Summary
突变率在通过波动测试测量年轻酿酒酵母细胞被用于预测不同的复制年龄的母细胞的突变频率。磁分选和流式细胞术，然后用于测量实际的突变频率和母细胞的年龄，以确定从预测的突变频率的任何偏差。
Abstract
酿酒酵母一直是一个很好的模型系统，研究机构和基因组不稳定的后果。从该酵母模型中获得的信息是相关的许多生物，包括人类中，由于DNA修复和DNA损伤应答因子在不同物种以及保守的。然而，S酵母尚未使用，充分满足时代的积累而增加复制（有丝分裂）突变的变化率是否由于技术的限制。例如，酵母复制寿命，通过显微测量涉及的细胞非常小的群体，其中禁止检测罕见的基因突变。遗传方法通过诱导子细胞的死亡以富集母亲细胞群已经被开发，但是总体大小是由与随机突变妥协的选择系统发生的频率仍有限。目前的协议采用磁索尔蒂的优势表面标记的酵母母细胞纳克获得老娘细胞通过表型选择量化罕见的基因突变的足够大的人群。突变率，通过波动测试测量，并且突变频率首先建立了年轻细胞和用于预测在各个复制青睐母细胞突变的频率。突变频率，然后对排序母细胞确定，并且母细胞的年龄是使用通过用荧光试剂，其检测在细胞分裂过程形成在它们的细胞表面芽疤痕染色流式细胞术测定。然后根据细胞分裂，以实验观察到对于给定的复制年龄的母细胞的频率的数量的预测突变频率的比较，可以识别是否有累积突变的速率与年龄有关的变化。这一基本协议的变化提供了手段来调查改变的特定基因功能的影响或在突变的积累特定的环境条件下复制衰老过程中解决机制的基本基因组的不稳定性。
Introduction
微生物，例如酿酒酵母 ，是优良的模型用于研究的突变率，但这些模型没有被充分利用的细胞有丝分裂的老化过程中，调查突变的累积。突变积累在核基因组中已经假设通过造成的渐进性丧失（或变化）的基因功能1促进老化。使用微生物系统，从而学习机制和突变的积累后果老龄化将大大加快影响这一过程的遗传因素和环境因素，因为浅显的遗传系统，识别和易于量化的微生物罕见的表型变化过程中的能力。 DNA修复因子和DNA损伤应答蛋白是高度保守的跨不同种类2，并且在生物体的老化基本相似性已被确定为生物体等不同的S。酵母的ð哺乳动物3，使它有可能从酵母中研究获得的结果将是相关的许多生物的衰老。
在S老化研究酵母利用衡量时性衰老或细胞复制衰老2老化模型。时性衰老的特征在于存活力的酵母细胞群是在非分裂状态（固定相）的渐进性丧失，由于养分耗竭3。的时间发生的老化模型已用于证明突变的积累而增加4岁时，由于大的细胞群在该模型中容易地得到执行的表型选择的突变体细胞。在这种情况下，突变积累似乎是由生长信号传导途径和氧化应激5的影响，并且每个这些因素是相关的理解在多细胞真核生物3老化。在复制衰老模型利用了不对称divisi在与南酵母母女细胞研究出现了连续的单元格代3老化。酵母复制衰老往往是通过母亲和女儿的细胞，或者更近，通过酵母细胞的小种群的视频显微镜的小种群的显微操作的微流体装置6,7测量。有限的人口规模使这些方法适用于除全基因组信息是从单细胞获得或频率非常高的遗传变化进行测量8有丝分裂过程中的老化研究基因突变的积累甚少。单个细胞的全基因组测序提供了大量的数据集，用于调查的突变积累，但表型选择系统具有提供测量突变率学习机制底层突变积累的装置的重要优点。研究，探讨通过表型选择的haploi突变频率与房价复制衰老期间ð酵母菌株还没有被报道。
突变率是使用波动测试9常用的测量。突变频率值反映细胞窝藏在一个群体中的基因序列的变异的总数。这包括其中独立的突变发生的细胞和那些细胞简单地继承预先存在的突变的任何后代。与此相反，通过波动测试测量突变率表示的是新出现的每个单元产生独立的突变的数目。这些测试通常涉及以低细胞密度接种许多复制培养，以减少在靶序列中添加细胞与预先存在的突变，生长的培养物至接近饱和，并通过在选择性培养基上生长鉴别突变的细胞的可能性。然后，在若干数学模型中的一个用于复制的人口确定突变的细胞的数目来估计i的数ndependent突变增长9期间出现。的独立突变的数量相比较的平均群体大小为突变率的一种量度。在S酵母突变频率和速率是经常使用的URA3和CAN1基因检测，因为丧失功能的突变，这些基因产生可选择的表型。 URA3功能的丧失使细胞的抗5 -氟乳清酸（5-FOA），由于由URA3编码的蛋白质转换成5-FOA成无毒分子10。的CAN1功能丧失使细胞产生耐药性刀豆氨酸，一种有毒的精氨酸类似物，由于CAN1编码的蛋白质运输精氨酸和刀豆氨酸进入细胞11。
遗传和物理分选策略已成功地获得较大的S.种群酵母母细胞，以方便复制性衰老的调查。遗传策略，包括对子代细胞的存活人口中选择聪明的做法。母富集程序（MEP）涉及的β-雌二醇诱导Cre重组酶的表达仅在子细胞中，从而导致该被加工成含有loxP位点12的两个基本的基因女儿特异性破坏。 MEP的菌株通常可在不存在诱导物的生长，但只母细胞将继续分化诱导后，而子细胞会通过细胞周期12的第一进展过程中阻止在M相通常。而此系统还没有被使用的老化过程中，广泛地研究的突变积累，它已被用于研究杂合性丢失，在二倍体酵母菌株的基因组不稳定性的一种相对常见的形式，以及生化改变在老化母细胞13,14。同样，女儿避雷器系统涉及S的女儿特异性表达cereviSIAE URA3基因15。子式避雷器菌株生长正常，直到5-FOA被加入到培养基中，在其中表达的URA3点的子细胞就会死亡，而母细胞继续生长15。这些都是非常有用的系统，丰富的母细胞，但它们依赖于维护构成选择系统的基因功能。在选择系统中的一个或多个部件的随机突变可能导致子细胞逃脱的选择和增殖指数。在环保部的菌株开发，适当的人口规模是确定的，以避免突变的子细胞可能逃脱选择12的外观。然而，这种限制人口规模妥协的基因组不稳定性的罕见形式的检测复制衰老过程。这种限制对人口规模可以部分克服了使用二倍体酵母菌株，每个基因的两个拷贝有助于选拔制度，因为大多数突变很可能是隐性12。然而，使用二倍体菌株的限制，可以容易地检测出相对于那些可以在单倍体酵母细胞中可容易地检测突变事件的类型。
物理分选策略包括母细胞与未标记的子细胞标记细胞表面分离富集母细胞的大量人口。 S的 观察到的细胞表面蛋白（细胞壁蛋白） 酵母子细胞中出芽已经没有利用标记，他们生产16子细胞标记母细胞是新合成的。例如，标记为在其表面上带有生物素的酵母细胞的初始群体可以生长，然后使用抗生物素微珠及磁性分选器16，因为由初始种群中产生的子细胞不包含在其表面上的生物素的子细胞中分离。串行增长和排序允许获得和分析母细胞逐渐年长人群。这个过程已被成功地用于研究酵母13,14,17,18的复制衰老过程中改变细胞生理学和基因表达。当前方法适应这个生物素标记及磁性分选技术为母细胞充实与测量的潜在稀有突变或通过表型选择的检测其他形式的基因组不稳定性的积累的目的。串行生长和物理分选允许突变积累在逐步老年人母细胞的分析，以及在它们的子代细胞种群。突变率每一代的确定允许的预测突变频率来计算对已经历细胞分裂的一个特定号码母细胞。因为预测的频率值是基于预期的增加，由于附加轮的细胞分裂，大幅偏离于所观察到的穆塔蒂上的频率相对于所预测的数值提供证据的累积突变的速率年龄特异性的变化。使用该协议，有对应于上通过流式细胞术结合分析母细胞的细胞分裂位点芽疤痕荧光染色可用于快速地确定有序和无序的人群的年龄分布。附加的荧光试剂，例如那些用于检测活性氧，也可以在此协议中使用。总体而言，该协议使得能够在基因组的不稳定性依赖于年龄的变化与相关性年龄相关的细胞生理变化的模型生物体适合研究了影响衰老相关的基因组不稳定性的遗传和环境因素的潜在有效的分析。
Protocol
1，准备媒体与解决方案
- 生长用酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）的标准协议，丰富培养基的细胞。制备2％细菌用蛋白胨，1％酵母提取物，对于YPD培养基2％葡萄糖溶液，并添加2％细菌用琼脂的固体培养基上19。高压灭菌消毒。使用另一种介质，如果需要的话，要测试的特定生长条件或突变酵母菌株。
- 使固体完全合成培养基缺乏精氨酸与60 mg / L的刀豆氨酸（SC-ARG +刀豆氨酸），选择刀豆氨酸抗性的突变体。制备的溶液是无氨基酸，2％葡萄糖，0.2％的完整补充混合物不含精氨酸（差混合物）0.67％细菌用酵母氮基，2％细菌用琼脂19。高压釜中并冷却之前从20毫克/毫升的储备溶液加入刀豆氨酸（过滤灭菌，保存于4℃）19。
- 使含有5 - 氟乳清酸（5-FOA）的固体合成完全培养基中。准备500ml的溶液是1.34％细菌用酵母氮无氨基酸和碱，4％葡萄糖，0.4％的完整补充混合物，和0.2％的5-FOA的过滤消毒19。高压灭菌500毫升的4％细菌琼脂液，清凉简单地说，然后拌入500毫升过滤灭菌营养液。使用合适的替代媒体为其他突变检测。
- 用于生物素标记，制成500毫升的1X的磷酸盐含有137毫摩的氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10.14毫摩尔磷酸氢二钠，和1.77毫摩尔磷酸氢二钾，pH值缓冲盐溶液（PBS）中的溶液8，储存于4℃，并保持在在使用过程中的冰。
- 一个最新的5毫米的生物素的股票在无菌超纯水。
- 淬火生物素标记，制成500毫升的1X的PBS中，100毫米甘氨酸。储存在4℃下和在使用过程中保持在冰上。
- 根据所使用的细胞和实验的持续时间的数目，使1-2升含有1x PBS，2毫摩尔EDTA，0.5％bovi珠标记缓冲液NE血清白蛋白。过滤除菌和去气缓冲器。储存在4℃下和在使用过程中保持在冰上。
- 准备一个0.4％台盼蓝溶液在1X PBS，过滤消毒，并储存在室温细胞活力测试使用。
- 麦胚凝集素（WGA）的荧光缀合物的等分小体积（约100微升），以在-20℃下在铝箔包裹（或不透明）的微量离心管中存储用于确定小区的年龄。
2，测定突变速率和频率的
- 建立每个细胞生成使用波动测试标准培养条件下生长的细胞基线变异率。生长7至11复制1毫升文化从1,000-5,000个细胞/毫升的初始密度，以早期稳定期（〜10 8个细胞/毫升）中。
- 对于每个重复培养，稀释细胞1：2000和传播1-4微升到非选择性培养基（YPD），以确定菌落形成单位/毫升。佩莱在〜2400 x中剩余的细胞克在离心重悬在100μl水中1分钟，涂抹在选择性培养基，以确定突变。孵育板的前计数菌落三天30℃（根据需要，基于细胞的生长速率调整孵育时间）。
- 确定的，基于获得的选择性培养基上的菌落突变体（R）的数目发生在试验独立突变（ 米 ）的数目。使用LEA-库尔森中位数估计代突变菌落位数的R低于9公式中找到米 。然后替换值米直至方程的左边是几乎为零。
- 以确定突变率，首先计算乘以复制培养和体积的平均集落形成单位/毫升的活细胞涂布在选择培养基上的平均数目文化的传播毫升到选择性培养基。通过活细胞的这个平均数除以从步骤2.1.2 m值以获得每个细胞产生的突变率。
- 分别计算作为在步骤2.1.3中描述的活细胞在试验涂布在选择培养基上对每个复制培养的数量。除以活细胞涂布在选择培养基上，得到的突变频率的数目得到的培养突变体菌落（r）的数目。在步骤2.1中作为基线突变频率使用个别突变频率的平均值或中位数的复制培养。
- 使前，后的生物素标记的细胞（步骤3.2和3.4）的频率测量，以确定该标记步骤的结果中的突变，这将需要的频率的任何变化，以检测在突变积累特定年龄变化时予以考虑。
3，生物素标记
- 圣reak S。酵母从甘油在-80℃到YPD培养基和培养，在30℃下1-3天。
- 使用无菌移液管尖端，从平板划线到1ml水饲养的（或多个）传输单元记住1-1.5厘米的条纹的较厚生长部将给予约10 8个细胞。确定确切的细胞密度使用血球。
- 标签每株（或处理条件）每采集点上的突变频率将被确定或人口规模足以获得每个采样至少5-10突变菌落选择性培养基上10 8个细胞（基于突变频率从步骤2.2）。包括一个附加的10 8个细胞，每应变/条件基线测量。
- 按照标准程序从制造商，除了用5毫米的生物素试剂股票及孵育过程中轻轻摇动生物素标记。离心5分钟，在4℃下以3000×g离心所有离心步骤，S因斯纺丝温度超过400℃时可能会导致增加的细胞损失。最后一次洗涤后，悬浮细胞，以10 8标记的水个细胞/ ml的浓度。
- 检查使用台盼蓝染色细胞的活力。稀释10微升的细胞与23微升水，67微升的在1×PBS中0.4％台盼蓝。之前使用血球计分直播（未染色）和死（染色）细胞孵育至少40分钟在室温。
- 测量对基因组的不稳定性，细胞年龄，以及其他相关特性的基准值（参见第5，6，和7）。
- 转移的生物素标记的细胞至20ml每10 8个细胞的YPD培养基中的锥瓶中（约5×10 6个细胞/ ml）。生长培养物（S）16〜18小时，在20℃至10 8个细胞/ ml（四到五个小区几代）的近似密度，但不容许细胞达到稳定期。使用较短的培养时间的增长，在30℃。保持生物素标记为CELLS在4℃下长达几个小时，然后加入到培养基中，如果需要的话，以优化生长期和收集的定时。
4，珠标签和磁性分选
- 生长期后，稀释培养物的等分试样使用血细胞计数器测定细胞密度。离心沉淀细胞5分钟，在4℃下以3000×g的。倒掉上清液。
- 通过涡旋暂停沉淀在30ml珠标记缓冲液，然后离心，倾出上清液作为第4.1洗涤细胞。重复洗。
- 涡旋充分重悬细胞，50微升珠标记缓冲液，每10 8个细胞。加入2微升磁珠每10 8个细胞与涡简单地混合。在冰上孵育10分钟，周期性反转混合（修改从一个在线协议在http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>）。
- 用30ml珠标记缓冲液洗涤细胞三次。
- 每添加10 8个细胞0.5毫升珠标记缓冲液，并简要涡颗粒在介质中的设置只是，直到细胞悬浮。通过40微米的细胞滤网倒入50ml的管以除去任何残留的细胞团块。如果需要的话，离开细胞在冰上1-2小时之前装载在柱上。
- 按照制造商的建议协议磁列结合，清洗和洗脱磁珠标记的母细胞。对于标记细胞增多恢复，每次使用2×109个细胞中的至少一个列。
- 拆下装入列时，他们将阻止流动所发生的任何气泡。卸下并更换色谱柱上洗之间的分隔符，以防止细胞从珠（从网上协议的修改成为被困在http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf）。
- 保存从结合和洗涤步骤流经分析年轻细胞的母细胞产生的，如果需要的话。如在步骤4.7中所述浓缩的细胞。
- 使用多列分隔符，用于处理多个样本一次。同一样品在同一收集管的流出的多个列，以减少处理时间和减少的细胞损失。
- 通过以3,000 XG在4℃下离心5分钟，浓缩洗脱的母细胞。吸取所有，但1毫升每10 8原生物素标记的细胞缓冲区。涡短暂暂停细胞剩余的缓冲区。
- 稀释细胞的等分试样并弄脏用台盼蓝测定细胞密度和使用血球细胞活力（参见步骤3.5）。计算细胞中回收的总数量。
- 如果细胞的数量是基本上高于预期，通过洗脱样品通过另一列来尝试去除污染年轻细胞。如果细胞的数量是基本上低于预期，通过样品所保存的流过另一列来尝试改善母细胞的产率。
- 使用电池作进一步分析，在第5和第6或者描述，生长的细胞在YPD肉汤再次增加其复制的年龄（步骤3.7），并按照珠标记和排序（步骤4.1-4.8.1），而不需要重复的生物素标记。
5，确定复制型时代
- 旋转单元2分钟在5000 XG在室温下在本节中的所有步骤。把25微升回收的细胞（〜10 8个细胞/ ml）的入1.5ml的离心管中，用1ml的1×PBS清洗两次。吸了上清。
- 解冻WGA-共轭的等分，旋涡混匀，并简要地旋转，以消除蛋白聚集体。暂停单元在180微升的1×PBS和20μl的WGA的缀合荧光分子以日的表面上的标记芽痕E细胞。覆盖1.5毫升离心管中以箔，并培育轻轻摇动，在30℃下进行30分钟。
- 用1ml 1X PBS冲洗三次。
- 对于荧光显微镜，载玻片标签并使用防褪色剂按标准协议安装。密封盖玻片，以避免在成像过程中细胞运动之前完全固化载玻片在黑暗中（高达几天）。指望每个样品至少50个细胞芽痕，以获得细胞时代的代表性指标。商店幻灯片长达1个月的观察芽痕，如果需要的话。
- 或者，通过在细胞悬浮于1ml的1×PBS步骤5.1.2后流式细胞仪进行流量测定从WGA-缀合物的荧光信号的强度。使用405nm激发激光器和三十分之五百三十零nm发射滤波器，505纳米长通滤波器的WGA-Alexa的488包括未染色的控制，每个收集点。
- 年轻细胞和衰老细胞的计数显微镜图芽痕由在x轴的相同的细胞群中的WGA-共轭荧光对归一化的几何平均值y轴（染色的几何平均/未染色的几何平均数）。得到的线性趋势线这种关系的方程。对于随后的实验中，替换的细胞群体对于x的方程中的WGA-缀合物的荧光强度的归一化几何平均数和求解y以确定试样的平均细胞年龄。
6，突变频率
- 如在步骤2.1.1中所述扩散的排序从步骤4.7到YPD培养基中，并在选择性培养基中的缓冲液重新悬浮母细胞。使用1毫升悬浮母细胞在选择性培养基和自旋细胞以5,000 xg离心1分钟。
注：价差较大的稀释细胞体积上YPD培养基为细胞年龄的增长，以弥补增加的老年人口非活细胞和衰老细胞的数量。- 孵育YPD培养基并从选择性培养基平板步骤6.1在30℃下为3和4天。加大培养时间长达一个星期很老的细胞或缓慢增长的压力。如在步骤2.2中所述计算突变频率。
7，计算预测的突变频率给定复制性年龄
- 通过从已分类的母细胞的相关分类的平均年龄减去初始细胞群体的平均年龄计算在生物素标记的细胞在实验过程中的复制性年龄平均增加。使用在步骤5.2中计算出的细胞年龄或步骤5.2.2。
- 乘以增加在步骤7.1计算平均细胞年龄在步骤2.1.3中获得的突变率。此值添加到基线突变频率为计算在步骤2.2确定预测的突变频率为有关复制的年龄的细胞的初始群体。
Representative Results
在图1的流程图所示的总体步骤的程序，包括在该突变率，频率，和细胞年龄测量的各点。精确确定的频率和突变（或其它形式的基因组不稳定性）在年轻细胞群的速率是重要的第一步，由于需要用于选择适当的群体大小为标签和磁分选。速度值可以使用波动测试9成立。实施例结果的酵母菌株中选择用于在CAN1基因发生突变而赋予了URA3基因赋予对5-FOA刀豆氨酸抗性或突变BY4741遗传背景20示于图2。使细胞生长在20℃下为代表率的实验，并且在20℃和30℃下代表频率的实验。这些温度被使用，因为最初的细胞群生长在30℃下进行再生长，在20℃下进行后续的代表选实验。从独立试验速率值是可比的初始细胞群和细胞的菌株具有CAN1基因在其正常位置上的染色体V生物素标记后，从左侧臂端粒约32千碱基对（ www.yeastgenome.com ）（ 图2A，薰衣草列）。 CAN1的突变率在第二酵母菌株，有一个缺失从其正常位置CAN1基因在染色体的V和CAN1对第八号染色体从端粒约25千碱基对的右臂插入初始种群大幅上涨21（ 图2B）。CAN1基因突变频率也可比对初始细胞群和生物素标记的细胞在两种生长温度（ 连接gure 2A，蓝色的列）。然而，在20℃下得到的突变频率被发现是比突变频率在30℃以上。为了检验这一温度效应是否仅限于CAN1基因，我们测量了在URA3突变通过使用酵母菌株具有CAN1插入染色体上的第VIII选择用于抗5-FOA。该菌株也具有从其染色体上V设置站点的删除URA3的和URA3插入到染色体VIII从端粒21约40千碱基对的右臂。突变频率也于20℃为URA3更高在这个染色体位置（ 图2C）。总的来说，这表明，生长温度可能会影响突变的频率，但是生物素标记似乎不影响突变频率。因此，突变率和频率的初始人群需要在相同的生长坦佩确定叉涂抹在将被用于发的生长和分选。最好是，以验证生物素标记不使用该协议来调查其他类型的突变或基因组的重排之前，影响基因组的不稳定性。
正如预期的那样，在图2A所示的突变率值比相应的频率测量几倍以下。出现这种差异，因为突变率测量细胞的新突变与每个轮细胞分裂的外观，而突变频率测量突变的细胞中的人口数累计在生长周期结束。用于这些试验的速率和95％置信区间表明，可重复的结果可以通过使用每案7复制培养，这是重复的最小数目建议用于此协议来获得。
一旦初始频率和速率值确定，人口规模应为CHOSEN，确保足够的细胞是多轮分选，以可靠地确定突变频率后本。标记每个时间点是在老化过程中的待分析10 8细胞的细胞群是适当时的频率和速率是相似于图2A所示。这一决定也取决于妈妈如何有效地标记细胞每一轮整理后回收。回收标记的母细胞的效率可以通过使用血细胞计数器确定细胞从列于每个排序洗脱的数量，并研究细胞形态快速地和简单地进行评价。两个要点由例如回收效率数据（ 图3A）所示：细胞的回收数量可能会出现较高的第一个排序后的预期，并且细胞的小渐进性丧失预期与续分拣。在高于预期的细胞，在某些实验中，第一种可能后，RESULT从芽细胞上的初始群体的标记。确定细胞与生物素标记的数量当与芽酵母细胞通常会被记录为一个单元格。芽存在于初始种群的标签，但是，将允许来自这些嫩芽发展的细胞也可以在排序过程中保留在列。这发生在回收效率的确定的影响取决于出芽细胞的初始细胞群的比例。对于较高的细胞数的第二个潜在原因后排序之一是有更趋于大芽细胞在这个时间点的分选过程中可完成细胞分裂。其结果是，大芽仍附着到其母亲的细胞可以被排序，但随后被洗脱的细胞进行检查时显示为不同的细胞。而细胞的一些损失与每一轮的增长和分选的观察，该协议可以导致在细胞中的80-90％每轮号后可靠保留orting。它是值得的实践过程，以确保该标记的细胞的80％或更多被隔离，以避免需要将标记不必要的大的初始细胞群。细胞与第一类（1毫米的过氧化氢在YPD培养基30分钟）后应激治疗并没有阻止细胞继续生长轮和排序的有效恢复，虽然有在回收一些可变性后的第一排序的应力（ 图3A）。
细胞的形态和生存力的检查也都确认母细胞的成功分离并用于调节在非选择性培养基中扩散的细胞时，用于确定的菌落形成单位的密度稀释/体积有用。母细胞变得越来越大，越来越不规则形状随着时间的增长，相对于子细胞（ 图3B）。因此，母细胞的样品应主要包括大，内部收益率egularly状细胞作为实验的进行，通过每一轮的排序。规则形状的许多小的椭圆形细胞的存在可能表明母细胞没有被充分地从子细胞分离。母细胞的存活率也应循序渐进，每一轮成长和排序的下降，虽然有在第一九时五十五细胞代可能不会有太大的变化。能够形成集落的细胞的数目可以更大幅度降低比被确定通过某种形式的直接染色对细胞的完整性是可行的，由于形成衰老细胞中的细胞数。当用直接染色方法的可行性第一开始下降（约80％或更少），则可能需要调整用于测量菌落形成单位密度在预期的更急剧下降，在活细胞的能力的稀释和卷形成集落（二至数倍减少）。
该复制年龄排序人群和对照人群的需要确定之前，从母细胞的突变频率数据可用于在累积突变的速率特定年龄的变化进行分析。这可以通过芽伤疤母细胞人工计数（ 图4）或通过流式细胞术来完成量化的芽痕检测试剂（ 图5）的信号。芽疤痕可以带有使用WGA-荧光偶联物（ 图4C）相对较低的背景信号。 图4A显示，大部分细胞通过分选过程的样品的流动具有零个或一个芽痕。从柱中洗脱的细胞主要是年龄母细胞（ 图4B和图5）。典型地，> 90％的洗脱细胞是母细胞，从而可以更容易地从流式细胞仪结果的流程图5中可以看出。细胞相对较少的芽痕（<6）OBTained超过两次排序可以代表污染的细胞是没有生物素标记的经历几轮细胞分裂有关的一轮增长的过程中，而不是被分割得很慢母细胞后。在细胞年龄的变化可能会增加与随后的几轮，如果不是所有的细胞在人口不断增长是一致的排序。
较大的细胞群可用于更快速地评估细胞年龄是否具有线性关系是WGA-荧光信号强度与每个细胞芽疤痕的数目之间建立通信。对于这种分析，所有的WGA-荧光信号强度的归一化是通过对相应的未染色的细胞群（女儿或母亲）以考虑在较旧的细胞中增加背景荧光得到的信号染色的细胞的信号除以完成。 图4和相同的代表细胞群体的5示出的分析。人工计数建立平均复制的年龄为0.95和11.4的子细胞（ 图4A）和母细胞群体（ 图4B），分别。对于这两个群体和三个附加种群归WGA-信号（平均年龄为3.0，6.9和14.4）中作图的芽疤痕对每个群体（ 图5B）的平均数目。这种线性关系然后可用于在以后的实验中相同的菌株和试剂，以确定平均细胞年龄从通过流式细胞仪获得的，从而允许快速，准确地测定细胞年龄的归一化WGA-信号。控制人口仍应被列入验证试验相似的染色效率。
年龄对突变的积累的影响可被寻址一次在先步骤获得的突变率的值，有效地分选的细胞，并测定细胞的年龄都完成了。怒江的时间点MBER时的频率可以被确定依赖于生物素标记的细胞群体的大小和细胞需要被散布在选择性培养基上，以获得可靠的结果数。如果随着年龄的变异率的变化，那么观察到的突变频率为老娘细胞应该不同于预期的完全基于额外回合的细胞分裂。所观察到的突变频率的比较来预测的突变频率可以识别在积累的突变率与年龄相关的差异。在协议中的第7所描述的，预测的频率可以从基线突变率的初始细胞群的增加和增加的突变频率为初始种群的母细胞的复制时代的产物而得到。增加CAN1突变频率都已经观察到增加细胞平均年龄在株CAN1在其正常位置染色体V（ 图6A）和与CAN1号染色体上的第VIII（ 图6B）的右臂的菌株。因为是所观察到的突变频率为母细胞在图6A类似，或者只是所预测的频率以下，则数据不提供任何证据的突变率的年龄特异性的变化。相反，突变频率与CAN1上VIII号染色体的菌株母细胞比所预测的频率（ 图6B）更高。注意，在图中所预测的频率就不会出现增加非常多，因为对数标度，必须使用用于y轴由于大的增加观察到的突变频率。因此，结果如图6B不提供证据支持的积累突变率的特定年龄的增加。在结果为数据集， 如图6A和6B的差别可能是由于迪菲租CAN1基因组的位置。这些类型的观测发展的假设，研究影响的突变率作为细胞年龄的机制，并制定模型来解释突变的积累与复制时代的起点。
对于在酵母复制衰老研究的突变积累的整体过程图1流程图。黑色文字和箭头指示的步骤主要步骤。弯曲的箭头反映了额外轮次的再生长，并且在同一细胞的分选的用于获得逐步旧的细胞。紫色的箭头和文字说明在该规定的测量时的步骤。频率 - 频率。
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图中年轻的细胞群2。测定突变频率和速度。 （A）的突变体菌落由扩展单元上的SC-精氨酸+刀豆氨酸培养基来选择功能丧失的突变的CAN1基因和相比存活细胞散布在选择性培养基上，以计算频率/速率的总数中选择。从生物素标记（IP）或生物素标记（PB）后前初始种群细胞，使用YPD培养基从5000个细胞/毫升的初始密度接近饱和生长。薰衣草列表示速率测量和蓝色列表示在所示温度下（20℃和30℃）制成的频率测量。七复制培养组生长的每个审判和四点五十八独立审判被执行。计算独立试验个体速率值被示出，并且对于这些试验误差棒表示95％置信区间确定D使用一个在线计算器22。频率代表均值和标准差。如使用上述的A部分使用了CAN1上的第八号染色体的右臂应变。（c）得到的突变频率下选择了突变菌落5-FOA获得和（b）表示CAN1突变率的菌株与位于染色体Ⅷ的右臂的URA3基因。方法是，否则为A部分，和平均值和标准差为三个或四个独立的试验中显示。
图3实施例进行排序，通过计算溶出的细胞数每一轮排序后测定效率。 （A）细胞在每种起始种群的总数之后，生物素标记被设置为1，并且将n细胞存在从每一轮磁性细胞分选的洗脱样品中的otal个数除以这些初始值，以获得标记的细胞的比例。总细胞数从使用血球获得的细胞数来确定。橙柱代表平均值和以下的标准协议标准偏差为三个独立试验。蓝色柱代表平均值和标准偏差，其中细胞在第一个排序后，立即用1mM的过氧化氢 处理30分钟两个独立的试验（B）大小和生物素标记（后生物素）和母细胞后细胞的形态学第三轮的磁性分选（3排序母细胞），使用标准的亮视野显微镜和20倍的目标显示后痊愈。在背景的白线是绑定在一个标准的血球可见的最小平方线。K“>请点击这里查看该图的放大版本。
图4测定采用手动芽痕计数复制时代。共聚焦显微镜依靠标有WGA-荧光共轭（激发波长488 nm和检测与543分之458纳米带通和505 nm的长传单个细胞芽痕过滤器的组合）。（一）经由（子代细胞的细胞流动手动芽痕数）以下的第三轮磁分选（N = 62）的（B）洗脱细胞的手动芽痕计数（母细胞）继第三轮的磁性分选（N = 54）的（C）母细胞保留下了第三轮的磁性分选的机智染色后使用具有3倍变焦63X油浸物镜拍摄哈哈WGA-荧光共轭。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图5测定采用流式细胞仪复制时代。10,000个细胞沾上了WGA-荧光共轭的样品通过流式细胞仪使用的激发，在488 nm和检测用三十零分之五百三十零带通和505长通滤波器组进行了分析。（一）直方图描绘细胞具有特定的WGA-荧光强度的子细胞群或经过三轮磁性分选的洗脱物（母细胞）的数量。群对应于图4中的分析。蓝色垂直线表示为广大的DAU的对应位置ghter细胞的母细胞直方图（B）在A中，每个人的细胞另外三个群体（平均年龄3.0，6.9和14.4）的荧光信号的归一化几何平均计算为几何平均的比值将染色的细胞和相应的未染色细胞群的几何平均值。这些值被绘制在比较的芽疤痕对每个总人口的平均数目（ 图4和数据未显示）。的R 2值的比较的趋势线给出的曲线图。
所描述的图2全光照的预测和观察到的突变频率之间的复制性衰老过程中的细胞与在CAN1基因突变图6的比较。入选克株CAN1在染色体V（A）其正常位置或第八号染色体（B）的右臂。细胞之前，生物素标记，并在20℃下后生长在固体培养基上在30℃。观察到的频率值显示橙色列（OBS）和老化细胞的预测频率显示为棕色柱（预）。每个图表的第一列中示出的初始突变频率为四个独立实验（PB）的生物素标记后的平均值和标准偏差。下面列的数字表示的芽疤痕对每个群体（细胞年龄）的平均数目。如在使用每个在图2A（IP列）和图2B中所示的初始速率值的协议的第7条所述的独立的预测值进行了测定。这些独立的值，然后取平均值。观测值是三次试验的装置。误差条表示标准偏差。
Discussion
该协议将多种方法，使资源，也可以有效地应用到基因组不稳定性的研究过程中的有丝分裂细胞的老化方法，可以在酿酒酵母中的模型系统。各种各样的实验，通过表型选择，将不同形式的基因组不稳定性可与磁性分选相结合来研究突变或染色体重排的具体形式可能积聚特定年龄的变化。而全基因组测序的方法可以提供关于整个类型与年龄的基因组发生的变化的更多信息，用表型选择系统来获得突变率的测量和优先隔离特定类型的基因变化的能力，是研究机械的重要优势老化相关的基因组不稳定性的方面。精简细胞年龄的决心和潜力，使physiologi平行测量通过流量校准仪的变化提供给关联与在特定的年龄范围等变化的细胞基因组的不稳定性有效的手段。中积累的突变率潜在年龄依赖性变化的测定，需要：1）在年轻细胞群小心判定率，2）准确地确定细胞的年龄，和3），以可靠地丰富母细胞可重复测量的足够大的种群的能力基因组不稳定的晚年。这种方法允许酵母模型系统，以有助于确定负责在速率和/或基因组不稳定性的有丝分裂活性细胞的频率依赖于年龄的变化基本机制。此外，遗传和环境因素可快速评估到年龄相关的基因组不稳定性的贡献。最终，这些特性可能导致该占其中复制衰老过程中的突变累积的方式模型发展。
该方法依赖于通过可选择的表型的出现来检测突变或其他类型的基因组不稳定性的测量这种事件的发生率的能力。然而，创意实验设计可以允许基因组不稳定性的许多方面进行调查。例如，URA3和CAN1基因可以被放置在不同基因组位点来测试基因组位置中的任何影响的结果。具体的非功能基因的等位基因的逆转，以功能基因的等位基因可以测试特定的突变过程。此外，引进的基因或侧翼与重复序列的基因的多个等位基因处于非活动状态，可以通过使用恢复或基因功能的丧失，研究重组事件分别。波动测试以确定这些不同的基因组不稳定事件9率的标准方法。该协议是使用广泛接受的和相对简单的LEA-库尔森位数估计，以确定木塔写化率，以使其更容易被不同的研究人员，即使MSS-最大似然估计方法被认为是用于确定突变率9的最佳方法。在MSS-最大似然估计进行了详细9预先审查，可以作为一种替代方法，但需要更精密的 计算。或者，自由软件来计算与该方法的突变率已经可用22。获得的突变率的重现性的措施，需要注意的实验设计，包括使用足够复制培养，在足够低的初始细胞密度接种培养物的几个方面，通过10,000倍或更多，并选择适当的培养体积用户数量的增加，以使整个细胞群可以被涂布在选择性培养基上。对于后一点，先前描述的公式可用于基于培养睾丸的级分来调节突变率D 9。变异在培养物的生长速率可以复杂化的重现性的突变率的测定，和改性中位数为基础估计可能产生在这样的情况下更可再现的结果最近已描述23。
准确地测量细胞年龄的能力的另一因素是用于建立在老细胞的基因组不稳定性的频率是否与预期值不同，由于事件在年轻细胞中的速率非常重要。我们已经发现WGA染色是优选calcofluor白色染色，无论是在背景和灵活性方面，由于WGA可用共轭到不同的荧光分子。这种灵活性可以与荧光试剂等电池特性同时测量提供更多的机会。最初的工作，建立了WGA染色信号强度和对细胞芽痕相应数量之间的关系，就可以导致更通过流式细胞仪快速测定细胞的年龄。这种方法还允许使用较大的人口规模比将通常检查显微镜，以提高测量的可重复性。虽然所有年龄的测定可通过细胞的显微镜检查进行，我们认为术方法的流程有助于影响年龄相关的基因组不稳定因素的快速筛查。
除了测定细胞年龄可靠，需要考虑到给予的细胞分裂母细胞被允许经历与每一个连续的圆形生长和分选的细胞的数目。使用较小的初始种群大小或更大的培养体积可以使细胞达到所需的细胞密度前进行更多的细胞分裂。例如，其他研究人员已经排序，得到非常老的酵母细胞16，其具有获取旧细胞具有较少experime的明显优点的使用仅两轮NTAL步骤。当考虑是否向增加培养物体积，以使细胞之前完成分拣更多的细胞分裂，记住在细胞上，可以在单个列中待处理的总数量的限制。使用较大的培养物体积的可能需要使用多个列的一个细胞种群进行分类。另外，如果细胞发生少发各种各样/采集点之间的细胞分裂，然后有更多的机会寿命期间观察与预期的突变频率在不同的时间点的偏差。举例来说，使用期限在采样只在早，晚的时间点可能会产生数据表明突变频率的稳定增长，但寿命期间的额外的中间时间取样可能会很快，然后高原表明，突变的频率增加。然而，由于该协议隔离旧母细胞，有机会得到更直接的测量变化的突变率随着年龄的。波动测试可以bê执行使用不同年龄段的母细胞，以确定突变率是否会有所不同使用年轻细胞中获得的速率。而培养这些波动测试将成为古老而又年轻细胞的混合物随着他们的成长，从开始获得与年轻细胞率的任何偏差可能是由于使用旧的起点人口。
可重复获得足够大的人口老龄母细胞精确测量基因组不稳定性的能力是这种方法的成功至关重要。而该协议描述了使用特定的磁分选系统用于此目的，其它基团已排序酵母母细胞替代系统14,18（ 见表材料 ）。这样的替代系统也应该用这种方法工作，虽然可以要求厂家“协议的一些优化。无论使用哪种特定的系统中，人口规模要求依赖于突变或基因组重排所选择的学习类型的振动d不同。在最低限度，必须有足够的母细胞，以获得每群中的至少一个突变的菌落来计算的突变频率。在实践中，效果可以说是相当的变量，如果只是零到五的突变菌落从人口规模和人口规模甚至小幅增长预期，使九时五十五突变菌落预期，可以大大提高可重复性。当生物素标记的起始群体，需要为每个分类的回收效率来加以考虑，以帮助识别所必需的适当的群体大小来测量在旧母细胞的突变频率。以90％的回收率母细胞的每个排序后，只有59％的原人口将经过五轮的生长和分选回收。这降到〜33％，恢复原有的人口经过五轮的增长，如果只有80％标示母细胞进行分选回收每个排序中编。测量低频率事件时，因为在人口规模二到三倍下降易造成人口比例的突变菌落数不可靠的测量和回收最大化是至关重要的。
有许多项增加或修改本协议的有丝分裂过程中细胞衰老，获得的基因组不稳定性的更广泛的理解。简单的例子包括在分析基因的功能，媒体的变化或其它环境条件的变化改变如何改变的突变与年龄的积累。突变率对于年轻细胞具有改变的基因的功能，或在适当条件下将被测量并用于确定突变是否积聚不同于预测的速率值和不同于在对照细胞群。在不同的点复制性衰老过程中的细胞群体可以被暴露于特定的压力，如活性氧或DNA损伤剂。 á短暂轻微暴露于氧化应激并没有显着地改变，以进行细胞分选（ 图3）的能力，但更严厉的应力可能复杂化细胞的恢复。初步的实验将是必要的，以验证母细胞仍然可以有效地具体讲后回收。此外，分离的母细胞的细胞特征可详细分析，包括活性氧，线粒体和液泡形态，和其他生理特性是与老化3相关联的水平。此外，母细胞可能是一个人口开始为进一步的治疗或处理。由于母亲和子细胞的过程中，在物理上是分开的，子细胞也仍然可以进行分析。例如，改变子代细胞或受损大分子的酵母母女细胞间的非对称遗传生理特性
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的，从国家研究所美国国立卫生研究院老龄化PHM被授予R00AG031911部分这篇文章的内容并不一定反映美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
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