelige resultater. Hvis mutationen kursændringer med alderen, så de observerede mutationsfrekvenser til aldrende mor celler, bør anderledes end forventet udelukkende baseret på yderligere runder af celledeling. Sammenligning af den observerede mutationsfrekvens på den forudsagte mutationsfrekvensen kan identificere aldersrelaterede forskelle i hastigheden af akkumulerende mutationer. Som beskrevet i punkt 7 i protokollen, kan den forudsagte frekvens opnås fra produktet af baseline mutation sats for den første celle befolkning og stigningen i replikative moderens alder celler føjet til mutationsfrekvensen for den indledende befolkning. Stigninger i CAN1 Mutationsfrekvensen er blevet observeret med øget gennemsnitlig celle alder i en stamme med CAN1 ved dens normale placering på kromosom V(Figur 6A) og en stamme med CAN1 på højre arm af kromosom VIII (figur 6B). Da de observerede mutationsfrekvenser til mor celler i figur 6A ligner eller lige under de forudsagte frekvenser, behøver oplysningerne ikke fremlægge nogen beviser for en aldersspecifik ændring i mutation sats. I modsætning hertil mutationsfrekvenser til mor celler af stammen med CAN1 på kromosom VIII var højere end de forudsagte frekvenser (figur 6b). Bemærk, at de forudsagte frekvenser i grafen ikke synes at stige meget fordi en logaritmisk skala skulle anvendes til y-aksen på grund af den store stigning i den observerede mutationsfrekvens. Derfor er resultaterne i figur 6B kan tilvejebringe dokumentation til støtte en aldersspecifik forøgelse i antallet af akkumulerende mutationer. Forskellen i resultaterne for de datasæt i figur 6A og 6B er sandsynligvis på grund af diffe leje genomiske placeringer af CAN1. Disse typer af observationer giver et udgangspunkt for at udvikle hypoteser til at undersøge mekanismer, der påvirker mutationsrater som celler alder og at udvikle modeller til at forklare mutation ophobning med replikativt alder.
Figur 1. Flowdiagram af den samlede procedure for behandlingen af mutation akkumulering ved gær replikativ aldring. Sort tekst og pile angiver vigtige skridt i proceduren. Den buede pil viser, at yderligere runder af genvækst og sortering af de samme celler anvendes for at opnå en gradvis ældre celler. Lilla pile og tekst angiver trin, hvor de angivne målinger er foretaget. Freq - frekvens.
upload / 51850 / 51850fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2. Bestemmelse af mutationsfrekvens og hastighed i unge cellepopulationer. (A) Mutant kolonier blev udvalgt ved at sprede celler på SC-ARG + canavanin medie til at vælge for tab af funktion mutationer i CAN1 genet og i forhold til det totale antal af levedygtige celler fordelt på selektivt medium til at beregne frekvenser / satser. Celler fra indledende populationer før biotinmærkning (IP) eller efter biotinmærkning (PB) blev dyrket ved hjælp YPD medium fra en indledende densitet på 5.000 celler / ml til nær mætning. Lavendel kolonner indikerer hastighedsmålinger og blå søjler repræsenterer frekvens målinger foretaget ved angivne temperaturer (20 ° C og 30 ° C). Sæt af syv replikat blev dyrket for hvert forsøg og 2-5 uafhængige forsøg blev udført. Individuelle kurser beregnede værdier for uafhængige forsøg er vist, og fejllinjer til disse undersøgelser udgør 95% konfidensintervaller bestemmed at bruge en online regnemaskine 22. Frekvenser repræsenterer gennemsnit og standardafvigelser. (B) CAN1 mutationsrater indhentet og repræsenteres som beskrevet for en del A ved hjælp af en stamme med CAN1 på højre arm af kromosom VIII. (C) mutationsfrekvenser opnået efter selektion for mutantkolonier på 5-FOA hjælp en stamme med URA3-genet placeret på højre arm af kromosom VIII. Metoder var ellers som del A, og de midler og standardafvigelser for tre eller fire uafhængige forsøg er vist.
Figur 3. Eksempel sortering effektivitet bestemmes ved beregning af antallet af eluerede celler efter hver runde af sortering. (A) det samlede antal celler i hver begyndende befolkning efter biotinmærkning var sat til en, og t otal antal celler er til stede i de eluerede prøver fra hver runde af magnetisk cellesortering blev divideret med de oprindelige værdier til opnåelse af fraktionen af mærkede celler. Samlet celleantal blev bestemt ud fra celletal opnået under anvendelse af et hæmocytometer. Orange søjler repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen for tre uafhængige forsøg efter standard protokol. Blå søjler repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen for to uafhængige forsøg, hvor cellerne blev behandlet med 1 mM hydrogenperoxid i 30 minutter umiddelbart efter den første slags. (B) Størrelse og morfologi af celler efter biotinmærkning (post-biotin) og mor celler inddrives efter den tredje runde af magnetisk sortering (SORT 3 mor celler) vist med standard lysfeltmikroskopi og en 20X mål. Hvide linjer i baggrunde er de linjer, der begrænser de mindste kvadrater synlige på en standard hæmocytometer.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Bestemmelse af replikation alder ved hjælp af manuel opløbet ar optælling. Konfokalmikroskopi blev brugt til at tælle opløbet ar på individuelle celler mærket med et WGA-fluorescerende konjugat (excitation ved 488 nm og detektion med 458/543 nm band pass og 505 nm lang aflevering filter kombination). (A) Manuel knop ar tællinger af celler fra gennemstrømningen (døtreceller) efter den tredje runde af magnetisk sortering (n = 62). (B) Manuel bud ar tællinger af eluerede celler (mor-celler) efter tredje runde af magnetisk sortering (n = 54). (C) Mor celler bevares efter den tredje runde af magnetisk sortering fotograferet med en 63X oliebestandighedsobjektet med 3x zoom, efter farvning witha WGA-fluorescerende konjugat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Bestemmelse af replikativ alder anvendelse af flowcytometri. Prøver af 10.000 celler farvet med en WGA-fluorescerende konjugat blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af excitation ved 488 nm og detektion med et 530/30 båndpas og 505 lange pass filter sæt. (A ) Histogrammer afbilder antallet af celler med specifikke WGA-fluorescensintensiteter til en datter celle population eller eluatet (mor celler) efter tre runder af magnetisk sortering. Populationerne svarer til dem der er analyseret i figur 4. Blå lodrette linjer angiver den tilsvarende position for størstedelen af Daughter celler på modercelle histogrammet. (B) Den normaliserede geometriske middelværdi til fluorescens-signalet af hver population er vist i A og tre yderligere population af celler (gennemsnitsalder 3,0, 6,9 og 14,4) blev beregnet som forholdet mellem den geometriske middelværdi af de farvede celler og den geometriske middelværdi af den passende ufarvet cellepopulation. Disse værdier er plottet i forhold til det gennemsnitlige antal bud ar for hver samlede befolkning (figur 4 og data ikke vist). R 2 værdi for tendensen linje i denne sammenligning er givet på grafen.
Figur 6. Sammenligning mellem forudsagte og observerede mutationsfrekvenser under replikation ældning. Celler med mutationer i CAN1 genet blev udvalgt som beskrevet for figur 2 using stammer med CAN1 på dens normale placering på kromosom V (A) eller på højre arm af kromosom VIII (B). Celler blev dyrket på fast medium ved 30 ° C før biotinmærkning og ved 20 ° C derefter. Observerede frekvens værdier er vist med orange søjler (OBS) og forudsagte frekvenser til alderen celler er vist med brune søjler (PRE). Den første søjle for hver graf viser middelværdi og standardafvigelse af den oprindelige mutationsfrekvens efter biotinmærkning fire uafhængige forsøg (PB). Tallene under søjlerne viser det gennemsnitlige antal opløbet ar for hver population (Cell Alder). Uafhængige forudsagte værdier blev bestemt som beskrevet i afsnit 7 i protokollen ved hjælp af hvert af den oprindelige sats værdier som vist i figur 2A (IP søjler) og 2B. Disse uafhængige værdier blev derefter beregnes. Observerede værdier er gennemsnit af tre forsøg. Error streger indikerer standardafvigelse.
Discussion
Denne protokol kombinerer flere metoder til at gøre det muligt for midler og metoder til rådighed i Saccharomyces cerevisiae modelsystem til effektivt anvendes til studiet af genom ustabilitet under mitotisk cellealdring. En bred vifte af assays til at kvantificere forskellige genom ustabilitet via fænotypisk selektion kunne kombineres med magnetisk sortering undersøge mulige aldersbetingede ændringer i akkumulering af særlige former for mutationer eller kromosomomlejringer. Mens hel-genom sekventering strategier kan give flere oplysninger om de overordnede typer af forandringer i et genom med alderen, evnen til at bruge fænotypisk selektion systemer til at opnå mutationsrate målinger og til fortrinsvis at isolere bestemte typer af genetiske ændringer er vigtige fordele for at studere mekanistisk aspekter ved aldring-relaterede genom ustabilitet. Strømlining bestemmelse af celle alder og potentiale til at gøre parallelle målinger af physiological ændringer gennem flowcytometri giver effektive midler til at korrelere genom ustabilitet med andre cellulære ændringer i bestemte aldersgrupper. Bestemmelse af potentielle aldersbetingede ændringer i satserne for akkumulere mutationer kræver: 1) omhyggelig bestemmelse af satserne i unge cellepopulationer, 2) nøjagtig bestemmelse af celle alder, og 3) evnen til pålideligt berige tilstrækkeligt store populationer af mor celler til reproducerbart måler genom ustabilitet i alderdommen. Denne tilgang gør det muligt for gær model system til at bidrage til at definere underliggende mekanismer er ansvarlige for aldersbetingede ændringer i fragtrater og / eller hyppighed af genom ustabilitet i mitotisk aktive celler. Desuden kan genetiske og miljømæssige faktorer hurtigt vurderes for bidrag til aldersbetinget genom ustabilitet. I sidste ende kan disse karakteriseringer føre til udvikling af modeller, der tegner sig for den måde, hvorpå mutationer akkumulerer i løbet af replikation ældning.
Denne fremgangsmåde afhænger af evnen til at påvise mutationer eller andre typer af genom ustabilitet via fremkomsten af selekterbare fænotyper til at måle sådanne begivenheder. Dog kan kreativitet i analysen design tillader mange aspekter af genom ustabilitet, der skal undersøges. For eksempel kan URA3 og CAN1 gener placeres på forskellige genomiske sider for at teste eventuelle påvirkninger af genomisk placering på resultater. Reversion af specifikke ikke-funktionelle gen alleler funktionelle gen alleler kunne teste bestemte mutationelle processer. Også kunne indførelsen af adskillige inaktive alleller af et gen eller flankerer et gen med gentagne sekvenser anvendes til at undersøge rekombinationsbegivenheder ved restaurering eller tab af genfunktion hhv. Udsving test er standard metode til bestemmelse af satserne for disse forskellige genom ustabilitet arrangementer 9. Protokollen er skrevet med godt accepteret og forholdsvis ligetil Lea-Coulson median estimator at bestemme mutasesgrad for at gøre det mere tilgængeligt for forskellige forskere, selv om MSS-maksimal sandsynlighed estimator metoden anses for den bedste fremgangsmåde for fastsættelse mutationsrater 9. MSS-maksimal sandsynlighed estimator er tidligere blevet revideret i detaljer 9, og kan anvendes som en alternativ metode, men kræver mere sofistikerede beregninger. Alternativt har gratis software til at beregne mutationsrater med denne metode er stillet til rådighed 22. Indhentning reproducerbare foranstaltninger mutationsrater kræver opmærksomhed på nogle få aspekter af forsøgets udformning, herunder ved hjælp af tilstrækkelige replikatkulturer, pode kulturer ved lave nok indledende celletætheder der stiger befolkningens størrelse ved 10.000 gange eller mere, og vælge hensigtsmæssige mængder kultur, således at hele population af celler kan spredes på selektivt medium. For sidstnævnte punkt kan en tidligere beskrevne formel anvendes til at justere mutationen på grundlag af den del af kulturen tested 9. Variation i vækst i kulturer kan komplicere bestemmelsen af en reproducerbar mutation sats, og en modificeret median baseret estimator, der kan give mere reproducerbare resultater i sådanne situationer er for nylig blevet beskrevet 23.
Evnen til at præcist at måle celle alder er en anden faktor, der er vigtig for at fastslå, om genom ustabilitet frekvenser i gamle celler er forskellige fra de værdier, der forventes som følge af mængden af hændelser hos unge celler. Vi har fundet WGA farvning at være at foretrække at Calcofluor hvid farvning, både med hensyn til baggrunden og fleksibilitet, da WGA er tilgængelig konjugeret til forskellige fluorescerende molekyler. Denne fleksibilitet kan give flere muligheder til samtidige målinger af andre celletyper karakteristika med fluorescerende reagenser. Indledende arbejde med at etablere et forhold mellem signal intensitet for WGA farvning og den tilsvarende antal opløbet ar på celler kan så føre til en merehurtig bestemmelse af celle alder gennem flowcytometri. Denne fremgangsmåde tillader også brug af større bestandsstørrelser, end det ville være typisk undersøgt ved mikroskopi for forbedret reproducerbarhed af målinger. Mens alle bestemmelser alder kunne gøres ved en mikroskopisk undersøgelse af cellerne, føler vi, at flowcytometri tilgang muliggør hurtig screening af faktorer, der påvirker aldersbetinget genom ustabilitet.
Ud over at måle celle alder pålideligt, bør tages i betragtning, der skal gives til antal celledelinger mor celler får lov til at gennemgå med hver efterfølgende runde af voksende og sortering celler. Anvendelse af en mindre oprindelige population størrelse eller en større kultur volumen kan tillade celler at undergå flere celledelinger, før de når den ønskede celletæthed. For eksempel har andre forskere kun benyttes to runder af sortering for at opnå meget gamle gærceller 16, som har den indlysende fordel at opnå gamle celler med færre experimental trin. Når man overvejer, om der skal øge kultur volumen til at tillade cellerne at fuldføre flere celledelinger før sortering huske grænsen for det samlede antal celler, som kan behandles i en enkelt kolonne. Brug af en større kultur volumen kan kræve brug af flere kolonner til at sortere en celle population. Også, hvis celler undergår færre runder af celledeling mellem sorterer / indsamlingssteder, så er der flere muligheder for at observere afvigelser fra de forventede mutationsfrekvenser på forskellige tidspunkter i løbet af levetiden. For eksempel kan prøveudtagning kun på de tidlige og sene tidspunkter i løbet levetid producere data, der indikerer en støt stigning i Mutationsfrekvensen, men prøveudtagning på yderligere mellemliggende gange under levetid kan vise, at mutationen stigende frekvens hurtigt, og derefter plateauer. Men da denne protokol isolerer gamle mor celler, er der en mulighed for at opnå et mere direkte mål for ændringer i mutationsrater med alderen. Udsving test kunne be udføres ved hjælp af mor celler i forskellige aldre til at afgøre, om mutationsrate vil afvige fra den, der opnås ved hjælp af unge celler. Mens kulturer til disse udsvings- tests vil blive en blanding af gamle og unge celler som de vokser, kan eventuelle afvigelser fra rentesatser startende med unge celler tilskrives brugen af en ældre start befolkning.
Evnen til at reproducerbart opnå en tilstrækkelig stor population af gamle mor celler til nøjagtigt at måle genom ustabilitet er afgørende for succes i denne strategi. Mens protokollen beskriver brugen af en bestemt magnetisk sorteringsanlæg til dette formål, har andre grupper sorteres gær mor celler med alternative systemer 14,18 (se tabel of Materials). Sådanne alternative systemer bør også arbejde med denne metode, men det kan blive nødvendigt vis optimering af producentens protokoller. Uanset det specifikke system, der anvendes, befolkningen størrelse kræverd varierer afhængigt af hyppigheden af den type mutation eller genom omlejring valgt til undersøgelsen. Som minimum skal der være nok mor-celler for at opnå mindst en mutant koloni pr befolkning til at beregne en mutationsfrekvens. I praksis kan resultaterne være ganske variabel hvis der kun nul til fem mutantkolonier forventes fra befolkningens størrelse, og selv en lille stigning i befolkningens størrelse, således at fem til ti mutantkolonier forventes, i høj grad kan forbedre reproducerbarhed. Når biotinmærkning et udgangsmateriale befolkning, der skal tages hensyn til at identificere den korrekte populationsstørrelse nødvendigt at måle mutationsfrekvens i gamle mor celler genanvendelseseffektivitet for hver slags. Med 90% genvinding af mor celler efter hver slags, vil kun 59% af den oprindelige befolkning skal tilbagebetales efter fem runder af vækst og sortering. Dette falder til ~ 33% genopretning af den oprindelige population efter fem runder af vækst og sortering hvis kun 80% af de mærkede mor celler inddriveed under hver slags. Måling og maksimere genvinding er afgørende, når man måler frekvens begivenheder lave, da to-tre gange fald i befolkningens størrelse let kunne føre til upålidelige antal mutantkolonier pr befolkningen.
Der er mange muligheder for at udvide eller ændre denne protokol til at opnå en bredere forståelse af genom ustabilitet under mitotisk celle aldring. Simple eksempler omfatter at analysere, hvordan ændringer i gen-funktioner, ændringer medier eller andre miljømæssige tilstand ændrer ændrer akkumulering af mutationer med alderen. Mutationsrater for unge celler med ændrede gen-funktion eller i den relevante tilstand ville blive målt og bruges til at afgøre, om mutationer akkumuleres anderledes end forudsagt af bpm og anderledes end i kontrolgruppen cellepopulationer. Cellepopulationer på forskellige punkter under replikativ aldring kan blive udsat for bestemte stressfaktorer, såsom reaktive oxygenspecies eller DNA-ødelæggende midler. Enforbigående og mild eksponering for oxidativ stress, ikke væsentligt ændrer evnen til at udføre cellesortering (figur 3), men strengere spændinger kan komplicere genvinding af celler. Indledende forsøg ville være nødvendigt at kontrollere, at mor celler stadig kan inddrives effektivt efter specifikke belastninger. Derudover kan de cellulære egenskaber isolerede mor celler analyseret i detaljer, herunder niveauer af reaktive oxygenarter, mitokondrie og vakuolær morfologi og andre fysiologiske karakteristika, der er forbundet med aldring 3. Desuden kunne moderen cellerne være en begyndende befolkning for en yderligere behandling eller manipulation. Da mor og datter celler er fysisk adskilt under proceduren, er datter celler også stadig til rådighed for analyse. For eksempel ændringer i fysiologiske egenskaber døtreceller eller asymmetriske arv af beskadigede makromolekyler mellem gær mor og datter celler
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud R00AG031911 fra National Institute on Aging af National Institutes of Health til PHM Indholdet i denne artikel afspejler ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
- Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
- McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
- Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
- Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
- Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).
- Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
- Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
- Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
- Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
- Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
- Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).
