Summary
Mutation priser i unga Saccharomyces cerevisiae-celler mäts genom fluktuations- tester används för att förutsäga mutationsfrekvenser för moderceller av olika replikativa åldrar. Magnetisk sortering och flödescytometri används sedan för att mäta de faktiska mutationsfrekvenser och ålder på moderceller för att identifiera eventuella avvikelser från förutsagda mutationsfrekvenser.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae har varit en utmärkt modellsystem för att undersöka mekanismer och konsekvenser av genomet instabilitet. Information som erhålls från denna jäst modell är relevant för många organismer, inklusive människor, eftersom DNA-reparation och DNA-skada responsfaktorer är väl konserverad över olika arter. Emellertid S. cerevisiae har ännu inte använts för att till fullo ta itu med om graden av ackumulera mutationer förändringar med ökande replika (mitotiska) ålder på grund av tekniska begränsningar. Till exempel mätningar av jästreplika livslängd genom mikromanipulation innebära mycket små populationer av celler som förbjuder upptäcka sällsynta mutationer. Genetiska metoder för att berika för moderceller i populationer genom att inducera död dotterceller har utvecklats, men populationsstorlekar fortfarande begränsas av hur ofta slumpmässiga mutationer som äventyrar urvalssystemen uppstår. Den nuvarande protokollet utnyttjar magnetisk sorting utanpå märkta jäst moderceller för att få tillräckligt stora populationer av åldrande mor celler att kvantifiera sällsynta mutationer genom fenotypiska val. Mutationshastigheter, mätt genom fluktuations- tester och mutationsfrekvenser först upprättas för unga celler och användes för att förutsäga den frekvens av mutationer i moderceller av olika replikativa åldrar. Mutationsfrekvenser skall sedan bestämmas för sorterade moderceller, och åldern av modercellerna bestäms med användning av flödescytometri genom färgning med ett fluorescerande reagens som detekterar knopp ärr formade på sina cellytor under celldelning. Jämförelse av förutsedda mutationsfrekvenser baserat på antalet celldelningar till frekvenserna experimentellt observerats för moderceller i en given replika ålder kan sedan identifiera om det finns åldersrelaterade förändringar i graden av ackumulerande mutationer. Variationer av denna grundläggande protokoll ger möjlighet att undersöka hur förändringar i specifika genfunktioner ellersärskilda miljöförhållanden mutation ansamling ta itu mekanismerna bakom genomet instabilitet under replika åldrande.
Introduction
Mikroorganismer, såsom jästen Saccharomyces cerevisiae, är utmärkta modeller för att undersöka mutationshastigheter, men dessa modeller har inte utnyttjats fullt ut för att undersöka en ansamling av mutationer under mitotiska cellernas åldrande. Mutation ackumulering i det nukleära genomet har hypoteser för att bidra till åldrande genom att resultera i progressiv förlust av (eller variation i) genfunktioner 1. Möjligheten att använda ett mikrobiellt system för att studera de mekanismer och konsekvenser av mutations ackumulering under åldrandet kan kraftigt påskynda identifieringen av genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar denna process, på grund av facile genetiska systemen och hur lätt kvantifiera sällsynta fenotypiska förändringar i mikroorganismer. DNA-reparationsfaktorer och DNA skador svars proteiner är väl konserverad över skiftande art 2, och grundläggande likheter i organism åldrande har identifierats för organismer så olika som S. cerevisiae end däggdjur 3, vilket gör det troligt att resultaten från studier i jäst kommer att vara relevant för åldrande i många organismer.
Studier av åldrandet i S. cerevisiae använder sig av två åldrande modeller som mäter kronologiska åldrande eller replika åldrande celler. Kronologisk åldrande kännetecknas av progressiv förlust av livskraft i jäst cellpopulationer som befinner sig i en icke delande tillstånd (stationär fas) på grund av näringsämnen utarmning 3. Den kronologiska åldrande modellen har använts för att visa att mutationer ackumuleras med stigande ålder 4, eftersom stora cellpopulationer är lätta att få tag i denna modell för att utföra fenotypiska val för muterade celler. I det här fallet verkar mutation ackumulering påverkas av tillväxtsignalvägar och oxidativ stress 5, och var och en av dessa faktorer är relevant för förståelsen åldring i flercelliga eukaryoter 3. Den replikativa åldrandet modell utnyttjar den asymmetriska divisipå mellan S. cerevisiae mor och dotter celler för att undersöka åldrandet som sker med successiva cellgenerationer 3. Jäst replika åldrande har ofta mätts genom mikromanipulation av små populationer av mor och dotterceller, eller på senare tid, genom video mikroskopi av små populationer av jästceller i mikroflödessystem enheter 6,7. Begränsade populationsstorlekar gör dessa metoder dåligt lämpad för att undersöka mutation ackumulering under mitotisk åldrande, om inte hel-genomet information inhämtas från enskilda celler eller mycket högfrekventa genetiska förändringar mäts 8. Hel-genomet sekvensering av enskilda celler ger stora datamängder för att utreda mutation ackumulation, men fenotypiska selektionssystem har den viktiga fördelen att den ger en metod att mäta mutationshastigheter för att studera mekanismerna bakom mutation ackumulering. Studier för att undersöka mutationsfrekvenser och priser genom fenotypiska val i haploid jäststammar under replika åldrande har ännu inte rapporterats.
Mutationshastigheter är vanligen mätt med användning fluktuations- tester 9. Mutationsfrekvensen värden återspeglar det totala antalet celler som härbärgerar en mutation i en gen-sekvensen i en population. Detta innefattar celler där oberoende mutationer uppstår och varje avkomma av dessa celler som helt enkelt ärver redan existerande mutationer. Däremot mutationshastigheter mäts genom fluktuation tester representerar antal oberoende mutationer som nyligen uppstår med varje cell generation. Dessa tester vanligtvis att ympa många replikatodlingar vid låga celldensiteter att minska sannolikheten för att lägga till celler med redan existerande mutationer i en målsekvens, växande kulturerna till nära mättnad och identifiering av muterade celler genom odling på selektivt medium. Antalet muterade celler som identifieras i likadana populationer används sedan i en av flera matematiska modeller för att uppskatta antalet independent mutationer som uppstått under tillväxt 9. Vid jämförelse av antalet oberoende mutationer att den genomsnittliga befolkningen storlek ger ett mått på den mutationshastighet. I S. cerevisiae, mutationsfrekvenser och priser ofta mäts med hjälp av URA3 och CAN1 gener, eftersom bortfall av funktionen mutationer i dessa gener producerar valbara fenotyper. Förlust av URA3-funktion gör celler resistenta mot 5-fluoroorotinsyra (5-FOA), eftersom det protein som kodas av URA3 omvandlar 5-FOA i en toxisk molekyl 10. Förlust av funktion av CAN1 tillåter celler att bli resistenta mot kanavanin, en toxisk arginin analog, eftersom det protein som kodas av CAN1 transporterar arginin och kanavanin i celler 11.
Både genetiska och fysiska sorteringsstrategier har framgångsrikt använts för att erhålla större populationer av S. cerevisiae moderceller för att underlätta utredningar av replika åldrande. Genetiska strategier inkluderar smarta metoder som väljer mot dottern cellöverlevnad i en population. Mamman program för anrikning (MEP) involverar beta-estradiol induktion av Cre rekombinas uttryck bara i dotterceller, vilket leder till dottern specifik störning av två viktiga gener som var konstruerade för att innehålla loxP platser 12. MEP-stammar kan odlas normalt i frånvaro av induceraren, men endast de moderceller kommer att fortsätta att dela sig efter induktion, medan dotterceller kommer att gripa vid M-fasen typiskt under deras första progression genom cellcykeln 12. Även om detta system inte har använts för att i stort sett studera mutations ackumulering under åldrandet, har den använts för att studera förlust av heterozygositet, en relativt frekvent form av genomet instabilitet i diploida jäststammar, samt biokemiska förändringar i åldrande mor celler 13,14. På samma sätt innebär dotter-arrester systemet dotter specifikt uttryck av S. cereviSIAE URA3-genen 15. Dotter-Skyddssystem stammar växa normalt tills 5-FOA sättes till mediet, vid vilken punkt dotterceller som uttrycker URA3 kommer att dö, medan moderceller fortsätter att växa 15. Dessa är användbara system för att berika för moderceller, men de är beroende av underhåll av genfunktioner som utgör urvalssystemet. Slumpmässiga mutationer i en eller flera komponenter i det selektionssystem kan resultera i dotterceller som undgår valet och föröka sig exponentiellt. Under utvecklingen av MEP stammarna, lämpliga befolknings storlekar var fast besluten att undvika uppkomsten av muterade dotterceller som kunde fly valet 12. Men denna gräns i befolkningens storlek äventyrar upptäckt av sällsynta former av genomet instabilitet under replika åldrande. Denna begränsning av befolkningens storlek kan delvis övervinnas genom användning av diploida jäststammar med två kopior av varje gen bidrar till urvalssystemet, eftersom de flestamutationer skulle sannolikt vara recessiv 12. Men användningen av diploida stammar begränsar de typer av mutationshändelser som lätt kan detekteras jämfört med dem som lätt kan detekteras i haploida jästceller.
Fysisk sorteringsstrategier omfattar isolering av moderceller med en märkt cellytan från omärkta dotterceller att berika för stora populationer av moderceller. Observationen att cellytproteiner (cellväggsproteiner) i S. cerevisiae dotterceller är nysyntetiserade under knopp har utnyttjats för att märka moderceller utan märkning av dotterceller som de producerar 16. Till exempel kan en första population av jästceller märkta på deras yta med biotin odlas och isoleras sedan från deras dotterceller med användning av anti-biotin mikropärlor och magnetisk sortering 16 eftersom dottercellerna som genereras av den initiala populationen inte kommer att innehålla biotin på sin yta . Seriell tillväxt ochsortering låter progressivt äldre populationer av moderceller som ska erhållas och analyseras. Detta förfarande har använts framgångsrikt för att undersöka förändringar i cellfysiologi och genuttryck under replika åldrande jäst 13,14,17,18. Den nuvarande metoden anpassar denna biotin märkning och magnetisk sortering teknik för att anrika moderceller i syfte att mäta ackumulationen av potentiellt sällsynta mutationer eller andra former av genomet instabilitet analyserade genom fenotypiska val. Serie tillväxt och fysisk sortering tillåter analys av mutations ackumulering i progressivt äldre moderceller, liksom i deras dotter cellpopulationer. Bestämning av mutationshastigheter per generation tillåter en förutsagd mutationsfrekvensen beräknas för moderceller som har genomgått en viss antal celldelningar. Sedan förutsagda frekvensvärden är baserade på den förväntade ökningen på grund av ytterligare omgångar av celldelning, betydande avvikelser i de observerade Mutatipå frekvenser jämfört med förväntade värden ger belägg för åldersspecifika förändringar i graden av ackumulerande mutationer. Med hjälp av detta protokoll, kan fluorescerande färgning av knopp ärr som motsvarar områden av celldelningar på moderceller i kombination med analys med flödescytometri användas för att snabbt bestämma åldersfördelningen av sorterade och osorterade populationer. Ytterligare fluorescerande reagens, såsom de som används för detektering av reaktiva syreföreningar, kan också utnyttjas under detta protokoll. Sammantaget gör detta protokoll effektiv analys av åldersberoende förändringar i genomet instabilitet med potential för korrelation till åldersrelaterade cell fysiologiska förändringar i modellorganism väl lämpade för att studera de genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar åldersrelaterade genomet instabilitet.
Protocol
1 Beredning av media och lösningar
- Odla celler med användning av jästextrakt-pepton-glukos (YPD) rikt medium för standardprotokollet. Bered en 2% Bacto-pepton, 1% jästextrakt, 2% glukoslösning för YPD-medium och tillsätt 2% Bacto-agar för fast medium 19. Autoklavera för att sterilisera. Använd ett alternativt medium, om så behövs, för att testa en viss tillväxt skick eller mutant jäststam.
- Gör fast syntetiskt komplett medium som saknar arginin med 60 mg / L kanavanin (SC-arg + kanavanin) för att välja för kanavanin resistenta mutanter. Bered en lösning som är 0,67% bacto-jästkvävebas utan aminosyror, 2% glukos, 0,2% färdigt tillägg blandning utan arginin (dropout mix) och 2% bacto-agar 19. Autoklav och sval före tillsats kanavanin från en 20 mg / ml stamlösning (filtersteriliserad, förvarad vid 4 ° C) 19.
- Gör fast syntetiskt komplett medium innehållande 5-fluororotsyra (5-FOA). Bered 500ml av en lösning som är 1,34% Bacto-jästkvävebas utan aminosyror, 4% glukos, 0,4% komplett tillägg blandningen och 0,2% 5-FOA och filter-sterilisera 19. Autoklav 500 ml av en 4% bacto-agar lösningen, coola kort, och sedan blanda med 500 ml filtersteriliserad näringslösning. Använd lämplig alternativ media för andra mutationsanalyser.
- För biotin märkning, göra 500 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-lösning innehållande 137 mM natriumklorid, 2,7 mM kaliumklorid, 10,14 mM natriumfosfat, dibasiskt, och 1,77 mM kaliumfosfat dibasisk, pH 8. Lagra vid 4 ° C och hålla den is under användning.
- Gör en ny 5 mM biotin lager i sterilt, ultrarent vatten.
- För att släcka biotin märkning, göra 500 ml 1 x PBS, 100 mM glycin. Förvara vid 4 ° C och hålla på is under användning.
- Beroende på antalet celler som används och hela experimentet, göra 1-2 liter bead-märkning buffert innehållande 1 x PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine serumalbumin. Filtrera sterilisera och de-gas buffert. Förvara vid 4 ° C och hålla på is under användning.
- Bered en 0,4% lösning av trypanblått i 1x PBS, filtrera sterilisera, och förvara vid RT för användning i mätningar cellviabilitet.
- Alikvotera små volymer (~ 100 pl) av en vetegroddagglutinin (WGA) fluorescerande konjugat att lagra vid -20 ° C i folie inslagna (eller ogenomskinliga) mikrocentrifugrör för användning vid bestämning av cell ålder.
2 Fastställande av mutationsfrekvens och frekvens
- Upprätta en baslinje mutationshastighet per cell generation använder fluktuations- tester för celler som odlats under standardodlingsbetingelser. Grow sju till elva replikera en ml kulturer från en initial densitet av 1,000-5,000 celler / ml till tidig stationär fas (~ 10 8 celler / ml).
- För varje replikat kultur späds cellerna 1: 2000 och spred 1-4 | il på icke-selektivt medium (YPD) för att bestämma kolonibildande-enheter / ml. Pellets återstående celler vid ~ 2400 xg under 1 min i en mikrocentrifug och återsuspendera i 100 | il vatten för att spridas på selektivt medium för att identifiera mutanter. Inkubera plattorna under tre dagar vid 30 ° C före räkna kolonier (justera inkubationstid efter behov baserat på tillväxt av celler).
- Bestäm antalet oberoende mutationer (m) som inträffade i försöket utifrån antalet mutanta kolonier (r) som erhållits på selektivt medium. Använd Lea-Coulson median estimatorn att hitta m genom att ersätta median antalet mutanta kolonier för r i formeln nedan 9. Sedan ersätta värden för m tills den vänstra sidan av ekvationen är praktiskt taget noll.
- För att bestämma mutationshastighet, först beräkna det genomsnittliga antalet viabla celler spreds på selektivt medium genom att multiplicera den genomsnittliga kolonibildande-enheter / ml av de likadana kulturer och volymenav kultur i ml spridning på selektivt medium. Dividera m-värdet från steg 2.1.2 av detta genomsnittliga antalet viabla celler för att erhålla mutationshastighet per cellgeneration.
- Individuellt beräkna antalet livskraftiga celler utspridda på selektivt medium för varje replikat kultur i en rättegång som beskrivs i steg 2.1.3. Dividera antalet mutanta kolonier (R) som erhölls för en kultur med antalet viabla celler spreds på selektivt medium för att erhålla mutationsfrekvensen. Använd den genomsnittliga eller medianen av de enskilda mutationsfrekvenser från replikatodlingar i steg 2.1 som en baslinje mutationsfrekvens.
- Gör frekvensmätningar före och efter biotin märkning celler (steg 3.2 och 3.4) för att avgöra om märkningen steg resulterar i en förändring i frekvensen av mutationer som måste beaktas vid prövning av åldersspecifika förändringar i mutations ackumulering.
3 Biotin Märkning
- Stryt S. cerevisiae från en glycerol lager vid -80 ° C på YPD medium och inkubera vid 30 ° C under 1-3 dagar.
- Med hjälp av en steril pipett spets, överföra celler från strimma plattan till 1 ml (eller fler) vatten med tanke på att 1-1.5 cm av ett tjockt odlas del av strimman kommer att ge ungefär 10 8 celler. Bestäm exakt celltäthet med hjälp av en hemocytometer.
- Etikett 10 8 celler per stam (eller behandlingstillstånd) per uppsamlingsplats där mutationsfrekvensen kommer att fastställas eller en befolkningsstorlek som är tillräcklig för att få åtminstone 5-10 muterade kolonier per provtagning på selektivt medium (baserad på mutationsfrekvensen från steg 2,2). Inkludera ytterligare 10 8 celler för baslinjen mätningar per stam / skick.
- Biotin etikett enligt standardförfarande från tillverkaren, med undantag för ett 5 mM biotinreagens lager och försiktigt gunga under inkubationstiden. Spin i 5 minuter vid 4 ° C vid 3000 xg för alla centrifugeringssteg, sedan spinning vid temperaturer högre än 4 ° C kan leda till ökad cellförlust. Efter den slutliga tvätten, suspendera cellerna till en koncentration av 10 åtta märkta celler / ml i vatten.
- Kontrollera livskraft celler med användning av trypanblått-färgning. Späd 10 pl celler med 23 l vatten och 67 pl av 0,4% trypanblått i 1x PBS. Inkubera i minst 40 minuter vid rumstemperatur innan scoring levande (ofärgade) och döda (färgade) celler med hjälp av en hemocytometer.
- Mät utgångsvärden för genomet instabilitet, cell ålder och andra relevanta egenskaper (se avsnitt 5, 6 och 7).
- Överför biotinmärkta celler till 20 ml YPD-medium per 10 8 celler i en Erlenmeyer-kolv (ca 5 x 10 6 celler / ml). Väx kultur (er) 16-18 h vid 20 ° C till en ungefärlig densitet av 10 8 celler / ml (4-5 cell generationer), men inte tillåter celler att nå stationär fas. Använd en kortare inkubationstid för tillväxt vid 30 ° C. Håll biotinmärkt calnar vid 4 ° C i upp till flera timmar före tillsats till mediet, om så behövs för att optimera timingen för tillväxtperioden och samling.
4. Bead Märkning och Magnetic Sortering
- Efter tillväxtfasen, späda en alikvot av kulturen för att bestämma celldensitet med användning av en hemocytometer. Pelletera celler genom centrifugering under 5 min vid 4 ° C vid 3000 x g. Häll bort supernatanten.
- Tvätta cellerna genom att vortexa att avbryta pelleten i 30 ml buffert bead-märkning, därefter centrifugering och hälla bort supernatanten som i avsnitt 4.1. Upprepa tvätt.
- Fullt suspendera cellerna i 50 pl buffert bead-märkning per 10 8 totala celler genom skakning. Tillsätt 2 l magnetiska kulor per 10 8 totala celler och skaka snabbt att blanda. Inkubera på is i 10 minuter, vända jämna mellanrum för att blanda (modifierad från en online-protokoll på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
- Tvätta cellerna tre gånger med 30 ml buffert vulst-märkning.
- Tillsätt 0,5 ml bead-märkning buffert per 10 8 totala celler och kort virvel pellet på medium inställning bara tills cellerna suspenderas. Häll genom ett 40 | im cellfilter in i ett 50 ml rör för att avlägsna eventuella kvarvarande cellklumpar. Vid behov lämnar cellerna på is i 1-2 timmar innan de laddas i kolonnen.
- Följ tillverkarens rekommenderade protokoll för de magnetiska kolonner för att binda, tvätta och eluera de magnetiska bead-märkt moderceller. För ökad återvinning av märkta celler, använda åtminstone en kolumn per 2 x 10 9 celler totalt.
- Ta bort eventuella bubblor som uppstår vid lastning kolumner, eftersom de kommer att blockera flödet. Ta bort och byt kolumnen till avgränsare mellan tvättarna för att förhindra att celler från att bli instängd mellan pärlorna (modifierade från en online-protokoll på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
- Save flöda igenom från bindande och tvättningssteg för att analysera unga celler som producerats av de moderceller, om så önskas. Koncentrera celler som beskrivs i steg 4.7.
- Använd flera kolumner separatorer för bearbetning av flera prover på en gång. Driv flera kolumner av samma prov i samma provrör för att minska hanteringstiden och minska förlusten av celler.
- Koncentrera eluerade moderceller genom centrifugering vid 3000 xg under 5 min vid 4 ° C. Aspirera alla utom 1 ml buffert per 10 8 ursprungliga biotinmärkta celler. Kort Vortex att avbryta cellerna i återstående buffert.
- Späd en alikvot av celler och färgas med trypanblått för att bestämma celltäthet och cellviabiliteten med användning av en hemocytometer (se steg 3.5). Beräkna det totala antalet celler som återvunnits.
- Om antalet celler är väsentligen högre än förväntat, passera elueringen provet genom en annan kolonn för att försöka ta bort kontaminerande unga celler.Om antalet celler är betydligt lägre än väntat, passera den sparade flödet genom provet genom en annan kolumn för att försöka förbättra utbytet av moderceller.
- Använd celler för vidare analyser, som beskrivs i avsnitt 5 och 6 kan också odla cellerna i YPD buljong igen för att öka sin replika ålder (steg 3.7) och följ med pärla märkning och sortering (steg 4.1-4.8.1), utan behöva upprepa biotinmärkning.
5. Fastställande av Replikativ Age
- Snurra cellerna i 2 min vid 5000 xg vid RT för alla steg i det här avsnittet. Sätt 25 | il av återvunna celler (~ 10 8 celler / ml) i ett 1,5 ml centrifugrör och tvätta två gånger med 1 ml 1 x PBS. Sug bort supematanten.
- Tina en delmängd av WGA-konjugat, virvel blanda och snurra kort för att eliminera proteinaggregat. Suspendera cellerna i 180 ^ il 1 x PBS och 20 pl av WGA konjugerade till en fluorescerande molekyl för att märka knopp ärr på ytan av the celler. Täck 1,5 ml centrifugrör med folie och inkubera med försiktig gungning vid 30 ° C under 30 min.
- Tvätta tre gånger med 1 ml 1X PBS.
- För fluorescensmikroskopi, etikett diabilder och montera per standardprotokoll genom att använda ett anti-fade medel. Fullt bota glasen i mörker (upp till några dagar) innan tätning täck att undvika cellrörelse under avbildning. Räkna knopp ärr på åtminstone 50 celler per prov för att erhålla ett representativt mått på cell ålder. Lagra bilder för upp till 1 månad för visning knopp ärr, om det behövs.
- Alternativt bestämma intensiteten av den fluorescerande signalen från WGA-konjugatet genom att utföra flödescytometri på celler suspenderade i 1 ml 1 x PBS efter steg 5.1.2. Använd en 405 nm excitation laser och 530/30 nm emissionsfilter med en 505 nm långpassfilter för WGA-Alexa 488 Inkludera en ofärgade kontroll för varje insamlingsplats.
- Diagram knopp ärr på unga celler och åldern räknade celler i mikroskop påy-axeln mot normaliserade geometriska medelvärdet (målat geometriskt medelvärde / ofärgade geometriskt medelvärde) i WGA-konjugat fluorescens från samma cellpopulationer på x-axeln. Erhåll ekvationen för en linjär trendlinje för detta förhållande. För efterföljande experiment, ersätta den normaliserade geometriska medelvärdet av WGA-konjugat fluorescensintensiteten hos en cellpopulation för x i ekvationen och lösa för y för att fastställa den genomsnittliga cellålder ett prov.
6. Mutation Frekvens
- Spread sorterade moderceller suspenderade i buffert från steg 4,7 på YPD medium och selektivt medium som beskrivs i steg 2.1.1. Använd 1 ml resuspenderade moderceller för selektiva medium och spin-celler vid 5000 xg under 1 min.
OBS: Sprid större volymer av utspädda celler på YPD-medium som celler ökar i ålder för att kompensera för allt fler olönsamma och åldrande celler i äldre befolkningar.- Inkubera YPD medium och selektiva medel plattor frånsteg 6,1 vid 30 ° C under tre och fyra dagar, respektive. Öka inkubationstid på upp till en vecka för mycket gamla celler eller långsamt växande raser. Beräkna mutationsfrekvens som beskrivs i steg 2.2.
7 Beräkning Predicted mutationsfrekvensen för en tanke Replikativ Age
- Beräkna den genomsnittliga ökningen av replika ålder biotinmärkta celler under loppet av experimentet genom att subtrahera den genomsnittliga åldern för den initiala cellpopulation från den genomsnittliga åldern på de sorterade moderceller för den aktuella sorten. Använd cell åldrar beräknats i steg 5.2 eller steg 5.2.2.
- Multiplicera mutationshastighet som erhålls i steg 2.1.3 av ökningen av medelcellåldern beräknats i steg 7.1. Lägg detta värde till baslinjen mutationsfrekvensen för den initiala populationen beräknas i steg 2.2 för att bestämma den förväntade mutationsfrekvensen för celler i den relevanta replika ålder.
Representative Results
Ett flödesschema i figur 1 visar de övergripande stegen i förfarandet, inklusive de punkter där mutationshastigheter, frekvenser och cell ålder mäts. Noggrant fastställa frekvensen och graden av mutationer (eller annan form av genomet instabilitet) i unga cellpopulationer är ett viktigt första steg, eftersom det är nödvändigt för att välja en lämplig befolkningsstorlek för märkning och magnetisk sortering. Kan fastställas Rate värden med hjälp av fluktuation tester 9. Exempel resultat jäststammar i BY4741 genetisk bakgrund 20 ut för att mutationer i CAN1 genen som förlänar kanavanin resistens eller mutationer i URA3-genen som ger resistens mot 5-FOA visas i figur 2. Cellerna odlades vid 20 ° C för representativa rate experiment, och vid 20 ° C och 30 ° C för representativa frekvens experiment. Dessa temperaturer användes eftersom initiala cellpopulationer som odlasvid 30 ° C, odlades sedan vid 20 ° C under de efterföljande representativa sorteringsexperiment. Frekvensvärden från oberoende studier var jämförbara för den initiala cellpopulation och cellerna efter biotin märkning av en stam som har CAN1 genen vid sin normala plats på kromosom V, ca 32 kilo par från vänster arm telomeren ( www.yeastgenome.com ) ( Figur 2A, lavendel kolumner). Mutationen hastigheten CAN1 var väsentligt högre i initiala populationer av en andra jäststam som har en deletion av CAN1 genen från dess normala läge på kromosom V och en insättning av CAN1 på högra armen av kromosom VIII ungefär 25 kilobaspar från telomeren 21 (Figur 2B). CAN1 gen mutationsfrekvenser var också jämförbara för initiala cellpopulationer och biotin märkta celler vid antingen tillväxttemperatur (Figur 2A, blå kolonner). Emellertid mutationsfrekvenser erhålles vid 20 ° C befanns vara högre än mutationsfrekvenser vid 30 ° C. För att testa om detta temperatureffekten begränsades till CAN1 genen, mätte vi mutationer i URA3 genom att välja för resistens mot 5-FOA hjälp av jäststam som har CAN1 insatt på kromosom VIII. Denna stam har också en strykning av URA3 från sin normala plats på kromosom V och en insättning av URA3 på rätt armen av kromosom VIII cirka 40 kilo par från telomeren 21. Mutationsfrekvenser var också högre vid 20 ° C under URA3 vid denna kromosomalt läge (figur 2C). Sammantaget visar detta att tillväxttemperaturen kan påverka frekvensen av mutationer, men biotinmärkning tycks inte påverka mutationsfrekvensen. Därför mutationshastigheter och frekvenser för inledande populationer måste fastställas vid samma tillväxt temperatur som kommer att användas för omgångar av tillväxt och sortering. Det är lämpligt att kontrollera att biotinmärkning påverkar inte genomet instabilitet innan du använder protokollet för att undersöka andra typer av mutationer eller genom omdisponeringar.
Som förväntat mutationsfrekvensen värden som visas i figur 2A är flera gånger lägre än motsvarande mått på frekvensen. Denna skillnad beror på att mutationshastighet mäter utseendet av celler med nya mutationer med varje omgång av celldelning, medan mutation frekvens åtgärder det kumulativa antalet mutanta celler i populationen vid slutet av tillväxtperioden. De priser och 95% konfidensintervall för dessa studier visar att reproducerbara resultat kan uppnås med hjälp av sju replikatodlingar per rättegång, vilket är det minsta antalet replikat föreslås för detta protokoll.
När de initiala frekvens och frekvensvärden bestäms bör en befolkningsstorlek vara chosen som säkerställer att lämpliga celler är närvarande efter flera omgångar av sortering för att tillförlitligt bestämma mutationsfrekvenser. Sätta etikett på en befolkning på 10 8 celler per tidpunkt som skall analyseras under åldrandet är lämpliga när frekvenser och priser liknar de som visas i figur 2A. Beslutet beror också på hur effektivt märkta mamma celler återvinns efter varje omgång av sortering. Effektiviteten för att återvinna märkta moderceller kan snabbt och enkelt utvärderas genom att använda en hemocytometer för att bestämma antalet celler som eluerats från kolonnerna för varje sort och att undersöka cellmorfologin. Två huvudpunkter belyses genom exempel återhämtning effektivitetsdata (Figur 3A): de utvunna antal celler kan visas högre än väntat efter den första sortera, och en liten progressiv förlust av celler förväntas med fortsatt sortering. Ju högre än förväntat antal celler i vissa experiment efter den första sorterings kunde result från märkning av knoppar på celler i den initiala populationen. En jästcell med en knopp skulle normalt görs som en enda cell vid fastställandet av antalet celler att märka med biotin. Märkning av knoppar som finns i den ursprungliga befolkningen, men skulle göra det möjligt för celler som utvecklas från dessa knoppar som också behållas på pelare under sorteringen. Inverkan av denna händelse på bestämning av återvinningseffektiviteten beror på den fraktion av okulerade celler i den ursprungliga cellpopulationen. En andra möjlig orsak till det högre antalet celler efter sort man är att det tenderar att vara mer stora okulerade celler vid denna tidpunkt som kan fylla celldelning under sorteringen. Som ett resultat kan stora knoppar fortfarande knutna till deras moderceller sorteras men sedan visas som distinkta celler när de eluerade cellerna undersöks. Medan en viss förlust av celler observeras med varje omgång av tillväxt och sortering, kan protokollet resultera i tillförlitlig kvarhållning av 80 till 90% av cellerna efter varje omgång av arorting. Det är värt mödan att öva förfarandet för att se till att 80% eller fler av de märkta cellerna isoleras för att undvika behovet att märka en onödigt stor initial cellpopulation. Behandling av celler med en mild stress efter den första sort (1 mM väteperoxid i YPD medium för 30 min) hindrade inte effektiv återvinning av celler med fortsatta rundor av tillväxt och sortering, även om det fanns vissa variationer i tillfrisknandet för första sortera efter stress (figur 3A).
Inspektion av cellmorfologin och livskraft är också användbara både för att bekräfta lyckad isolering av moderceller och för justering av spädningar / volymer som används vid spridning celler på icke-selektivt medium för att bestämma tätheten av kolonibildande enheter. Mother celler blivit allt större och mer oregelbundet formade när de åldras, jämfört med dotterceller (Figur 3B). De mor cellprover bör därför i första hand bestå av stora, irregularly formade celler eftersom experimentet fortskrider genom varje omgång av sortering. Förekomsten av många små ovala celler av regelbunden form skulle kunna tyda på att moderceller ännu inte tillräckligt långt bort från dotterceller. Livskraft stamceller bör även successivt sjunka med varje omgång av växande och sortering, även om det kanske inte mycket förändring under de första 5-10 cellgenerationer. Antalet celler med förmåga att bilda kolonier kan minska mycket mer dramatiskt än antalet celler som bestämts vara livsduglig genom någon form av direkt färgning för cellernas integritet, på grund av bildningen av åldrande celler. När livskraften genom en direkt färgningsmetod först börjar att minska (ca 80% eller mindre), kan det vara nödvändigt att justera spädningar och volymer som används för att mäta kolonibildande enhet densiteter i väntan på en mer dramatisk minskning i förmågan hos viabla celler att bildar kolonier (ett två till flera gånger minskning).
Denreplikativa åldrarna de sorterade populationerna och kontrollpopulationer måste fastställas före mutation frekvensdata från moderceller kan analyseras för åldersspecifika förändringar i graden av ackumulerande mutationer. Detta kan åstadkommas genom manuell räkning av knopp ärr på moderceller (Figur 4) eller genom flödescytometri för att kvantifiera signalen för linda ärr detektionsreagens (Figur 5). Bud ärr kan märkas med relativt låg bakgrundssignal med användning av WGA-fluorescent konjugat (figur 4C). Figur 4A visar att de flesta celler från flödet genom prover av sorteringsproceduren har noll eller en knopp ärr. Cellerna elueras från kolonnerna är oftast i åldern moderceller (figur 4B och 5). Typiskt> 90% av eluerade celler är stamceller, som kan ses mer lätt från flödescytometri resultatet i Figur 5. Celler med relativt få knopp ärr (<6) OBTained efter mer än två omgångar av sortering kunde representera kontaminerande cellerna som inte var biotinmärkt som genomgick några omgångar av celldelning under den aktuella omgången av tillväxt, i motsats till moderceller som delar sig mycket långsamt. Variationen i cellåldern kan öka med efterföljande omgångar av sortering om inte alla celler i populationen växer likformigt.
En större cellpopulation kan användas snabbare att utvärdera cell ålder om ett linjärt förhållande etableras mellan WGA-fluorescens signalintensiteter och antal knopp ärr per cell. För denna analys är normalisering av alla WGA-fluorescens signalintensiteter kommas genom att dividera signalen av färgade celler av den signal som erhålls för lämplig ofärgade cellpopulation (dotter eller mamma) att ta hänsyn till ökad bakgrunds fluorescens i de äldre cellerna. Figur 4 och 5 visar analys av samma representativa cellpopulationer.Manuell räkning etablerat genomsnittliga replikativa åldrarna 0,95 och 11,4 för dottercell (Figur 4A) och mor cellpopulationer (Figur 4B), respektive. Normaliserade WGA-signaler för dessa två populationer och de tre tilläggs populationer (genomsnittliga åldern 3,0, 6,9 och 14,4) avsattes mot det genomsnittliga antalet knopp ärr för varje population (figur 5B). Denna linjärt förhållande kan sedan användas med samma stam och reagenser i framtida experiment för att bestämma genomsnittlig cell ålder från den normaliserade WGA-signal som erhålls genom flödescytometri, möjliggör snabb och noggrann bestämning av cell ålder. Kontrollpopulationer bör ändå tas för att kontrollera liknande färgnings effektivitet mellan försöken.
Tidens påverkan på ansamling av mutationer kan behandlas så snart de tidigare stegen att erhålla mutationshastighet värden, effektivt sortera celler och bestämma cell åldrar uppnås. Den number av tidpunkter vid vilken frekvensen kan bestämmas beror på storleken av den biotinmärkt cellpopulationen och antalet celler som måste spridas på selektivt medium för att erhålla tillförlitliga resultat. Om mutationsförändringar med åldern, då de observerade mutationsfrekvenser för åldrande mor celler bör skilja sig från de som förväntas enbart bygger på ytterligare omgångar av celldelning. Jämförelse av det observerade mutationsfrekvensen med den förutsagda mutationsfrekvensen kan identifiera åldersrelaterade skillnader i hastigheten för ackumulerande mutationer. Som beskrivs i avsnitt 7 i protokollet, kan den förväntade frekvensen erhållas från produkten från baslinjen mutationshastighet för den första cellpopulation och ökningen av replika ålder av moderceller läggs till i mutationsfrekvensen för den ursprungliga befolkningen. Ökningar i CAN1 mutationsfrekvensen har observerats med ökad genomsnittlig cell ålder i en stam med CAN1 vid dess normala läge på kromosom V(Figur 6A) och i en stam med CAN1 på högra armen av kromosom VIII (fig 6B). Eftersom de observerade mutationsfrekvenser för moderceller i figur 6A liknar eller strax under de förväntade frekvenserna, behöver uppgifterna inte lämnat några bevis för en åldersspecifik förändring av mutationshastighet. Däremot mutationsfrekvenser för moderceller av stammen med CAN1 på kromosom VIII var högre än de förväntade frekvenserna (figur 6B). Observera att de förväntade frekvenserna i diagrammet inte verkar öka väldigt mycket eftersom en logaritmisk skala måste användas för y-axeln på grund av den stora ökningen av observerade mutationsfrekvensen. Därför resultaten i figur 6B tillhandahåller lagen för en åldersspecifik ökning av graden av ackumulerande mutationer. Skillnaden i resultaten för de datauppsättningar i figur 6A och 6B är sannolikt på grund av den diffe hyra genomiska platser för CAN1. Dessa typer av observationer ger en utgångspunkt för att utveckla hypoteser för att studera mekanismer som påverkar mutationshastigheter som celler ålder och att utveckla modeller för att förklara mutation ackumulering med replika åldern.
Figur 1 Flödesschema över den övergripande förfarandet för undersökning av mutation ackumulering under jästreplika åldrande. Svart text och pilar anger viktiga steg i proceduren. Den böjda pilen visar att ytterligare rundor av återväxt och sortering av samma celler används för att erhålla progressivt äldre celler. Lila pilar och texten anger steg där de angivna mätningarna görs. Freq - frekvens.
upload / 51850 / 51850fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2 Fastställande av mutationsfrekvens och hastighet hos unga cellpopulationer. (A) Mutanta kolonier selekterades genom att sprida cellerna på SC-arg + kanavanin mediet för att selektera för förlust-av-funktion mutationer i CAN1 genen och jämfört med det totala antalet viabla celler spreds på selektivt medium för att beräkna frekvenser / priserna. Celler från initiala populationer före biotin märkning (IP) eller efter biotin märkning (PB) odlades med hjälp YPD medium från en initial densitet av 5.000 celler / ml till nära mättnad. Lavendel kolumner visar mätningar ränta och blå kolumnerna representerar frekvensmätningar som gjorts vid angivna temperaturer (20 ° C och 30 ° C). Set av sju replikatodlingar odlades för varje försök och 2-5 oberoende försök utfördes. Individuella hastighetsvärden som beräknats för oberoende studier visas, och felstaplar för dessa studier utgör 95% konfidensintervall bestämmerd använda en online kalkylator 22. Frekvenser representerar medelvärden och standardavvikelser. (B) CAN1 mutationshastigheter erhållits och representeras som beskrivits för en del A med hjälp av en stam med CAN1 på höger armen av kromosom VIII. (C) Mutation frekvenser som erhålls efter valet för muterade kolonier på 5-FOA använder en stam med URA3-genen ligger på högra armen av kromosom VIII. Metoder var i övrigt som för del A och medelvärden och standardavvikelser för tre eller fyra oberoende studier visas.
Figur 3 Exempel sorteringseffektivitet bestäms genom att beräkna antalet eluerade celler efter varje omgång av sortering. (A) Det totala antalet celler i varje start population efter biotinmärkning var inställd på ett, och t otal antal celler som föreligger i de eluerade proverna från varje omgång av magnetisk cellsortering delades av dessa initiala värden för att erhålla den fraktion av märkta celler. Totala cellantal bestämdes från cellräkningar som erhålls med användning av en hemocytometer. Orange kolumner representerar medelvärdet och standardavvikelse för tre oberoende studier enligt standardprotokoll. Blå kolumner representerar medelvärdet och standardavvikelsen för två oberoende studier där cellerna behandlades med 1 mM väteperoxid i 30 minuter direkt efter första slaget. (B) Storlek och morfologi av celler efter biotin märkning (post-biotin) och moderceller återhämtade sig efter den tredje omgången av magnetisk sortering (sorterings 3 moderceller) visas med standard ljusfältsmikroskopi och 20X objektiv. Vita linjer i bakgrunderna är de linjer som avgränsar de synliga på en standard hemocytometer minsta torg.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Fastställande av replika ålder med manuell knopp ärr räkning. Konfokalmikroskopi användes för att räkna knopp ärr på enskilda celler märkta med en WGA-fluorescerande konjugat (excitation vid 488 nm och detektion med 458/543 nm bandpass och 505 nm lång passning filterkombination). (a) manuell knopp ärr räkningar av celler från flödet genom (dotterceller) efter den tredje omgången av magnetisk sortering (n = 62). (B) Manuell knopp ärr räkningar av eluerade celler (moderceller) genom att följa tredje omgången av magnetisk sortering (n = 54). (C) Mor celler behålls efter den tredje omgången av magnetisk sortering fotograferas med hjälp av en 63x oljeimmersionsobjektiv med 3X zoom efter färgning witha WGA-fluorescerande konjugat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Bestämning av replikativ ålder med hjälp av flödescytometri. Prover av 10.000 celler färgade med en WGA-fluorescent konjugat analyserades genom flödescytometri med användning av excitation vid 488 nm och detektion med en 530/30 bandpass och 505 långpassfilteruppsättning. (A ) Histogram som visar antalet celler med specifika WGA-fluorescensintensiteter för en dottercell population eller eluatet (moderceller) efter tre rundor av magnetisk sortering. Populationer motsvara de som analyserades i fig 4. Blue vertikala linjerna anger den motsvarande positionen för den största delen av daughter celler på modercellen histogrammet. (B) Den normaliserade geometriska medelvärdet för fluorescenssignal för varje population som visas i A och ytterligare tre population av celler (medelålder 3,0, 6.9 och 14.4) beräknades som förhållandet mellan det geometriska medelvärdet av de färgade cellerna och det geometriska medelvärdet av den lämpliga ofärgade cellpopulationen. Dessa värden är avsatta i jämförelse med det genomsnittliga antalet knopp ärr för respektive totala populationen (figur 4 och data visas ej). Värde R2 för trendlinjen av denna jämförelse ges i diagrammet.
Figur 6 Jämförelse mellan förutsedda och observerade mutationsfrekvenser under replikativa åldrandet. Celler med mutationer i CAN1 genen selekterades såsom beskrivits för fig 2 using stammar med CAN1 på sin normala plats på kromosom V (A) eller på höger armen av kromosom VIII (B). Celler odlades på fast medium vid 30 ° C före biotinmärkning och vid 20 ° C därefter. Observerade frekvensvärden visas med orange kolumner (OBS) och förutspådda frekvenser för åldrade celler visas med bruna kolonner (Pre). Den första kolumnen för varje diagram visar medelvärdet och standardavvikelsen för den inledande mutationsfrekvensen efter biotinmärkning för fyra oberoende försök (PB). Siffrorna under kolumnerna anger det genomsnittliga antalet knopp ärr för varje population (Cell Age). Oberoende förutsagda värden bestämdes som beskrivs i avsnitt 7 i protokollet att använda var och en av de initiala hastighetsvärden som visas i figur 2A (IP kolumner) och 2B. Dessa oberoende värden sedan medelvärdet. Observerade värden är medelvärden av tre försök. Felstaplar anger standardavvikelse.
Discussion
Detta protokoll kombinerar flera metoder för att aktivera resurser och metoder finns i Saccharomyces cerevisiae modellsystem som skall tillämpas på ett effektivt sätt till studiet av genomet instabilitet under mitotiska cellernas åldrande. Ett brett utbud av analyser för att kvantifiera olika former av genomet instabilitet genom fenotypisk selektion skulle kunna kombineras med magnetisk sortering undersöka tänkbara åldersspecifika förändringar i ansamling av särskilda former av mutationer eller kromosomrearrangemang. Även hel-genomet sekvense metoder skulle kunna ge mer information om de övergripande typer av förändringar som sker i ett genom med ålder, möjlighet att använda fenotypiska selektionssystem för att få mätningar mutationsfrekvens och att företrädesvis isolera specifika typer av genetiska förändringar är viktiga fördelar för att studera mekanistisk aspekter av åldrandet relaterade genomet instabilitet. Effektivisering bestämning av cell ålder och potential att göra parallella mätningar av physiological förändringar genom flöde ger cytometry effektivt sätt att korrelerar genomet instabilitet med andra cellulära förändringar under specifika åldersintervall. Fastställande av potentiella åldersberoende förändringar i andelen ackumulerande mutationer kräver: 1) noggrann bestämning av priser i unga cellpopulationer, 2) noggrann bestämning av cell ålder och 3) förmåga att på ett tillförlitligt sätt berika tillräckligt stora populationer av moderceller att reproducerbart mäta genomet instabilitet i ålderdomen. Detta tillvägagångssätt gör jästen modellsystem för att bidra till att definiera underliggande mekanismer som ansvarar för åldersberoende förändringar i priser och / eller frekvenser av genomet instabilitet i mitotiskt aktiva celler. Dessutom kan genetiska och miljömässiga faktorer snabbt bedömas för bidrag till åldersberoende genomet instabilitet. I slutändan kan dessa beskrivningar leda till utveckling av modeller som står för det sätt på vilket mutationer ackumuleras under replika åldrande.
Denna metod är beroende av förmågan att detektera mutationer eller andra typer av genomet instabilitet genom uppkomsten av valbara fenotyper för att mäta andelen sådana händelser. Däremot kan kreativitet i analys designen tillåter många aspekter av genomet instabilitet som skall undersökas. Exempelvis kan URA3- och CAN1 generna placeras på olika genomiska platser för att testa eventuella influenser av genomisk plats på resultat. Återgång av specifika icke-funktionella gen alleler för funktionell gen alleler kunde testa särskilda mutationsprocesser. Dessutom kan införandet av ett flertal inaktiva alleler av en gen eller flankerar en gen med upprepningssekvenser användas för att undersöka rekombinationshändelser genom restaurering eller förlust av genfunktion, respektive. Fluktuationer tester är standardförfarandet för att fastställa priser för dessa olika genomet instabilitet evenemang 9. Protokollet är skriven med hjälp av väl accepterade och relativt okomplicerad Lea-Coulson median estimatorn att bestämma mutatakt för att göra den mer tillgänglig för olika forskare, trots att MSS-maximum likelihood estimator metod anses vara den bästa metoden för att bestämma mutationshastigheter 9. MSS-maximum likelihood estimator har tidigare granskats i detalj 9, och kan användas som en alternativ metod, men kräver mer avancerade beräkningar. Alternativt har fri programvara för att beräkna mutationshastigheter med denna metod gjorts tillgängliga 22. Att få reproducerbara mått på mutationshastigheter kräver uppmärksamhet på några aspekter av experimentell design, bland annat med hjälp tillräckliga replikatodlingar, ympa kulturer vid låga nog initiala celldensiteter att befolkningsstorleken ökar med 10.000-faldig eller mer, och välja lämpliga kulturvolymer så att hela population av celler kan spridas på selektivt medium. För den senare punkten, kan en tidigare beskriven formel användas för att justera den mutationshastighet baserad på den fraktion av kultur tested 9. Variation i tillväxttakten av kulturer kan försvåra fastställandet av en reproducerbar mutationshastighet, och en modifierad median baserad estimator som kan ge mer reproducerbara resultat i sådana situationer har nyligen beskrivits 23.
Förmågan att noggrant mäta cell ålder är en annan faktor som är viktig för att fastställa om genomet instabilitet frekvenser i gamla celler skiljer sig från de värden som förväntas på grund av graden av händelserna i unga celler. Vi har hittat WGA färgning att föredra att kalkofluorvit färgning, både vad gäller bakgrund och flexibilitet, eftersom WGA finns konjugerad till olika fluorescerande molekyler. Denna flexibilitet kan ge fler möjligheter för samtidig mätning av andra cellegenskaper med fluorescerande reagenser. Inledande arbete för att upprätta en förbindelse mellan signalintensitet för WGA färgning och motsvarande antal knopp ärr på cellerna kan sedan leda till en mersnabb bestämning av cell ålder genom flödescytometri. Detta tillvägagångssätt möjliggör också användning av större befolkningsstorlekar än vad som normalt granskas av mikroskopi för bättre reproducerbarhet mätningar. Medan alla åldersbestämningar kan göras genom mikroskopisk undersökning av cellerna, anser vi att flödescytometri metod underlättar snabb screening av faktorer som påverkar åldersberoende genomet instabilitet.
Förutom att mäta cell ålder tillförlitligt, måste hänsyn tas till det antal celldelningar moderceller tillåts genomgå med varje successiv runda växa och sortera celler. Användning av en mindre initial population storlek eller större odlingsvolym kan tillåta celler att genomgå fler celldelningar innan den når önskad celltäthet. Exempelvis har andra forskare använt endast två rundor av sortering för att erhålla mycket gamla jästceller 16, som har den uppenbara fördelen av att erhålla gamla celler med färre experimental steg. När kommissionen överväger att öka odlingsvolym för att låta cellerna att slutföra fler celldelningar före sortering, tänk på gränsen för det totala antalet celler som kan behandlas i en enda kolumn. Användning av en större kulturvolym kan göra det nödvändigt att använda flera kolumner för att sortera en cellpopulation. Dessutom, om cellerna genomgår färre omgångar av celldelning mellan sorterar / insamlingspunkter, då det finns fler möjligheter att observera avvikelser från förväntade mutationsfrekvenser vid olika tidpunkter under livslängden. Till exempel kan provtagning endast vid tidiga och sena tidpunkter under livslängden fram uppgifter som tyder på en stadig ökning av mutationsfrekvensen, men provtagning vid ytterligare mellantider under livslängden kan visa att mutationsfrekvensen ökar snabbt och sedan planar ut. Eftersom detta protokoll isolerar gamla moderceller, finns det en möjlighet att få en mer direkt mått på förändringar i mutationshastigheter med åldern. Fluktuationer tester kunde be utfördes med användning av moderceller i olika åldrar för att bestämma huruvida mutationshastighet kommer att skilja sig från den hastighet som erhålls med användning av unga celler. Medan kulturer för dessa fluktuations- tester kommer att bli en blandning av gamla och unga celler när de växer, kan eventuella avvikelser från hastigheter erhållna startande med unga celler tillskrivas användningen av en äldre startpopulationen.
Förmågan att reproducerbart erhålla en tillräckligt stor population av åldrade moderceller för att noggrant mäta genomet instabilitet är kritisk för framgången med detta tillvägagångssätt. Medan protokollet beskriver användningen av en särskild magnetisk sorteringssystem för detta ändamål, har andra grupper sorterat jästmoderceller med alternativa system 14,18 (se tabell of Materials). Sådana alternativa system bör också arbeta med denna metod, även om vissa optimering av tillverkarnas protokoll skulle krävas. Oavsett det specifika system som används, befolkningsstorlek kräverd varierar beroende på hur ofta den typ av mutation eller genomet ombildning valts för studien. Vid minst måste det finnas tillräckligt med moderceller för att få åtminstone en mutant koloni per invånare för att beräkna en mutationsfrekvens. I praktiken kan resultaten vara ganska varierande om endast noll till fem muterade kolonier väntas från befolkningsstorlek, och till och med en liten ökning av befolkningsstorleken, så att 5-10 muterade kolonier väntas, i hög grad kan förbättra reproducerbarhet. När biotinmärkning en utgångspopulation, återvinningseffektiviteten för varje sort måste tas i beaktande för att identifiera en lämplig befolkningsstorleken nödvändigt att mäta mutationsfrekvensen i gamla moderceller. Med 90% återvinning av moderceller efter varje sort, skulle bara 59% av den ursprungliga populationen återvinnas efter fem omgångar av tillväxt och sortering. Det sjunker till ~ 33% återvinning av den ursprungliga befolkningen efter fem omgångar av tillväxt och sortering om bara 80% av märkta moderceller återed under varje sort. Att mäta och maximera återvinningen är avgörande när mätning av låga händelser frekvens, eftersom en 2-3 gångers minskning av befolkningsstorleken lätt kan leda till otillförlitliga antal muterade kolonier per invånare.
Det finns många alternativ för att utöka eller ändra detta protokoll för att få en bredare förståelse av genomet instabilitet under mitotiska cellernas åldrande. Enkla exempel är att analysera hur förändringar i genfunktioner, förändringar media, eller andra förändringar miljö skick förändrar ansamling av mutationer med åldern. Mutation priser för unga celler med förändrade genen funktion eller i lämpligt tillstånd skulle mätas och användas för att fastställa om mutationer ackumuleras annorlunda än förutspått av hastighetsvärden och annorlunda än i kontrollcellpopulationer. Cellpopulationer vid olika punkter under replika åldrande kan utsättas för specifika stressfaktorer, såsom reaktiva syreradikaler eller DNA-skadande medel. Ettövergående och mild exponering för oxidativ stress inte väsentligt förändrar förmågan att utföra cellsortering (figur 3), men hårdare påkänningar kan komplicera återhämtning av celler. Preliminära experiment skulle vara nödvändigt att kontrollera att moderceller kan fortfarande återvinnas effektivt efter specifika påfrestningar. Dessutom kan de cellulära egenskaperna av isolerade stamceller analyseras i detalj, inklusive nivåer av reaktiva syreradikaler, mitokondrie och vakuolär morfologi och andra fysiologiska egenskaper som är förknippade med åldrande 3. Dessutom kunde de moderceller vara en utgångspopulation för en ytterligare behandling eller manipulation. Eftersom mor och dotterceller är fysiskt åtskilda under förfarandet, dottercellerna är också fortfarande tillgängliga för analys. Till exempel förändringar i fysiologiska egenskaper dotterceller eller den asymmetriska arv av skadade makromolekyler mellan jäst mor och dotterceller
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av bidrag R00AG031911 från National Institute on Aging av National Institutes of Health till PHM Innehållet i denna artikel inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
- Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
- McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
- Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
- Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
- Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).
- Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
- Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
- Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
- Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
- Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
- Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).
