Summary
Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.
Introduction
Calcium ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff für die Übertragung von zellulären physiologischen und pathophysiologischen Signale 1 verantwortlich. Cytosolischen Calciumkonzentrationen werden durch die Aktivität der Calciumpumpen und Calciumtauscher gering gehalten. Das Sarkoplasma / Endoplasmatischen Retikulum Kalzium-ATPase (SERCA) füllt das endoplasmatischen Retikulum (ER) Calciumspeicher als Teil einer "Pumpe Leck" System, während die Plasmamembran Calcium ATPase (PMCA) extrudiert Calcium an den extrazellulären Raum, sowohl im ATP-abhängigen Weise 2. Physiologischen Botenstoffe, wie Hormone oder Neurotransmitter, übertragen ihre Signale über G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Aktivierung von Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der Plasmamembran hydrolysiert zu Diacylglycerol und Inositoltriphosphat (IP3) 3 zu erzeugen. Während Diacylglycerin in der Plasmamembran bleibt diffundiert IP3 in das Cytosol und bindet an IP3-Rezeptors (IP3Rs), die Liganden-aktivierten Calciumkanäle, in die ER-Membran und Calcium ist von dem ER luminalen Speicher die mit einer Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration 4 gelöst. Eine alternative Route für Calcium in das Cytosol zu erreichen, ist durch Calciumkanäle und Wärmetauscher in der Plasmamembran vorhanden sind. Übersprechen zwischen diesen beiden Fächern wurden beschrieben: Calcium induzierte Calciumfreisetzung (CICR), wo extrazelluläres Calcium induziert Calcium-Freisetzung aus ER speichert 5 und Speicher betrieben Calcium Eintrag (SOCE), wo Entleerung der ER speichert durch STIM erfasst und bewirkt Öffnung Orai Calcium-Kanäle in der Plasmamembran zu fördern Nachfüllen der ER speichert 6.
Unter pathophysiologischen Bedingungen ist die zelluläre Kalziumantwort deregulierten und cytosolischen Calciumerhöhungen in Abwesenheit von physiologischen Stimulatoren 1. Die Calcium-Reaktion kann in einer Anzahl von Weisen beeinflusst werden: verlängerte CalciumSignal, verzögerte Calciumentfernung aus dem Cytosol, Erschöpfung der Kalziumspeichern oder lokalisierte Veränderungen der Kalzium. Darüber hinaus sind die Mitochondrien nehmen eine zentrale Rolle bei der Pufferung und der Freisetzung von Kalzium 7. Längerer und / oder supra zytosolischen Kalziumanstieg führt zum Zelltod. In der Tat ist Calcium öfter als nicht in der zellularen pathophysiologischen Antwort beteiligt und ist ein Schlüsselereignis in einer Vielzahl von Erkrankungen, wie von neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen, Krebs, Knochenerkrankungen und Nierenerkrankungen, die hauptsächlich mit Zelltod verbunden sind, und Verlust oder die Veränderung von Organ- oder Gewebefunktion 8-10. Darüber hinaus hat der Störungscalciumsignale an zellulären Anpassung und Veränderungen der zellulären Funktionen und Antworten verknüpft.
Traditionell werden Calcium-Signale mit einem negativ geladenen fluoreszierenden Calcium-Indikator, der in einer Zelle durchlässigen Acetoxymethyl (AM) in Esterform in die Zellen geladen werden, wird gemessen. Einmal durch zelluläre Esteras gespaltenes bleiben die Fluoreszenzindikatoren innerhalb des intrazellulären Kompartiment und Erhöhung der Fluoreszenzintensität, wenn Kalzium gebunden ist. Die bekannteste und verwendet Calciumindikator ist die ratiometrische Fura-2 von Roger Tsien und Kollegen 11 entwickelt. Calcium-Indikatoren mit unterschiedlichen Affinitäten für Calcium erlauben verschiedene Calcium-Pools zu überwachen. Nachweismethoden umfassen Live Cell Imaging, Fluoreszenz Mikroplatten-Reader und Durchflusszytometrie. Die relativ schnelle Kinetik der Calciumsignale (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden bis Minuten) macht das Live Cell Imaging, die beste Methode für die Gewinnung die meisten Informationen über Eigenschaften des Calciumsignals. Abgesehen von der schnellen Kinetik der Kalzium-Signale (in Millisekunden), ist Live Cell Imaging eine bessere Methode zur Untersuchung von zellulären Kompartimentierung von Kalzium Signalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle 12. Absolute Calciumkonzentrationen kann durch Bestimmung der minimalen und maximalen Fluoreszenz des Calcium ind berechnet werdenicator durch Zugabe eines Calcium-Chelators und Permeabilisierung der Zellen, die jeweils in der durch die Grynkiewicz et al. 11 beschrieben.
Die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Calcium-Signale zu messen wurde zuerst in den 1980er Jahren in der immunologischen Zellen entwickelt, bei denen die Möglichkeit, mehrere Parameter, wie die Membranintegrität und die Trennung der Zellpopulation, und dem Erfordernis der Zellen in Suspension in Verbindung mit der Entwicklung der einzelnen Wellenlänge zu messen Calcium Indikatoren Durchflusszytometrie einer idealen und convenientdetection Verfahren 13-15. In adhärenten Zellen, bietet Live Cell Imaging die meisten Informationen über Calcium-Signal, was am wichtigsten ist die Kinetik, erfordert jedoch ein kompliziertes Setup bestehend aus einem Fluoreszenzmikroskop, ein Perfusionssystem, Aufrechterhaltung der Zellumgebung, wie Temperatur, und spezialisierte Mikroskop-Software für den Erwerb und Analysieren von Daten. Alternative Verfahren, wie ein Fluoreszenzmikroplattenlesegerät oder Pharmacollogischen Mittel, durch Verwendung von Calciumchelatoren sind in Bezug auf die gewonnenen Informationen unvergleichlich. Durchflusszytometrie wird immer häufiger verwendet, um cytosolische Calcium in adhärenten Zellen, obwohl zu überwachen, in den meisten Studien nur Endpunktmessungen durchgeführt. Verwendung des Verfahrens zunächst von Gergely et al. In immunologischen B-Zellen 16, Änderungen in der cytosolischen freien Kalziumkonzentration mittels Durchflusscytometrie mit Echtzeit-Kinetik und die Überwachung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Zellen aus einer Probenpopulation wurden erfolgreich bei Krebs epithelialen Zellen gemessen und Krebsstammzellhybriden 17. Dieses Verfahren wurde für die Verwendung in adhärenten Epithelzellen, die schwierig mit Calcium-Indikatoren 18 zu laden sind, angepasst.
Hier mit einem verewigt adhärenten Zelllinie aus dem S1-Segment der Rattenniere proximalen Tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 abgeleitet, beschreiben wir eine optimierte vereinfachte methode zur Messung von Änderungen in der cytosolischen Calciumkonzentration durch Durchflusszytometrie. Da viele Epithelzellen eine Reihe von organischen Transporter für anionische Verbindungen besitzen, können Beladung von Zellen mit einem Calcium-Indikator als eine Herausforderung sein. Um das Ausströmen von Kalzium-Indikatoren, Probenecid, der prototypischen Inhibitor der organisches Anion Transporter und ursprünglich entwickelt, um die renale Ausscheidung von Penicillin 20 verringern zu verhindern, wird gleichzeitig im Inkubationsmedium aufgetragen. Die Zellen werden in Monokalziumindikator geladen gehalten, in Suspension gebracht und Calciumsignale unmittelbar nach Zugabe der Verbindung detektiert werden.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Bereiten Sie einen modifizierten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, kein Phenol rot). Lagerung bei 4 ° C.
- Machen 1,5 M CaCl 2 und 2 M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,2) Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser.
- Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung von Probenecid. Für die Form der freien Säure (oft als wasserunlöslich), aufzulösen Probenecid Pulver in 1 N NaOH, zu füllen, um drei Viertel der endgültige Volumen mit destilliertem Wasser und langsam titriert auf pH 7,4 mit 1 N HCl. Lagerung bei 4 ° C.
- Aufzulösen Fluoreszenzlässige Membran Calcium bindenden Farbstoff in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Vorratskonzentration von 1 mM. Lagerung bei -20 ° C im Dunkeln.
- Vor jedem Experiment frisch herzustellen Probenecid enthaltenden HBSS Fluss (PHF) Puffer durch Kombinieren modifizierter HBSS mit (Endkonzentrationen) 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Probenecid und 5,55 mM Glucose. Warm bis 37 ° C.
2. Zellkultur
- Platte 2,5 x 10 5 Zellen des proximalen Tubulus der Niere (WKPT-0293 Cl.2) pro Well einer 6-Well-Platte oder 35 mm-Schale in Standardkulturmedium wachsen und für 2 Tage Erreichen einer Konfluenz von etwa 70%.
3. Calcium Dye Loading
- Für jede Vertiefung oder Schale, Mischungs 1 ml Kulturmedium, enthaltend 5% fötales Rinderserum, 4 uM zellpermeabel Calcium bindenden Farbstoff und 2 mM Probenecid.
- Ersetzen des Kulturmediums mit 1 ml Ladepuffer Mischung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 30 min in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Die Platte mit Aluminiumfolie, um ein Ausbleichen der Fluoreszenzindikator verhindern.
4. Herstellung von Cells für die Durchflusszytometrie
- Warm 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung auf 37 ° C.
- Saugen Calcium Ladefarbstofflösung aus jeder Vertiefung und 1 ml Trypsin entlang der Wand des Bohrlochs.
- Inkubieren bei 37 ° C, bis alle Zellen abgelöst werden.
- Übertragungszellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und Pellets durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 g für 1 min.
- Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
- Wash-Zellen durch Zugabe von 1 ml PHF Puffer und resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 g für 1 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6. und 4.7. zwei weitere Male.
- Zellen in einem Endvolumen von 500 ul Puffer PHF und mit den Zellen für die Experimente innerhalb 1 Std.
- Optional: count Zellen die Zellkonzentration zu bestimmen und 5 × 10 4 - 1x 10 5 Zellen pro Messung.
5. Fluss Cytometer-Setup
- Starten Sie das Durchflusszytometer, öffnen Sie die Fluidik Schublade und Flip das Entlüftungsventil Kippschalter um den Luftdruck der Hülle Fluidtank erhöhen.
- "Prime" das Instrument, um potenzielle Wohnsitz Luftblasen aus dem Inneren der inneren Rohre und der Durchflusskammer zu entfernen.
- In der Durchflusszytometrie Software, Open zwei Dot-Plot-Fenster.
- Die erste Punktdiagramm erfordert vorwärts gestreuten Licht (FSC) für den X-Parameter und Seitwärtsstreulicht (SSC) für die Y-Parameter, um die Qualität der Zellen innerhalb der Probe durch ihre Größe und ihre Granularität zu steuern.
- Der zweite Punkt-Diagramm misst die Fluoreszenzintensität des Calcium-gebundene Farbstoff. Wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenzdetektionskanal für den Parameter Y über eine logarithmische Skala und Zeit in Sekunden für den Parameter X auf einer linearen Skala.
- Stellen Sie die Flussrate auf "hoch".
6. Durchflusszytometrie Messung
- Führen die Messungen bei RT. In einer Durchflußcytometrieprobe Rohr (11,5 x 75 mm), fügen Sie 480 ul PHF Puffer.
- In 20 ul Zellsuspension und kurz Vortex mischen.
- Bewegen der Röhre Tragarm an der Seite und die Position der Probenröhre über dem Probeninjektionsrohr, bis eine dichte Abdichtung gebildet wird. Bringen Sie das Rohr Tragarm in seine ursprüngliche Mittelstellung.
- Optimierung Messung durch Einstellen der Fluoreszenzkanal, so daß die mittlere Fluoreszenzintensität der Probe auf etwa 10 2 auf der y-Achse. Speichern und für spätere Experimente.
- Um ein Experiment zu starten, wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3.
- Rekordfluoreszenzbasis für 50 sec.
- Pause Messung, entfernen Sie das Probenröhrchen, fügen Verbindung von Interesse, kurz vortexen und zum Probeninjektionsrohr. Dieser Schritt sollte nicht länger als 15 sec.
- Fortsetzen Messung und weiterhin für insgesamt 204,8 sec.
- Verwenden Sie einen Kalzium ionophore wie Ionomycin (10 uM) und ein Calcium-Chelatbildner, wie beispielsweise Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), MnCl 2 oder CoCl 2 (2 mM) für positive und negative Kontrollen.
7. Datenanalyse
- Analysieren von Daten mit dedizierten Durchflusszytometrie Software für die Offline-Analyse, wie WinMDI (Windows Multiple Document Interface für die Durchflusszytometrie), einer freien Software-Paket von Joe Trotter am Scripps Institute, Durchflusszytometrie Core Facility entwickelt.
- Öffnen Sie ein Punktdiagramm mit SSC und FSC-Parameter.
- Wählen Sie die Region der Zellen für die Analyse mit Hilfe der "Regionen" Werkzeug (Rechtsklick auf das Bild), um abgestorbene Zellen oder Zelltrümmer in der linken unteren Ecke von der Datenanalyse (Abbildung 1) auszuschließen.
- Quadrant-Analyse (Figur 2)
- Öffnen einer Dichteverteilung mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
- Unse die gleichen Gating Region wie in 7.3.
- Quantifizieren Sie die Daten mit Hilfe der "Quadrant" -Tool.
- Einstellen der Quadranten Separatoren, so daß die vertikale Linie zum Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung gegeben, und die horizontale Linie in der Mitte des Grundfluoreszenz in den Kontrollen gegeben. Sicherzustellen, dass die Positionierung der Quadranten Separatoren in allen Proben gleich ist.
- Der Prozentsatz an Zellen in jedem Quadranten ist in jeder Ecke (2) angezeigt. Vergleichen des oberen rechten Quadranten (UR) zwischen den Proben.
- Histogrammanalyse (Figur 3)
- Öffnet die Steuerdaten in einem Histogramm-Fenster mit der Fluoreszenzintensität auf der x-Achse und Ereignisse auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
- Für eine Bildübersicht, fügen die Testdaten, um zu der Kontrollparzelle als Overlay Parzellen (weiter zu → Öffnen Sie Datei → Datei auswählen → Overlay-Datei) verglichen werden.
- Für die quantitative Analyse einzelner Histogramm gewinnenster müssen verwendet werden. Tor der Zellpopulation mit der Region R1 aus Schritt 7.3.
- In der nicht-behandelten Kontrolle, mit dem Marker-Funktion ("Marker"), um den Bereich für die Analyse ausgehend von dem Mittelpunkt zwischen dem minimalen und maximalen Fluoreszenz des Steuer Spitze und endet bei der maximalen Fluoreszenzintensität zu kennzeichnen. Der Prozentsatz an Zellen in diesem Bereich berechnet.
- Abrufen von Daten aus dem Statistik-Fenster. Wiederholen Sie für verbleibende Datendateien mit dem gleichen markierten Bereich für die Analyse.
- Fluoreszenzintensitätsanalyse (Figur 4)
- Öffnen einer Dot-Plot mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen.
- Enable "Kinetics Mode" und "Overlay Kinetics Line". Eine blaue Linie in der Dot-Plot der mittleren Fluoreszenzintensität repräsentiert erscheinen.
- Quantifizierung der relativen Calcium-Einstrom, indem Sie mehrere rechteckige Bereiche. Jede Region sollte awreite von etwa "50", die gleichbedeutend mit "10 sec" ist. Definieren Sie bis zu 15 rechteckige Bereiche.
- Abrufen Quantifizierung aus der Statistik-Fenster und kopieren Sie in eine Tabellenkalkulation.
- Verwenden Sie die y-Mittelwert Daten für die Analyse. Berechnet den Mittelwert der R2 bis R6, die gleich 20 bis 50 sec ist. Dies ist der Ausgangswert.
- Wählen eines geeigneten Zeitintervalls für Calcium-Einstrom-Analyse (abhängig von Beginn, Dauer und Intensität).
- Berechnen der Calciumsignale aus jeder Region innerhalb dieses Zeitintervalls relativ zu dem mittleren Grundlinienwert, das heißt, das Fluoreszenzsignal vor Zugabe der Verbindung, die auf 100% gesetzt. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung der Regionen veröffentlichen Verbindung hinaus; Das ist die Durchschnittscalciumsignal durch die Verbindung hervorgerufen wird.
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Representative Results
Um cytosolischen Calcium zu erhöhen, wurden zwei pharmakologische Verbindungen zu Nieren proximalen Tubuluszellen (WKPT-0293 Cl.2) mit zellpermeablen Kalzium bindenden Farbstoff, Fluo-3-AM beladen angewendet. Unbehandelten Kontrollproben wurden mit Calcium bindenden Farbstoff in Gegenwart von Probenecid geladen und gemischt, aber ohne den Zusatz irgendwelcher Verbindungen. Thapsigargin (TG) ist ein klassisches Inhibitor der SERCA Pumpe führt, aus dem ER Leckage und zu erhöhten zytosolischen Calcium. Tunicamycin (TUN) Blöcke N-Glykosylierung von Proteinen, die zur Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, sondern erhöht auch die zytosolischen Calcium 18,21. Als positive Kontrolle, Ionomycin (Iono), ein Calcium-Ionophor wodurch die Plasmamembran durchlässig für extrazelluläres Calcium, verwendet. Zur Analyse wurde die Zellpopulation durch die Auswahl einer Region im SSC / FSC-Punktediagramm (R1 in Abbildung 1) gated. Eine Dichte Grundstück für Fluoreszenzintensität gegen die Zeit wurde für jede Datendatei erstellt. Durch Verwendung des Quadrantenfunktion wurde die Dot-Plot in vier Bereiche Fluo-3 Fluoreszenzintensität repräsentiert vor und nach Zugabe der Verbindung und über und unter dem Fluoreszenzbasis getrennt. Quantifizierung als Prozentsatz der gated Zellpopulation in jedem Quadranten erlaubt die Bestimmung der erhöhten cytosolischen Calciumkonzentration. In diesem Beispiel bewirkt, 3 uM TG eine Erhöhung des Prozentsatzes von Zellen in dem oberen rechten Quadranten anzeigt, daß ein Calciumsignal induziert wurde. Der Prozentsatz der Zellen steigt von 42,8% in den Kontroll 51,3% (1,20-fach) in TG behandelten Zellen. Ebenso steigert 6 uM TUN den Prozentsatz an Zellen mit einer erhöhten Calciumfluoreszenzintensität auf 49,9% (1,17-fach). Applikation von 10 & mgr; M IONO ergab 65,5% (1,53-fach) von Zellen in dem oberen rechten Quadranten (Abbildung 2). Das Histogramm Analyse ergab 1,41 fach, 1,36-fach und 2,11-fach durch TG, TUN und IONO jeweils (Abbildung 3) (für die Statistik finden Sie unter <sup> 18). Schließlich mit der Region Analysemodus mehrfach, TG, TUN und IONO verursacht 1,55 fach, 1,29-fach und 4,54-fach erhöht in Calciumsignals über Kontrolle bzw. (Abbildung 4).
Die empfindlichste Analysemodus war der mehrfache Regionsanalyse. Im Gegensatz zu den Quadranten und Histogrammanalyse Arten, bei denen die Verteilung der Zellpopulation wird quantifiziert, quantifiziert die Region Analysemodus mehrere der Veränderung des Fluoreszenzsignals von der Gesamtzellpopulation. Die größte Diskrepanz in den Ergebnissen aus verschiedenen Analysearten war für Ionomycin, die von 1,53 fache Erhöhung gegenüber der Kontrolle aus dem Quadranten Analyse bis 4,54 fache von dem Mehrbereichsanalyse reichten. Die getesteten Verbindungen zeigten keine solche Varianzen. Jedoch in allen Analysearten, das Ausmaß an Calciumsignal evozierten gleich geblieben, obwohl die absoluten Werte unterschieden, dh hatte IONO die größte Wirkung, gefolgt von TG und TUN. Anwendung der TG, TUN oder IONO ergibt dauerhafte Veränderungen in zytosolischen Kalzium. Um festzustellen, ob physiologische Calciumsignale, die flüchtig sind, können mit dieser Methode gemessen werden, wurde ATP zu WKPT-0293 Cl.2 Zellen angewendet. ATP rief eine rasche und vorübergehende Calcium-Signal, das nicht in seiner Gesamtheit durch die Durchflusszytometrie Verfahren aufgezeichnet werden. ATP-Konzentrationen bei 20 bis 100 & mgr; m schwierig, daher erkennen die Konzentration wurde reduziert, um "slow down" die Kalzium-Signale. Wie in 5 gezeigt ist, könnte eine Änderung der cytosolischen Calcium nach Zugabe von 5 & mgr; M ATP gemessen werden. Dennoch war der Höhepunkt der Fluoreszenzänderung nicht erfasst. Verwendung des Quadrantenanalyse (5B) und Histogrammanalyse (5C) Modi keinen Unterschied in Calciumsignale in ATP konnte aufgrund der vorübergehenden Natur des Calciumsignals detektiert werden. Jedoch mit ausgewählten Teilen der Spur, die mehrere rectangulaRegion Analysemodus r verzeichnete einen 1,85 fachen Anstieg der Kalzium-Signal unmittelbar nach Wiederaufnahme Messung (5A).
Abbildung 1. SSC gegen FSC-Punktediagramm. Die Integrität der Zellpopulation mit Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) beurteilt. Ein Bereich wird für die weitere Analyse ausgewählt (R1). Tote Zellen und Zelltrümmer, die Lichtstreuung reduziert, sind ausgeschlossen. Eine repräsentative Punktdiagramm dargestellt.
Abbildung 2. Quadrant-Analyse. Grundlinienfluoreszenz von Calcium bindenden Farbstoff beladene WKPT-0293 Cl.2 Zellen wurde für 50 sec gemessen. Messung gestoppt wurde, Verbindung oder diluent zugegeben, gevortext, um zu mischen und die Messung wurde unmittelbar für insgesamt 204,8 sec aufgenommen. Die Quantifizierung erfolgte mit Quadrantenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Histogramm-Analyse. Histogramm Grundstück von Calciumbindefarbstoffbela WKPT-0293 Cl.2 Zellen mit TG, TUN oder IONO behandelt. Mit der Markerfunktion, den Prozentsatz der gated Zellen mit hoher Calciumbindungsfarbstoff Fluoreszenzintensität wurde durch die Positionierung der Ausgangspunkt des Markers auf dem Höhepunkt der Steuerkurve und endend bei der maximalen Fluoreszenz quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine larg ansehenER-Version dieser Figur.
Abbildung 4. Multiple Region Analyse. Grundlinienfluoreszenz von Calcium bindenden Farbstoff beladene WKPT-0293 Cl.2 Zellen wurde für 50 sec gemessen. Messung wurde gestoppt, Verbindung oder Verdünnungsmittel zugegeben, gevortext, um zu mischen und die Messung wurde unmittelbar für insgesamt 204,8 sec aufgenommen. Die Quantifizierung erfolgte mit mehreren rechteckigen Bereich Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Analyse der ATP-induzierten Calcium-Signale. Fluoreszenzbasis of Calciumbindefarbstoffbela WKPT-0293 Cl.2 Zellen wurde für 50 sec gemessen. Messung wurde gestoppt, 5 & mgr; M ATP zugegeben, gevortext, um zu mischen und die Messung wurde unmittelbar für insgesamt 204,8 sec aufgenommen. Die Daten wurden unter Verwendung mehrerer rechteckigen Bereich Analyse (A), Quadrantenanalyse (B) oder Histogrammanalyse (C) quantifiziert. Bei der Mehrfachbereichsanalyse wurde nur die transiente Calciumsignals analysiert. Repräsentative Daten oder Analysen von n = 3 -. 7 gezeigt werden Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Calcium ist ein Schlüsselereignis in mehreren Zellprozesse als second messenger-Signalmoleküls als auch als ein Mittel, um zwischen dem ER und Mitochondrien vermitteln wirkt. Die Fähigkeit, Änderungen in der freien cytosolischen Calciumkonzentrationen zu messen, ist eine nützliche Technik, die in allen Bereichen der Zellbiologie gelten können. Es gibt verschiedene Methoden, um cytosolische Calcium-Signale zu detektieren. Klassisch, Signale von einer ratiometrischen Calciumindikator, wie Fura-2, werden in lebenden Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Bildgebungsaufbau und absolute Calciumkonzentrationen überwacht werden können, Bestimmen von minimalen und maximalen Fluoreszenzintensitäten abgeleitet werden. Diese Technik erfordert jedoch spezielle Ausrüstung, wie zum Beispiel ein Fluoreszenzmikroskop, einem Live Cell Imaging einzurichten und Analyse-Software. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren zum Nachweis Calcium in dem Cytosol von adhärenten Epithelzellen mittels Durchflusszytometrie, die zugänglich für die meisten Laboratorien.
Epithelien sind in possession einer Anordnung von Transporter für den Transport von Stoffwechselprodukten, Arzneimitteln und Xenobiotika verantwortlich. Von besonderer Bedeutung ist die SLC22A Superfamilie, dem organischen Kation und organischem Anion Transporter zählen 22 und die ATP-Bindungskassette (ATP) Superfamilie, die die Multidrug-Resistenz P-Glykoprotein ABCB1- und Multidrug-Resistenz-Proteine (MRP) unter den Mitgliedern 23 zählt . Anfängliche Experimente unter Verwendung des Rattennierenzelle des proximalen Tubulus Leitung WKPT-0293 Cl.2 wurden durchgeführt, wie in der Veröffentlichung von Gergely et al. 16 beschrieben. Die Zellen wurden in Suspension gebracht und mit Fluo-3.00 geladen. Es wurde jedoch nur eine bescheidene Veränderung mit 10 uM Ionomycin (38,14% gegenüber 50,95% in Kontrolle durch Quadrantenanalyse oder 1,78 fache von mehreren Regionsanalyse) beobachtet. Wir vermuten, dass epitheliale Transporter für die Armen Beladung der Zellen mit Fluo-03.00 verantwortlich waren. Um dieses Problem, Probenecid und PSC833, Inhibitoren von organische eine Umgehungnion Transporter und die Multidrug-Resistenz P-Glykoprotein, wurden jeweils gleichzeitig mit der Calcium-Bindungsfarbstoff-Zellmonoschichten aufgetragen. Probenecid verbesserte Calcium-Bindungsfarbstoffbeladung, wie durch einen Anstieg der Fluoreszenzgrundlinienintensität angegeben, während PSC833 keine Wirkung, was im Gegensatz zu einem früheren Bericht in chinesischen Hamstereierstockzellen 24 hat. Dieser Unterschied liegt vermutlich in der Höhe der ABCB1- in den verschiedenen Zelllinien; die WKPT-0293 Cl.2 Zellinie birgt eine geringe endogene Niveau ABCB1-, die durch toxische Substanzen, wie toxische Metalle 25,26 induziert werden kann. Die Verwendung von Probenecid zu verbessern Calciumfarbstoffbeladung kann zu anderen Zelltypen, Probenecid empfindliche Verkehrssysteme aufweisen, wie Zellen des Nervensystems, Blut-Hirn-Schranke und die Leber, in der Calcium-Signalgebung eine Rolle bei der intrazellulären Signalübertragung spielen verlängert Wegen.
Der einfache Nachweis von Calcium-Bindung an Fluo-3 liegt in seiner requisung von nur einer Anregungswellenlänge (506 nm) und eine Emissionswellenlänge (525 nm). Allerdings sind die mit einzelnen Wellenlänge Calcium-bindende Farbstoffe, die als nicht-ratiometrischen Farbstoff erzeugten Daten, kann nur zum relativen Anstieg der cytosolischen Calcium gegenüber nicht-behandelten Kontrollen zu quantifizieren. Um absolute Calciumkonzentrationen zu bestimmen, ist ein ratiometrisches Farbstoff notwendig, da eine spektrale Verschiebung tritt nach Calciumbindung, dass ermöglicht eine Korrektur der ungleichen Farbstoffbeladung und Bleichen. Die ratiometrische Farbstoff Indo-1 wurde bei der Erfassung der Calciummobilisierung in immunologischen Zellen durch Durchflusszytometrie 27,28 verwendet worden, aber bisher hat sich diese nicht in Epithelzellen durchgeführt. Mit den beiden Emissionsspektren von UV-erregbaren Indo-1 (400 nm, wenn Calcium gebunden und 475 nm, wenn Kalzium kostenfrei), absolute zytosolischen Calciumkonzentrationen bestimmt werden kann, wie durch Grynkiewicz et al. 11 beschrieben.
Unser Beispiel-Daten eingesetzt pharmakologische Verbindungen, ap induzierenermanente Änderung zytosolischen Kalzium. Physiologische Kalziumsignale sind von geringer Intensität, zeigen schnelle Kinetik und sind vergänglich, so bleibt die Frage, ob die Durchflusszytometrie Methode ist empfindlich genug, um physiologische Calciumsignale erkennen. Experimente mit ATP wurden mit dem WKPT-0293 Cl.2 Zelllinie, die purinerger birgt, wie durch erhöhte Kalziumsignal bei Anwendung von ATP (von Live Cell Imaging gemessen) gezeigt durchgeführt. Verwendung des Durchflusszytometers könnte erhöhte cytosolische Calcium, bei dem 1 - 100 uM ATP, aber die schnelle Natur des Signals in Verbindung mit der Verzögerung der Wiederaufnahme der Messung nach der Zugabe der Verbindung bedeutet, dass nur ein Teil des Signals erfasst werden konnten. So ein großer Nachteil der Durchflusszytometrie Methode ist die begrenzte Fähigkeit, schnell (<10 sec) aufzunehmen und vorübergehend Calciumsignale; sondern das Verfahren ist besser geeignet für Reize, die zu langsameren Übergangssignale (> 10 sec) oder persistent erhöhte calc gebenium-Signale. Diese Einschränkungen könnten durch eine Verringerung Stimulator Konzentration oder durch Aufbringen von Inhibitoren für Calcium-Wiederaufnahme-Mechanismen, um die Freigabe Calcium im Cytosol beibehalten, aber Vorsicht zu treffen, um einen Inhibitor-Konzentration, die cytosolische Calcium per se nicht erhöht auszuwählen umgangen werden.
Die Informationen, die von Live Cell Imaging erworben und Durchflusszytometrie sind recht unterschiedlich. Mit Live Cell Imaging, bedeutet die hohe Auflösung, dass räumliche Veränderungen an Kalzium kann durch Auswahl intrazellulären Regionen der einzelnen Zellen für die Bildgebung gemessen werden. 2 Sek daher schnelle Calcium-Signale können aufgezeichnet werden - Weiterhin werden Fluoreszenzsignale nonstop alle 1 erworben. Im Gegensatz dazu ist die Durchflusszytometrie besser geeignet für langsamere und langanhaltende Calciumsignale und misst Calciumsignale von einer gesamten Zellpopulation. Nur relative Änderungen der Kalzium-Signale können mit dem Verfahren der Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Jedoch weist die Durchflusszytometrie Verfahren eine Reihe von Advanteile gegenüber herkömmlichen lebenden Zellen: 1) Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen (Stimulatoren und Inhibitoren der Calcium-Signal) durchgeführt werden; 2) spezifische Imaging Expertise ist nicht erforderlich; 3) Forschungstechniker können die Messungen durchzuführen; 4) klinische und nicht-klinische Labors, die nicht über die Mittel, um hochauflösende Bildgebung und ratiometrische Calcium Messungen können Calcium-Signalgebung untersuchen zuführen. Zusammengenommen ist die Durchflusszytometrie Verfahren sinnvoll, wenn der Prüfer zunächst möchte eine Rolle für Calcium zu etablieren und konnte leicht anzuwenden Inhibitoren zu vor- und nachgelagerten Signalwege zu bestimmen, während Live Cell Imaging erforderlich wäre, um das Kalzium-Signal zu charakterisieren (zB., Kinetik , Intensität, räumliche Veränderungen) näher.
Zusammenfassend beschreiben wir eine schnelle, einfache und empfindliche Methode zum Nachweis von Echtzeit relativen Änderungen der cytosolischen Calcium in schwer Last anhaftenden Epithel NierenZellen, die in Suspension gebracht wurden. Für Experimentatoren ohne Zugang zu einem Durchflusszytometrie kann dieses Verfahren leicht zu einem Spektrofluorimeter mit der Zellsuspension in einer Küvette aufgebracht werden.
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Acknowledgments
Forschung in den Labors wird von der Fritz-Bender-Stiftung, München, Deutschland (TD) und einer von der Universität Witten / Herdecke internen Forschungsförderung (W.-KL) finanziert. Wir möchten Prof. Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut für Physiologie, Pathophysiologie & Toxikologie, Universität Witten / Herdecke) für hilfreiche Anregungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
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- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
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