Summary
칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.
Introduction
칼슘은 세포 생리 및 병리 생리 학적 신호 (1)의 전송을 담당하는 중요한 초 메신저. 세포질 칼슘 농도는 칼슘 펌프 및 칼슘 교환기의 활성을 낮게 유지된다. 근질 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA)는 ATP 의존적 방식 모두에서 세포막 칼슘 ATPase를 (PMCA)는 세포 외 구획 칼슘 압출 반면 "펌프 누출"시스템의 일부로서 소포체 (ER) 칼슘 저장소 리필 2. 이러한 호르몬 또는 신경 전달 물질과 같은 생리 메신저, G 단백질 커플 링 수용체, 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 트리 포스페이트 (IP3) (3)를 생성하는 세포막에 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PIP2)을 가수 분해 포스 포 리파제 C의 활성화를 통해 신호를 전송한다. 디아 실 글리세롤은 세포막에 남아있는 반면, IP3은 세포질 내로 확산되어 IP3 수용체에 결합ER 막과 칼슘에서 발견 리간드 칼슘 채널 활성화의 (IP3Rs)는, 세포질 칼슘 농도 4의 증가에서 남중 소포체 내강 저장소에서 해제됩니다. 세포질에 도달하는 칼슘 대체 경로는 세포막에 존재하는 칼슘 채널 교환기 통해서이다. 이 두 구획 사이의 크로스 토크 설명 하였다 : 칼슘에 의한 칼슘의 세포 외 칼슘이 ER 저장 5에서 칼슘 방출을 유도 릴리스 (CICR), 저장이 STIM에 의해 감지 된 ER 저장 비우는 칼슘 항목 (SOCE)를 운영하고 Orai의 개방 원인 세포막에있는 칼슘 채널 ER 저장소 (6)의 재 충진을 촉진.
병태 생리 학적 조건 하에서, 세포 칼슘 응답 생리적 자극 (1)의 부재하에 탈과 사이토 졸 칼슘 증가이다. 칼슘 응답은 다수의 방식으로 영향을받을 수있다 : 칼슘 장기간신호, 세포질에서 칼슘 제거, 칼슘 저장 또는 칼슘의 지역화 변경의 고갈을 지연. 또한, 미토콘드리아는 버퍼링의 중심 역할을 수행하고 칼슘 (7)을 발표. 장기간 및 / 또는 supramaximal 세포질 칼슘 증가는 죽음을 셀에 연결됩니다. 사실, 칼슘보다 종종 셀룰러 병태 생리 학적 반응에 관여하며, 주로 세포 사멸과 관련된 신경 퇴행성 질병, 심장 질환, 암, 골 질환 및 신장 질환과 같은 질병의 광범위한 배열의 키 이벤트하지보다 손실 또는 장기 나 조직 기능 8-10의 변화와. 또한, 칼슘 신호의 섭동 셀룰러 적응 및 세포 기능과 응답의 변화에 연결되었다.
전통적으로, 칼슘 신호는 세포 투과성 아세 (AM) 에스테르 형태로 세포 내로로드 음전하 형광 칼슘 지표로 측정된다. 일단 세포 esteras에 의해 절단ES, 형광 지표 세포 내 구획 내에 남아 칼슘이 결합하면 형광 강도의 증가. 가장 잘 알려진 및 사용 칼슘 표시기는 비율 계량의 Fura-2 로저 첸과 동료 (11)에 의해 개발되고있다. 칼슘 : 서로 다른 친화력과 칼슘 지표는 다른 칼슘 풀을 모니터링 할 수 있습니다. 검출 방법은 살아있는 세포 이미징, 형광 마이크로 플레이트 리더를 포함 유동 세포 계측법. (일반적으로 분 몇 초 이내) 칼슘 신호의 상대적으로 빠른 반응 속도는 칼슘 신호의 특성에 대한 대부분의 정보를 얻는 가장 좋은 방법 이미징 살아있는 세포를 만든다. 이외에도 (밀리 초 이내) 칼슘 신호의 빠른 동역학에서, 생균 이미징은 단일 셀 (12) 내 칼슘 신호 전달의 셀룰러 구획화를 연구하기위한 더 나은 방법이다. 절대 칼슘 농도는 칼슘 산업사의 최소 및 최대 형광을 결정함으로써 계산 될 수있다Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 각각 칼슘 킬레이트 제를 첨가하고 세포를 permeabilizing 의해 icator.
칼슘 신호를 측정하기 위해 유세포의 사용은 제 기회는 막 무결성 및 세포 집단을 분리하고, 단일 파장의 개발과 결합 현탁액 중의 세포의 요건과 같은 여러 파라미터를 측정하는 위치를 면역 세포에서 1980 년대에 개발 된 칼슘 지표는 이상과 convenientdetection 방법 13-15 유동 세포 계측법을했다. 부착 세포에서는 생균 이미징 칼슘 시그널링, 가장 중요한 키네틱 관한 대부분의 정보를 제공하지만, 취득하는 온도 등의 형광 현미경, 관류 시스템, 셀룰러 환경의 유지를 포함하는 복잡한 설정 및 특수 현미경 소프트웨어가 필요 데이터 분석. 이러한 형광 마이크로 플레이트 리더 또는 pharmacol 등의 다른 방법칼슘 킬레이트의 사용을 통해 ogical 수단이 얻은 정보의 측면에서 비교할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 더 넓게, 대부분의 연구에 불구하고 측정이 수행되는 경우에만 최종 점 접착 세포에서 사이토 졸 칼슘을 모니터링하는 데 사용되어 가고있다. 초기 게르 겔리 등의 문헌에 의해 개발 된 방법을 사용. 면역 B 세포 (16)에 실시간 속도론과 유세포 및 샘플 모집단 개별 셀에서 형광 강도를 모니터링하여 세포질 유리 칼슘 농도의 변화가 성공적 경부암 상피 세포에서 측정 된 암 줄기 세포는 17 잡종. 이 방법은 더 칼슘 지표 (18)로드하기 어려운 부착 상피 세포에 사용하기 위해 적응했다.
여기서, 쥐 신장 근위 세뇨관 (c12에 WKPT-0293) (19)의 S1 세그먼트로부터 유도 된 무한 증식 자기편 상피 세포주를 사용하여, 우리는 최적의 간략화를 설명 m유동 세포 계측법에 의해 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 ethod. 많은 상피 세포는 음이온 성 화합물에 대한 유기 운송의 번호를 가지고 있기 때문에, 칼슘 표시기 세포의 로딩은 도전이 될 증명할 수 있습니다. 칼슘 지표, 프로 베네 시드, 페니실린 (20)의 신장 배설을 감소하기 위해 개발 된 원래 원형 유기 음이온 수송의 억제제와의 유출을 방지하기 위해, 배양 매체에 동시에 적용된다. 세포는 칼슘 인디케이터 로딩 단층 유지 화합물 첨가 후 즉시 검출 할 수 현탁액 칼슘 신호로된다.
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Protocol
시약 및 솔루션 1. 준비
- 수정 된 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 준비 (mm 단위 : 136.9 염화나트륨, 5.37의 KCl, 0.34 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17의 NaHCO3, pH를 7.2, 아니 페놀 레드). 4 ℃에서 보관.
- 1.5 M CaCl2를 2 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) (pH를 7.2) 증류수 원액 만들기.
- 프로 베네 시드의 250 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. ,, 1 N의 NaOH에 베네 시드 파우더를 녹여 증류수로 최종 부피의 3/4 채우고 천천히 1 N HCl로 pH를 7.4로 적정 유리 산 형태의 경우 (불용성으로 종종 지칭). 4 ℃에서 보관.
- 1mM이 스톡 농도 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 형광 막 투과성 칼슘 결합 염료 녹인다. 어둠 속에서 -20 ° C에 보관하십시오.
- 각 실험에 앞서, 갓 제조 베네 시드를 함유 H하여 BSS 플럭스 (PHF) 버퍼 (최종 농도) 1.5 mM의 염화칼슘 2, 10 mM의 HEPES, pH를 7.2, 5 % 소 태아 혈청, 2 MM의 프로 베네 시드, 및 5.55 mM의 포도당과 HBSS를 수정 결합하는. 37 ° C의 따뜻한.
2. 세포 배양
- 표준 배지에서 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시의 웰 플레이트 당 2.5 × 10 5 신장 근위 세뇨관 세포 (c12에 WKPT-0293)과 약 70 % 포화 상태에 도달하는 2 일 동안 성장한다.
3. 칼슘 염료로드
- 각 웰 또는 접시를 들어, 5 % 소 태아 혈청, 4 μM 세포 투과성 칼슘 결합 염료 및 2 밀리미터 베네 시드를 함유하는 1 ml의 배지를 섞는다.
- 각 웰에 1 ml의 로딩 염료 혼합물과 배양 배지를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 형광 표시기의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버.
Ce의 제 담유동 세포 계측법에 대한 LLS
- 37 ° C의 따뜻한 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 솔루션입니다.
- 대기음 칼슘 로딩 염료 각 웰의 솔루션과는 우물의 벽을 따라 1 ml의 트립신을 추가합니다.
- 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어.
- 1 분 10,000 g에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 1.5 ML 튜브 및 펠렛 세포를 전송합니다.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 로 pipetting 아래로 1 ML의 PHF 버퍼에 resuspend을 추가하여 세포를 씻으십시오.
- 1 분 10,000 g에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
- 반복 4.6 단계를 반복합니다. 4.7. 또 두 번.
- 500 μL의 PHF 완충액 최종 부피 세포를 재현 탁하고, 1 시간 내에 실험에 셀을 사용한다.
- 선택적 : 카운트 세포는 세포 농도를 결정하고, 5 × 104 사용할 - 측정 당 1 × 105 세포.
5. 흐름 CYT오 미터 설치
- , 흐름 cytometer 시작 플루이 딕스 서랍을 열고 시스 유체 탱크의 공기 압력을 증가시키는 통기 밸브 토글 스위치 플립.
- "프라임"내측 튜브 및 유동 챔버 내에서 잠재적 상주하는 공기 방울을 제거하는 기기.
- 유동 세포 계측법 소프트웨어에서 열린 두 점 플롯 창.
- 첫 번째 점 플롯은 앞으로 각각의 크기와 입도 (granularity)를 통해 시료 내에서 세포의 품질을 제어 할 수있는 Y 매개 변수의 X 매개 변수 및 측면 산란광 (SSC)에 대한 산란광 (FSC)가 필요합니다.
- 제 도트 플롯은 칼슘 - 결합 된 염료의 형광 강도를 측정한다. 리니어 스케일의 X 매개 변수에 대해 초 단위로 로그 스케일와 시간을 사용하여 Y 매개 변수에 대한 적절한 형광 검출 채널을 선택합니다.
- '높은'에 유량을 설정합니다.
6. 유동 세포 계측법 M전 측정
- RT에서 측정을 수행합니다. 샘플 튜브 (11.5 X 75mm) 유세포에서, 480 μL의 PHF 버퍼를 추가합니다.
- 혼합 20 μL 세포 현탁액 간략하게 소용돌이를 추가합니다.
- 측으로 튜브지지 암을 이동시키고 기밀 밀봉이 형성 될 때까지 시료 주입 관을 통해 샘플 튜브를 위치. 원래 중심 위치로 튜브 지지대를 돌려줍니다.
- 샘플의 평균 형광 강도가 약 10이 y 축상되도록 형광 채널을 조정하여 측정을 최적화. 저장하고 다음 실험을 위해 사용합니다.
- 실험을 시작하려면, 반복은 6.3에 6.1 단계를 반복합니다.
- 50 초 동안 기록 기준 형광.
- 간단히 추가, 관심, 소용돌이의 화합물을 샘플 튜브를 제거하고 시료 주입 관으로 돌아가 측정을 일시 중지합니다. 이 단계는 15 개 이상의 초를 복용해서는 안된다.
- 측정을 다시 시작하고 204.8 초 총 계속합니다.
- 칼슘 사용 ionophore 같은 이오 노마 이신 (10 μM), 및 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA) 같은 칼슘 킬레이트 제, MnCl 2의 CoCl2 (2 mM)을 각각 양성 및 음성 대조군에 대한.
7. 데이터 분석
- 이러한 WinMDI (유동 세포 계측법 용 Windows 다중 문서 인터페이스), 스크립스 연구소, 유동 세포 계측법 핵심 시설에 조 트로터가 개발 한 무료 소프트웨어 패키지와 오프라인 분석을 위해 전용 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.
- SSC와 FSC 매개 변수를 사용하여 도트 플롯을 엽니 다.
- "지역"도구를 사용하여 분석을위한 세포의 지역을 선택 죽은 세포 또는 데이터 분석에서 왼쪽 하단에있는 세포 파편 (그림 1)를 제외 (이미지에 마우스 오른쪽 단추로 클릭).
- 쿼드런트 분석 (그림 2)
- y 축상의 x 축과 형광 강도에 시간 밀도 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
- 우리7.3과 동일한 게이팅 영역 전자.
- "사분면"도구를 사용하여 데이터를 정량화.
- 수직선은 화합물 첨가시에 놓이고 수평 라인이 대조군에서 기준선 형광의 중앙에 위치되도록 사분면 세퍼레이터를 조정. 사분면 구분의 위치가 모든 샘플에서 동일한 지 확인합니다.
- 각 사분면에있는 세포의 비율은 각 모서리 (그림 2)에 표시됩니다. 샘플 사이의 사분면 (UR)를 비교한다.
- 히스토그램 분석 (그림 3)
- y 축상의 x 축 및 이벤트에 대한 형광 강도 히스토그램 창에서 제어 데이터를 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
- 화보 개요, 오버레이 플롯으로 제어 플롯 (파일 → 오버레이 → 파일 열기 → 파일로 이동)에 비교하는 테스트 데이터를 추가 할 수 있습니다.
- 정량 분석의 경우, 하나의 히스토그램은 승리dows 사용해야합니다. 게이트 단계 7.3에서 영역 R1을 사용하여 세포 집단.
- 비 처리 제어에서, 최대 형광 강도의 최소값과 제어 피크의 최대 형광과 끝점 사이 중간 지점에서 시작하는 분석 영역을 표시하기 위해 ( "마커") 마커 기능을 사용한다. 이 영역에서의 세포의 비율이 계산된다.
- 통계 창에서 데이터를 검색합니다. 분석을 위해 동일한 표시된 영역을 이용하여 데이터 파일을 나머지에 대해 반복.
- 형광 강도 분석 (그림 4)
- y 축상의 x 축과 형광 강도의 시간 도트 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
- "속도론 모드"와 "오버레이 속도론 라인"을 사용합니다. 파란색 선은 평균 형광 강도를 나타내는 도트 플롯에 나타납니다.
- 여러 사각형 영역을 만들어 상대 칼슘 유입을 정량화. 각 지역은 아 있어야한다"10 초"에 해당 "50", 약 idth. 15 사각형 영역을 정의.
- 통계 창에서 정량화를 검색하고 스프레드 시트에 복사합니다.
- 분석을 위해 Y-평균 데이터를 사용합니다. 20 초 50에 해당 R6에 R2의 평균을 계산합니다. 이 기준값이다.
- 칼슘 유입 분석 (발병, 기간 및 강도에 따라 다름)에 대한 적절한 시간 간격을 선택합니다.
- , 평균 기준값이 시간 간격 내에서 상대 100 %로 설정되는 화합물을 첨가 전에 즉, 형광 신호를 각 영역에서의 칼슘 신호를 계산한다. 화합물 첨가를 게시 평균 및 표준 편차의 영역을 결정하고; 이 화합물에 의해 유발 된 평균 칼슘 신호이다.
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Representative Results
세포질 칼슘을 증가시키기 위해, 두 약물 화합물은 세포 투과성 칼슘 결합 염료, FLUO-3-AM로드 신장 근위 세뇨관 세포 (WKPT-0293 c12에)에 적용되었다. Nontreated 대조 시료는 베네 시드의 존재하에 칼슘 결합 염료로드 된 혼합 그러나 어떤 화합물의 첨가없이 하였다. 쌥시 가르 긴 (TG)는 ER에서 누출로 이어지는 증가 세포질 칼슘의 결과로 SERCA 펌프의 고전적인 억제제이다. Tunicamycin (TUN) 블록 펼쳐진 단백질 반응의 활성화로 이어지는 단백질의 N-당화뿐만 아니라 세포질 칼슘 18,21 증가합니다. 양성 대조군, 이오 노마 이신 (IONO)로서, 세포 외 칼슘 세포막 투과성 만드는 칼슘 이온 운반체를 사용 하였다. 분석을 위해, 세포 집단은 (도 1에 R1) SSC / FSC 도트 플롯에서 지역을 선택하여 게이팅 하였다. 대 시간 형광 강도 대 밀도 플롯은 각각의 데이터 파일을 작성. 사분면 함수를 사용함으로써 도트 플롯 기준선 형광 전과 화합물 첨가 후 위와 아래에 fluo-3 형광 강도를 나타내는 네 부분으로 분리 하였다. 각 사분면의 문이 세포 인구의 비율로 정량화가 증가 세포질 칼슘 농도의 결정을 할 수 있습니다. 이 예에서, 3 μM TG는 칼슘 신호가 유도되었음을 나타내는 사분면 내의 세포의 백분율의 증가를 야기한다. 세포의 비율은 TG 처리 한 세포에서 51.3 % (1.20 배)에 제어에 42.8 %에서 증가한다. 유사하게, 6 μM의 TUN은 49.9 % (1.17 배)으로 증가 칼슘 형광 강도로 세포의 비율을 증대시킨다. 10 μM IONO의 응용 프로그램 오른쪽 상단 사분면에있는 세포 (그림 2)의 65.5 % (1.53 배) 결과. 히스토그램 분석은 1.41 배, 1.36 배와 TG, TUN과 IONO, 각각 (그림 3)으로 2.11 배의 결과 (통계, 참조 <SUP> 18). 마지막으로, 다중 영역 분석 모드를 사용하여, TG, TUN 및 IONO은 1.55 배, 1.29 배 및 각각 제어 (도 4) 위에 칼슘 신호의 4.54 배 증가를 일으켰다.
가장 민감한 분석 모드는 여러 영역 분석했다. 세포 집단의 분포가 정량화 사분면과 히스토그램 분석 모드, 달리, 다중 영역 분석 모드는 전체 세포 집단에서 형광 신호의 변화를 정량화한다. 다른 분석 모드의 결과에서 가장 큰 차이는 여러 지역 분석에서 4.54 배에 사분면 분석 제어를 통해 1.53 배 증가에서였다 이오 노마 이신을 위해이었다. 시험 화합물은 차이를 나타내지 않았다. 절대 값이 상이하지만 그러나 모든 분석 모드에 걸쳐, 칼슘 신호의 범위, 즉, 동일하게 유지 유발, IONO는 TUN TG로하고이어서 큰 효과가 있었다. TG, TUN 또는 IONO의 적용은 세포질 칼슘의 영구적 인 변화를 초래한다. 과도하다 생리 칼슘 신호,이 방법을 사용하여 측정 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 ATP가 WKPT-0293 c12에 세포에 적용 하였다. ATP는 방법 유세포 의해 그 전체에 기록 할 수없는 신속하고 일시적인 칼슘 신호를 유발. 20에서의 ATP 농도 - 100 μM 농도에서는 칼슘 신호를 "느리게"로 감소시켰다 따라서 감지하기 어려웠다. 도 5에 도시 된 바와 같이, 세포질 칼슘의 변화는 5 μM의 ATP의 첨가 후에 측정 될 수있다. 또, 형광 변화의 피크는 기록되지 않았다. 사분면 분석 (도 5b) 및 히스토그램 분석을 사용하여 (도 5C) 모드, ATP 칼슘 신호의 차이로 인해 칼슘 신호의 과도 특성을 검출 할 수 없었다. 그러나, 추적에서 선택한 부분, 여러 rectangulaR 영역 분석 모드 직후에 측정 (도 5a)을 재개 칼슘 신호의 1.85 배 증가를 기록했다.
그림 1. SSC FSC 도트 플롯 대. 세포 집단의 무결성 측면 스 캐터 (SSC) 및 전방 산란 (FSC)를 사용하여 평가된다. 영역은 추가 분석 (R1)이 선택된다. 광 산란을 감소 죽은 세포와 세포 파편은 제외된다. 대표 도트 플롯이 표시됩니다.
그림 2. 쿼드런트 분석. 염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘 기준선 형광을 50 초 동안 측정 하였다. 측정 정지 한, 화합물 또는 디luent 첨가, 혼합하여 볼 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 정량화가 사분면 분석을 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 히스토그램 분석. TG, TUN 또는 IONO 치료 염료로드 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘의 히스토그램 플롯. 마커 기능, 제어 곡선의 피크에서 마커의 시작 포인트를 배치하고, 최대 형광에서 끝나는 의해 정량 하였다 높은 칼슘 결합 염료 형광 강도와 게이트 된 세포의 비율을 사용. larg의 보려면 여기를 클릭하세요이 그림의 어 버전.
4. 여러 지역 분석을 그림. 염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘 기준선 형광을 50 초 동안 측정 하였다. 측정은, 화합물 또는 희석제를 첨가하고, 혼합을 중지 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 정량화가 여러 사각형 영역 분석을 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ATP 유도 칼슘 신호의 그림 5. 분석. 기준 형광 O염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 F 칼슘을 50 초 동안 측정 하였다. 측정은 5 μM의 ATP를 첨가하고, 혼합을 중지 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 데이터는 다수의 직사각형 영역 분석 (A), 사분면 분석 (B) 또는 히스토그램 분석 (C)를 사용하여 정량 하였다. 다중 영역 분석을 위해, 오직 과도 칼슘 신호를 분석 하였다. 대표적인 데이터 또는 n에서 분석 = 3 -. (7)가 표시됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
칼슘은 제 메신저 신호 전달 분자로서, 또한 ER 및 미토콘드리아 사이에서 통신하기위한 수단으로 작용하는 다수의 세포 과정에 키 이벤트이다. 자유 세포질 칼슘 농도의 변화를 측정하는 능력은 세포 생물학의 모든 영역에 적용 할 수있는 유용한 기술이다. 사이토 졸 칼슘 신호를 검출하기위한 다양한 방법이있다. 고전 등의 Fura-2와 같은 칼슘 비율 계량 표시기로부터의 신호는, 형광 촬상 설정 및 절대 칼슘 농도를 이용하여 살아있는 세포에서 모니터링이 최소 및 최대 형광 강도를 결정하는 단계로부터 유도 될 수있다. 그러나,이 기술은 형광 현미경, 설정 생균 이미징 및 분석 소프트웨어와 같은, 특수 장비를 필요로한다. 여기서, 우리는 대부분의 실험실에 액세스 유세포 분석기를 사용하여 부착 성 상피 세포의 시토 졸, 칼슘 검출을위한 간단한 방법을 설명한다.
상피 포에대사, 생체 이물질 및 약물의 수송에 대한 책임을 수송의 배열의 ssession. 특히 중요한 유기 양이온과 유기 음이온 수송 (22)에 속하고,에 SLC22A 상과는, 자사의 회원들 (23)을 사이에 약제 내성 P 당 단백질 ABCB1 및 약제 내성 단백질 (MRPs)를 계산 ATP 결합 카세트 (ATP) 상과, . 게르 겔리 등 알에 의해 종이에 설명 된대로 쥐의 신장 근위 세뇨관 세포 라인 WKPT-0293 c12에를 사용하여 초기 실험을 수행 하였다. (16). 세포 현탁액에 가져오고 FLUO-오전 3시 탑재했다. 그러나, 완만 한 변화는 10 μM의 이오 노마 이신 (사분면 분석에 의해 제어 50.95 % 또는 복수 영역 분석에 의해 1.78 배 대 38.14 %)으로 관찰 하였다. 우리는 상피 운송이 FLUO-오전 3시와 세포의 가난한로드에 대한 책임이 있다는 가설을 세웠다. 이 문제, 프로 베네 시드와 PSC833, 유기의 억제제를 우회하는nion 전송기 및 다 약제 내성 P 당 단백질은 각각 칼슘 세포 단층에 염료를 결합하여 동시에인가 하였다. PSC833 중국 햄스터 난소 세포 (24) 이전의 리포트는 대조적이다 효과, 없었다 반면 기준선 형광 강도의 증가에 의해 지시 된 바와 같이 프로 베네 시드가 염료 로딩 바인딩 칼슘 개선. 이 차이는 아마 다른 세포주 ABCB1의 수준에있다; WKPT-0293 c12에 세포주는 독성 금속 (25), (26)과 같은 유해 물질에 의해 유도 될 수 ABCB1의 낮은 내인성 수준, 항구. 칼슘 염료 로딩을 개선하기 베네 시드의 사용은 예컨대 칼슘 시그널링은 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 할 수있다 신경계, 혈액 - 뇌 장벽 및 간암의 세포와 같은 베네 시드에 민감한 운송 시스템을 나타내는 다른 유형의 세포로 확장 될 수있다 경로.
칼슘의 쉬운 탐지는 requi에 FLUO-3 거짓말에 결합단지 하나의 여기 파장 (506 ㎚) 및 하나의 발광 파장 (525 ㎚)의 별 개로. 그러나, 단파장 칼슘 비 비율 적으로 염료, 염료를 결합하여 생성 된 데이터는, 단지 비 처리 제어 위에 세포질 칼슘의 상대적 증가를 정량화하는데 사용될 수있다. 스펙트럼 변화가 동일하지 않은 염료로드 및 표백의 보정 기능을 결합 칼슘 후에 발생하기 때문에 절대 칼슘 농도를 확인하려면, 비율 계량 염료가 필요하다. 비율 적 염료 인도 1 27,28 유세포하여 면역 세포에서 칼슘 동원의 검출에 사용되었지만, 지금까지,이 상피 세포에서 수행되지 않았다. (칼슘이 결합 할 때 475 nm의 자유 칼슘 때 400 ㎚) Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 절대 세포질 칼슘 농도가 결정될 수있다 UV-흥분성 인도 - 1 개의 발광 스펙트럼을 사용.
우리의 예 데이터는 AP를 유도 약리 화합물을 사용세포질 칼슘 ermanent 변화. 생리 칼슘 신호, 낮은 강도의 아르 빠른 반응 속도를 표시하고 일시적이며, 따라서 문제는 방법 유세포 생리 칼슘 신호를 검출 할 정도로 민감 여부에 남아있다. ATP와 실험 (생균 촬상에 의해 측정 됨) ATP인가시의 증가 된 칼슘 신호에 의해 입증 된 바와 같이 퓨린 수용체를 품고 WKPT-0293 c12에 세포주로 수행 하였다. 100 μM의 ATP, 그러나 복합 첨가가 신호의 일부만이 기록 될 수 있다는 것을 의미 후에 측정을 재개 지연과 결합 된 신호의 급속한 자연 - 사이토, 증가 된 세포 내 칼슘을 1로 관찰 할 수있는 흐름을 사용. 따라서 방법 유세포의 주요 단점은 급속한 (<10 초) 기록하는 제한된 용량 및 과도 칼슘 신호이고; 오히려 방법은 느린 과도 신호 (> 10 초) 또는 영구 상승 석회질을 야기 자극에 더 적합IUM 신호. 이러한 제한은 자극기 농도를 감소시킴으로써 또는 세포질에 방출 된 칼슘을 유지 칼슘 재 흡수 기작 저해제를 적용하지만주의가 사이토 졸 칼슘 자체를 증가하지 않는다 억제제 농도를 선택하도록주의해야 의해 회피 될 수있다.
정보는 라이브 세포 이미징 인수와 흐름 세포 계측법 아주 다르다. 생균 이미징으로 고해상도 칼슘 공간적 변경 이미징 단셀의 세포 내 영역을 선택하여 측정 할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 신속한 칼슘 신호를 기록 할 수 2 초 - 또한, 형광 신호가 논스톱 매 1을 취득한다. 대조적으로, 세포 계측법 느리고 오래 지속 칼슘 신호 더 적합하고 전체 세포 집단에서의 칼슘 신호를 측정 흐른다. 칼슘 신호에 만 상대 변경 방법 유동 세포 계측법으로 정량화 할 수있다. 그러나, 방법은 유동 세포 계측법 ADVAN을 가지고종래 생균 촬상 위에의 tages : 화합물 (자극제 칼슘 신호 전달 억제제의 1) 높은 처리량 스크리닝) 수행 될 수있다; 2) 특정 이미징 전문 지식이 필요하지 않습니다; 3) 연구 기술자는 측정을 수행 할 수 있습니다; 4) 수단을 갖고 있지 않은 임상 및 비 임상 실험실 칼슘 시그널링을 조사 할 수있는 고해상도 이미지 및 칼슘 비율 적 측정을 수행한다. 종합적 방법 유세포은 동역학 조사자가 초기 칼슘 역할을 확립하고자 쉽게 상류와 하류 신호 전달 경로를 결정하는 저해제를 적용 할 수 있다면 생균 이미징이 (칼슘 신호를 특성화하기 위해 요구되는 반면에, 유용 예. 더욱 상세하게, 강도, 공간적 변화).
요약하면, 우리는에 세포질 칼슘 실시간 상대적인 변화의 검출을위한, 간단하고 빠르고 민감한 방법을 서술하기 어려운 부하 부착 신장 상피정지하게되어 세포. 유세포 액세스없이 실험자를 들어,이 방법은 쉽게 큐벳의 셀 서스펜션 spectrofluorimeter에 적용될 수있다.
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Acknowledgments
실험실에서 연구 프리츠 - 벤더 재단, 뮌헨, 독일 (TD에)와 (W.-KL에) 위튼 / Herdecke 내부 연구비의 대학 재정 지원된다. 우리는 도움이 제안을 (생리학, 병태 생리 및 독성, 위튼 대학 / Herdecke 연구소) 교수 박사 박사 프랭크 Thévenod에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
