Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/51857
Automatic Translation
1, 2
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Summary

Кальций участвует в многочисленных физиологических и патофизиологических сигнальных путей. Изображений живых клеток требует специального оборудования и может занять много времени. Быстрый, простой метод с использованием цитометр потока для определения относительных изменений цитозольным кальция в прикрепленных эпителиальных клеток ввели в суспензии оптимизированы.

Introduction

Кальций является важным вторичным мессенджером отвечает за передачу клеточного физиологических и патофизиологических сигналов 1. Цитозольные концентрации кальция на низком уровне благодаря активности насосов кальция и обменных кальция. Саркоплазматического / эндоплазматический АТФазы ретикулума кальция (SERCA) пополняет эндоплазматической сети (ER) магазин кальция в качестве части системы «утечки насоса" в то время как АТФ-азы плазматической мембраны кальция (PMCA) экструдирует кальция в внеклеточное, как в АТР-зависимых манер 2. Физиологические мессенджеры, такие как гормоны или нейромедиаторы, передают свои сигналы через G-белками рецепторов, активацию фосфолипазы С, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) в плазматической мембране, чтобы генерировать и диацилглицерол инозитол трифосфата (IP3) 3. В то время как диацилглицерин остается в плазматической мембране, IP3 диффундирует в цитозоле и связывается с рецептором IP3S (IP3Rs), которые лиганд активированные кальциевые каналы, найденные в ER мембраны и кальций высвобождается из ER просвета магазине кульминацией к увеличению концентрации кальция цитозольных 4. Альтернативный путь для достижения кальция в цитозоль через кальциевых каналов и теплообменников, присутствующих в плазматической мембране. Перекрестные помехи между этими двумя отсеками были описаны: выпуск кальция индуцированной кальция (CICR), где внеклеточного кальция вызывает высвобождение кальция из ER магазинах 5, и магазин работает поступления кальция (SOCE), где опорожнения из ER магазинах воспринимается СТИМ и вызывает открытие ORAI кальциевые каналы в плазматической мембране, чтобы способствовать повторным наполнением ER магазинах 6.

Под патофизиологических условиях, ответ сотовой кальция разрегулирована и цитозольных увеличивается кальция в отсутствие физиологических стимуляторов 1. Реакция кальция может повлиять на несколькими способами: длительное кальцийСигнал, задерживается удаление кальция из цитоплазмы, истощение магазинах кальция или локализованных изменений в кальция. Кроме того, митохондрии взять на главную роль в буферизации и выпуская кальций 7. Длительное и / или сверхмаксимальном цитозольный увеличение кальция приводит к гибели клеток. На самом деле, кальция чаще всего не участвует в клеточном патофизиологической ответ и является ключевым событием в широком спектре заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, болезни сердца, рак, болезни костей и заболевания почек, которые в основном связаны с клеточной смерти и потеря или изменение органа или ткани функции 8-10. Кроме того, возмущение сигналов кальция было связано с клеточной адаптации и изменений в клеточных функций и реакций.

Традиционно сигналы кальция измеряются с отрицательно заряженной флуоресцентного индикатора кальция, который загружается в клетках в клетки проницаемыми ацетоксиметиловый (AM) форме эфира. После того, как расщепляется клеточными esterasэс, флуоресцентные показатели остаются в пределах внутриклеточное пространство и увеличить интенсивность флуоресценции при кальция связан. Самый известный и используемый показатель кальция является пропорциональный Фура-2 разработана Роджером Tsien и коллег 11. Показатели кальция с различной аффинностью к кальция позволяют различные бассейны кальция, подлежащих мониторингу. Методы обнаружения включают живых изображений сотовый, флуоресценции планшетного и проточной цитометрии. Относительно быстро кинетика кальциевых сигналов (обычно в течение нескольких секунд до минут) делает живых изображений сотовый наилучший метод для получения наиболее полную информацию о характеристиках сигнала кальция. Помимо быстрой кинетики сигналов кальция (в пределах миллисекунд), изображений живых клеток является лучшим методом изучения клеточного обособления кальциевой сигнализации в пределах одной ячейки 12. Абсолютные концентрации кальция можно рассчитать путем определения минимального и максимального флуоресценции экз кальцияicator добавлением хелатирующего кальция и permeabilizing клетки, соответственно, как описано Grynkiewicz соавт. 11.

Использование проточной цитометрии для измерения сигналов кальция была впервые разработана в 1980-х годах в иммунологических клеток, где возможность измерения нескольких параметров, таких как целостности мембраны и разделения популяции клеток, а также требование клеток в суспензии в сочетании с развитием одной длине волны показатели кальция из проточной цитометрии идеального и convenientdetection метода 13-15. В прикрепленных клеток, изображений живых клеток обеспечивает наиболее полную информацию о кальциевой сигнализации, самое главное кинетики, но требует сложной настройки, содержащий флуоресцентный микроскоп, систему перфузии, поддержание клеточной среды, таких как температура, и специализированное программное обеспечение микроскоп для приобретения и анализа данных. Альтернативные способы, такие как флуоресценция микропланшет-ридера или Pharmacological средства через использование хелаторов кальция несравнимы с точки зрения накопленного информации. Проточной цитометрии становится все более широко используются для контроля цитозольную кальция в прикрепленных клеток, хотя, в большинстве исследований, только конечная точка измерения выполняются. С помощью метода, первоначально разработанный Gergely и др. В иммунологических В-клеток 16, изменения в цитозольной концентрации свободного кальция с помощью проточной цитометрии с в режиме реального времени и мониторинга кинетики интенсивности флуоресценции в отдельных клеток из популяции образца были успешно измеряется в раковых эпителиальных клеток и стволовых клеток рака гибриды 17. Этот метод был дополнительно приспособлен для использования в адгезивных эпителиальных клеток, которые трудно загружать с показателями кальция 18.

Здесь, с помощью клейкого иммортализованной линии эпителиальных клеток, полученной из сегменте S1 крысы проксимальных канальцах почек (WKPT-0293 Cl.2) 19, опишем оптимизированную упрощенную меню для измерения изменений в цитозольной концентрации кальция методом проточной цитометрии. Поскольку многие эпителиальные клетки обладают рядом органических перевозчиков для анионных соединений, загрузка клеток с индикатором кальция может оказаться сложной задачей. Чтобы предотвратить отток показателей кальция, пробенецидом, прототипом ингибитора органических анионов перевозчиков и первоначально разработанной для уменьшения почечной экскреции пенициллина 20, применяется одновременно в среде инкубации. Клетки поддерживали в монослоев для индикатора кальция загрузки, приведены в подвески и кальциевых сигналов могут быть обнаружены сразу же после того соединения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов и решения

  1. Подготовка сбалансированный солевой раствор модифицированной Хэнка (HBSS) (в мм: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, рН 7,2, нет фенол красный). Хранить при 4 ° С.
  2. Сделать 1,5 М CaCl 2 и 2 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) (рН 7,2) Исходные растворы с использованием дистиллированной воды.
  3. Подготовьте 250 мМ исходного раствора пробенецидом. Для форме свободной кислоты (часто упоминается как нерастворимый в воде), растворить порошок пробенецид в 1 N NaOH, заполнить на три четверти конечного объема дистиллированной воды и медленно титруют до рН 7,4 с помощью 1 н HCl. Хранить при 4 ° С.
  4. Растворите люминесцентные мембраны проницаемыми связывания кальция красителя в безводный диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации фондовом 1 мМ. Хранить при температуре -20 ° С в темноте.
  5. Перед каждым экспериментом, недавно подготовить пробенецид, содержащий H-BSS поток (PHF) буфер модифицирован путем объединения HBSS с (в конечной концентрации) 1,5 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,2, 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ пробенецида, и 5,55 мМ глюкозы. Теплый до 37 ° С.

2. Культура клеток

  1. Пластинчатые 2,5 х 10 5 почечные клетки проксимальных канальцах (WKPT-0293 Cl.2) на лунку 6-луночный планшет или 35 мм чашку в стандартной культуральной среде, и расти в течение 2 дней достигая слияния примерно 70%.

3. Кальций Dye Загрузка

  1. Для каждой скважины или блюдо, смешать 1 мл культуральной среды, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, 4 мкМ клеток проницаемой связывания кальция краситель и 2 мМ пробенецида.
  2. Заменить культуральной среды с красителем смеси 1 мл в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2. Накройте тарелку с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентного индикатора.

4. Подготовка Ceзаполняет для проточной цитометрии

  1. Теплый 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) раствор до 37 ° С.
  2. Аспирируйте кальция решение нагрузка красителя из каждой лунки и добавить 1 мл трипсина вдоль стены колодца.
  3. Инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока все клетки отделены.
  4. Передача клетки в 1,5 мл пробирку гранул и центрифугированием в микроцентрифуге при 10000 г в течение 1 мин.
  5. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
  6. Вымойте клеток путем добавления 1 мл буфера PHF и ресуспендируйте с помощью пипетки вверх и вниз.
  7. Гранул клетки центрифугированием при 10000g в течение 1 мин.
  8. Повторите шаги 4,6. и 4.7. еще два раза.
  9. Ресуспендируют клеток в конечном объеме 500 мкл буфера PHF и использовать клетки для экспериментов в течение 1 часа.
  10. Дополнительно: счета клетки для определения концентрации клеток и использовать 5 х 10 4 - 1 х 10 5 клеток на измерения.

5. Расход Cytметрового установки

  1. Начните поток цитометр, открыть ящик струйной и переверните вентиляционный клапан тумблер, чтобы увеличить давление воздуха в баке оболочка жидкости.
  2. "Премьер" прибор для удаления потенциальных пузыри проживание воздуха изнутри внутренних труб и проточной камеры.
  3. В цитометрии программного потока, открытые две точечные участок окна.
    1. Первый точка участок требует вперед рассеянный свет (FSC) для параметра X и боковой рассеянный свет (SSC) для параметра Y для контроля за качеством клеток в образце через их размера и их детализации, соответственно.
    2. Второй участок точка измеряет интенсивность флуоресценции кальций связан красителя. Выберите соответствующий канал обнаружения флуоресценции для параметра Y с помощью логарифмической шкале и время в секундах для параметра X на линейной шкале.
  4. Установите расход на "высокий".

6. проточной цитометрии Mмерка

  1. Выполните измерения при комнатной температуре. В проточной цитометрии пробирку (11,5 х 75 мм), добавляют 480 мкл буфера PHF.
  2. Добавить клеточной суспензии 20 мкл и кратко вихрь перемешать.
  3. Перемещение опорной трубки руку в сторону и поместите пробирку в течение впрыска образец трубки до тех пор, герметичное уплотнение не образуется. Верните опорную трубу руку в исходное центральное положение.
  4. Оптимизация измерения, регулируя флуоресценции канал таким образом, что среднее интенсивность флуоресценции образца при температуре приблизительно 10 2 на оси у. Сохранить и использовать для последующих экспериментов.
  5. Чтобы начать эксперимент, повторите шаги 6,1 до 6,3.
  6. Запись базовой флуоресценции на 50 сек.
  7. Пауза измерения, снимите пробирку, добавить интерес соединения, вихря кратко и вернуться к инъекции образца трубы. Этот шаг не следует принимать более 15 сек.
  8. Резюме измерения и продолжаться в течение в общей сложности 204,8 сек.
  9. Используйте I кальцияonophore, такие как иономицин (10 мкМ), а хелатор кальция, такие как этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), MnCl 2 или CoCl 2 (2 мМ), в течение положительных и отрицательных контролей, соответственно.

Анализ 7. Данные

  1. Анализ данных с помощью специального программного обеспечения проточной цитометрии для автономного анализа, такие как WinMDI (Windows Multiple Interface Document для проточной цитометрии), бесплатный пакет программного обеспечения, разработанного Джо Троттер в Скриппса института, проточной цитометрии основной комплекс.
  2. Откройте точка участок с SSC и FSC параметров.
  3. Выберите область ячеек для анализа с помощью "Регионы" инструмент (щелкните правой кнопкой мыши на изображении), чтобы исключить мертвые клетки или клеточных обломков нашли в нижнем левом углу от анализа данных (Рисунок 1).
  4. Квадрант анализ (Рисунок 2)
    1. Откройте плотности сюжет со временем на оси абсцисс и интенсивности флуоресценции от оси у. Используйте все события.
    2. Намэлектронной тот же стробирования регион в 7,3.
    3. Количественная данные с помощью "Quadrant" инструмент.
    4. Регулировка квадранта сепараторов так, чтобы вертикальная линия находится в момент соединения того и горизонтальная линия находится в центре базовой флуоресценции в контрольной группе. Убедитесь, что позиционирование квадранта сепараторов равна во всех образцах.
    5. Процент клеток в каждом квадранте отображается в каждом углу (рисунок 2). Сравните верхнюю правую четверть (UR) между образцами.
  5. Анализ гистограммы (рисунок 3)
    1. Откройте данные управления в окне гистограммы с интенсивности флуоресценции от оси х и событий на оси ординат. Используйте все события.
    2. Для наглядного обзора, добавить тестовые данные, чтобы быть по сравнению с контрольным участком как наложения участков (перейдите в меню Файл → Открыть файл → Выберите файл → Overlay).
    3. Для количественного анализа, один гистограмма выигратьстеклам должен быть использован. Ворота популяция клеток с помощью, начиная с шага 7.3 регионе R1.
    4. В необработанной контроля, использовать функцию маркера («маркеры»), чтобы выделить участок для анализа, начиная от середины между минимальной и максимальной флуоресценции пике управления и заканчивая при максимальной интенсивности флуоресценции. Процент клеток в этой области вычисляется.
    5. Получение данных из окна статистики. Повторите для оставшихся файлов данных, используя тот же отмеченную область для анализа.
  6. Анализ интенсивности флуоресценции (рис 4)
    1. Откройте точка участок со временем на оси абсцисс и интенсивности флуоресценции от оси у. Используйте все события.
    2. Включить "Кинетика режим" и "Overlay кинетики линия". Синяя линия появится в дот участка, представляющего среднее интенсивности флуоресценции.
    3. Количественной оценки относительной приток кальция путем создания нескольких прямоугольных областей. Каждый регион должен иметь AWidth около "50", что эквивалентно "10 сек". Определить до 15 прямоугольных областей.
    4. Получить количественную из окна статистики и скопировать в таблицу.
    5. Используйте данные Y-средство для анализа. Подсчитать среднее значение R2-R6, что эквивалентно 20 до 50 сек. Это базовое значение.
    6. Выберите подходящий временной интервал для анализа притока кальция (зависит от появления, продолжительности и интенсивности).
    7. Рассчитать сигналы кальция из каждого региона в этом интервале времени по отношению к средним исходным значением, то есть сигнал флуоресценции перед соединением того, который установлен на 100%. Определить среднее значение и стандартное отклонение регионах прикреплять соединение дополнение; это среднее сигнал кальция, вызванный соединения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для увеличения цитозольную кальций, два фармакологические соединения наносили на проксимальных почечных канальцев клеток (WKPT-0293 Cl.2), нагруженных связывания клеток проницаемой кальция красителя, Fluo-3-AM. Образцы необработанных контрольных были загружены кальция связывания красителя в присутствии пробенецида и были смешаны, но без добавления каких-либо соединений. Тапсигаргин (TG) является классическим ингибитором SERCA насоса приведет к утечке из ER и что приводит к увеличению цитозольным кальция. Туникамицина (TUN) блоки N-гликозилирование белков приводит к активации разложенном ответ белка, но также увеличивает цитозольного кальция 18,21. В качестве положительного контроля, иономицина (Iono), что делает кальциевый ионофор плазматической мембраны проницаемы для внеклеточный кальций, был использован. Для анализа, клеточная популяция была закрытой, выбрав регион в дот участка SSC / FSC (R1 на рисунке 1). Плотность участок для интенсивности флуоресценции от времени была создана для каждого файла данных, С помощью квадранта функцию, точка участок был разделен на четыре области, представляющих Fluo-3 интенсивность флуоресценции до и после соединения и того выше и ниже базовой линии флуоресценции. Количественное как процент от закрытого клеточной популяции в каждом квадранте позволяет определить повышенной цитозольной концентрации кальция. В этом примере, 3 мкМ ТГ приводит к увеличению процента клеток в верхнем правом квадранте, указывающее, что сигнал кальция была индуцированной. Процент клеток возрастает от 42,8% в контроле до 51,3% (1,20 раза) в TG обработанных клеток. Аналогично, 6 мкМ TUN увеличивает процент клеток с повышенной интенсивностью флуоресценции кальция до 49,9% (1,17 раза). Применение 10 мкмоль Iono привело 65,5% (1,53 раза) клеток в правом верхнем квадранте (рисунок 2). Анализ гистограммы привело 1,41 раза, 1,36 раза и 2,11 раза по Т.Г., TUN и Iono, соответственно (Рисунок 3) (для статистики, см <SUP> 18). Наконец, с помощью режима множественного анализа регион, TG, TUN и IONO вызвало 1,55 раза, 1,29 раза и 4,54 кратное повышение сигнала кальция более контроля, соответственно (Рисунок 4).

Режим наиболее чувствительны анализ был анализ множественного область. В отличие от режимов квадранте и анализа гистограммы, где распределение популяции клеток количественно, режим множественный анализ область количественно определяет изменение флуоресцентного сигнала от общего количества клеток. Наибольшее расхождение в результатах различных режимах анализа было для иономицина, которые варьировались от 1,53 кратное увеличение по сравнению с контролем от квадранта анализа на 4,54 раза от анализа множественной области. Тестируемые соединения не обладают такой дисперсии. Тем не менее, во всех режимах анализа, степень сигнала кальция вызвала остались прежними, хотя абсолютные значения отличаются, то есть, IONO был самый большой эффект с последующим TG, а затем TUN. Применение Т.Г., TUN или Iono приводит постоянных изменений в цитоплазме кальция. Чтобы определить, является ли физиологические сигналы кальция, которые являются временными, может быть измерена с помощью этого метода, АТФ был применен к WKPT-0293 Cl.2 клеток. АТФ вызывал быстрое и кратковременное сигнал кальция, который не может быть записана в полном объеме по методу проточной цитометрии. Концентрации ATP в 20 - 100 мкм, трудно обнаружить, поэтому концентрация была снижена до "замедлить" сигналы кальция. Как показано на фиг.5, изменение цитозольного кальция может быть измерено после добавления 5 мкМ АТФ. Тем не менее, пик изменений флуоресценции не было зафиксировано. Использование квадранта анализ (рис 5b) и анализ гистограммы (рис 5c) режимы, никакой разницы в кальциевых сигналов в АТФ не может быть обнаружен из-за переходного характера сигнала кальция. Тем не менее, с отдельных частей следа, многократный rectangulaРежим анализ регион г записали 1,85-кратное увеличение сигнала кальция сразу же после возобновил измерения (рисунок 5А).

Рисунок 1
Рисунок 1. SSC против FSC точка сюжета. Целостность клеточной популяции оценивается с помощью боковой разброс (SSC) и вперед разброс (FSC). Область выбрана (R1) для дальнейшего анализа. Мертвые клетки и остатки клеток, которые уменьшили рассеяние света, исключаются. Представитель точка график показан.

Рисунок 2
Рисунок 2. Квадрант анализ. Базовый флуоресценция связывания кальция красителя загружен WKPT-0293 Cl.2 клетки измеряли в течение 50 сек. Измерение был остановлен, соединение или диluent был добавлен, встряхивали, чтобы смешивать и измерение было возобновлено сразу же в общей сложности 204,8 сек. Количественную оценку проводили с помощью квадранта анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Гистограмма анализ. Гистограмма участок связывания кальция красителя загружен WKPT-0293 Cl.2 клетки, обработанные с ТГ, TUN или Iono. С помощью функции маркера, процент закрытых ячеек с обязательного высоким содержанием кальция интенсивности флуоресценции красителя количественно путем размещения начальную точку маркера на пике кривой управления и заканчивая максимальной флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупэ версия этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Несколько анализ региона. Базовый флуоресценция связывания кальция красителя загружен WKPT-0293 Cl.2 клетки измеряли в течение 50 сек. Измерение было остановлено, был добавлен соединение или разбавитель, встряхивали, чтобы смешивать и измерение было возобновлено сразу же в общей сложности 204,8 сек. Количественную оценку проводили с использованием нескольких прямоугольную анализ региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Анализ АТФ-индуцированных сигналов кальция. Базовый флуоресценции ое связывать кальций красителя загружен WKPT-0293 Cl.2 клетки измеряли в течение 50 сек. Измерение было остановлено, 5 мкМ АТФ был добавлен, встряхивали, чтобы смешивать и измерение было возобновлено сразу же в общей сложности 204,8 сек. Данные были количественно с использованием множественного анализа прямоугольную область (А), квадрант анализа (б) или анализ гистограммы (C). Для анализа множественного области, только переходный сигнал кальция была проанализирована. Характерные результаты аналитической работы с п = 3 -. 7 показаны Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Кальций является ключевым событием в нескольких клеточных процессов, действующих в качестве второй молекулы посланник сигнализации, а также в качестве средства общения между ЭР и митохондрий. Возможность измерения изменений в свободных цитозольными концентрации кальция является полезным методом, который может применяться во всех областях клеточной биологии. Существуют различные методы для выявления цитозольные сигналы кальция. Классически, сигналы от индикатора логометрического кальция, такие как фура-2, контролируются в живых клетках, используя установку изображений флуоресценции и абсолютные концентрации кальция может быть получен из определения минимальные и максимальные интенсивности флуоресценции. Тем не менее, этот метод требует специального оборудования, такого как флуоресцентный микроскоп, живой визуализации клеток, созданной и программного обеспечения для анализа. Здесь мы опишем простой метод обнаружения кальция в цитозоле прикрепленных эпителиальных клеток с использованием проточной цитометрии, который доступен для большинства лабораторий.

Эпителий в роssession из массива транспортеров, ответственных за перевозки метаболитов, ксенобиотиков и лекарственных средств. Особое значение имеет SLC22A суперсемейство, к которой органический катион и органический анион транспортеры принадлежат 22 и АТФ-связывающего кассетного (АТФ) суперсемейство, которая подсчитывает множественной лекарственной устойчивостью P-гликопротеин ABCB1 и множественная лекарственная устойчивость белков (МСП) среди своих членов 23 , Первоначальные эксперименты с использованием почках крыс проксимального линия трубочка клеток WKPT-0293 Cl.2 проводили, как описано в статье по Gergely др. 16. Клетки были введены в суспензию и загружается с Fluo-3 AM. Тем не менее, только небольшие изменения наблюдалось с 10 мкмоль иономицина (38,14% против 50,95% в контроле по анализу квадранте или 1,78 раза по многократного анализа область). Мы предположили, что эпителиальные транспортеры были ответственны за плохой загрузки клеток с Fluo-3 AM. Чтобы обойти эту проблему, пробенецид и PSC833, ингибиторы органического аNion транспортеры и множественная лекарственная устойчивость P-гликопротеин, соответственно, были применены одновременно с кальция связывания красителя монослоев клеток. Пробенецид улучшилось кальций связывающий красителем, как указано в увеличении базовой интенсивности флуоресценции, в то время как PSC833 не имел никакого эффекта, который в отличие от предыдущего доклада в клетках яичника китайского хомячка 24. Это различие, вероятно, лежит в уровнях ABCB1 в различных клеточных линий; WKPT-0293 Cl.2 клеточная линия таит в себе низкую эндогенный уровень ABCB1, которые могут быть вызваны токсичных веществ, таких как токсичные металлы 25,26. Использование пробенецид, чтобы улучшить красителем кальция может быть распространено на другие типы клеток, которые демонстрируют систем пробенецид, чувствительных транспорта, таких как клетки нервной системы, гематоэнцефалический барьер и печени, где сигнализации кальция может играть определенную роль в внутриклеточной сигнализации Пути.

Просто обнаружение кальция связывания с Fluo-3 заключается в его requirement только одной длины волны возбуждения (506 нм) и одной длиной волны излучения (525 нм). Тем не менее, данные, полученные с одного связывания кальция длина волны красители, как не-логометрического красителя, могут быть использованы только для количественной оценки относительных увеличение цитозольного кальция более необработанных контролей. Для определения абсолютных концентраций кальция, пропорциональный краситель необходим, потому что спектральный сдвиг происходит после связывания кальция, что позволяет скорректировать нагрузки неравной красителя и отбеливания. Ратиометрический краситель индо-1 был использован в выявлении мобилизации кальция в иммунологических клеток с помощью проточной цитометрии 27,28, но до сих пор, это не была выполнена в эпителиальных клетках. Использование двух спектров испускания УФ-возбудимый индо-1 (400 нм при связывании кальция и 475 нм, когда кальций свободный), абсолютные цитозольных концентрации кальция может быть определено, как описано Grynkiewicz соавт. 11.

Наш пример данные используются фармакологические соединения, которые вызывают арermanent изменение цитозольным кальция. Физиологические сигналы кальция низкой интенсивности, отображения быстрой кинетики и преходящи, таким образом, остается открытым вопрос, является ли поток цитометрии метода является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить физиологические сигналы кальция. Эксперименты с АТФ проводились с WKPT-0293 Cl.2 клеточной линии, которая таит в пуринергической рецепторы как показали увеличения сигнала кальция при применении АТФ (измеряется изображений живых клеток). Использование проточного цитометра, увеличение цитозольного кальция можно было наблюдать с 1 - 100 мкМ АТФ, но быстрое природу сигнала в сочетании с задержкой в ​​возобновлении измерение после соединение дополнение к тому, что только часть сигнала может быть записана. Таким образом, основным недостатком метода проточной цитометрии является его ограниченные возможности записывать быстрое (<10 сек) и переходные сигналы кальция; а метод больше подходит для стимулов, которые приводят к более медленных переходных сигналов (> 10 сек) или постоянной повышенной известковоНМУ сигналы. Эти ограничения можно обойти за счет снижения концентрации стимулятора или путем применения ингибиторов для механизмов обратного захвата кальция, чтобы сохранить выпущенный кальция в цитозоле, но осторожность должны быть приняты, чтобы выбрать концентрацию ингибитора, что не увеличивает цитозольную кальция как такового.

Информация, полученная с помощью изображений живых клеток и проточной цитометрии весьма различны. С изображений живых клеток, высокое разрешение означает, что пространственные изменения в кальция может быть измерена путем выбора внутриклеточные участки отдельных клеток для получения изображения. Кроме того, сигналы флуоресценции приобретаются без остановок каждый 1 - 2 сек, поэтому быстрые сигналы кальция могут быть записаны. В отличие от этого, проточной цитометрии больше подходит для более медленных и долговечны сигналов кальция и измеряет сигналы кальция из целого клеточной популяции. Только относительно изменений в сигналах кальция может быть определена количественно с методом проточной цитометрии. Но, методом проточной цитометрии имеет ряд Advanщества перед обычными живых клеток изображений: 1) высокая пропускная скрининга соединений (стимуляторов и ингибиторов кальциевой сигнализации) может быть выполнена; 2) опыт конкретных изображений не требуется; 3) научно-исследовательские специалисты могут проводить измерения; 4) клинические и не клинические лаборатории, которые не имеют средств, чтобы выполнить с высоким разрешением изображений и логометрических измерения кальция может расследовать сигнализацию кальция. Взятые вместе, проточной цитометрии метод полезен, если следователь изначально желает установить роль кальция и может легко применяться ингибиторы определить нефтедобыче и нефтепереработке, сигнальные пути, в то время как изображения живой клетки должны будут характеризовать сигнал кальция (например., Кинетика , интенсивность, пространственные изменения) более подробно.

Таким образом, мы описываем быстрый, простой и чувствительный метод для обнаружения в режиме реального времени относительных изменений в цитоплазме кальция в трудных для нагрузки приверженцем эпителиальных почекКлетки, которые были приведены в суспензии. Для экспериментаторов без доступа к проточной цитометрии, этот способ может быть легко применен к спектрофлуориметре с клеточной суспензии в кювете.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Исследования в лабораториях финансируется Фриц-Бендер фонда, Мюнхен, Германия (в ТД) и Университета Виттен / Хердекке внутреннего исследовательского гранта (на В.-KL). Мы хотели бы поблагодарить проф д-р д-р Франк Thévenod (Институт физиологии, патофизиологии и токсикологии Университета Виттен / Хердекке) за полезные предложения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Invitrogen F-1241  Cell permeable
Probenecid Sigma-Aldrich P-8761 Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-062
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
Thapsigargin Tocris Bioscience 1138
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) Joe Trotter, The Scripps Institute Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  4. Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
  5. Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
  6. Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
  7. Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
  8. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
  9. Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
  10. Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  12. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
  13. Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
  14. June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
  15. Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
  16. Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
  17. Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
  18. Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
  19. Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
  20. Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
  21. Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
  22. Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
  23. Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
  24. Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
  25. Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
  26. Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
  27. Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
  28. Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).

Tags

Клеточная биология выпуск 92 почки FACS второй гонец проксимальных канальцах показатели кальция пробенецид эндоплазматическая сеть иономицином
Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic… More

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (92), e51857, doi:10.3791/51857 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter