Summary
Kalcium är involverad i ett stort antal fysiologiska och patofysiologiska signalvägar. Levande cell imaging kräver specialiserad utrustning och kan vara tidskrävande. En snabb, enkel metod med användning av en flödescytometer för att bestämma relativa förändringar i cytosoliskt kalcium i adherenta epitelceller bringas i suspension var optimerad.
Introduction
Kalcium är en viktig andra budbärare som ansvarar för överföring av cellulära fysiologiska och patofysiologiska signaler 1. Cytosoliska kalciumkoncentrationer hålls låga genom verksamheten av kalciumpumpar och kalcium värmeväxlare. Sarkoplasma / endoplasmatiska retiklet kalcium ATPas (SERCA) fyller det endoplasmatiska retiklet (ER) kalcium butik som en del av en "pump läcka" systemet, medan plasmamembranet kalcium ATPas (PMCA) extruderar kalcium till det extracellulära rummet, både i ATP-beroende sätt 2. Fysiologiska budbärare, såsom hormoner eller neurotransmittorer, sänder sina signaler via G-proteinkopplade receptorer, aktivering av fosfolipas C, vilket hydrolyserar fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) i plasmamembranet för att generera diacylglycerol och inositoltrifosfat (IP3) 3. Medan diacylglycerol kvar i plasmamembranet, diffunderar IP3 in i cytosolen och binder till IP3-receptorns (IP3Rs), vilken ligand är aktiverade kalciumkanaler, som finns i ER-membranet och kalcium frigöres från ER luminala butik som kulminerar i en ökning i cytosoliska kalciumkoncentrationer 4. En alternativ väg för kalcium att nå cytosolen är genom kalciumkanaler och växlarna är närvarande i plasmamembranet. Överhörning mellan dessa två avdelningar har beskrivits: kalcium inducerad kalciumfrisättning (CICR) där extracellulärt kalcium inducerar kalciumfrisättning från ER butiker 5, och lagra drivs kalcium post (SOCE) där tömning av ER butikerna känns av Stim och orsakar öppnandet av Orai kalciumkanalerna i plasmamembranet för att främja påfyllning av ER lagrar 6.
Under patofysiologiska förhållanden, är den cellulära kalciumsvaret avreglerade och cytosola kalciumökningar i frånvaro av fysiologiska stimulatorer 1. Kalciumsvar kan påverkas på flera sätt: långvarig kalciumsignal, fördröjd kalcium bort från cytosolen, utarmning av kalcium butiker eller lokala förändringar i kalcium. Dessutom mitokondrierna ta på sig en central roll i buffring och släppa kalcium 7. Långvarig och / eller supramaximal cytosoliskt ökning kalcium leder till celldöd. I själva verket är kalcium oftast involverade i cellulära patofysiologiska svar och är en viktig händelse i ett brett spektrum av sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, hjärtsjukdomar, cancer, skelettsjukdom och njursjukdom, som främst förknippas med celldöd och förlust eller ändring av organ eller vävnad funktion 8-10. Dessutom har störning av kalciumsignaler kopplats till cellulär anpassning och förändringar i mobilfunktioner och svar.
Traditionellt är kalciumsignalerna mäts med en negativt laddad fluorescerande indikator kalcium som laddas in i celler i ett cell permeabelt acetoximetyl (AM) esterform. När spjälkas av cellulära Esterases, de fluorescerande indikatorerna fortfarande inom det intracellulära utrymmet och öka i fluorescensintensiteten när kalcium är bunden. Den mest kända och använda kalcium indikator är ratiometrisk Fura-2 har utvecklats av Roger Tsien och kollegor 11. Kalcium indikatorer med varierande affinitet för kalcium tillåta olika kalcium pooler som skall övervakas. Detektionsmetoder inkluderar levande cell imaging, fluorescens-mikroplattläsare och flödescytometri. De relativt snabb kinetik av kalciumsignaler (oftast inom några sekunder till minuter) gör levande cell imaging den bästa metoden för att få mest information om egenskaperna hos kalciumsignalen. Bortsett från de snabba kinetiken av kalciumsignaler (inom millisekunder), är levande cell imaging en bättre metod för att studera cellulära uppdelning av kalciumsignalering i en enda cell 12. Absoluta kalciumkoncentrationer kan beräknas genom att bestämma lägsta och högsta fluorescens av kalcium indicator genom att tillsätta en kalcium kelator och permeabilisering av cellerna, respektive, såsom beskrivits av Grynkiewicz et al., 11.
Användningen av flödescytometri för att mäta kalciumsignaler utvecklades först på 1980-talet i immunologiska celler där möjlighet att mäta flera parametrar, såsom membranintegritet och separering av cellpopulation, och kravet på celler i suspension i kombination med utveckling av en enda våglängd kalcium indikatorer gjorde flödescytometri ett ideal och convenientdetection metod 13-15. I vidhäftande celler, ger levande cell imaging mest information om kalciumsignalering, viktigast av kinetiken, men kräver en komplicerad installation bestående av ett fluorescensmikroskop, ett perfusionssystem, underhåll av den cellulära miljön, såsom temperatur och specialiserad mikroskop programvara för att förvärva och analysera data. Alternativa metoder såsom en fluorescensmikroplattläsare eller Pharmacological sätt genom användning av kalcium chelatorer är makalös när det gäller fått information. Flödescytometri blir mer allmänt används för att övervaka cytosoliskt kalcium i vidhäftande celler men i de flesta studier, bara slutpunkten mätningar utförs. Med användning av den metod som ursprungligen utvecklades av Gergely et al., I immunologiska B-celler 16, förändringar i cytosolisk fri kalciumkoncentration genom flödescytometri med realtids kinetik och övervakning av fluorescensintensiteten i enskilda celler från en provpopulation har framgångsrikt mätt i cancerepitelceller och cancer stamcell hybrider 17. Denna metod har vidare anpassat för användning i adherenta epitelceller, vilka är svåra att ladda med kalciumindikatorer 18.
Här, med hjälp av en odödlig vidhäftande epitelcellinje härledd från S1 segmentet av råttnjure proximala tubuli (WKPT-0293 CI.2) 19 beskriver vi en optimerad förenklad metod för mätning av förändringar i cytosolen kalciumkoncentrationen genom flödescytometri. Eftersom många epitelceller har ett antal organiska transportörer för anjoniska föreningar, kan laddning av celler med en kalciumindikator visa sig vara en utmaning. För att förhindra utflödet av kalciumindikatorer, probenecid, den prototypiska inhibitom av organisk anjon transportörer och som ursprungligen utvecklades för att minska den renala utsöndringen av penicillin 20, appliceras samtidigt i inkubationsmediet. Cellerna hålls i monolager för kalcium indikator laddning, bringas i fjädring och kalciumsignalerna kan upptäckas omedelbart efter förening tillsats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagens och lösningar
- Bered en modifierad Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (i mM: 136,9 NaCI, 5,37 KCI, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCOs 3, pH 7,2, ingen fenolrött). Förvaras vid 4 ° C.
- Gör 1,5 M CaCl 2 och 2 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) (pH 7,2) stamlösningar med användning av destillerat vatten.
- Förbered en 250 mM stamlösning av probenecid. För den fria syraformen (ofta kallad vattenolösliga), lös probenecid pulver i 1 N NaOH, fyll till tre fjärdedelar av den slutliga volymen med destillerat vatten och långsamt titreras till pH 7,4 med 1 N HCl. Förvaras vid 4 ° C.
- Lös fluorescerande membran permeabelt kalciumbindande färgämnet i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) till en stamkoncentration av 1 mM. Förvara vid -20 ° C i mörker.
- Före varje experiment nyligen förbereda probenecid innehållande HBSS flux (PHF) buffert genom kombinering modifierad HBSS med (i slutkoncentrationer) 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% fetalt bovint serum, 2 mM probenecid, och 5,55 mM glukos. Värm till 37 ° C.
2. Cellkultur
- Plate 2,5 x 10 5 njur proximala tubuli celler (WKPT-0293 CI.2) per brunn i en 6 brunnar eller 35 mm skålen i standardodlingsmedium och växa i 2 dagar når en sammanflyt på ca 70%.
3. Kalcium Dye Loading
- För varje brunn eller skålen, blanda 1 ml odlingsmedium innehållande 5% fetalt bovint serum, 4 pM cellpermeabel kalciumbindande färgämne och 2 mM probenecid.
- Ersätta odlingsmediet med en ml loading dye blandning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 30 min i en fuktad inkubator med 5% CO2. Täck plattan med aluminiumfolie för att förhindra blekning av fluorescerande indikator.
4. Beredning av Cells för flödescytometri
- Varm 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning till 37 ° C.
- Aspirera kalcium loading dye lösning från varje brunn och tillsätt 1 ml trypsin längs väggen av brunnen.
- Inkubera vid 37 ° C tills alla celler är fristående.
- Överför celler till ett 1,5 ml rör och pellet genom centrifugering i en mikrocentrifug vid 10.000 g under 1 min.
- Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 1 ml PHF-buffert och återsuspendera genom att pipettera upp och ned.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 10.000 g under 1 min.
- Upprepa steg 4.6. och 4.7. ytterligare två gånger.
- Resuspendera cellerna i en slutlig volym av 500 | il PHF buffert och använda celler för experiment inom en timme.
- Tillval: räkna celler för att bestämma cellkoncentrationen och använd 5 x 04-1 Oktober x 10 5 celler per mätning.
5. Flödes Cytometer Setup
- Starta flödescytometern öppnar Fluidics facket och fäll avluftningsventilen vippbrytare för att öka lufttrycket i slidan vätskebehållaren.
- "Prime" instrumentet för att ta bort eventuella bosatt luftbubblor inifrån innerslangar och flödet kammaren.
- I flödescytometri programvara, öppna två-plotten fönster.
- Den första punktdiagram kräver framåt spritt ljus (FSC) för X-parametern och sidospritt ljus (SSC) för Y-parametern för att styra för kvaliteten hos cellerna i provet genom deras storlek och deras granularitet, respektive.
- Den andra punktdiagram mäter fluorescensintensiteten hos den kalciumbundna färgämnet. Välj lämplig fluorescensdetektion kanal för Y-parametern med hjälp av en logaritmisk skala och tid i sekunder för X parameter på en linjär skala.
- Ställ in flödeshastigheten till "hög".
6. Flödescytometri Measurement
- Utför mätningarna vid RT. I ett flödescytometri provrör (11,5 x 75 mm), tillsätt 480 l PHF buffert.
- Tillsätt 20 l cellsuspension och kort virvel för att blanda.
- Flytta röret stödarm åt sidan och placera provröret över provinsprutningsröret tills en tät försegling bildas. Avkastning röret bärarmen till sitt ursprungliga centrerade läge.
- Optimera mätningen genom justering av fluorescenskanalen så att den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos provet är vid approximativt 10 två på y-axeln. Spara och använda för efterföljande experiment.
- För att starta ett experiment, upprepa steg från 6,1 till 6,3.
- Record baslinje fluorescens för 50 sek.
- Pausa mätningen, ta bort provröret, till förening av intresse, virvel kort och återgå till provinsprutningsröret. Detta steg bör inte ta mer än 15 sekunder.
- Återuppta mätning och fortsätt för totalt 204,8 sek.
- Använd en kalcium ionophore, såsom jonomycin (10 ^ M), och en kalcium kelator, såsom etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), MnCl2 eller CoCl2 (2 mM), för positiva och negativa kontroller, respektive.
7. Data Analysis
- Analysera data med hjälp av dedikerade flödescytometri programvara för offline analys, såsom WinMDI (Windows Multiple Document Interface för flödescytometri), ett gratis programpaket som utvecklats av Joe Trotter vid The Scripps Institute, flödescytometri Core Facility.
- Öppna ett punktdiagram med SSC och FSC parametrar.
- Välj den region av celler för analys med hjälp av "regioner" verktyg (högerklicka på bilden) för att utesluta döda celler eller cellfragment som finns i det nedre vänstra hörnet från dataanalysen (figur 1).
- Quadrant analys (figur 2)
- Öppna en densitet tomt med tiden på x-axeln och fluorescensintensiteten på y-axeln. Använd alla händelser.
- Osse samma slussområdet som i 7.3.
- Kvantifiera data genom att använda "Quadrant" verktyg.
- Justera kvadrant separatorer så att den vertikala linjen är placerad vid tidpunkten för föreningen tillägg och den horisontella linjen är placerad i centrum av baslinjen fluorescens i kontrollerna. Säkerställa att placeringen av kvadranten separatorer är lika i alla prover.
- Procentandelen av celler i varje kvadrant visas i varje hörn (fig 2). Jämför den övre högra kvadranten (UR) mellan proverna.
- Histogramanalys (Figur 3)
- Öppna styrdata i ett histogram fönster med fluorescensintensitet på x-axeln och händelser på y-axeln. Använd alla händelser.
- För en illustrerad översikt, lägg testdata jämföras med kontroll tomten som overlay tomter (gå till Arkiv → Open File → Välj fil → Overlay).
- För kvantitativ analys, singel histogram vinnatorna måste användas. Gate cellpopulationen med hjälp regionen R1 från steg 7.3.
- I den icke-behandlad kontroll, använd markör funktion ("markörer") för att markera området för analys med utgångspunkt från mittpunkten mellan de lägsta och högsta fluorescens hos styr topp och som slutar vid den maximala fluorescensintensitet. Den procentuella andelen av celler i detta område beräknas.
- Hämta data från statistikfönstret. Upprepa för återstående datafiler med hjälp av samma markerade området för analys.
- Fluorescensintensiteten analys (Figur 4)
- Öppna ett punktdiagram med tiden på x-axeln och fluorescensintensiteten på y-axeln. Använd alla händelser.
- Aktivera "Kinetics Mode" och "Overlay Kinetics Line". En blå linje visas i punktdiagram som representerar den genomsnittliga fluorescensintensiteten.
- Kvantifiera relativa kalciuminflöde genom att skapa flera rektangulära regioner. Varje region ska ha awidth av omkring "50", vilket är detsamma som "10 sek". Definiera upp till 15 rektangulära regioner.
- Hämta kvantifiering från statistikfönstret och kopiera till ett kalkylblad.
- Använd y-medelvärdet data för analys. Beräkna medelvärdet av R2 till R6, som är ekvivalent med 20 till 50 sek. Detta är utgångsvärdet.
- Välj ett lämpligt tidsintervall för kalciuminflöde analys (beror på start, varaktighet och intensitet).
- Beräkna kalciumsignalerna från varje region inom detta tidsintervall i förhållande till genomsnittligt utgångsvärde, det vill säga, fluorescenssignalen innan förening tillsats, som är satt till 100%. Bestäm medelvärdet och standardavvikelsen för regionerna posta förening tillägg; detta är den genomsnittliga kalciumsignalen framkallas av föreningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att öka cytosoliskt kalcium ades två farmakologiska föreningar tillämpas på njur proximala tubuli celler (WKPT-0293 CI.2) laddade med cellpermeabla kalciumbindande färgämne, Fluo-3-AM. Obehandlade kontrollprover laddades med kalciumbindande färgämnet i närvaro av probenecid och blandades men utan tillsatsen av några föreningar. Tapsigargin (TG) är en klassisk hämmare av SERCA pumpen leder till läckage ut ur ER och resulterar i ökad cytosoliskt kalcium. Tunikamycin (TUN) blockerar N-glykosylering av proteiner som leder till aktivering av den ovikta proteinsvar men ökar också cytosoliskt kalcium 18,21. Som en positiv kontroll, jonomycin (IONO), en kalciumjonofor göra plasmamembranet permeabelt för extracellulärt kalcium, användes. För analys, var cellpopulationen gated genom att välja en region i SSC / FSC-plotten (R1 i figur 1). En densitet tomt för fluorescensintensiteten mot tid skapades för varje datafil. Genom att använda den kvadrant funktion ades dot plot separerades i fyra områden som representerar Fluo-3 fluorescens intensitet före och efter förening tillsats och ovanför och nedanför baslinjen fluorescens. Kvantifiering i procent av gated cellpopulation i varje kvadrant tillåter bestämning av ökad cytosolic kalciumkoncentration. I detta exempel är tre iM TG orsakar en ökning av den procentuella andelen av celler i den övre högra kvadranten indikerar att en kalciumsignal har inducerats. Den procentuella andelen celler ökar från 42,8% i kontroll till 51,3% (1,20 gånger) i TG behandlade celler. På samma sätt, förstärker 6 pM TUN procentandelen celler med ökad kalciumfluorescensintensitet till 49,9% (1,17-faldig). Tillämpning av 10 pM IONO gav 65,5% (1,53-faldigt) av celler i den övre högra kvadranten (Figur 2). Histogrammet Analysen resulterade i 1,41 gånger 1,36 gånger och 2,11 gånger genom TG, TUN och IONO, respektive (Figur 3) (för statistik, se <sup> 18). Slutligen, med hjälp av multipel mod regionen analys, TG, TUN och IONO orsakade 1,55 gånger 1,29 gånger och 4,54 gångers ökning av kalciumsignal över kontroll, respektive (Figur 4).
Den mest känsliga analysläge var analysen multipel regionen. I motsats till den kvadrant och histogramanalys lägen, där fördelningen av cellpopulationen kvantifieras, kvantifierar multipla läge regionen analys förändringen i fluorescenssignalen från den totala cellpopulationen. Den största skillnaden i resultaten från olika analyslägen var för ionomycin som varierade från 1,53 faldig ökning över kontrollen från kvadranten analys till 4,54 gånger från analysen multipel regionen. De testade föreningarna uppvisade inte sådan varians. Men i alla analyslägen, framkallade förblev omfattningen av kalcium signalen detsamma även om de absoluta värdena skilde, dvs IONO hade den största effekten, följt av TG och sedan TUN. Tillämpning av TG, TUN eller IONO leder till permanenta förändringar i cytosoliskt kalcium. För att avgöra om fysiologiska kalciumsignaler, som är flyktiga, kan mätas med hjälp av denna metod, var ATP tillämpas WKPT-0293 CI.2 celler. ATP framkallade en snabb och övergående kalciumsignal, som inte kunde spelas in i sin helhet av flödescytometri metoden. ATP-koncentrationer på 20-100 iM var svåra att upptäcka därför koncentrationen reducerades till "sakta ner" kalciumsignalerna. Såsom visas i figur 5, kunde en förändring i cytosoliskt kalcium mätas efter tillsats av 5 pM ATP. Ändå var det maximalt av fluorescensförändring registreras inte. Med användning av kvadrant-analys (figur 5B) och histogram-analys (fig 5c) lägen, ingen skillnad i kalciumsignaler i ATP kunde detekteras på grund av den övergående naturen hos den kalciumsignal. Emellertid med valda delar av spår, det multipla rektanguR-regionen analysläge registreras en 1,85-faldig ökning i kalciumsignalen omedelbart efter återupptagen mätning (figur 5A).
Figur 1. SSC kontra FSC-plotten. Integriteten hos cellpopulationen bedöms med användning av sidospridning (SSC) och framåtspridning (FSC). En region är vald (R1) för ytterligare analys. Döda celler och cellrester, som har minskat ljusspridning, är undantagna. En representativ punktdiagram visas.
Figur 2. Quadrant analys. Baseline fluorescens av kalciumbindande färgämnesladdade WKPT-0293 CI.2 celler mättes under 50 sek. Mätning stoppades, förening eller diluent tillsattes, vortexades för att blanda och mätning återupptogs omedelbart för totalt 204,8 sek. Kvantifiering utfördes med hjälp av kvadranten analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Histogram-analys. Histogram tomt på kalciumbindande färgämnesladdade WKPT-0293 CI.2 celler som behandlats med TG, TUN eller IONO. Med hjälp av markeringsfunktionen, andelen gated celler med hög kalciumbindande färgfluorescensintensiteten kvantifierades genom att placera utgångspunkten för markören på toppen av styrkurvan och slutar vid maximal fluorescens. Klicka här för att se en larger version av denna siffra.
Figur 4. region analys Multiple. Baseline fluorescens av kalciumbindande färgämnesladdade WKPT-0293 CI.2 celler mättes under 50 sek. Mätning stoppades, föreningen eller ett utspädningsmedel tillsattes, vortexades för att blanda och mätning återupptogs omedelbart för totalt 204,8 sek. Kvantifiering utfördes med hjälp av multipla region analys rektangulär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Analys av ATP-inducerade kalciumsignaler. Baslinje fluorescens of kalciumbindande färgämnes laddad WKPT-0293 CI.2 celler mättes under 50 sek. Mätning avbröts, 5 pM ATP tillsattes, vortexades för att blanda och mätning återupptogs omedelbart för totalt 204,8 sek. Data kvantifierades med användning av multipel regionen analys rektangulär (A), kvadrant analys (B) eller histogramanalys (C). För analys multipel regionen, endast övergående kalciumsignalen analyseras. Representativa data eller analys från n = 3 -. 7 visas Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalcium är en nyckelhändelse i multipla cellulära processer som verkar som en andra budbärare signalerande molekyl och även som ett sätt att kommunicera mellan ER och mitokondrier. Möjligheten att mäta förändringar i fria cytosoliska kalciumkoncentrationer är en användbar teknik som kan tillämpas på alla områden av cellbiologi. Det finns olika metoder för att upptäcka cytosoliska kalciumsignaler. Klassiskt, signaler från en ratiometrisk indikator kalcium, såsom Fura-2, övervakas i levande celler med användning av en fluorescensavbildning setup och absoluta kalciumkoncentrationer kan härledas från fastställande av det minsta och maximala fluorescensintensiteterna. Detta kräver dock tekniken specialutrustning, såsom ett fluorescensmikroskop, en levande cell imaging inrättats och analysprogram. Här beskriver vi en enkel metod för kalciumdetektering i cytosolen av adherenta epiteliala celler med användning av flödescytometri, som är tillgänglig på de flesta laboratorier.
Epitel är i possession av en rad transportörer som ansvarar för transport av metaboliter, xenobiotika och droger. Av särskild betydelse är SLC22A super, till vilken organisk katjon och organisk anjon transportörer hör 22, och ATP-bindande kassett (ATP) super, som räknar multiresistens P-glykoprotein ABCB1 och multiresistens proteiner (MRP) bland sina medlemmar 23 . Inledande experiment med användning av råttnjure proximala tubulus cellinje WKPT-0293 CI.2 utfördes såsom beskrivits i artikeln av Gergely et al., 16. Cellerna togs i fjädring och laddad med Fluo-03:00. Men endast en blygsam förändring observerats med 10 pM ionomycin (38,14% mot 50,95% i kontroll av kvadrant analys eller 1,78 gånger genom analys multipel region). Vi antog att epiteliala transportörer var ansvariga för den dåliga laddning av cellerna med Fluo-03:00. För att kringgå detta problem, probenecid och PSC833, hämmare av organisk anion transportörer och den multiläkemedelsresistens P-glykoprotein, respektive, applicerades samtidigt med kalciumbindande färgämne till cellmonolagren. Probenecid förbättrat kalciumbindande färgämne lastning, såsom indikeras genom en höjning av baslinjen fluorescensintensitet, medan PSC833 hade ingen effekt, vilket är i motsats till en tidigare rapport i kinesisk hamsterovarieceller 24. Denna skillnad ligger förmodligen i nivåerna av ABCB1 i olika cellinjer; den WKPT-0293 CI.2 cellinje hyser en låg endogen nivå av ABCB1, som kan induceras av giftiga ämnen, till exempel giftiga metaller 25,26. Användningen av probenecid för att förbättra kalcium färgämne lastning kan utvidgas till andra celltyper som uppvisar probenecidbehandlade känslig transportsystem, såsom celler i nervsystemet, blod-hjärnbarriären och levern, där kalciumsignalering kan spela en roll i intracellulär signalering vägar.
Det enkla detektion av kalcium binder till Fluo-3 ligger i dess behöver utförasdF av endast en excitationsvåglängd (506 nm) och en emissionsvåglängd (525 nm). Men de data som genereras med enda våglängd kalciumbindande färgämnen, som en icke-ratiometrisk färgämne, kan endast användas för att kvantifiera relativa ökningar av cytosoliskt kalcium över obehandlade kontroller. För att bestämma absoluta kalciumkoncentrationer, är det nödvändigt med en ratiometrisk färgämne eftersom en spektral förskjutning sker efter kalciumbindande som möjliggör korrigering av ojämn färg lastning och blekning. Den kvotmetrisk färgämnet Indo-1 har använts i detektion av kalciummobilisering i immunologiska celler med flödescytometri 27,28 men hittills har detta inte gjorts i epitelceller. Använda två emissionsspektra av UV-exciterbar Indo-1 (400 nm när kalcium bundet och 475 nm när kalciumfritt), absolut cytosoliska kalciumkoncentrationer kan bestämmas enligt beskrivning av Grynkiewicz et al. 11.
Våra exempeldata som används farmakologiska substanser som inducerar apermanent förändring i cytosoliskt kalcium. Fysiologiska kalciumsignalerna är av låg intensitet, visar snabb kinetik och är övergående, alltså återstår frågan om huruvida flödescytometri metoden är tillräckligt känslig för att detektera fysiologiska kalciumsignaler. Experiment med ATP utfördes med WKPT-0293 CI.2 cellinje som härbärgerar purinerga receptorer, vilket framgår av en ökad kalciumsignal vid applicering av ATP (mätt med levande cell imaging). Med användning av flödescytometern, kunde ökad cytosoliskt kalcium observeras med 1-100 pM ATP, men den snabba naturen hos den signal som kombineras med den fördröjning i att återuppta mätning efter förening dessutom inneburit att endast en del av den signal kunde registreras. Således en stor nackdel av flödescytometri metoden är dess begränsade kapacitet att spela in snabbt (<10 sek) och övergående kalciumsignaler; snarare metoden är mer lämplig för stimuli som ger upphov till långsammare transienta signaler (> 10 sek) eller ihållande förhöjda calcium signaler. Dessa begränsningar skulle kunna kringgås genom att minska stimulator koncentration eller genom att tillämpa hämmare för kalcium återupptagsmekanismer för att behålla den frigjorda kalcium i cytosolen men försiktighet måste vidtas för att välja en inhibitor koncentration som inte ökar cytosoliskt kalcium i sig.
Den information som förvärvats av levande cell imaging och flödescytometri är helt olika. Med levande cell imaging, den höga upplösningen gör att rumsliga förändringar i kalcium kan mätas genom att välja intracellulära regioner av enskilda celler för avbildning. Dessutom är fluorescenssignaler förvärvas nonstop varje 1 - 2 sek kan därför registreras snabba kalciumsignaler. I kontrast, flödescytometri är mer lämpad för långsammare och långvariga kalciumsignaler och mäter kalciumsignaler från en hel cellpopulationen. Endast relativa förändringar i kalciumsignaler kan kvantifieras med flödescytometri metod. Men, den flödescytometri metod har ett antal fördellar jämfört med konventionell levande cell imaging: 1) hög throughput screening av föreningar (stimulatorer och inhibitorer av kalciumsignalering) kan utföras; 2) specifik avbildning sakkunskap inte krävs, 3) forskningstekniker kan utföra mätningarna; 4) kliniska och icke-kliniska laboratorier som inte har möjlighet att utföra högupplösta bilder och ratiometriska mätningar kalcium kan undersöka kalciumsignalering. Sammantaget är flödescytometri metoden användbar om utredaren vill börja etablera en roll för kalcium och kunde enkelt ansöka hämmare för att bestämma uppströms och nedströms signalvägar, medan levande cell imaging skulle krävas för att karakterisera kalciumsignalen (t.ex.., Kinetik , intensitet, rumsliga förändringar) i ytterligare detalj.
Sammanfattningsvis beskriver vi en snabb, enkel och känslig metod för detektion av realtids relativa förändringar i cytosoliskt kalcium i svårlast vidhäftande epitel njureceller, som har förts in i suspension. För praktiker utan tillgång till en flödescytometri, kan denna metod lätt tillämpas på en spektrofluorimeter med cellsuspensionen i en kyvett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forskning inom laboratorier finansieras av Fritz-Bender Foundation, München, Tyskland (till TD) och University of Witten / Herdecke intern forskningsbidrag (till W.-KL). Vi vill tacka Prof Dr Dr Frank Thévenod (Institutet för fysiologi, patofysiologi och toxikologi vid universitetet i Witten / Herdecke) för användbara förslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
