Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è una piccola specie di teleostei originario dell'India che è un organismo modello utile per comportamentale 1 e Medical Research 2,3. Zebrafish sono anche comunemente usato nella sperimentazione di varie sostanze farmacologiche per caratterizzare il loro impatto sul comportamento. Vari dosaggi e orari di somministrazione dei farmaci sono stati utilizzati per studiare il comportamento del pesce zebra dopo la somministrazione di composti come stimolanti 4, ansiolitici 5 e etanolo 6-8.
Il nostro laboratorio ha studiato gli effetti dei diversi orari di somministrazione di etanolo su ansia zebrafish e locomozione in chiaro / scuro ben validato test 9, 20, anche comunemente indicato come il test scototaxic. Un nuovo metodo di somministrazione di etanolo è stata sviluppata per aumentare l'efficienza di ripetitivo, somministrazione giornaliera per un lungo periodo di tempo (21 giorni) 6 10-12. Anche se questo metodo è ampiamente accettato, compensazione zebrafish può aumentare la variabilità del tempo necessario per introdurre e togliere il pesce dalla soluzione della droga. Pertanto, l'esatta esposizione al composto di interesse può variare nel corso di un esperimento che coinvolge somministrazione ripetuta. Un metodo che riduce le fonti di errore derivante dalla variabilità dei tempi di trasporto è quindi desiderabile. Con il nostro metodo siamo in grado di spostare tutti i pesci simultaneamente, con conseguente tempo di dosaggio identico in ogni pesce. Dopo l'esposizione di etanolo (qui descritto), zebrafish può essere verificato in qualsiasi number di test comportamentali, compresi quelli che valutano l'ansia. Gruppi di pesci dosaggio utilizzando il nuovo metodo ha applicazioni pratiche al di là della capacità di replicare in modo accurato e standardizzare il dosaggio tra soggetti e tra gruppi di pesci. L'avvento di un nuovo software che consente la tracciabilità dei pesci multipli in una sola volta può vedere i ricercatori utilizzano i nostri metodi per garantire la replicabilità e la precisione nei loro esperimenti. Considerando l'uso diffuso di zebrafish come organismo modello per le neuroscienze comportamentali, questo metodo aumenta l'efficienza e praticità nei futuri studi farmacologici.
In questo paradigma, un programma di dosaggio ripetuto è stato impiegato che rispecchia circa orari bere umani. I pesci sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi: controllo, tutti i giorni-moderata, o settimanale-binge. Il programma di dosaggio è stato di 21 giorni di durata, scelto perché ha superato in modo significativo i tempi di esposizione in studi precedenti 7. Pesci di controllo ha ricevuto lo zero alcohol, pesce tutti i giorni-moderata ha ricevuto 0,2% di alcol una volta al giorno, e pesce settimanale-binge ricevuto 1,4% di alcol una volta alla settimana. Il / compito buio la luce è stata utilizzata per valutare l'ansia dopo 2 giorni di astinenza. Questo è relativamente semplice test per amministrare che utilizza un'arena rettangolare, in cui le pareti da un lato sono bianchi e dall'altro lato sono scuri 9. Zebrafish adulti preferiscono robusto il lato oscuro della scena in condizioni di controllo 6,9,13. Aumento ansia è operativamente definita come molto più tempo trascorso nella zona di buio, e diminuita l'ansia può essere assunta quando il pesce spende relativamente più tempo trascorso nella zona di luce. Con il software motion-tracking, altre variabili informative possono essere quantificati, tra cui velocità media, l'immobilità, meandri, e la zona transizioni 14.
Il metodo di dosaggio sviluppato nel nostro laboratorio può applicare a qualsiasi ricerca in cui i composti idrosolubili vengono somministrati una o più zebrafish. Molti altri agenti farmacologici che possono beneficiare di questa metodologia sono attualmente in fase di sperimentazione in zebrafish. Comunemente composti testati includono la nicotina, clordiazepossido, buspirone, e scopolamina, che vengono sciolti in un modo simile a etanolo; mescolando la quantità appropriata della sostanza chimica in acqua. Pertanto, la portata generale di questa procedura è molto più ampio e non limitato a etanolo. Inoltre, dopo la somministrazione di farmaci per più giorni, la luce / buio compito è soltanto uno dei molti test comportamentali che potrebbero essere impiegati. Dopo la somministrazione del farmaco o durante l'astinenza, altri saggi popolari che possono essere utilizzati includono il test di immersione romanzo serbatoio 15 e le prove di comportamento sociale, come shoaling 16. La procedura che segue illustrerà un metodo efficiente di trasferire più volte gruppi di pesci o di singoli pesci in soluzioni contenenti un composto farmacologico di interesse. Inoltre, il processo di ansia test con la luce di prova / scuroin gruppi di pesci che sono in ritiro dopo essere stati esposti a lunghi orari di somministrazione alcole verrà descritto.
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Protocol
Tutte le procedure e test comportamentali sono stati approvati da Research Animal Comitato Etico dell'Università di MacEwan con il numero di protocollo 06-11-12, che è in conformità con il Consiglio canadese per le linee guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali da esperimento.
1. Preparare dosaggio Serbatoi, soluzioni e schema di somministrazione
- Preparare un programma di somministrazione tale che gli animali vengono dosati nello stesso ambiente e nello stesso momento della giornata per evitare confusioni di tempo o di polarizzazione a stimoli visivi.
- Ottenere il maggior numero di identici, 1.5 L, chiare come serbatoi necessari per il numero di gruppi di dimensioni polipropilene di deposizione delle uova. Utilizzare i gruppi di 8 pesci per vasca, che permette per 2 gruppi di pesci da esaminare al giorno più avanti nella procedura (vedi punto 3). Utilizzare un serbatoio e un serbatoio di dosaggio per gruppo (2x numero totale di gruppi).
- Mettere 400 micron inserti di riproduzione in tutti i serbatoi. Fill i serbatoi con acqua habitat o ad osmosi inversa alla giusta temperatura (per zebrafish, 25-28 ° C), che è coerente con il pesce di temperatura sono normalmente alloggiati a.
NOTA: Ci possono essere interazioni chimiche indesiderate tra alcuni farmaci e le componenti chimiche dell'acqua habitat tamponata. In questa situazione, utilizzare acqua ad osmosi inversa tamponata con sali minimi o nessun acquario per la somministrazione del farmaco, così come per i gruppi di controllo. - Assicurarsi che i serbatoi sono in un ambiente neutrale per evitare di condizionamento pesce a stimoli visivi esterni durante il dosaggio.
- Mettere 400 micron inserti di riproduzione in tutti i serbatoi. Fill i serbatoi con acqua habitat o ad osmosi inversa alla giusta temperatura (per zebrafish, 25-28 ° C), che è coerente con il pesce di temperatura sono normalmente alloggiati a.
- Preparare la soluzione di droga. Mescolare la giusta quantità di farmaco con l'acqua habitat nelle vasche di riproduzione. Preparare la soluzione etanolica 0,2% combinando 3 ml di etanolo alto grado (95% etanolo non denaturato) con 1,497 ml di acqua. Preparare la soluzione etanolica 1,4% combinando 21 ml di etanolo con 1479 ml di acqua.
2. Rete di pesce e EtProcedura di Amministrazione hanol
- Pesce con attenzione netti da loro carri armati di habitat e il trasferimento nel serbatoio appropriato contenente l'inserto di deposizione delle uova. Idealmente, ospitare il pesce nel foglietto deposizione delle uova per eliminare compensazione del tutto.
- Con tutti i pesci nei loro rispettivi serbatoi di contenimento, sollevare delicatamente la deposizione delle uova inserire fuori dal serbatoio e posizionarlo nel serbatoio della soluzione farmacologica appropriata (Figura 1A).
- Registrare il tempo di dosaggio, come richiesto. Utilizzare 30 min in soluzione di etanolo per la procedura qui descritta.
- Se possibile, assistenti aiutano con il trasferimento di tutti i gruppi sperimentali alla soluzione farmaco simultaneamente per garantire un tempo preciso dosaggio. In alternativa, trasferire un gruppo alla volta e tenere traccia dei singoli gruppi di dosaggio volte (Figura 1A).
- Alla fine del periodo di somministrazione prevista, togliere il pesce dalla soluzione di etanolo sollevando attentamente l'inserto riproduttivadalla soluzione droga e posizionando di nuovo nel serbatoio.
- Delicatamente netto il pesce nelle di mantenimento e ricollocarle nel loro habitat fino alla prossima volta dosaggio programmato, o inserire inserire di nuovo nel serbatoio la deposizione delle uova per eliminare rete.
- Come accennato in precedenza, se possibile entro i parametri delle apparecchiature di stabulazione degli animali, la casa degli animali nella stessa vasca e l'inserto di deposizione delle uova che viene utilizzato come serbatoio. In questo modo si elimina la compensazione del tutto durante la procedura di amministrazione.
3. Test comportamentale
- Ottenere una luce / arena scuro larghezza 9,5 centimetri con 55 cm di lunghezza e 9,5 cm di profondità con un pavimento bianco impermeabile (Figura 1B). Fissare impermeabile carta non riflettente bianco e nero alle pareti interne della Arena utilizzando velcro, con la metà dell'arena coperta di bianco e per metà coperto di nero. Riempire la scena ad una profondità di 5 cm con acqua ambiente alla temperatura di 25-28 ° C. Maintain questa temperatura durante tutto il test.
- Minimo lo stimoli visivi esterni con la costruzione di una recinzione bianca a tre lati per l'arena di essere situato in. Assicurarsi che l'area di prova è diffusa illuminazione ambientale che non provochi riflessi sulla superficie dell'acqua, ma è sufficientemente luminoso per il software di monitoraggio movimento, o per posta -hoc quantificazione manuale da immagini video.
- Posizionare l'arena nel recinto e impostare i parametri di registrazione e di analisi del movimento del software di monitoraggio comportamento. Impostare la durata di prova per 5-15 minuti, a seconda della domanda di ricerca.
NOTA: Qui, abbiamo usato 5 min. - Trasportare il gruppo di pesci da testare per l'area di ricerca nel serbatoio habitat e metterli al di fuori del recinto dell'arena. Acclimatare il pesce per 10 minuti.
- Un pesce delicatamente netta del gruppo e il luogo appropriato nel centro della luce / arena scuro, avendo cura di rilasciare il pesce quando è posizionato parallelamente all'asse lungo dell'arena di Avoid polarizzazione il pesce per la luce o zona oscura.
- Inizia comportamento registrazione immediatamente dopo che l'animale è stato rilasciato. Guarda per eventuali problemi di software con monitoraggio del pesce o per il salto di pesce o di congelamento. Ruotare l'arena di 180 ° dopo la metà dei soggetti sono stati testati per evitare che confonde a causa di pregiudizi derivanti dalla quale estremità dell'arena è orientata verso l'estremità aperta del contenitore.
- Dopo il processo è terminato, delicatamente rete e togliere il pesce dal nell'arena per un serbatoio o serbatoio di habitat.
4. Analisi
- Esaminare il tempo trascorso in luce rispetto a zone scure. Per ogni gruppo e ogni pesce, ottenere il relativo tempo trascorso in zone chiare e scure e analizzare utilizzando un t-test un campione (o di Wilcoxon per dati non parametrica; differenza (metà del tempo di prova totale) 150 sec) per determinare se i gruppi preferiscono significativamente una zona sopra l'altra.
- Per confrontare le preferenze, calcolare un preferiscaIndice renza sottraendo il tempo trascorso nella zona di luce dal tempo trascorso nella zona di buio e confrontare le differenze tra i gruppi. t-test può essere utilizzato per confrontare due gruppi. Confronta più gruppi con una analisi a senso unico della varianza utilizzo di test HSD di Tukey post hoc dove (o test di Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari.
- Confrontare la velocità, il numero di transizioni di zona, serpeggianti, e l'immobilità tra i gruppi. Utilizzare una analisi della varianza utilizzando test di HSD post-hoc di Tukey dove (prova o Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari.
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Representative Results
Per mantenere la precisione e controllo in studi farmacologici con zebrafish è importante volta la durata della somministrazione di etanolo costantemente e accuratamente come descritto sopra. La procedura può aumentare la facilità e la velocità del procedimento di dosaggio. La somministrazione di etanolo nei tempi previsti sia un settimanale o giornaliera, binge-moderata ha determinato livelli di ansia alterati, misurati con la luce / buio di prova, rispetto ai controlli. Quando la prova due giorni dopo l'ultima somministrazione, zebrafish nel gruppo di controllo (che hanno ricevuto niente alcool, ma erano ancora trasferito ai serbatoi di dosaggio) visualizzato nelle modalità previste di comportamento, con una spesa di pesce di controllo molto più tempo sul lato oscuro dell'arena ( Figura 2A) simile a zebrafish ingenuo in altri studi 6,9,13. Pesce nel gruppo binge settimanale ha mostrato alcuna preferenza né per l'chiare o scure zone del compito durante il test due giorni dopo l'ultima somministrazione di etanolo (Figura 2B (Figura 2C); in contrasto con il gruppo di controllo. L'indice di preferenza indicato una differenza significativa tra i gruppi di controllo e tutti i giorni-moderati (Figura 2D). Non ci sono state differenze significative nella velocità di nuoto, o immobilità tra i gruppi (Tabella 1), e, quindi, questo effetto non è stato a causa di un deficit motorio nel pesce.
Figura 1:. Procedura di trasferimento e la Luce / arena scuro Le foto rappresentano la procedura di trasferimento (A) In primo luogo, i pesci si trovano nel serbatoio di trasferimento (a sinistra).. Dosaggio serbatoio contenente etanolo è dipinto (destra). (BC) Spostando il pesce dal serbatoio trasferimento alla soluzione etanolica richiede l'Researcher per sollevare l'inserto deposizione dal serbatoio trasferimento e nel serbatoio della soluzione di etanolo. (D) La luce / buio dell'arena come illustrato misurata larghezza 9,5 centimetri di 9,5 cm di profondità e 55 cm di lunghezza. Pavimento bianco viene utilizzato, insieme con pareti nere su mezzo dell'arena (sinistra) e pareti bianche sull'altra metà, creando una zona di luce e buio.
Figura 2: Risultati rappresentativi e trackplots interno etanolo dosaggio su tre gruppi di zebrafish dopo 2 giorni diritto di recesso. (A) Un trackplot rappresentante di un unico percorso di movimento per il controllo zebrafish per tutta la 5 min chiaro / scuro di prova. Sotto è la stessa trackplot zebrafish rappresentato come heatmap, che è una rappresentazione colorata di movimento zebrafish tutto il processo, in base al tempo trascorso il pesce nella posizione rappresentata da ciascun pixel. (B) rapprese Atrackplot entative di un singolo zebrafish dal gruppo settimanale-binge tutta la 5 min chiaro / scuro compito. Di seguito è riportato il heatmap dallo stesso zebrafish. (C) Un trackplot rappresentante di un unico movimento zebrafish quotidiano-moderata in tutta la 5 min chiaro / scuro di prova. Di seguito la mappa termica della stessa zebrafish. (D) L'indice di preferenza è stato calcolato per tutte le di tempo trascorso nella zona di luce dal tempo trascorso nella zona oscura sottraendo. I numeri negativi indicano la preferenza per la zona scura. I numeri positivi indicano preferenza per la zona di luce. I risultati indicano una differenza significativa nella preferenza tra controllo e gruppi di tutti i giorni-moderati a 2 giorni diritto di recesso * p <0.05 (ANOVA). Nota c'è anche una preferenza significativa per scuro nel gruppo di controllo, p <0.05 (un campione t-test, differenza 0), e una preferenza significativa per la luce nel gruppo giornaliero-moderata, p <0.05 (un campione <em> t-test, differenza 0). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Velocità | Immobilità | |
| (Cm / sec) | (Sec) | |
| 2 giorni Wd | 2 giorni Wd | |
| Controllo (n = 13) | 9.1 ± 0.6 | 1.9 ± 0.6 |
| Binge (n = 14) | 9.8 ± 0.5 | 0,8 ± 0,2 |
| Cronica (n = 15) | 10.3 ± 0.5 | 2.5 ± 1.0 |
Tabella 1: Velocità media e l'immobilità durante la lampada di prova / scuro. La velocità media di nuoto (cm / sec) e l'immobilità (sec) di un gruppo rappresentativo di zebrafish dopo 2 giorni di astinenza (media ± SEM). Qui, non sono state trovate differenze significative in entrambe le velocità o l'immobilità. Usato con il permesso di Holcombe et al., (2013).
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Discussion
Precedenti studi che coinvolgono la somministrazione del farmaco in zebrafish hanno semplicemente fatto affidamento sulla compensazione di pesce per il loro trasporto dal proprio serbatoio di casa nella soluzione della droga 12,16. La compensazione non è sempre coerente e spesso richiede più tempo del previsto a causa della risposta di fuga del pesce zebra, che ha una significativa variabilità individuale. Metodi di trasferimento tradizionali, pur utile, possono essere migliorate riducendo la quantità di tempo totale dei pesci passano fuori dell'acqua, e diminuendo la quantità di variabilità nel tempo di trasferimento tra animali. Oltre a migliorare la praticità, questo metodo fornisce ai ricercatori la possibilità di dosare grandi gruppi di pesci contemporaneamente in una soluzione per una precisa quantità di tempo. I metodi precedenti che richiedano la somministrazione di un singolo pesce, o il tentativo di netto tutto gruppi di pesci contemporaneamente. Il primo è lento e diminuisce la velocità, mentre il secondo è un compito scomodo e difficile. Inoltre, sistemi di Motion Tracking che cdi valutare il comportamento dei pesci multipli contemporaneamente possono beneficiare della precisione di questo metodo. Pesce potrebbe essere trasferito direttamente dal inserto deposizione delle uova nell'arena shoaling, che garantirebbe vicino l'esposizione simultanea a l'arena per tutti i pesci.
Utilizzando questo nuovo metodo ha prodotto risultati significativi quando implementate su tre gruppi di zebrafish per un periodo di 21 giorni. Pesci di controllo ha ricevuto niente alcool, pesce tutti i giorni-moderata ha ricevuto una piccola quantità di alcol una volta al giorno, e pesce settimanale-binge ricevuto una buona dose di alcol una volta alla settimana durante il periodo di 21 giorni. Alla luce / buio compito, il dosaggio ma non ha modificato la normale preferenza del pesce zebra per la zona oscura in condizioni di controllo. Tuttavia, dopo 2 giorni di astinenza etanolo, zebrafish nel gruppo tutti i giorni-moderata ha preferito la zona di luce dell'arena, una inversione di preferenza. L'analisi statistica conferma un cambiamento significativo nella zona di preferenza. È possibile che il dosaggio Operaziri portato in etanolo comportamento di ricerca a causa di un posto preferenza condizionata (CPP), con il pesce cerca di etanolo (uno stimolo appetitivo), e preferendo la zona bianca a causa della sua somiglianza rispetto all'area dosaggio luminosa. Una recente ricerca rivela che CPP può verificarsi in zebrafish e nelle zone in cui zebrafish vengono dosati con etanolo 17,18. Settimanale binge-pesce non ha mostrato alcuna preferenza 2 giorni dopo l'etanolo, e anche se le prove sui meccanismi neurali che rappresentano questo dato manca, è possibile che le dosi poco frequenti ma grandi di alcol può danneggiare il cervello, possibilmente lasciando il pesce in grado di discriminare tra le zone.
Un altro vantaggio che questa procedura di dosaggio conferisce ricercatori è la sua generalizzabilità. Come descritto, la procedura produce risultati chiari e utili in zebrafish. Tuttavia, la procedura non è limitata ai soli zebrafish. I vincoli sulla procedura sono riportate le dimensioni e limiti dei serbatoi di dosaggio, animali e testiApparecchiatura ng, così come la capacità di analizzare i dati. Con l'uso di software di motion tracking, studi recenti hanno trattato molte variabili aggiuntive per tutta la prova. Bianco evitare assuefazione, piazze incrociate, locomozione assuefazione, la latenza alla zona bianca, nuoto irregolare, thigmotaxis (tempo trascorso vicino alle mura arena), e la valutazione dei rischi possono essere quantificati 14. È concepibile utilizzare questa procedura in altri organismi modello, come pesci rossi, che sono stati precedentemente utilizzati per studiare il ruolo della tolleranza e recesso 19. I ricercatori sperano di studiare gli effetti di altri agenti farmacologici o tossine ambientali, l'uso di altri test comportamentali, o altri animali marini o di acqua dolce, potrebbe anche utilizzare questa metodologia di base.
Usando questo protocollo è semplice ed efficace. Tuttavia, se i risultati non sono quelli previsti, in considerazione risoluzione dei problemi del sistema di motion tracking per garantire la corretta raccolta dei dati. Tracking deve essere morbido e preciso attraverso le prove. Il sistema di monitoraggio deve essere registrando il movimento del corpo centrale del pesce in ogni momento. Qualsiasi saltare o movimenti incontrollati di tracking dot a causa di artefatti visivi, come riflessi di luce sul increspature dell'acqua, o le impostazioni di tracciamento sbagliato può confondere i risultati. Alcune discrepanze nei risultati possono derivare da piccole differenze nel design arena o ambienti di dosaggio. Per essere sicuri di replica, l'arena dovrebbe essere come descritto, con particolare riguardo all'utilizzo di un pavimento bianco per massimizzare l'efficienza di monitoraggio in zebrafish. Con altri pesci che sono di colore più chiaro, un pavimento scuro dovrebbe essere utilizzato per aiutare nella motion tracking. Allo stesso modo, il dosaggio del pesce in un ambiente che è esente da stimoli visivi che potrebbe BIAS il pesce è estremamente importante. Qualsiasi colore distinto, modello o colore che è percepibile ai pesci potrebbero confondere i risultati. È raccomandato un sfondo di colore chiaro neutro simile a quella del sistema di allevamento. </ P>
Anche se è possibile modificare questo metodo, se necessario, per le altre specie di pesci, i risultati possono variare in termini di luce innata / preferenza scuro 20-21. E 'anche importante notare anche la procedura qui descritta causa ancora qualche stress. Sebbene compensazione è notevolmente ridotta, la procedura prevede ancora un brevissimo periodo di tempo in cui il pesce deve essere fuori di acqua, eventualmente indurre una risposta allo stress. Ramsay e colleghi hanno scoperto che 22 zebrafish compensate aveva almeno il doppio i livelli di cortisolo nel loro corpo rispetto a quelle che non sono state compensate. Dal momento che il cortisolo è un ormone legato allo stress 11 si può alterare la risposta comportamentale che viene misurato. Mentre il nostro metodo riduce compensazione, non elimina. Tuttavia, dà ai ricercatori la possibilità di eliminare l'incidenza di compensazione se il desiderio da abitazioni zebrafish negli inserti di riproduzione. Gli studi futuri dovrebbero esaminare se l'uso del inser deposizione delle uovat per il trasferimento di pesce può ridurre la risposta allo stress rispetto alla rete. Inoltre, è di fondamentale importanza per mantenere i tempi di dosaggio precisi e tempi di trasferimento tra i gruppi. Le variazioni di orari o grandi differenze di dosaggio nel tempo trascorso fuori dall'acqua potrebbe alterare i risultati. Per ridurre possibili effetti circadiani, è anche fondamentale per dosare il pesce in tempi simili della giornata. Nel pesce esperimento in corso sono stati trattati e testati 10:00-14:00. Replica precisa e affidabile di questo procedimento si basa sul ripetere il protocollo con precisione.
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Disclosures
Gli autori riconoscono Joshua Gallup per l'uso della sua fotografia attrezzature utilizzate per la Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da un Consiglio di Ricerca di Ingegneria concessione (NSERC) Canada Discovery Scienze Naturali e (a TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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