Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinere Magnetic Sortering av Mor Cells og svingninger tester for å analysere Genome Ustabilitet Under Mitotisk cellealdring Published: October 16, 2014 doi: 10.3791/51850
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

Mutasjon priser hos unge Saccharomyces cerevisiae celler målt gjennom svingninger testene brukes til å forutsi mutasjonsfrekvenser for mors celler av ulike replikativt aldre. Magnetisk sortering og flowcytometri blir så brukt til å måle selve mutasjon frekvenser og alder av moderceller for å identifisere eventuelle avvik fra forventede mutasjons frekvenser.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae har vært en utmerket modellsystem for å undersøke mekanismer og konsekvenser av genom ustabilitet. Informasjonen fra denne gjær modellen er relevant for mange organismer, inkludert mennesker, siden DNA reparasjon og DNA-skade responsfaktorer er godt bevart på tvers av ulike arter. Imidlertid S. cerevisiae har ennå ikke blitt brukt til å fullt ut ta om frekvensen av akkumulere mutasjoner endrer seg med økende replikative (mitotisk) alder på grunn av tekniske begrensninger. For eksempel målinger av gjær replikative levetid gjennom micromanipulation bære svært små populasjoner av celler, som forbyr påvisning av sjeldne mutasjoner. Genetiske metoder for å berike for mor celler i populasjoner ved å fremkalle døden av datterceller har blitt utviklet, men bestandsstørrelser er fortsatt begrenset av hvor ofte tilfeldige mutasjoner som kompromittere utvalg systemer oppstår. Den nåværende protokollen tar nytte av magnetisk sorting av overflate-merket gjær mors celler for å få store nok bestander av aldrende mor celler til å kvantifisere sjeldne mutasjoner gjennom fenotypiske valg. Mutasjon priser, målt gjennom kursregulerings tester, og mutasjon frekvenser er først etablert for unge celler og brukes til å forutsi hyppigheten av mutasjoner i mors celler av ulike replikativt aldre. Mutasjons frekvenser er så bestemt for sorterte mor celler, og alderen til mor celler bestemmes ved hjelp av flowcytometri ved farging med et fluorescerende reagens som oppdager bud arr dannet på sine celleoverflaten under celledeling. Sammenligning av predikerte mutasjonsfrekvens basert på antall av celledelinger til frekvensene eksperimentelt observert for moder celler av en gitt replikative alder kan deretter identifisere om det er aldersrelaterte endringer i frekvensen av mutasjoner samler. Varianter av denne grunnleggende protokollen gi midler til å undersøke påvirkning av endringer i bestemte genfunksjoner ellerspesifikke miljøforhold på mutasjon opphopning å løse mekanismer underliggende genomet ustabilitet under replikative aldring.

Introduction

Mikroorganismer, så som gjæren Saccharomyces cerevisiae, er gode modeller for å undersøke mutasjon priser, men disse modellene er ikke blitt fullt utnyttet for å undersøke akkumuleringen av mutasjoner under mitotisk aldring av celler. Mutasjon akkumulering i atom genomet har blitt antatt å bidra til aldring ved resulterer i progressivt tap av (eller variasjon i) genfunksjoner en. Muligheten til å bruke en mikrobiell system for å studere mekanismene og konsekvensene av mutasjon akkumulering under aldring kan i stor grad akselerere identifikasjon av genetiske og miljømessige faktorer som påvirker denne prosessen, på grunn av lettvinte genetiske systemer og den enkle kvantifisere sjeldne fenotypiske endringer i mikroorganismer. DNA-reparasjonsfaktorer og DNA skade respons proteiner er godt bevart på tvers av ulike arter 2, og grunnleggende likheter i organisme aldring er identifisert for organismer så forskjellige som S. cerevisiae end pattedyr 3, noe som gjør det sannsynlig at resultatene fra studiene i gjær vil være relevant for aldring i mange organismer.

Studier av aldring i S. cerevisiae gjøre bruk av to aldrings modeller som måler kronologisk aldring eller replikative aldring av celler. Kronologisk aldring er karakterisert ved progressivt tap av levedyktighet i gjær-cellepopulasjoner som er i en ikke-delende tilstand (stasjonær fase) på grunn av næringsmangel 3. Den kronologiske aldringen modellen har blitt brukt til å demonstrere at mutasjoner akkumuleres med økende alder 4, siden store cellepopulasjoner er lett skaffes i denne modellen til å utføre fenotypiske valg for mutante celler. I dette tilfellet vises mutasjon akkumulering å bli påvirket av vekst-signalveier og oksidativt stress 5, og hver av disse faktorer er relevante for forståelsen aldring i flercellede eukaryoter 3. Replikativ aldring modellen utnytter asymmetrisk divisipå mellom S. cerevisiae mor og datter celler for å undersøke aldring som oppstår med påfølgende cellegenerasjoner tre. Gjær replikative aldring har ofte blitt målt gjennom micromanipulation av små bestander av mor og datter celler, eller mer nylig, gjennom videomikroskopi av små bestander av gjærceller i microfluidic enheter 6,7. Begrenset bestandsstørrelse gjør disse tilnærmingene dårlig egnet for å undersøke mutasjon akkumulering under mitotisk aldring mindre hel-genom opplysningene er innhentet fra enkeltceller eller svært høy frekvens genetiske endringer er målt åtte. Hel-genomsekvensering av enkeltceller gir betydelige datasett for å undersøke mutasjon akkumulering, men fenotypiske utvalg systemer har den viktige fordelen av å gi et middel for å måle mutasjon priser for å studere mekanismene bak mutasjon akkumulering. Studier for å undersøke mutasjons frekvenser og priser gjennom fenotypiske valg i haploid gjærstammer under replikative aldring har ennå ikke blitt rapportert.

Mutasjon priser blir ofte målt med svingnings tester ni. Mutasjonsfrekvens verdiene reflekterer det totale antall av celler som inneholder en mutasjon i et gen-sekvens i en populasjon. Dette inkluderer celler som forekommer uavhengige mutasjoner og enhver avkom av de celler som bare arve pre-eksisterende mutasjoner. I motsetning til dette mutasjon priser, målt gjennom svingningsprøver representerer antall uavhengige mutasjoner som nylig oppstå med hver celle generasjon. Disse tester som involverer typisk å inokulere mange replikere kulturer ved lave celletettheter for å redusere sannsynligheten for å legge til celler med tidligere eksisterende mutasjoner i en målsekvens, voksende kulturene til nær metning, og identifisere mutante celler etter vekst på selektivt medium. Antallet mutantceller som er identifisert i de replikate populasjoner blir så brukt i en av flere matematiske modeller for å estimere antall independent mutasjoner som oppsto under vekst ni. Sammenligning av antall uavhengige mutasjoner til den gjennomsnittlige populasjonsstørrelse gir et mål på mutasjonsfrekvensen. I S. cerevisiae, er mutasjon frekvenser og priser ofte målt ved hjelp av URA3 og CAN1 gener, siden tap-av-funksjon mutasjoner i disse genene produserer valg fenotyper. Tap av URA3-funksjonen gjør cellene er resistente mot 5-fluoroorotic-syre (5-FOA), siden proteinet kodet for av URA3 omdanner 5-FOA til en toksisk 10 molekyl. Tap av funksjonen av CAN1 tillater celler å bli resistente mot canavanine, et giftig arginin analog, siden proteinet kodet for av CAN1 transporterer arginin og canavanine inn i celler 11.

Både genetiske og fysiske sorterings strategier har blitt ansatt for å oppnå større bestander av S. cerevisiae mors celler til rette for undersøkelser av replikative aldring. Genetiske strategier inkluderer smarte tilnærminger som velger mot datter celle overlevelse i en befolkning. Moren berikelse program (MEP) innebærer beta-østradiol induksjon av Cre recombinase uttrykk bare i datterceller, som fører til datter-spesifikk forstyrrelse av to viktige gener som ble konstruert for å inneholde loxP sider 12. MEP-stammer kan dyrkes vanligvis i fravær av indusereren, men kun moderceller vil fortsette å dele seg etter induksjon, mens datterceller vil arrestere på M-fasen vanligvis i løpet av deres første progresjon gjennom cellesyklusen 12. Selv om dette systemet ikke har vært brukt til å undersøke lag mutasjon akkumulering under aldring, har det blitt brukt til å studere tap av heterozygositet, en relativt hyppig form av genom ustabilitet i diploide gjærstammer, så vel som biokjemiske endringer i aldring modercellene 13,14. På samme måte omfatter den datter-avledersystemet datter-spesifikk ekspresjon av S. cerevisiae URA3 genet 15. Datter-Arrester stammer vokse normalt inntil fem-FOA legges til mediet, og da datterceller uttrykker URA3 vil dø, mens mors celler fortsette å vokse 15. Disse er nyttige systemer for å berike for mor celler, men de er avhengig av vedlikehold av genfunksjoner som utgjør utvalget system. Tilfeldige mutasjoner i ett eller flere komponenter i valget av system kan føre til datterceller som rømmer utvalget og sprer eksponentielt. Under utviklingen av MEP stammer, passende bestandsstørrelse var fast bestemt på å unngå utseendet av mutante datterceller som kunne unnslippe valg 12. Men denne grensen i størrelse populasjon kompromitterer påvisning av sjeldne former av genom ustabilitet under replikative aldring. Denne begrensning på populasjonsstørrelse kan delvis overvinnes ved hjelp av diploide gjærstammer med to kopier av hvert gen bidrar til valget av system, siden de flestemutasjoner ville trolig være recessive 12. Men bruk av diploide stammer begrenser hvilke typer mutasjons hendelser som lett kan oppdages i forhold til de som lett kan oppdages i haploide gjærceller.

Fysiske sorterings strategier inkluderer isolering av mors celler med et merket celleoverflaten fra umerkede datterceller til å berike for store bestander av mors celler. Observasjonen at celleoverflateproteiner (cellevegg proteiner) av S. cerevisiae datterceller er nylig syntetisert under spirende har blitt utnyttet til å merke mors celler uten merking av datterceller som de produserer 16. For eksempel kan en første populasjon av gjærceller som er merket på sin overflate med biotin bli dyrket og deretter isoleres fra deres datterceller ved hjelp av anti-biotin-mikroperler og magnetisk sortering 16 fordi datterceller som genereres av den opprinnelige populasjon ikke inneholder biotin på overflaten . Serie vekst ogsortering tillater progressivt eldre populasjoner av moderceller som skal oppnås og analyseres. Denne prosedyren har vært brukt med hell til å undersøke endringer i cellefysiologi og genuttrykk under replikative aldring av gjær 13,14,17,18. Den nåværende fremgangsmåte tilpasser denne biotin merking og magnetisk sortering teknikk å anrike for mor-celler med det formål å måle akkumuleringen av potensielt sjeldne mutasjoner eller andre former for genom ustabilitet analysert gjennom fenotypiske markeringer. Serie vekst og fysisk sortering tillate analyse av mutasjon akkumulering i progressivt større, mor-celler, så vel som i deres dattercellepopulasjoner. Fastsettelse av mutasjon priser per generasjon tillater en spådd mutasjon frekvens som skal beregnes for mor celler som har gjennomgått et bestemt antall celledelinger. Siden spådd frekvensverdier er basert på den forventede økningen skyldes flere runder med celledeling, betydelige avvik i de observerte Mutatipå frekvenser i forhold til den anslåtte verdier gi bevis for aldersspesifikke endringer i frekvensen av akkumulere mutasjoner. Ved hjelp av denne protokollen, kan fluorescerende farging av knoppen arr som tilsvarer områder av celledelinger på Mother celler kombinert med analyse av flowcytometri brukes til å raskt bestemme aldersfordeling av sortert og usortert populasjoner. Ytterligere fluorescerende reagenser, slik som de som brukes for å detektere reaktive oksygenforbindelser, kan også benyttes under denne protokollen. Samlet sett gjør dette protokollen effektiv analyse av aldersavhengige endringer i genomet ustabilitet med potensial for korrelasjon til aldersrelaterte celle fysiologiske endringer i modellorganisme godt egnet til å studere genetiske og miljømessige faktorer som påvirker aldringsrelaterte genomet ustabilitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av Media og løsninger

  1. Grow celler ved hjelp av gjærekstrakt-pepton glukose (YPD) rik medium for standardprotokollen. Forbered en 2% Bacto-pepton, 1% gjærekstrakt, 2% glukoseoppløsning til YPD medium og tilsett 2% Bacto-agar for fast medium 19. Autoklav å sterilisere. Bruke et alternativt medium, hvis nødvendig, for å teste et spesielt veksttilstand eller mutant gjærstamme.
  2. Lage solide syntetisk komplett medium mangler arginin med 60 mg / L canavanine (SC-arg + canavanine) for å velge for canavanine resistente mutanter. Tilbered en løsning som er 0,67% Bacto-gjær nitrogenbase uten aminosyrer, 2% glukose, 0,2% komplett supplement blandingen uten arginin (frafall blanding), og 2% Bacto-agar 19. Autoklav og kul før tilsetning canavanine fra en 20 mg / ml stamløsning (filter-sterilisert, lagret ved 4 ° C) 19.
    1. Lag fast syntetisk komplett medium inneholdende 5-fluoroorotic syre (5-FOA). Forbered 500ml av en løsning som er 1,34% Bacto-gjær nitrogenbase uten aminosyrer, 4% glukose, 0,4% fullført supplement-blanding, og 0,2% 5-FOA og filtersteriliser-19. Autoklav 500 ml av en 4% Bacto-agar løsning, kule kort, og deretter blande seg med 500 ml filter-sterilisert næringsstoff løsning. Bruk egnet alternativ media for andre mutasjonsanalyser.
  3. For biotin merking, blir 500 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning inneholdende 137 mM natriumklorid, 2,7 mM kaliumklorid, 10,14 mM natriumfosfat dibasisk, og 1,77 mM kaliumhydrogenfosfat, pH 8. Oppbevar ved 4 ° C og holder på is under bruk.
  4. Lag en frisk 5 mM biotin lager i sterile, ultrarent vann.
  5. Å slukke biotin merking, lage 500 ml 1x PBS, 100 mM glysin. Oppbevar ved 4 ° C og holde på is under bruk.
  6. Avhengig av antallet av celler som brukes og varigheten av forsøket, blir 1-2 L av perle-merking buffer inneholdende 1 x PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine serum albumin. Filter sterilisere og de-gass buffer. Oppbevar ved 4 ° C og holde på is under bruk.
  7. Forbered en 0,4% trypanblått løsning i 1x PBS, filter sterilisere, og oppbevar ved RT for bruk i celle levedyktighet målinger.
  8. Delmengde små volum (~ 100 ul) av en hvetekim agglutinin (WGA) fluorescerende konjugat til å lagre ved -20 ° C i innpakket folie (eller ugjennomsiktige) mikrosentrifugerør for bruk i å bestemme cellealder.

2. Fastsettelse av mutasjonsraten og frekvens

  1. Etablere en baseline mutasjonsraten per celle generasjon bruker svingnings tester for celler dyrket under standard kultur forhold. Dyrk i sju til elleve replikere 1 ml kulturer fra en initial densitet på 1000-5000 celler / ml til tidlig stasjonær fase (~ 10 8 celler / ml).
    1. For hver replikat kultur, fortynn cellene 1: 2000 og spre 1-4 pl på ikke-selektivt medium (YPD) for å fastslå kolonidannende enheter-/ ml. Pellet resterende celler på ~ 2400 xg i 1 min i en mikrosentrifuge og resuspender i 100 mL vann for å spre seg ut mot selektivt medium for å identifisere mutanter. Inkuber platene i tre dager ved 30 ° C før telling kolonier (juster inkubasjonstiden etter behov basert på veksten av celler).
    2. Bestem antall uavhengige mutasjoner (m) som oppstod i rettssaken basert på antall mutante kolonier (r) oppnådd på selektivt medium. Bruk Lea-Coulson median estimator å finne m ved å erstatte median antall mutante kolonier for r i formelen under 9. Deretter erstatte verdier for m til venstre side av ligningen er tilnærmet null.
      Ligning 1
    3. For å bestemme mutasjonshastighet, først beregne den gjennomsnittlige antall levedyktige celler spredt på selektivt medium ved å multiplisere den gjennomsnittlige kolonidannende enheter-/ ml av de gjentatte kulturer og volumetav kultur i ml spredning på selektivt medium. Fordel m verdi fra trinn 2.1.2 av denne gjennomsnittlig antall levedyktige celler for å få mutasjonsraten per celle generasjon.
  2. Individuelt beregne antallet levedyktige celler spredt på selektive medium for hvert replikat kultur i en prøve som beskrevet i trinn 2.1.3. Del antall mutante kolonier (R) som oppnås for en kultur med antall levedyktige celler spredt på selektive medium for å oppnå den mutasjonsfrekvens. Bruk gjennomsnittet eller medianen av de enkelte mutasjonsfrekvenser fra replikere kulturer i trinn 2.1 som en baseline mutasjonsfrekvens.
  3. Gjør frekvensmålinger før og etter biotin merking celler (trinn 3.2 og 3.4) for å avgjøre om merking vise resultatene i noen endring i hyppigheten av mutasjoner som må tas i betraktning ved testing for aldersspesifikke endringer i mutasjon akkumulering.

3. Biotin Merking

  1. Streak S. cerevisiae fra en lager glycerol ved -80 ° C på YPD-medium og inkuber ved 30 ° C i 1-3 dager.
  2. Ved hjelp av en steril pipette tips, overføre celler fra strek plate til 1 ml (eller flere) av vann husk at 1-1,5 cm av en tett vokst del av strek vil gi ca 10 8 celler. Bestem eksakt celletetthet ved hjelp av en hemocytometer.
  3. Etiketten 10 8 celler pr stamme (eller behandling tilstand) pr oppsamlingssted ved hvilken mutasjonsfrekvens vil bli bestemt eller en populasjon størrelse tilstrekkelig til å oppnå minst 5-10 mutante kolonier pr prøvetaking på selektivt medium (basert på mutasjonsfrekvens fra trinn 2.2). Inkluder ytterligere 10 8 celler for basismålinger per belastning / tilstand.
  4. Biotin merking i henhold til standard prosedyre fra fabrikanten, bortsett fra å bruke en 5 mM biotin reagens lager og rist under inkubering. Sentrifugering i 5 min ved 4 ° C ved 3000 x g for alle sentrifugeringstrinn, since å spinne ved temperaturer som er høyere enn 4 ° C kan føre til økt celletap. Etter den siste vask, suspendere cellene til en konsentrasjon på 10 8 merkede celler / ml i vann.
  5. Kontroller levedyktighet av cellene ved hjelp av trypan blå farging. Fortynn 10 mL av cellene med 23 pl vann og 67 pl av 0,4% trypanblått i 1x PBS. Inkuber i minst 40 min ved RT før scoring levende (ufargede) og døde (farget) celler ved hjelp av en hemocytometer.
  6. Måle utgangsverdier for genom ustabilitet, celle alder og andre relevante egenskaper (se avsnittene 5, 6 og 7).
  7. Overfør biotin-merkede celler i 20 ml av YPD-medium pr 10 8 celler i en Erlenmeyerkolbe (ca. 5 x 10 6 celler / ml). Dyrk kulturen (e) 16 til 18 timer ved 20 ° C til en tilnærmet tetthet på 10 8 celler / ml (4:56 celle generasjoner), men ikke tillater celler å nå stasjonære fase. Bruk en kortere inkubasjonstid for vekst ved 30 ° C. Hold biotinmerket calen ved 4 ° C i opptil flere timer før tilsetning til mediet, hvis det er nødvendig for å optimalisere tidsberegningen av vekstperioden, og samlingen.

4. Bead Merking og Magnetic Sorting

  1. Etter vekstfasen, fortynne en porsjon av kulturen for å bestemme celletetthet ved hjelp av et hemocytometer. Pellet-celler ved sentrifugering i 5 min ved 4 ° C ved 3000 x g. Hell av supernatanten.
  2. Vask cellene ved å virvle å suspendere pelleten i 30 ml perle-merking buffer, deretter sentrifugering og støping av supernatant som i avsnitt 4.1. Gjenta vask.
  3. Fullt resuspender celler i 50 mL perle-merking buffer per 10 8 totalt celler ved virvling. Tilsett 2 mL magnetiske kuler per 10 8 totalt celler og vortex kort for å blande. Inkuber på is i 10 minutter, snudd om periodisk å blande (modifisert fra et nettprotokoll på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
  4. Vask cellene tre ganger med 30 ml perle-merking buffer.
  5. Tilsett 0,5 ml perle-merking buffer per 10 8 totalt celler og kort vortex pellet på middels innstilling like før cellene resuspendert. Hell gjennom en 40 um celle sil inn i et 50 ml rør for å fjerne eventuelle gjenværende celleklumper. Hvis nødvendig, la cellene på is i 1-2 timer før lasting på kolonnen.
  6. Følg produsentens anbefalte protokoll for de magnetiske kolonner å binde, vaske, og eluere de magnetiske perle-merket mors celler. For økt utvinning av merkede celler, bruker minst en kolonne per 2 x 10 9 totale celler.
    1. Fjern eventuelle bobler som oppstår ved lasting kolonner, som de vil blokkere flyt. Fjerne og erstatte kolonnen på separator mellom hver vask for å hindre at celler fra å bli fanget mellom perlene (modifisert fra en online-protokollen på http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. Lagre strømme gjennom fra binding og vasketrinnene for å analysere små celler som produseres av modercellene, om ønsket. Konsentrer-celler som beskrevet i trinn 4.7.
    3. Bruk flere kolonner separatorer for behandling av flere prøver på en gang. Eluere flere kolonner av samme prøven i den samme samling rør for å redusere håndteringstiden og redusere tap av celler.
  7. Konsentrer eluerte moderceller ved sentrifugering ved 3000 xg i 5 min ved 4 ° C. Aspirer alle unntatt 1 ml buffer per 10 8 opprinnelige biotin-merkede celler. Vortex kort for å suspendere celler i resterende buffer.
  8. Fortynn en aliquot av celler og flekken med trypan blått for å bestemme celletetthet og cellelevedyktigheten ved hjelp av et hemocytometer (se trinn 3.5). Beregn det totale antall celler gjenvunnet.
    1. Dersom antall celler er vesentlig høyere enn forventet, passerer eluering prøven gjennom en annen kolonne for å prøve å fjerne kontaminerende unge celler.Dersom antall celler er betydelig lavere enn forventet, passerer den lagrede strømmen gjennom prøven gjennom en annen kolonne for å prøve å forbedre utbyttet av moderceller.
  9. Bruk celler for videre analyser, som beskrevet i avsnitt 5 og 6. Alternativt kan dyrke cellene i YPD kokes igjen for å øke sin replikative alder (trinn 3.7) og følger med vulsten merking og sortering (trinn 4.1-4.8.1), uten må gjenta biotin merking.

5. Fastsettelse av replikative Age

  1. Spin celler i 2 min ved 5000 xg ved RT for alle trinnene i denne delen. Sett 25 pl av de gjenvundne celler (~ 10 8 celler / ml) i en 1,5 ml sentrifugerør og vaskes to ganger med 1 ml PBS 1X. Aspirer off supernatant.
    1. Tine en delmengde av WGA-konjugat, til vortex blande, og spinne kort for å eliminere protein aggregater. Suspender celler i 180 pl 1 x PBS og 20 ul WGA konjugert til et fluorescerende molekyl å merke knopp arr på overflaten av the celler. Dekk til 1,5 ml sentrifugerør med folie og inkuberes med forsiktig gynging ved 30 ° C i 30 min.
    2. Vask tre ganger med 1 ml PBS 1X.
  2. For fluorescerende mikroskopi, etikett lysbilder og montere per standard protokollen ved hjelp av en anti-fade agent. Fullt kurere lysbilder i mørket (opp til et par dager) før forsegling dekkglass for å unngå celle bevegelse under avbildning. Antall arr knopp på minst 50 celler pr prøve å oppnå en representativ måling av cellealder. Lagre lysbilder for inntil 1 måned for visning bud arr, hvis det er nødvendig.
    1. Alternativt kan bestemme intensiteten av det fluorescerende signalet fra WGA-konjugat ved å utføre flowcytometri på celler suspendert i 1 ml 1 x PBS etter trinn 5.1.2. Bruk en 405 nm eksitasjon laser og 530/30 nm utslipp filter med en 505 nm lang pass filter for WGA-Alexa 488. Inkluder en unstained kontroll for hvert returpunkt.
  3. Graf knopp arr på unge celler og alderen celler telles ved mikroskopi påy-aksen mot normalisert geometrisk gjennomsnitt (farget geometrisk gjennomsnitt / unstained geometrisk gjennomsnitt) av WGA-konjugatvaksine fluorescens fra de samme cellepopulasjoner på x-aksen. Hente ligningen for en lineær trendlinje for dette forholdet. For etterfølgende eksperimenter, erstatte normalisert geometrisk gjennomsnitt av WGA-konjugatvaksine fluorescens intensitet av en cellepopulasjon for xi ligningen og løse for y for å bestemme den gjennomsnittlige celle alder av en prøve.

6. Mutation Frequency

  1. Spread sortert moder celler resuspenderes i buffer fra trinn 4.7 på YPD-medium, og selektivt medium som beskrevet i trinn 2.1.1. Bruk 1 ml resuspenderte moderceller for selektivt medium og spin-celler ved 5000 x g i 1 min.
    MERK: Spre større mengder utvannet celler på YPD medium som celler øker i alder for å kompensere for økende antall ikke-levedyktige og senescent celler i eldre populasjoner.
    1. Inkuber YPD medium og selektivt medium plater fratrinn 6.1 ved 30 ° C i 3 og 4 dager, henholdsvis. Øk inkubasjonstid opptil en uke for svært gamle celler eller langsomt voksende stammer. Beregn mutasjonsfrekvens som beskrevet i trinn 2.2.

7. Beregning Forutmutasjonsfrekvensen for en gitt replikative Age

  1. Beregn den gjennomsnittlige økningen i replikative alder av biotinmerket celler i løpet av eksperimentet ved å trekke gjennomsnittsalderen på den første cellepopulasjon fra gjennomsnittsalderen på de sorterte moderceller for den aktuelle typen. Bruk celle aldre beregnet i trinn 5.2 eller trinn 5.2.2.
  2. Multipliser mutasjonsraten oppnådd i trinn 2.1.3 av økningen i gjennomsnittlig celle alder beregnet i trinn 7.1. Legg denne verdien til referansemutasjonsfrekvens for den første populasjon beregnet i trinn 2.2 for å bestemme den forutsagte mutasjonsfrekvens for celler av den relevante replikative alder.

Representative Results

Et flytdiagram i figur 1 viser de samlede trinn i fremgangsmåten, inkludert de punkter hvor mutasjon priser, frekvenser og cellealder måles. En nøyaktig bestemmelse av frekvensen og frekvensen av mutasjoner (eller annen form for genom ustabilitet) i små cellepopulasjoner er et viktig første trinn, siden det er nødvendig for å velge en passende populasjonsstørrelse for merking og magnetisk sortering. Verdigrunnlag kan etableres ved hjelp av svingnings tester ni. Eksempler på resultater for gjærstammer i BY4741 genetisk bakgrunn 20 valgt for mutasjoner i genet som CAN1 jf canavanine resistens eller mutasjoner i URA3-genet som gir resistens mot 5-FOA er vist i figur 2. Celler ble dyrket ved 20 ° C for representative -forsøk, og ved 20 ° C og 30 ° C for representative frekvenseksperimenter. Disse temperaturer ble brukt fordi innledende celle populasjoner dyrketved 30 ° C ble deretter dyrket ved 20 ° C i de etterfølgende representative sortering eksperimenter. Rate verdier fra uavhengige forsøk var sammenlignbare for den første cellepopulasjon og celler etter biotin merking for en belastning som har CAN1 genet på sitt normale sted på kromosom V, ca 32 kilobasepar fra venstre arm telomere ( www.yeastgenome.com ) ( Figur 2A, lavendel kolonner). Mutasjonsraten av CAN1 var betydelig høyere i startpopulasjoner av et sekund gjærstamme som har en sletting av CAN1 genet fra sin normale plassering på kromosom V og en innsetting av CAN1 på høyre arm av kromosom VIII ca 25 kilobasepar fra telomere 21 (figur 2B). CAN1 genmutasjon frekvenser var også sammenlignbare for første cellepopulasjoner og biotin merket celler i hver veksttemperatur (Fifigur 2A, blå søyler). Imidlertid mutasjonsfrekvens oppnådd ved 20 ° C ble funnet å være høyere enn mutasjons frekvenser ved 30 ° C. For å teste hvorvidt dette temperatureffekt er begrenset til CAN1 genet, målte vi mutasjoner i URA3 ved seleksjon for resistens overfor 5-FOA ved hjelp av gjærstamme som har CAN1 innsatt på kromosom VIII. Denne belastningen har også en sletting av URA3 fra sin normale området på kromosom V og en innsetting av URA3 på høyre arm av kromosom VIII ca 40 kilobasepar fra telomere 21. Mutasjons frekvenser var også høyere ved 20 ° C i URA3 på denne kromosomal plassering (figur 2C). Samlet viser dette at veksttemperaturen kan påvirke hyppigheten av mutasjoner, men biotin merking synes ikke å påvirke mutasjonsfrekvens. Derfor mutasjon priser og frekvenser for startpopulasjoner må bestemmes på samme vekst tempetemperaturen som skal brukes for runder med vekst og sortering. Det anbefales å kontrollere at biotin merking påvirker ikke genomet ustabilitet før bruk av protokollen til å undersøke andre typer mutasjoner eller genom rearrangementer.

Som forventet, mutasjon frekvensverdier som er vist i figur 2A er flere ganger lavere enn de tilsvarende frekvensmålinger. Denne forskjellen oppstår fordi mutasjonsfrekvens måler utseendet av celler med nye mutasjoner med hver runde av celledeling, mens mutasjonsfrekvens måler den kumulative antall mutante celler i populasjonen ved slutten av vekstperioden. Satsene og 95% konfidensintervall for disse studiene viser at reproduserbare resultater kan oppnås ved hjelp av syv replikere kulturer per rettssaken, som er minimum antall replikater foreslått for denne protokollen.

Når de innledende frekvens og frekvensverdier er bestemt, bør en bestandsstørrelse være chosen som sikrer at tilstrekkelige celler er til stede etter flere runder med sortering å pålitelig bestemme mutasjonsfrekvenser. Merking en populasjon av 10 8 celler per tidspunkt som skal analyseres under aldring er hensiktsmessig når frekvenser og prisene er lik de som er vist i figur 2A. Denne beslutningen avhenger også av hvor effektivt merket mor celler blir gjenvunnet etter hver runde med sortering. Effektiviteten av utvinne merkede moderceller kan raskt og enkelt evaluert ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme antall celler som ble eluert fra kolonnene for hvert slag, og for å undersøke cellemorfologi. To hovedpunkter er illustrert ved eksempel utvinning effektivitetsdata (figur 3A): de gjenvunne antall celler kan vises høyere enn ventet etter den første typen, og en liten progressiv tap av celler er forventet med fortsatt sortering. Jo høyere enn forventet antall celler i noen eksperimenter etter det første slag kunne result fra merking av knopper på celler i det første populasjon. En gjærcelle med en knopp ville typisk bli merket som en enkelt celle ved å bestemme antall celler å merke med biotin. Merking av knopper som er tilstede i den opprinnelige populasjonen, selv om, ville tillate cellene som utvikler seg fra disse knopper til også å bli beholdt i kolonnene under sortering. Påvirkningen av denne forekomst på bestemmelse av virkningsgrad avhenger brøkdel av budded celler i den innledende cellepopulasjon. En annen mulig grunn for den høyere cellenummeret etter sorter ene er at det har en tendens til å være mer store budded cellene på dette tidspunkt som kan være fullføring celledeling under sorteringen. Som et resultat, kan store knopper fremdeles festet til deres modercellene skal sorteres, men da fremstå som distinkte celler når de eluerte celler blir undersøkt. Selv om noe tap av celler er observert med hver runde av vekst og sortering, kan protokollen resultere i pålitelig tilbakeholdelse av 80-90% av cellene etter hver runde med sOrting. Det er verdt innsatsen for å praktisere fremgangsmåten for å sikre at 80% eller mer av de merkede celler blir isolert for å unngå behovet for å merke en unødvendig stor initial cellepopulasjon. Behandling av celler med en mild stress etter det første slag (1 mM hydrogenperoksyd i YPD-medium i 30 minutter) ikke hindre effektiv utvinning av celler med fortsettelse runder av vekst og sortering, selv om det var noen variasjon i gjenoppretting for den første slags etter stress (figur 3A).

Inspeksjon av cellemorfologi og levedyktighet er også nyttige både for å bekrefte vellykket isolering av moderceller, og for justering av fortynninger / volumer som benyttes ved å spre cellene på ikke-selektivt medium for å bestemme tettheten av kolonidannende enheter. Mor cellene blir stadig større og mer uregelmessig formet som de gamle, sammenlignet med datterceller (Figur 3B). Moren celleprøver bør derfor primært bestå av store, irregularly formet celler som eksperimentet utvikler seg gjennom hver runde med sortering. Nærværet av mange små ovale celler av vanlig form, kan tyde på at modercellene ikke blir tilstrekkelig adskilt fra datterceller. Levedyktighet av moren cellene skal også gradvis avta med hver runde av voksende og sortering, selv om det kanskje ikke mye endring i løpet av de første fem på ti cellegenerasjoner. Antall celler i stand til å danne kolonier kan reduseres mye mer dramatisk enn antallet av celler som er bestemt å være levedyktig ved noen form for direkte farging av celleintegritet, på grunn av dannelsen av senescent celler. Når levedyktighet ved en direkte fargingsmetode først begynner å falle (ca. 80% eller mindre), kan det være nødvendig å justere fortynninger og volumer som benyttes til å måle colony forming unit tettheter i påvente av en mer dramatisk nedgang i evnen av de levedyktige celler til å skjema kolonier (en to til flere ganger reduksjon).

Denreplikativt alderen de sorterte populasjoner og kontrollpopulasjoner må bestemmes før mutasjon frekvensdata fra mor celler kan analyseres for aldersspesifikke endringer i frekvensen av akkumulere mutasjoner. Dette kan oppnås gjennom en manuell telling av knoppen arr på mors celler (figur 4) eller gjennom flowcytometri å kvantifisere signal for knoppen arr deteksjon reagens (figur 5). Bud arr kan merkes med relativt lavt bakgrunnssignal ved hjelp av WGA-fluorescerende konjugater (figur 4C). Figur 4A viser at de fleste celler fra strømningen gjennom prøver av sorteringsfremgangsmåten har null eller en knopp arret. Cellene ble eluert fra kolonnene er for det meste i alderen moderceller (figurene 4B og 5). Typisk> 90% av cellene er eluerte moderceller, som kan ses lettere fra flowcytometri resultat i figur 5. Celler med relativt få knopp arr (<6) obtained etter mer enn to runder med sortering kunne representere forurensende celler som ikke ble biotin merket som gjennomgikk noen runder med celledeling i den aktuelle runden av vekst, i motsetning til mor celler som deler seg veldig sakte. Variasjonen i celle alder kan øke med påfølgende runder med sortering om ikke alle celler i befolkningen vokser jevnt.

En større cellepopulasjon kan brukes raskere å evaluere cellealder dersom en lineær sammenheng opprettes mellom WGA-fluorescens signalintensitet og antall knopp arr per celle. For denne analysen, er normaliseringen av alle WGA-fluorescens signalintensitetene oppnådd ved å dele signalet fra fargede celler fra signalet som oppnås for den aktuelle unstained cellepopulasjon (datter eller mor) for å gjøre rede for økt bakgrunnsfluorescens i de eldre celler. Figurene 4 og 5 viser analyse av de samme representative cellepopulasjoner.Manuell telling etablert gjennomsnittlig replikativt alderen 0,95 og 11,4 for datteren cellen (figur 4A) og mor cellepopulasjoner (Figur 4B), henholdsvis. Normalisert WGA-signaler for disse to populasjoner og de ​​tre ekstra populasjoner (gjennomsnittsalder på 3,0, 6,9, og 14,4) ble plottet mot gjennomsnittlig antall bud arr for hver populasjon (Figur 5B). Denne lineært forhold kan så brukes med den samme belastning og reagenser i fremtidige eksperimenter for å bestemme gjennomsnittlig celle alder fra den normaliserte WGA-signalet som oppnås ved flowcytometri, som tillater rask og nøyaktig bestemmelse av cellealder. Kontroll bestander bør fortsatt være med å verifisere lignende flekker effektivitet mellom studier.

Påvirkningen av alder på akkumulering av mutasjoner kan håndteres når de tidligere trinnene av å skaffe mutasjon frekvensverdier, en effektiv sortering cellene, og bestemmelse av celle aldre er oppnådd. Number av tidspunkter hvor frekvensen kan bli bestemt avhengig av størrelsen av den biotin-merkede cellepopulasjon, og antallet celler som må spres på selektivt medium for å oppnå pålitelige resultater. Hvis mutasjon rente endrer seg med alderen, da de observerte mutasjonsfrekvenser for aldrende mor celler bør avvike fra de som forventet basert utelukkende på flere runder med celledeling. Sammenligning av den observerte mutasjonsfrekvensen til den forutsagte mutasjonsfrekvens kan identifisere aldersrelaterte forskjeller i frekvensen av mutasjoner samler. Som beskrevet i avsnitt 7 av protokollen, kan det forutsies frekvens fås fra produktet fra referansemutasjonsfrekvensen for den første cellepopulasjon og økningen i replikative alder av moderceller tilsettes mutasjonsfrekvens for den første populasjon. Økninger i CAN1 mutasjon frekvens har blitt observert med økt gjennomsnittlig celle alder i en stamme med CAN1 på sitt normale sted på kromosom V(Figur 6A), og i en stamme med CAN1 på høyre arm av kromosom VIII (figur 6B). Siden de observerte mutasjonsfrekvenser for mors celler i Figur 6A er lik eller like under den anslåtte frekvenser, trenger dataene ikke gi noen bevis for en aldersspesifikk endring i mutasjonsraten. I kontrast, mutasjons frekvenser for moderceller av stamme med CAN1 på kromosom VIII var høyere enn den anslåtte frekvenser (Figur 6B). Legg merke til at de predikerte frekvenser i grafen ikke synes å øke svært mye fordi en log skala måtte brukes for y-aksen på grunn av den store økning i den observerte mutasjonsfrekvens. Derfor trenger resultatene i figur 6B gi bevis som støtter en aldersspesifikk økning i frekvensen av samler mutasjoner. Forskjellen i resultatene for de datasettene i figur 6A og 6B er sannsynlig på grunn av diffe leie genomisk steder av CAN1. Disse typer observasjoner gir et utgangspunkt for å utvikle hypoteser for å studere mekanismer som påvirker mutasjon priser som celler alder og å utvikle modeller for å forklare mutasjon akkumulering med replikative alder.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for den generelle prosedyre for å undersøke mutasjon akkumulering under gjær replikative aldring. Sort tekst og pilene viser hovedtrinn i fremgangsmåten. Den buede pil reflekterer at ytterligere runder med gjenvekst og sortering av de samme cellene blir anvendt for å oppnå progressivt eldre celler. Lilla piler og tekst viser trinnene der de oppgitte målinger er utført. Freq - frekvens.

opplasting / 51850 / 51850fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 2. Fastsettelse av mutasjonsfrekvens og sats på unge cellepopulasjoner. (A) Mutant kolonier ble valgt ut ved å spre cellene på SC-arg + canavanine medium for å velge ut for tap-av-funksjon mutasjoner i CAN1-gen og i forhold til det totale antall levedyktige celler spredt på selektivt medium for å beregne frekvenser / priser. Celler fra innledende populasjoner før biotin merking (IP) eller etter biotin merking (PB) ble dyrket ved hjelp av YPD-medium fra en initial densitet på 5000 celler / ml til nær metning. Lavendel kolonner indikerer måling og blå kolonnene representerer frekvensmålinger gjort ved angitte temperaturer (20 ° C og 30 ° C). Sett med syv replikere kulturer ble dyrket for hvert forsøk og 04:58 uavhengige forsøk ble utført. Individuelle rente verdier beregnet for uavhengige forsøk er vist, og feilfelt for disse studiene representerer 95% konfidensintervall bestemmed Bruk en online kalkulator 22. Frekvenser representerer middelverdier og standardavvik. (B) CAN1 mutasjon priser innhentet og representert som beskrevet for del A ved hjelp av en stamme med CAN1 på høyre arm av kromosom VIII. (C) Mutasjons frekvenser innhentet følgende utvalg for mutante kolonier på 5-FOA hjelp en stamme med URA3-genet ligger på den høyre arm av kromosom VIII. Metodene var ellers som for en del A, og midlene og standardavvik for tre eller fire uavhengige forsøk er vist.

Figur 3
Figur 3. Eksempel sortering effektivitet bestemmes ved beregning av antall eluted celler etter hver runde med sortering. (A) Det totale antall celler i hver start populasjon etter biotin merking ble satt til en, og t otal antall celler som er tilstede i den eluerte prøver fra hver runde av magnetisk cellesortering ble dividert med de opprinnelige verdier for å oppnå den brøkdel av merkede celler. Totale celle tall ble bestemt fra celletall innhentet ved hjelp av en hemocytometer. Oransje søylene representerer gjennomsnitt og standardavvik for tre uavhengige forsøk etter standard protokoll. Blå kolonner representerer gjennomsnittet og standardavvik for to uavhengige forsøk hvori cellene ble behandlet med 1 mM hydrogenperoksid i 30 minutter umiddelbart etter det første slag (B). Størrelse og morfologi av celler etter biotin merking (post-biotin), og modercellene restituert etter den tredje runden av magnetisk sortering (slags 3 Mor celler) som vises ved hjelp av standard lyse felt mikroskopi og en 20X objektiv. Hvite linjer i bakgrunnene er linjene som bandt de minste synlige på en standard hemocytometer firkanter.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Fastsettelse av replikative alder bruker manuell knopp arr telling. Konfokalmikroskopi ble brukt til å telle knopp arr på individuelle celler merket med en WGA-fluorescerende konjugatvaksine (eksitasjon ved 488 nm og deteksjon med 458/543 nm band pass og 505 nm lang pasning filterkombinasjon.) (A) Manuelt knopp arr tellinger av celler fra strømning gjennom (datterceller) etter den tredje runden av magnetisk sortering (n = 62) (B). Manual knopp arr tellinger av eluerte celler (mor-celler) etter tredje runde av magnetisk sortering (n = 54). (C) Mor celler beholdt etter den tredje runden av magnetisk sortering fotografert ved hjelp av en 63X oljeneddyppingsobjektivet med 3X zoom etter farging viddha WGA-fluorescerende konjugat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Fastsettelse av replikative alder ved hjelp av flowcytometri. Prøver av 10.000 celler farget med en WGA-fluorescerende konjugat ble analysert ved flowcytometri hjelp eksitasjon ved 488 nm og deteksjon med en 530/30 band pass og 505 lang pass filter sett. (A ) histogrammer som viser antall celler med bestemte WGA-fluorescens intensiteter for en datter cellepopulasjon eller eluatet (mor celler) etter tre runder med magnetisk sortering. Populasjoner samsvarer med de som er analysert i figur 4. Blå vertikale linjer angir den tilsvarende posisjon for flertallet av daughter celler på modercellen. histogram (B) Den normaliserte geometriske gjennomsnittet for fluorescens-signal av hver populasjon er vist i A og tre ytterligere populasjon av celler (gjennomsnittsalder 3,0, 6,9 og 14,4) ble beregnet som forholdet av den geometriske middelverdi av de fargede cellene og geometrisk gjennomsnitt av den aktuelle unstained cellepopulasjon. Disse verdiene er plottet i forhold til det gjennomsnittlige antall knopp arr for hver totale populasjon (figur 4, og data ikke vist). R 2 verdi for trendlinjen av denne sammenligningen er gitt på grafen.

Figur 6
Figur 6. Sammenligning av predikerte og observerte mutasjons frekvenser under replikative aldring. Celler med mutasjoner i CAN1 genet ble selektert som beskrevet for figur 2 using stammer med CAN1 på sitt normale sted på kromosomet V (A) eller på den høyre arm av kromosom VIII (b). Celler ble dyrket på fast medium ved 30 ° C før biotin merking og ved 20 ° C deretter. Observerte frekvensverdier vises med oransje søylene (OBS) og spådde frekvenser for alderen celler er vist med brune kolonner (PRE). Den første kolonnen for hver graf viser gjennomsnitt og standardavvik av den første mutasjon frekvens etter biotin merking for fire uavhengige forsøk (PB). Tallene nedenfor søylene angir gjennomsnittlig antall bud arr for hver populasjon (Cell Age). Uavhengige predikerte verdier ble bestemt som beskrevet i § 7 i protokollen med hvert av de innledende rate verdier vist i figur 2A (IP kolonner) og 2B. Disse uavhengige verdier ble så gjennomsnittsberegnet. Observerte verdier er middel for tre forsøk. Feilfelt angir standardavvik.

Discussion

Denne protokollen kombinerer flere metoder for å aktivere ressurser og tilnærminger tilgjengelig i Saccharomyces cerevisiae modellsystem for å bli effektivt anvendt til studiet av genom ustabilitet under mitotiske celle aldring. En lang rekke analyser for å kvantifisere forskjellige former av genom ustabilitet gjennom fenotypisk valg kan kombineres med magnetisk sortering for å studere mulige aldersspesifikke endringer i akkumulering av bestemte former for mutasjoner eller kromosom rearrangementer. Mens hel-genomsekvensering tilnærminger kan gi mer informasjon om de overordnede typer endringer som forekommer i et genom med alderen, evnen til å bruke fenotypiske utvalg systemer for å få mutasjon rate målinger og å fortrinnsvis isolere bestemte typer genetiske endringer er viktige fordeler for å studere mekanistisk aspektene av aldring-relaterte genomet ustabilitet. Strømlinjeforming av bestemmelse av cellealder og potensialet for å gjøre parallelle målinger av fysiologiskcal endringer gjennom flowcytometri gi effektiv måte å relatere genomet ustabilitet med andre celleforandringer under bestemte aldersgrupper. Fastsettelse av eventuelle aldersavhengige endringer i prisene for akkumulering av mutasjoner krever: 1) forsiktig fastsettelse av priser hos unge cellepopulasjoner, 2) nøyaktig bestemmelse av celle alder, og 3) muligheten til å pålitelig berike tilstrekkelig store populasjoner av mors celler til reproduserbart måle genomet ustabilitet i alderdommen. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for gjæren modellsystem for å bidra til å definere underliggende mekanismene som er ansvarlige for aldersavhengige endringer i priser og / eller frekvensene av genom ustabilitet i mitotisk aktive celler. Videre kan genetiske og miljømessige faktorer være raskt vurderes for bidrag til aldersavhengig genom ustabilitet. Til syvende og sist, kan disse karakteristikkene føre til utvikling av modeller som står for den måten som mutasjoner akkumuleres i løpet replikative aldring.

Denne metode avhenger av evnen til å påvise mutasjoner eller andre typer av genom ustabilitet gjennom forekomsten av valgbare fenotyper for å måle forekomst av slike hendelser. Imidlertid kan kreativitet i analyse utforming tillate mange aspekter av genomet ustabilitet å bli undersøkt. For eksempel kan den URA3 og CAN1 gener bli plassert på forskjellige genomiske områder for å teste eventuelle påvirkninger av genomisk posisjon på resultatene. Reversering av spesifikke ikke-funksjonelle genet lene til funksjonelle genet lene kunne teste bestemte mutasjons prosesser. Dessuten kan innføringen av flere inaktive alleler av et gen eller flankerende et gen med gjentatte sekvenser bli brukt til å undersøke rekombinasjon hendelser ved tilbakeføring eller tap av genfunksjon, respektivt. Svingnings tester er standardmetoden for å fastsette priser på disse ulike genom ustabilitet hendelser ni. Protokollen er skrevet ved hjelp av godt akseptert og relativt grei Lea-Coulson median estimator å bestemme mutasjon sats for å gjøre det mer tilgjengelig for ulike forskere, selv om MSS-maximum likelihood estimator metoden regnes som den beste tilnærmingen for å bestemme mutasjon priser ni. Den MSS-maximum likelihood estimator er tidligere gjennomgått i detalj 9, og kan brukes som en alternativ metode, men krever mer sofistikerte beregninger. Alternativt har gratis programvare for å beregne mutasjon priser med denne metoden blitt gjort tilgjengelig 22. Innhenting reproduserbare målinger av mutasjon priser krever oppmerksomhet til noen aspekter av eksperimentell design, blant annet ved hjelp tilstrekkelige replikere kulturer, inokulere kulturer ved lave nok innledende celletetthet at bestandsstørrelsen øker med 10.000 ganger eller mer, og velge hensiktsmessige kultur volumer slik at hele populasjon av celler kan spres på selektivt medium. For det sistnevnte punkt, kan en formel som tidligere er beskrevet kan brukes til å justere den mutasjonsfrekvens basert på den fraksjon av kulturen tested ni. Variasjon i vekstrate av kulturer kan komplisere fastsettelse av en reproduserbar mutasjonsraten, og en modifisert median-basert estimator som kan gi mer reproduserbare resultater i slike situasjoner har nylig blitt beskrevet 23.

Evnen til å måle cellealder er en annen faktor som er viktig for å etablere hvorvidt genom ustabilitet frekvenser i gamle celler er forskjellige fra de forventede verdiene på grunn av hastigheten av hendelser hos unge celler. Vi har funnet WGA flekker å være å foretrekke å calcofluor hvite flekker, både når det gjelder bakgrunn og fleksibilitet, siden WGA er tilgjengelig konjugert til forskjellige fluorescerende molekyler. Denne fleksibiliteten kan gi flere muligheter for samtidige målinger av andre celle egenskaper med fluorescerende reagenser. Innledende arbeidet med å etablere en sammenheng mellom signalintensitet for WGA farging og tilsvarende antall bud arr på cellene kan da føre til en merhurtig bestemmelse av cellealder ved strømningscytometri. Denne tilnærmingen gjør også bruk av større bestandsstørrelse enn det som ville være typisk undersøkt ved mikroskopi for bedre reproduserbarhet av målinger. Mens alle aldersbestemmelser kan gjøres gjennom mikroskopisk undersøkelse av cellene, føler vi at flowcytometri tilnærming forenkler rask screening av faktorer som påvirker aldersavhengig genom ustabilitet.

I tillegg til å måle cellealder på en pålitelig måte, må tas i betraktning for å bli gitt til antall celledelmodercellene får lov til å gjennomgå med hver suksessive runde av vokser og sorteringscellene. Bruk av en mindre opprinnelig populasjon størrelse eller større kulturvolum kan tillate cellene å gjennomgå flere celledelinger før den når den ønskede celletetthet. For eksempel, har andre forskere brukt bare to runder av sortering å skaffe svært gamle gjærceller 16, som har den åpenbare fordelen av å skaffe gamle celler med færre experimental trinn. Ved vurderingen av om å øke kultur volum slik at cellene til å fullføre flere celledelinger før sortering, husk grensen på det totale antall celler som kan behandles i en enkelt kolonne. Bruk av en større kulturvolum kan nødvendiggjøre bruken av flere kolonner for å sortere en cellepopulasjon. Også, hvis cellene gjennomgå færre runder med celledeling mellom sorterer / innsamlingspunkter, så det er flere muligheter til å observere avvik fra forventet mutasjons frekvenser ved forskjellige tidspunkter under levetid. For eksempel kan prøvetaking bare på tidlig og sent tidspunkter under levetid produsere data som indikerer en jevn økning i mutasjonsfrekvens, men prøvetaking på flere mellomtider i løpet av levetiden kan vise at mutasjon frekvensen øker raskt og deretter platåer. Imidlertid, siden denne protokollen isolerer gamle mor-celler, er det en mulighet for å oppnå en mer direkte måling av endringer i mutasjonsrater med alderen. Svingning tester kunne be utført ved hjelp av mors celler i ulike aldre for å avgjøre om mutasjonsraten vil være forskjellig fra frekvensen oppnådd ved hjelp av små celler. Mens kulturene for disse svingningsprøver vil bli en blanding av store og små celler som de vokser, kan eventuelle avvik fra prisene oppnådd som starter med små cellene kan tilskrives bruken av en eldre startpopulasjonen.

Evnen til å reproduserbart skaffe en stor nok bestand av gamle mor celler til å måle genomet ustabilitet er avgjørende for å lykkes med denne tilnærmingen. Mens protokollen beskriver bruken av en bestemt magnetisk sorteringssystem for dette formål, har andre grupper sortert gjærmoderceller med alternative systemer 14,18 (se tabell of Materials). Slike alternative systemene bør også arbeide med denne metoden, men noen optimalisering av produsentenes protokoller kan være nødvendig. Uavhengig av den spesielle system som brukes, størrelsen populasjon kreverd varierer avhengig av frekvensen av den type av mutasjon eller genom omleiring valgt for studien. Som et minimum, må det være nok moderceller for å oppnå minst en mutant koloni pr befolkningen til å beregne en mutasjonsfrekvens. I praksis kan resultatene være ganske variabel hvis forventes bare null til fem mutante kolonier fra bestandsstørrelse, og selv en liten økning i bestandsstørrelsen, slik at fem på ti mutante kolonier er forventet, i stor grad kan forbedre reproduserbarhet. Når biotin merking av en start befolkning, oppsamlingseffektivitet for hvert slag som må tas i betraktning for å finne den riktige populasjonsstørrelse nødvendig å måle mutasjonsfrekvens i gamle moderceller. Med 90% gjenvinning av mors celler etter hvert slag, ville bare 59% av den opprinnelige befolkningen gjenopprettes etter fem runder med vekst og sortering. Dette faller til ~ 33% gjenvinning av den opprinnelige populasjon etter fem runder av vekst og sortering hvis bare 80% av merket modercellene gjenoppretteed i løpet av hver sort. Måle og maksimere utvinning er avgjørende når du måler lavfrekvente hendelser, siden en to til tre ganger reduksjon i størrelse befolkningen lett kan føre til upålitelige antall muterte kolonier per befolkningen.

Det finnes mange alternativer for å utvide eller endre denne protokollen for å få en bredere forståelse av genomet ustabilitet under mitotisk celle aldring. Enkle eksempler er å analysere hvordan endringer i genfunksjoner, medieendringer eller andre miljøtilstanden endringer endre opphopning av mutasjoner med alderen. Mutasjon priser for unge celler med endret gen-funksjon eller i den aktuelle tilstanden ville bli målt og brukes til å avgjøre om mutasjoner akkumuleres annerledes enn spådd av verdiene og annerledes enn hos kontrollcellepopulasjoner. Cellepopulasjoner ved forskjellige punkter i løpet av replikative aldring kunne bli utsatt for bestemte belastninger, slik som reaktive oksygenarter eller DNA-skadende midler. Aforbigående og mild eksponering for oksidativt stress ikke vesentlig endre evnen til å utføre cellesortering (figur 3), men hardere påkjenninger kan vanskeliggjøre gjenvinning av celler. Foreløpige eksperimenter ville være nødvendig for å bekrefte at moderceller kan fremdeles bli effektivt gjenvunnet etter spesielle påkjenninger. I tillegg kan de cellulære egenskapene til moder isolerte celler bli analysert i detalj, inkludert nivåer av reaktive oksygenforbindelser, mitokondriell og vacuolar morfologi, og andre fysiologiske egenskaper som er forbundet med aldring 3. Videre kan modercellene være en start populasjonen for en ytterligere behandling eller manipulering. Siden mor og datter-celler er fysisk atskilt under prosedyren, dattercellene er også fremdeles tilgjengelig for analyse. For eksempel endringer i fysiologiske karakteristikker av datterceller eller asymmetrisk arv av skadde makromolekyler mellom gjær mor og datterceller S. cerevisiae modellsystem for å bli effektivt anvendt for å undersøke mekanismer som er ansvarlige for akkumulering av genetiske endringer i den mitotiske celle aldring.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd R00AG031911 fra National Institute on Aging av National Institutes of Health til PHM Innholdet i denne artikkelen ikke nødvendigvis offisielle utsikt over National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 100 mg
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 25 columns suitable for QuadroMACS separator
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976 Separator Only
QuadroMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-051 Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm BD Biosciences 352340 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146 Powder, filtering after dissolving important to remove particulates
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 Life Technologies W11261 Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930 10 ml, other antifade reagents could also be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
  2. Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
  3. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
  4. Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
  5. Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
  7. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
  8. McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
  9. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
  10. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
  11. Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
  12. Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
  13. Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).
  14. Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
  15. Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
  16. Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
  17. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
  18. Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
  19. Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  20. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  21. Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
  22. Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
  23. Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
  24. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).

Tags

Mikrobiologi Aldring mutasjoner genom ustabilitet, Fluktuasjonsprøven magnetisk sortering mor celle replikative aldring
Kombinere Magnetic Sortering av Mor Cells og svingninger tester for å analysere Genome Ustabilitet Under Mitotisk cellealdring<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, M. N., Maxwell, P. H.… More

Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter