Summary
Calcium er involveret i mange fysiologiske og patofysiologiske signalveje. Live-cell imaging kræver specialiseret udstyr og kan være tidskrævende. En hurtig, enkel metode under anvendelse af et flowcytometer til at bestemme de relative ændringer i cytosolisk calcium i adhærerende epitelceller bragt i suspension blev optimeret.
Introduction
Calcium er en vigtig second messenger ansvarlig for transmission af cellulære fysiologiske og patofysiologiske signaler 1. Cytosoliske calciumkoncentrationerne holdes lavt gennem aktiviteten af calcium pumper og calcium vekslere. Det sarkoplasmiske / endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA) genopfylder det endoplasmatiske reticulum (ER) calcium lager som del af en "pumpe lække" system, hvorimod plasmamembranen calcium ATPase (PMCA) ekstruderer calcium til det ekstracellulære rum, både i ATP-afhængige måder 2. Fysiologiske messengers, såsom hormoner eller neurotransmittere, sender deres signaler gennem G-protein-koblede receptorer, aktivering af phospholipase C, der hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) i plasmamembranen at generere diacylglycerol og inositoltriphosphat (IP3) 3. Mens diacylglycerol forbliver i plasmamembranen, IP3 diffunderer ind i cytosolen og binder til IP3 receptors (IP3Rs), som ligand aktiverede calciumkanaler, fundet i ER-membranen og calcium frigives fra ER luminale butik kulminerede i en stigning i cytosoliske calciumkoncentrationer 4. En alternativ vej for calcium at nå cytosolen gennem calciumkanaler og varmevekslere til stede i plasmamembranen. Krydstale mellem disse to rum er blevet beskrevet: calcium induceret calcium frigivelse (CICR) hvor ekstracellulært calcium inducerer calcium frigivelse fra ER butikker 5, og butikken drives calcium post (SOCE) hvor tømning af ER stores registreres af STIM og forårsager åbning af Orai calciumkanaler i plasmamembranen at fremme genpåfyldning af ER-butikker 6.
Under patofysiologiske tilstande, det cellulære calcium respons er deregulerede og cytosolisk calcium stigninger i fravær af fysiologiske stimulatorer 1. Calcium reaktion kan påvirkes på en række måder: langvarig calciumsignal, forsinket calcium fjernelse fra cytosolen, udtynding af calcium butikker eller lokaliserede ændringer i calcium. Endvidere mitokondrierne tage på en central rolle i buffering og frigive calcium 7. Langvarig og / eller supramaksimal cytosolisk calcium stigning fører til celledød. Faktisk calcium er oftere end ikke er involveret i den cellulære patofysiologiske respons og er en vigtig begivenhed i en bred vifte af sygdomme, såsom neurodegenerative sygdomme, hjertesygdomme, cancer, knoglesygdom og nyresygdom, som er hovedsagelig forbundet med celledød og tab eller ændring af organ eller væv funktion 8-10. Desuden er forstyrrelse af calcium signaler er knyttet til cellulær tilpasning og ændringer i cellulære funktioner og reaktioner.
Traditionelt er calcium signaler målt med en negativt ladet fluorescerende calcium-indikator, der er lagt ind i celler i en celle-permeable acetoxymethyl (AM) ester form. Når spaltes af cellulære Esterases, forbliver fluorescerende indikatorer inden det intracellulære rum og stige i fluorescensintensitet, når calcium er bundet. Den mest kendte og anvendte calcium indikator er ratiometrisk Fura-2 er udviklet af Roger Tsien og kolleger 11. Calcium indikatorer med forskellige tilhørsforhold for calcium tillade forskellige calcium puljer, der skal overvåges. Detektionsmetoder inkluderer live-cell imaging, fluorescens mikropladeaflæser og flowcytometri. De relativt hurtige kinetik calcium signaler (normalt inden for et par sekunder til minutter) gør levende celle billeddannelse den bedste metode til at få de fleste oplysninger om karakteristika for calcium signal. Bortset fra de hurtige kinetik for calcium signaler (i millisekunder), live cell imaging er en bedre metode til at studere cellulære opdeling af calcium signalering inden for en enkelt celle 12. Absolutte calciumkoncentrationer kan beregnes ved at bestemme den minimale og maksimale fluorescens af calcium INDICATOR ved tilsætning af en calciumchelator og permeabilisering af cellerne, henholdsvis som beskrevet af Grynkiewicz et al. 11.
Anvendelse af flowcytometri til måling af calcium signaler blev først udviklet i 1980'erne i immunologiske celler, hvor muligheden for at måle flere parametre, såsom membran integritet og adskillelse af cellepopulationen, og kravet om celler i suspension kombineret med udviklingen af enkelt bølgelængde calcium indikatorer gjort flowcytometri en ideel og convenientdetection metode 13-15. I adhærente celler, live cell imaging giver den mest information om calcium signalering, vigtigst kinetikken, men kræver en kompliceret opsætning, der omfatter et fluorescens mikroskop, et perfusionssystem, opretholdelse af det cellulære miljø, såsom temperatur, og specialiseret mikroskop software til at erhverve og analyse af data. Alternative metoder, såsom et fluorescens-mikropladelæser eller Pharmacological midler gennem brug af calciumchelatorer er uforlignelig i form af indsamlede informationer. Flowcytometri bliver mere udbredt at overvåge cytosolisk calcium i adhærerende celler dog i de fleste undersøgelser, kun endepunkt målingerne er udført. Brug den metode, der oprindeligt er udviklet af Gergely et al. I immunologiske B-celler 16 har ændringer i cytosol fri calciumkoncentration ved flowcytometri med real-time kinetik og overvågning af fluorescens intensitet i de enkelte celler fra en prøve population succes blevet målt i kræft epitelceller og cancer stamceller hybrider 17. Denne fremgangsmåde blev yderligere tilpasset til anvendelse i adhærerende epitelceller, som er vanskelige at indlæse med calcium indikatorer 18.
Her, ved hjælp af en udødeliggjort klæbende epithelial cellelinie afledt fra S1 segmentet af rottenyre proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 beskriver vi en optimeret forenklet metode for målingen af ændringer i cytosolisk calciumkoncentration ved flowcytometri. Da mange epitelceller i besiddelse af en række organiske transportører for anioniske forbindelser kan loading af celler med en calcium-indikator vise sig at være en udfordring. For at forhindre udstrømning af calcium indikatorer, probenecid, prototypisk inhibitor af organiske anion transportører og oprindeligt udviklet til at reducere renal udskillelse af penicillin 20, påføres samtidigt i inkubationsmediet. Cellerne opretholdes i monolag for calcium indikator lastning, bringes i suspension og calcium signaler kan påvises umiddelbart efter forbindelse tilsætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser og opløsninger
- Forberede en modificeret Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) (i mM: 136,9 NaCI, 5,37 KCI, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, ingen phenolrødt). Opbevares ved 4 ° C.
- Lav 1,5 M CaCl2 og 2 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) (pH 7,2) stamopløsninger med destilleret vand.
- Forbered en 250 mM stamopløsning af probenecid. For den frie syreform (ofte omtalt som vanduopløselig) opløses probenecid pulver i 1 N NaOH, fyldes op til tre fjerdedele af det endelige volumen med destilleret vand og langsomt titreres til pH 7,4 med 1 N HCI. Opbevares ved 4 ° C.
- Opløs fluorescerende membranpermeabel calcium bindende farvestof i vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO) til en stamkoncentration på 1 mM. Opbevares ved -20 ° C i mørke.
- Forud for hvert eksperiment forberede frisk probenecid indeholdende HBSS flux (PHF) puffer ved at kombinere modificeret HBSS med (i slutkoncentrationer) 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% føtalt bovint serum, 2 mM probenecid, og 5,55 mM glucose. Opvarm til 37 ° C.
2. Cell Culture
- Plate 2,5 x 10 5 nyre proximale tubuliceller (WKPT-0293 Cl.2) pr brønd i en 6-brønds plade eller 35 mm skål i standard dyrkningsmedium og vokse i 2 dage at nå en konfluens på ca. 70%.
3. Calcium Dye Loading
- For hver brønd eller skål, bland 1 ml dyrkningsmedium indeholdende 5% føtalt bovint serum, 4 uM celle-permeable calcium bindende farvestof og 2 mM probenecid.
- Erstatte dyrkningsmedium med 1 ml loading dye blandingen i hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter i en befugtet inkubator med 5% CO 2. Dæk pladen med aluminiumfolie for at undgå blegning af fluorescerende indikator.
4. Fremstilling af CeLLS til flowcytometri
- Varm 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning til 37 ° C.
- Aspirat calcium loading dye opløsning fra hver brønd og tilsæt 1 ml trypsin langs brøndens væg.
- Der inkuberes ved 37 ° C, indtil alle celler er fritliggende.
- Overfør celler til et 1,5 ml rør og pellet ved centrifugering i en mikrocentrifuge ved 10.000 g i 1 min.
- Aspireres forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet.
- Vask cellerne ved tilsætning af 1 ml PHF buffer og resuspenderes ved pipettering op og ned.
- Pelletere celler ved centrifugering ved 10.000 g i 1 min.
- Gentag trin 4.6. og 4.7. yderligere to gange.
- Resuspender celler i et endeligt volumen på 500 pi PHF buffer og anvende cellerne til forsøg inden for 1 time.
- Valgfrit: tæller celler for at bestemme koncentrationen af cellen og anvende 5 x 04-1 Oktober x 10 5 celler pr måling.
5. Flow Cytdometret Setup
- Start flowcytometret åbne fluidik skuffen og flip udluftningsventilen vippekontakt til at øge lufttrykket af tanken sheathvæske.
- "Prime" instrumentet til at fjerne potentielle bopæl luftbobler fra inden for de slanger og strømningskammeret.
- I flowcytometri software, åbne to dot plot vinduer.
- Den første dot plot kræver fremad spredt lys (FSC) for X-parameter og side spredte lys (SSC) for Y-parameter til at styre for kvaliteten af cellerne i prøven gennem deres størrelse og granularitet hhv.
- Den anden dot plot måler fluorescensintensiteten af calcium-bundet farvestof. Vælg den relevante fluorescenspåvisning kanal for Y parameter ved at anvende en logaritmisk skala og tid i sekunder for X parameter på en lineær skala.
- Indstil flowet til "høj".
6. Flowcytometri Measurement
- Udfør målingerne ved stuetemperatur. I en flowcytometri prøverør (11,5 x 75 mm), tilsættes 480 pi PHF buffer.
- Tilsæt 20 pi cellesuspension og kortvarigt vortex at blande.
- Flyt tuben bærearm til siden og placere prøveglasset over prøven injektion rør, indtil en tæt forsegling er dannet. Vende røret bærearm til sin oprindelige centreret position.
- Optimere måling ved at justere fluorescens kanal, således at den gennemsnitlige fluorescensintensitet af prøven er på ca. 10 2 på y-aksen. Gemme og bruge de efterfølgende eksperimenter.
- For at starte et eksperiment, skal du gentage trin 6,1-6,3.
- Optag basisliniefluorescensen for 50 sec.
- Pause måling fjerne prøverøret tilsættes forbindelsen af interesse, vortex kortvarigt og vende tilbage til prøveindsprøjtning røret. Dette trin bør ikke tage mere end 15 sek.
- Genoptage måling og fortsætte i alt 204,8 sek.
- Brug en calcium ionophore, såsom ionomycin (10 uM), og en calciumchelator, såsom ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), MnCI2 eller CoCl2 (2 mM), positive og negative kontroller, henholdsvis.
7. Data Analysis
- Analysere data ved hjælp af dedikerede flowcytometri software til offline analyse, såsom WinMDI (Windows Multiple Document Interface til flowcytometri), en gratis software pakke udviklet af Joe Trotter på The Scripps Institute, flowcytometri Core Facility.
- Åbn en dot plot med SSC og FSC parametre.
- Vælg den region af celler til analyse ved hjælp af "Regioner" værktøj (højreklik på billedet) for at udelukke døde celler eller cellerester findes i nederste venstre hjørne af dataanalysen (Figur 1).
- Kvadrant analyse (figur 2)
- Åbne en densitet plot med tiden på x-aksen og fluorescensintensitet på y-aksen. Brug alle arrangementer.
- Ose samme gating region som i 7.3.
- Kvantificere de data ved at bruge "Quadrant" værktøj.
- Juster kvadrantelektroderne separatorer således at den lodrette linie er placeret ved forbindelsen tilsætning og den vandrette linje er placeret i centrum af basisliniefluorescensen i kontrollerne. Sikre, at placeringen af kvadrantelektroderne separatorer er ens i alle prøver.
- Procentdelen af celler i hver kvadrant er vist i hvert hjørne (figur 2). Sammenlign øverste højre kvadrant (UR) mellem prøver.
- Histogram analyse (figur 3)
- Åbne styredataene i et histogram vindue med fluorescensintensitet på x-aksen og arrangementer på y-aksen. Brug alle arrangementer.
- For en billedlig overblik, tilsæt testdata, der skal sammenlignes med kontrolgruppen plot som overlay plots (gå til File → Open File → Vælg fil → Overlay).
- Til kvantitativ analyse enkelt histogram vindeduer skal anvendes. Gate cellepopulationen hjælp regionen R1 fra trin 7.3.
- I den ikke-behandlede kontrolgruppe, bruge markør funktion ("markører") for at markere det område, til analyse startende fra midtpunktet mellem det minimale og maksimale fluorescens af kontrol top og slutter ved den maksimale fluorescensintensitet. Procentdelen af celler i dette område beregnes.
- Hente data fra statistik vinduet. Gentag for resterende datafiler ved hjælp af den samme markerede område til analyse.
- Fluorescensintensitet analyse (figur 4)
- Åbne et dot-plot med tiden på x-aksen og fluorescensintensitet på y-aksen. Brug alle arrangementer.
- Aktiver "Kinetics Mode" og "Overlay Kinetics Line". En blå linje vises i dot-plot, der repræsenterer den gennemsnitlige fluorescens intensitet.
- Kvantificere den relative calciuminflux ved at oprette flere rektangulære områder. Hver region skal have awidth omkring "50", hvilket svarer til "10 sec". Definer op til 15 rektangulære regioner.
- Hent kvantificering fra statistik vinduet og kopiere ind i et regneark.
- Brug y middelværdi data til analyse. Beregne middelværdien af R2 til R6, som svarer til 20 til 50 sek. Dette er den grundlæggende værdi.
- Vælg et passende tidsinterval for calciumindstrømning analyse (afhænger debut, varighed og intensitet).
- Beregn calcium signaler fra hver region inden for dette tidsinterval i forhold til den gennemsnitlige baseline værdi, dvs. fluorescenssignalet før forbindelsen tilføjelse, der er sat til 100%. Bestem middelværdi og standardafvigelse af regionerne skrive sammensatte tilføjelse; dette er den gennemsnitlige calcium signal fremkaldt af forbindelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at øge cytosolisk calcium, blev to farmakologiske forbindelser anvendes på renale proksimale tubuliceller (WKPT-0293 Cl.2) indlæst med celle gennemtrængelig calcium bindende farvestof, Fluo-3-AM. Ubehandlede kontrolprøver blev fyldt med calcium bindende farvestof i nærvær af probenecid og blev blandet, men uden tilsætning af nogen forbindelser. Thapsigargin (TG) er et klassisk inhibitor af SERCA pumpe fører til lækage ud af ER og resulterer i øget cytosolisk calcium. Tunicamycin (TUN) blokke N-glycosylering af proteiner, der fører til aktivering af det udfoldede protein reaktion, men øger også cytosolisk calcium 18,21. Som en positiv kontrol, ionomycin (IONO), en calciumionophor gør plasmamembranen gennemtrængelig for ekstracellulært calcium, blev anvendt. Til analyse blev cellepopulationen gated ved at vælge et område i SSC / FSC dot plot (R1 i figur 1). En tæthed plot for fluorescens intensitet vs. tid blev oprettet for hver datafil. Ved hjælp af kvadrant funktion, blev dot plot opdelt i fire områder, der repræsenterer Fluo-3 fluorescens intensitet før og efter tilsætning af forbindelse og over og under basisliniefluorescensen. Kvantificering som procent af gated celle population i hver kvadrant tillader bestemmelse af øget cytosolisk calcium koncentration. I dette eksempel 3 uM TG forårsager en stigning i procentdelen af celler i den øvre højre kvadrant indikerer, at en calcium signal er blevet fremkaldt. Procentdelen af celler stiger fra 42,8% i kontrollen til 51,3% (1,20 gange) i TG behandlede celler. Tilsvarende 6 uM TUN forøger procentdelen af celler med forøget calcium fluorescensintensitet til 49,9% (1,17 gange). Anvendelse af 10 uM IONO resulterede i 65,5% (1,53 gange) af celler i den øverste højre kvadrant (figur 2). Histogrammet Analysen resulterede i 1,41 fold, 1,36 gange og 2,11 gange af TG, TUN og IONO henholdsvis (Figur 3) (for statistik, se <sup> 18). Endelig giver regionen analyse tilstand multiple, TG, TUN og IONO forårsaget 1,55 gange, 1,29 gange og 4,54 gange stigninger i calcium signal over kontrol (figur 4).
Den mest følsomme analyse tilstand var regionen analyse multiple. I modsætning til den kvadrant og histogram analyse tilstande, hvor fordelingen af cellepopulationen kvantificeres regionen analyse tilstand multiple kvantificerer ændringen i fluorescerende signal fra den totale cellepopulation. Den største forskel i resultaterne fra forskellige analyseresultater modes var for ionomycin der varierede fra 1,53 fold forøgelse i forhold til styring fra kvadrant analyse til 4,54 gange fra regionen analyse multiple. De testede forbindelser udviste ikke en sådan varians. Men i alle analyser modes, omfanget af calcium signal fremkaldte forblev den samme, selvom de absolutte værdier afveg, dvs IONO havde den største effekt, efterfulgt af TG og derefter TUN. Anvendelse af TG, TUN eller IONO resulterer i varige ændringer i cytosolisk calcium. At afgøre, om der kan måles fysiologiske calcium signaler, som er flygtige, bruge denne metode blev ATP anvendt på WKPT-0293 Cl.2 celler. ATP fremkaldte en hurtig og forbigående calcium signal, som ikke kunne optages i sin helhed af flowcytometri metode. ATP-koncentrationer på fra 20 til 100 pM var vanskelig at opdage derfor koncentrationen blev reduceret til "bremse" calcium signaler. Som vist i figur 5, kan der måles en ændring i cytosolisk calcium efter tilsætning af 5 pM ATP. Alligevel blev toppen af fluorescens ændring ikke registreres. Ved hjælp af kvadrant analyse (figur 5B) og histogram analyse (figur 5C) modes, ingen forskel i calcium signaler i ATP kunne påvises på grund af den forbigående karakter af calcium signal. Men med udvalgte dele af spor, den mangesidede rectangular region analyse, der er optaget en 1,85 ganges forøgelse af calcium signal umiddelbart efter genoptaget måling (figur 5A).
Figur 1. SSC versus FSC-punktdiagram. Integriteten af cellepopulationen vurderes ved anvendelse sidespredning (SSC) og forward scatter (FSC). En region er valgt (R1) til yderligere analyse. Døde celler og cellerester, hvilket har reduceret lysspredning, er udelukket. Et repræsentativt dot plot vises.
Figur 2. Quadrant analyse. Basisliniefluorescensen af calcium bindende dye-loaded WKPT-0293 Cl.2 celler blev målt til 50 sek. Måling blev stoppet, forbindelse eller diluent blev tilsat hvirvlet for at blande og måling blev genoptaget straks i alt 204,8 sek. Kvantificering blev udført under anvendelse kvadrant analyse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Histogram analyse. Histogram plot af calcium bindende dye-loaded WKPT-0293 Cl.2 celler behandlet med TG, TUN eller IONO. Ved hjælp af markør-funktionen, procentdelen af gated celler med højt calcium bindende farvestoffluorescens intensitet blev kvantificeret ved at placere startpunktet for markør på toppen af styrekurven og slutter ved den maksimale fluorescens. Klik her for at se et largis version af denne figur.
Figur 4. Multiple region analyse. Basisliniefluorescensen af calcium bindende dye-loaded WKPT-0293 Cl.2 celler blev målt til 50 sek. Måling blev stoppet, forbindelse eller fortyndingsmiddel blev tilsat hvirvlet for at blande og måling blev genoptaget straks i alt 204,8 sek. Kvantificering blev udført ved hjælp af flere rektangulære region analyse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Analyse af ATP-induceret calcium signaler. Basisliniefluorescensen of calcium bindende dye-loaded WKPT-0293 Cl.2 celler blev målt til 50 sek. Måling blev standset, 5 uM ATP blev tilsat hvirvlet for at blande og måling blev genoptaget straks i alt 204,8 sek. Dataene blev kvantificeret ved anvendelse af multiple rektangulært område analyse (A), kvadrant analyse (B) eller histogram analyse (C). For regionen analyse multiple blev kun forbigående calcium signal analyseres. Repræsentative data eller analyser fra n = 3 -. 7 er vist Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium er en vigtig begivenhed i flere cellulære processer, der virker som en anden messenger signalmolekyle og også som et middel til at kommunikere mellem ER og mitokondrier. Evnen til at måle ændringer i frie cytosoliske calciumkoncentrationer er en nyttig teknik, der kan anvendes på alle områder af cellebiologi. Der er forskellige metoder til at opdage cytosoliske calcium signaler. Klassisk, signaler fra en ratiometrisk calcium-indikator, såsom Fura-2, overvåges i levende celler ved hjælp af en fluorescensimagografi opsætning og absolutte calciumkoncentrationer kan udledes bestemme minimum og maksimum fluorescensintensiteter. Imidlertid kræver denne teknik specialiseret udstyr, såsom et fluorescens-mikroskop, en levende celle imaging oprettet og analysesoftware. Her beskriver vi en simpel metode til påvisning calcium i cytosolen af adhærerende epitelceller ved hjælp af flowcytometri, som er tilgængelige for de fleste laboratorier.
Epithel er i possession af en vifte af transportører, der er ansvarlige for transport af metabolitter, miljøfremmede stoffer og narkotika. Af særlig betydning er den SLC22A superfamilien, som organisk kation og organisk aniontransporter tilhører 22, og det ATP-bindende kassette (ATP) superfamilien, som tæller multiresistens P-glycoprotein ABCB1 og multiresistens proteiner (MRPs) blandt sine medlemmer 23 . Indledende forsøg under anvendelse af rotte-nyre proximale tubulus cellelinie WKPT-0293 Cl.2 blev udført som beskrevet i artiklen af Gergely et al. 16. Cellerne blev bragt i suspension og fyldt med Fluo-3 AM. Imidlertid blev kun en beskeden ændring observeret med 10 pM ionomycin (38.14% versus 50.95% i kontrol fra kvadrant analyse eller 1,78 gange ved multipel region analyse). Vi antager, at epitheliale transportører var ansvarlige for den dårlige lastning af cellerne med Fluo-3 AM. For at omgå dette problem, probenecid og PSC833, hæmmere af organisk ennion transportører og multiresistens P-glycoprotein, henholdsvis blev anvendt samtidig med calcium bindende farvestof til cellemonolag. Probenecid forbedret calcium bindende farvestof lastning, som indikeret ved en stigning i baseline fluorescensintensitet, mens PSC833 havde ingen virkning, hvilket er i modsætning til en tidligere rapport i ovarieceller fra kinesisk hamster 24. Denne forskel skyldes sandsynligvis størrelsen af ABCB1 i de forskellige cellelinier; den WKPT-0293 Cl.2 cellelinie rummer en lav endogen niveau ABCB1, som kan induceres af giftige stoffer, såsom giftige metaller 25,26. Anvendelsen af probenecid at forbedre calcium farvestof belastning kan udvides til andre celletyper, der udviser probenecidtabletter-sensitive transportsystemer, såsom celler i nervesystemet, blod-hjerne-barrieren og leveren, hvor calcium signalering kan spille en rolle i intracellulær signalering veje.
Den nemme detektion af calcium binding til Fluo-3 ligger i dets vandskraveneMåle- af kun en excitationsbølgelængde (506 nm) og en emissionsbølgelængde (525 nm). Men de genererede data med enkelt bølgelængde calcium bindende farvestoffer, som en ikke-ratiometrisk farvestof, kan kun anvendes til at kvantificere relative stigninger i cytosolisk calcium i forhold til ikke-behandlede kontroller. For at bestemme absolutte calciumkoncentrationer, er det nødvendigt med en ratiometriske farvestof fordi en spektral skift sker efter calciumbinding der giver mulighed for korrektion af ulige farvestof lastning og blegning. Den ratiometrisk farvestof Indo-1 er blevet anvendt i påvisning af calciummobilisering i immunologiske celler ved flowcytometri 27,28 men hidtil har dette ikke udført i epitelceller. Ved hjælp af to emissionsspektre af UV-exciteres Indo-1 (400 nm, når calcium er bundet og 475 nm, når calcium fri), absolutte cytosoliske calciumkoncentrationer kan bestemmes som beskrevet af Grynkiewicz et al. 11.
Vort eksempel data ansat farmakologiske forbindelser, der inducerer apermanent ændring i cytosolisk calcium. Fysiologiske calcium signaler er af lav intensitet, vise hurtige kinetik og er forbigående, og dermed spørgsmålet er stadig, om flowcytometri metode er følsom nok til at påvise fysiologiske calcium signaler. Forsøg med ATP blev udført med WKPT-0293 Cl.2 cellelinie, som huser purinergiske receptorer, som påvist ved forøget calcium signal ved anvendelse af ATP (målt ved levende celler). Ved hjælp af flowcytometeret, kan øget cytosolisk calcium iagttages med 1-100 uM ATP, men den hurtige karakter signal kombineret med den forsinkede genoptage målingen efter forbindelse betød desuden, at kun en del af det signal kunne registreres. Således en væsentlig ulempe ved flowcytometri metode er den begrænsede evne til at optage hurtige (<10 sek) og forbigående calcium signaler; snarere metode er mere egnet til stimuli, der giver anledning til langsommere transiente signaler (> 10 sec) eller vedvarende forhøjet calcIUM signaler. Disse begrænsninger kunne omgås ved at reducere stimulator koncentration eller ved at anvende inhibitorer for calcium reuptake mekanismer til at holde de frigivne calcium i cytosolen men forsigtighed skal træffes for at vælge en inhibitor koncentration, der ikke øger cytosolisk calcium per se.
De oplysninger, erhvervet af levende celler og flowcytometri er helt anderledes. Med levende celler, den høje opløsning betyder, at der kan måles rumlige ændringer i calcium ved at vælge intracellulære regioner af enkelte celler til billeddannelse. Desuden er fluorescenssignaler erhverves nonstop hver 1 - 2 ud sek derfor hurtige calcium signaler kan optages. I modsætning hertil flowcytometri er mere egnet til langsommere og langvarige calcium signaler og måler calcium signaler fra en hel-celle population. Kun relative ændringer i calcium-signaler kan kvantificeres med flowcytometri metode. Men flowcytometri metode har en række af Advanlene i forhold til konventionelle billedbehandling af levende celler: 1) high throughput screening af forbindelser (stimulatorer og inhibitorer af calcium signalering) kan udføres; 2) specifik billeddannelse ekspertise er ikke nødvendig; 3) Forskning teknikere kan udføre målingerne; 4) kliniske og ikke-kliniske laboratorier, der ikke har midler til at udføre høj opløsning billeddannelse og ratiometriske calcium målinger kan undersøge calcium signalering. Tilsammen flowcytometri metode er nyttig, hvis investigator oprindeligt ønsker at etablere en rolle for calcium og kunne nemt anvende hæmmere til at bestemme opstrøms og nedstrøms signalveje, hvorimod levende celler ville være forpligtet til at karakterisere calcium signal (f.eks., Kinetik , intensitet, rumlige ændringer) i yderligere detaljer.
Sammenfattende beskriver vi en hurtig, enkel og følsom metode til påvisning af real-time relative ændringer i cytosolisk calcium i vanskelige-til-load vedhængende epitelial nyreceller, der er blevet bragt i suspension. For eksperimentatorerne uden adgang til et flowcytometri kan denne fremgangsmåde let anvendes på en spektrofluorimeter med cellesuspensionen i en kuvette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forskning i laboratorierne er finansieret af Fritz-Bender Foundation, München, Tyskland (TD) og en University of Witten / Herdecke interne forskningsbevilling (til W.-KL). Vi vil gerne takke Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut for Fysiologi, patofysiologi og Toksikologi, University of Witten / Herdecke) for nyttige forslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
