Abstract
مع وتيرة التقدم العلمي المتسارع، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لعلم الأعصاب التجريبي بسرعة وسهولة التلاعب التعبير الجيني في مخ الفأر. نحن هنا وصف تقنية لأول مرة من قبل Passini وولف للتسليم داخل الجمجمة المباشر من الجينات المحورة فيروسي-المشفرة في مخ الفأر حديثي الولادة. في أبسط أشكاله، فإن الإجراء يتطلب سوى دلو الجليد وحقنة ميكروليتر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول للاستخدام مع إطارات التجسيمي لتحسين الاتساق للباحثين جديد لهذه التقنية. تعتمد هذه الطريقة على قدرة الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) للتحرك بحرية من البطينات الدماغية في لحمة الدماغ في حين بطانة البطانة العصبية لا تزال غير ناضجة خلال 12-24 ساعة الأولى بعد الولادة. الحقن داخل البطينات من AAV في هذه النتائج في سن التنبيغ على نطاق واسع من الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ. يبدأ التعبير في غضون أيام من الحقن ويستمر لlifetim(ه) من الحيوان. عيار الفيروسية يمكن تعديلها للتحكم في كثافة الخلايا العصبية transduced، في حين شارك في التعبير عن بروتين فلوري يوفر تسمية الحيوية للخلايا transduced. مع ارتفاع توافر المرافق الأساسية الفيروسية لتوفير الكواشف كلا قبالة الجاهزة للاستخدام، وتعبئتها مسبقا وإعداد الفيروسي العرف، وهذا النهج يوفر طريقة في الوقت المناسب لمعالجة التعبير الجيني في مخ الفأر التي هي سريعة وسهلة وأقل تكلفة بكثير من الهندسة التقليدية سلالة الجرثومية.
Introduction
الطرق التقليدية لتعديل العصبي التعبير الجيني تتطلب وقتا طويلا والتلاعب سلالة الجرثومية باهظة الثمن. البديل دي نوفو يقترب مثل Electroporation للفي الرحم أو الحقن lentiviral التجسيمي تحقق نتائج أسرع وأقل تكلفة ولكن لديها عيب تتطلب التدخل الجراحي المعقد 1-3. وعلاوة على ذلك، التعبير التحوير لديها مجموعة والمكاني المحدود مع هذه الأساليب. هنا، نحن تصف طريقة سريعة وسهلة واقتصادية للتلاعب على نطاق واسع عن طريق حقن الخلايا العصبية داخل البطينات من الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) في مخ الفأر حديثي الولادة. وقد وصفت طريقة أول مرة من قبل جون وولف وماركو Passini في عام 2001، حيث اقترح حجم الجسيمات الصغيرة من سمح AAV لنزع فتيل داخل السائل الدماغي الشوكي لأنها تمر من البطينات الجانبية من خلال حاجز بطانية عصبية غير ناضجة وإلى لحمة الدماغ 4، 5. الحقن داخل البطينات من AAV داخل وIRST 24 ساعة بعد الولادة عوائد تنبيغ الفيروسية على نطاق واسع من مجموعات فرعية العصبية التي تغطي كل منطقة من مناطق الدماغ، من بصيلات الشم لجذع الدماغ 6،7. يتم التعبير عن الجينات المحورة تسليمها فيروسي ونشطة خلال أيام من الحقن ويستمر لمدة تصل الى عام بعد ترنسدوكأيشن. وبالتالي، هذا التلاعب تنوعا يتيح الدراسات تتراوح بين أوائل نمو الدماغ بعد الولادة إلى الشيخوخة وانحطاط في الكبار.
في تطويع التقنية لاحتياجات تجريبية محددة لدينا، فقد ركزنا بشكل أساسي على AAV8 المصلي لأنه هو الأكثر كفاءة في transducing الخلايا العصبية 6. وتبين لنا أن عيار الفيروسية يمكن أن تضعف السيطرة على كثافة الخلايا العصبية transduced للتجارب اختبار خلايا الجوهرية عواقب التلاعب الجيني. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر أن اثنين من الفيروسات يمكن أن يشترك حقن لإنتاج أنماط التعبير التي هي منحازة مجموعات متميزة أو متداخلة من الخلايا العصبية، اعتمادا على الأنماط المصلية المختارة لالتعبئة والتغليف الفيروسي. عملنا توسع براعة هذه التقنية للاستخدام في مجموعة واسعة من إعدادات علم الأعصاب التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أداء جميع الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم استعراض الإجراءات الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل كلية بايلور للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
تمت الموافقة فيروس الغدة المرتبطة (AAV) ناقلات النسخ المتماثل غير كفء للتسليم التحوير في الدماغ القوارض للسلامة الأحيائية المستوى 1 استخدام. الرجوع إلى الموقع CDC لنشر حكومة الولايات المتحدة "السلامة الأحيائية في علم الأحياء الدقيقة والمختبرات الطبية الحيوية (BMBL)" الذي يفصل متطلبات محددة فيما يتعلق بإجراءات الحماية ومعالجة فيروس المناسبة. تحقق مع موظفي السلامة البيطرية والبيئية المحلية لمعرفة المتطلبات المحددة للإجراءات المؤسسية باستخدام الفيروسات. الأنظمة المتعلقة غرف الإجراء، والحجر الصحي، وتحديد أقفاص واقية تختلف باختلاف المؤسسات.
1. قبلحلج P0 الجراء وفوستر والأمهات
- توفير مستوى عال من الدهون طعام لجميع الإناث الحوامل والمرضعات لدعم الطلب على الطاقة من تربية والرضاعة.
- في المساء، وإنشاء قفص تربية عن طريق إضافة واحدة أو اثنتين من الإناث صحية للقفص من ذكر مقيم واحد. في صباح اليوم التالي، والتحقق من الإناث المكونات التزاوج وفصل الإناث عن الذكور إذا المكونات موجودا.
- استخدام الأمهات الحاضنة لرفع الجراء من خلفية وراثية ذات الخصائص الأم الفقيرة (على سبيل المثال، C57BL / 6 أو C3HeJ). أمهات فوستر تقبل الجراء من القمامة أخرى إذا ولدت الجراء نقل في غضون أربعة أيام من القمامة الحاضنة الأم الخاصة.
- إنشاء قفص التزاوج منفصل باستخدام ICR أو الإناث FVB إلى جانب مربي التجريبية بحيث مجموعتين من الإناث تسليم في نفس الوقت تقريبا.
- سوف الإناث في تقديم 19 ± 1 يوما من تاريخ قابس، اعتمادا على سلالة الخلفية. ثلاثة أيام قبل دelivery (بعد 16 يوما من تاريخ قابس)، ووضع الإناث الحوامل في قفص نظيفة مع مواد التعشيش الطازجة وملجأ مغطى.
- التحقق من وجود الجراء حديثي الولادة مرتين يوميا بدءا 2 أيام قبل تاريخ التسليم المتوقع (بعد 17 يوما من تاريخ قابس). دراسة القفص مع الحد الأدنى من الإجهاد للأمهات من قبل الطفولية من خلال الجزء السفلي من وجود حديثي الولادة الوردي. الفئران تقديم الجراء عموما في الصباح ولكن في مناسبات نادرة سيلقي في الظهر.
- تخطط لإجراء الحقن في أقرب وقت الجراء والتمريض (الذي سيكون واضحا من خلال بقع الحليب مرئية)، أو في غضون 6 ساعة من الولادة، أيهما يأتي أولا.
2. إعداد المعدات اللازمة لحقن
- إعداد حقن حقنة 10 ميكرولتر مع إبرة 32 G للولدان P0 العامة. إذا كان أداء حقن التجسيمي، جبل المحقنة إلى الذراع مناور.
- إذا باستخدام إطار التجسيمي للحقن، تبريد مرحلة حديثي الولادة إلى 4-8 درجة مئوية بإضافة 100٪ إيثان رأ والثلج الجاف إلى الخزان في الواجهة الأمامية للكتلة. الحفاظ على درجة حرارة أعلى من 1 ° C لتجنب قضمة الصقيع من الجراء.
3. إعداد التخفيفات الفيروسية للحقن
- إعداد 1٪ حل التريبان صبغة زرقاء (20x والأسهم).
- إعداد 5-25 مكل من الفيروسات (AAV) الأسهم الغدة المرتبطة داخل مجلس الوزراء من الدرجة 2 السلامة الأحيائية. ضع هذه aliquots في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تجنب دورات إضافية تجميد ذوبان الجليد ويسبب هذا الفيروس لانقاص فعالية ترنسدوكأيشن.
- إزالة قسامة من AAV من -80 ° C الفريزر ومكان على الجليد لذوبان الجليد.
- إعداد الحل الفيروسي للحقن عن طريق تمييع الفيروس في المالحة الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة (PBS). تبدأ مع التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف (10 أكتوبر - 10 أغسطس الجسيمات الفيروسية / نصف الكرة الأرضية) لتعظيم الاستفادة الأولي لنمط ترنسدوكأيشن.
- إضافة 20x والأزرق التريبان في حل AAV إلى تركيز النهائي من 0.05٪.
الطبقة = "jove_title"> 4. تنظيم الجراء الوليد للحقن
- وضع لوحة الألومنيوم صغيرة على الجليد لتبرد. وضع مهمة الجافة مسح على رأس لوحة لحماية الجلد الجرو من المعدن البارد. هذا بمثابة سطح بارد شقة للالتخدير وحقن الجراء.
- إعداد لوحة الاحترار مناسبة لحفظ الفئران حديثي الولادة دافئة قبل وبعد الحقن.
- بمجرد أن تبدأ الجراء حديثي الولادة إلى ممرضة، وإزالة ما يقرب من نصف منهم من القفص وترك النصف الآخر مع والدتهما. وضع الجراء التي تم جمعها على لوحة ظاهرة الاحتباس بانتظار الحقن.
ملاحظة: إذا لم تهتم الأم البيولوجية لالجراء، وإزالة القمامة بالكامل من القفص فورا ووضع الجراء على لوحة ظاهرة الاحتباس انتظار الحقن. وقد تنشأ هذه الحالة مع القمامة أول ولد لC57BL / 6 الإناث أو مع السلالات الفطرية الأخرى التي لها خصائص تربية الفقيرة. في هذه الحالة، سوف بقع الحليب لا تكون مرئية على الجراء حديثي الولادة. - نقل الجرو واحد من لوحة الاحترار على لوحة معدنية الباردة للحث على التخدير انخفاض حرارة الجسم. الانتظار 2-3 دقائق لالجرو لتصبح تخدير كامل. تأكيد التخدير عن طريق الضغط بلطف جدا مخلب ورصد لقلة الحركة أو التنفس.
5. حقن AAV في الفئران حديثي الولادة
- يد خالية من الحقن داخل الجمجمة في الفئران حديثي الولادة AAV:
- تحميل 5 ميكرولتر من AAV المخفف مع 0.05٪ التريبان الأزرق في حقنة الحقن.
- قم بمسح رأس الجرو تخدير مع مسحة القطن غارقة في الايثانول 70٪.
- تحديد مواقع الحقن في 2/5 المسافة من خياطة امدا إلى كل عين. يقع موقع بديل حقن حوالي 0.8-1 ملم الوحشي من الدرز السهمي، في منتصف الطريق بين امدا bregma و. هذه المعالم واضحة من خلال الجلد في P0.
- بمناسبة موقع الحقن بالقلم المختبر غير سامة.
- عقد المحقنة مع مقياس موني مرئيةtoring حجم حل الاستغناء.
- تأكد من أن الإبهام يمكن أن تصل إلى أعلى المكبس. ثم إزالة الإبهام من المكبس في حين تحديد المواقع الإبرة لتجنب الاستغناء قصد الفيروس.
- إيجاد وضع مريح ليستعدوا الذراع للحقن عن طريق وضع الكوع على مقاعد البدلاء ويميل الذراع على دلو الجليد.
- وضع الجرو على جانبها مع رئيسها مباشرة تحت حقنة. تحويل رأس الجرو بحيث يواجه موقع الحقن ملحوظ يصل، ولكن بلطف اعتقادا راسخا هذا الموقف مع يد مفتوحة.
- عقد حقنة عمودي على سطح الجمجمة وادخال الإبرة في موقع الحقن ملحوظ على عمق حوالي 3 ملم. حقن الإبرة حتى يقلل من مقاومة طفيفة، مشيرا إلى أن الإبرة قد توغلت إلى البطين الجانبي. إذا كانت هناك حاجة إشارة، علامة 3 ملم من غيض من الإبرة مع صانع غير سامة. ضبط عمق الحقن لحجم الجرو والضغط على أساس صبغ رargeting من البطينين.
- عقد المحقنة بشكل صارم بحيث المكبس يمكن أن يكون الاكتئاب دون تحريك الإبرة كلما أوغلنا في الدماغ. إذا تم حقن النازحين في المهاد، وانتشار فيروسي ستكون محدودة للغاية.
- تبدأ ببطء حقن الفيروس في حين رصد حجم الاستغناء عن حقنة. إدارة حجم أقصى من 2 ميكرولتر في كل بطين. إذا كانت الإبرة في الموضع الصحيح، سوف تنتشر الصبغة لملء البطين.
- سحب ببطء الإبرة.
- يسمح موقع الحقن الأول ليغلق قبل حقن نصف الكرة الأرضية الأخرى.
ملاحظة: لا يحقن نفس الموقع أكثر من مرة. إعادة إدراج فيروس القوات إبرة الذي سبق أن حقن ليتسرب ويسبب إصابة أو وفاة الجرو. - ضخ البطين المقابل باستخدام نفس الإجراء.
- حقن التجسيمي من AAV في الفئران حديثي الولادة:
- تحميل 5 ميكرولتر من AAV المخفف مع 0.05٪ كثافة العمليات أزرق التريبانس حقن الحقنة التي عقدها تتلاعب التجسيمي.
- ضع بلطف رأس الجرو بين القضبان الأذن من الإطار حديثي الولادة. تأكد من أن الرأس هو مستوى في المحور Y (الأمام إلى الخلف) من خلال التحقق من أن الخط الفاصل بين bregma امدا وموازية للمرحلة. تأكد من أن الرأس هو مستوى في محور X (جنبا إلى جنب) عن طريق فحص أن يتصور خط بين الأذنين، أو خط بين العينين، موازية للمرحلة.
- قم بمسح رأس الجرو تخدير مع مسحة القطن غارقة في الايثانول 70٪.
- استخدام تتلاعب التجسيمي لوضع حقنة فوق امدا ثم الصفر X و Y إحداثيات. نقل الأسلحة إلى التجسيمي (X، Y) = (0.8، 1.5) ملم لالجراء P0 القياسية.
ملاحظة: حجم الجرو والإحداثيات التجسيمي قد تختلف من سلالة والعمر. ضبط الإحداثيات بناء على حقن صبغة حسب الحاجة لاستهداف البطينات الجانبية. - خفض ببطء الإبرة في موقع الحقن. سوف سطح الجمجمة INDالأنف والحنجرة ثم حرر بمجرد اختراق الإبرة الجلد. سحب الإبرة حتى يسترد الجمجمة شكل مقعر العادي، ولكن الحفاظ على شطبة من الإبرة تحت الجلد. الصفر وZ تنسيق في هذه المرحلة.
- ادخال الإبرة حتى Z = -1.7 ملم ثم تتراجع إلى -1.5 ملم.
- حقن ببطء الفيروس. يمكن لكل نصف الكرة يقبل تصل إلى 2 ميكرولتر من الحل.
- الحفاظ على حقنة في مكان لمدة 30-60 ثانية بعد الانتهاء من الحقن ومن ثم سحب الإبرة ببطء على مدى 1-2 دقيقة.
- تكرار لنصف الكرة الأرضية المقابل، باستخدام الإحداثيات السلبية في المحور السيني للموقع الحقن.
ملاحظة: إحداثيات بديلة للحقن هي (X، Y، Z) = (0.8، 2.0، -1.5) ملم و (1.2، 1.0، -1.5) ملم. إجراء الحقن الأولى في (0.8، 2.0)، ثم الانتقال إلى (0.8 -2.0)، (1.2، 1.0) وأخيرا (1.2 -1.0). حقن 1 ميكرولتر من الحل في كل موقع، ليصبح المجموع 2 ميكرولتر في نصف الكرة الغربي. التحرك بسرعة بين الحقن لاستكمال الإجراء في ليهق من 10 دقيقة.
6. بعد حقن العناية
- بعد الانتهاء من الحقن في نصفي الكرة الأرضية، ضع الجرو مرة أخرى على لوحة ظاهرة الاحتباس حتى في درجة حرارة الجسم والجلد عودة اللون إلى وضعها الطبيعي ويبدأ الجرو للتحرك.
- إذا باستخدام الأم البيولوجية لممرضة حديثي الولادة حقن، والعودة الجراء حقن للأم البيولوجية بعد أن استعادة الحركة الطبيعية. وضع الجراء uninjected المتبقية على لوحة الاحترار. كرر الإجراء حتى تم حقن جميع الفئران.
- في حالة استخدام حاضنة لأمي ممرضة حديثي الولادة حقن، نقل جميع الجراء حقنه إلى الحاضنة الأم للحصول على الرعاية بعد أن استعادة الحركة الطبيعية.
- إزالة معظم أو كل من الجراء التي تنتمي إلى الحاضنة الأم من القفص لضمان نجاح حقن الحيوانات.
- إذا الجراء الحاضنة الأم وحقن الجراء لها نفس العين ولون البشرة، وبمناسبة الجراء من الحاضنة الأم بالقلم المختبر حتى أنها يمكن أن تكونتتميز لاحقا.
- وضع الجراء الحاضنة الأم وبعض الفراش معا مع الجراء حقن. تأكد من أن الجراء حقن تكتسب رائحة ذرية البيولوجي لها لتحسين قبول الجراء جديدة.
- مكان إلا الجراء حقنه مرة أخرى في قفص الحاضنة الأم. اعدام أي الجراء المتبقية من الأم الحاضنة.
- ضمان أن الأم يحضر لوالتمريض الجراء حقنه في غضون 10 دقيقة من وضعها في قفص. إذا لم الأم جمع الجراء في هذا الوقت، نقل الجراء إلى الحاضنة أم أخرى.
- تسمية القفص مع بطاقة اقية لإظهار أنه يحتوي على الحيوانات المحقونة فيروسي. بيت القفص في منطقة افق لمدة 72 ساعة.
- بعد فترة الحجر 72 ساعة، ونقل الأم والجراء (ولكن لا الفراش أو عناصر أخرى القفص) إلى قفص نظيفة. إجراء هذا التحويل داخل المستوى لمجلس الوزراء للسلامة الأحيائية 2 لتجنب التعرض لأية الفراش الملوثة فيروسي. Return القفص نظيفة مع الحيوانات المحقونة إلى مرفق الماوس العادية.
- وضع القفص القذرة في حقيبة واقية، تعقيم بواسطة التعقيم، ومن ثم العودة القفص إلى الحظيرة.
7. تنظيف
- وضع حل الفيروس المتبقية في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. يحتفظ الفيروس كفاءة ترنسدوكأيشن لا يقل عن 2 أشهر عند تخزينها في 4 درجات مئوية 8.
- تطهير إبرة الحقن والمحاقن مع 2٪ التبييض يليه يشطف المتكررة في الماء منزوع الأيونات.
- تنظيف المنطقة العمل مع 2٪ التبييض تليها الايثانول 70٪.
- جمع كل السلع الاستهلاكية بما في ذلك نصائح ماصة، وأنابيب، وقناع، وقفازات واقية في كيس من البلاستيك. التخلص من النفايات كما هو مطلوب بموجب القانون المحلي والسياسات المؤسسية (أي الأوتوكلاف أو حرقها).
8. إعداد أدمغة فئران للتصوير
- وضع الماوس حقن ثاني أكسيد الكربون في القتل الرحيم في غرفة 3-4 أسابيع بعد الحقن. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية لإجراءات القتل الرحيم المناسبة. لا يروي الحيوانات مع بارافورمالدهيد حيث سيؤدي ذلك إلى إخماد التسمية مضان.
- إزالة العقول كلها من الجمجمة وإصلاح ل3-12 ساعة في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
- نقل الدماغ الثابتة إلى 30٪ سكروز لcryoprotection. احتضان عند 4 درجات مئوية حتى يغرق الدماغ إلى أسفل.
- جمع دلو من الجليد الجاف سحقا ناعما. قطع المخ في نصف أسفل خط الوسط. دفن نصفي الدماغ في الجليد الجاف لتجميد.
- تبريد مرحلة مشراح بإضافة الثلج الجاف والإيثانول بنسبة 100٪.
- تأمين الدماغ إلى مرحلة مع خط الوسط أسفل باستخدام برنامج تلفزيوني، والسماح لتجميد.
- القسم من خلال الدماغ في 30-45 ميكرون سمك باستخدام مشراح للانزلاق التجمد.
- أقسام المكان الى 24 لوحات تحتوي كذلك حل التجمد (الجلسرين 250 مل، 300 مل جلايكول الإثيلين، 500 مل 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4). بطانات وايال احباط القصدير وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- جمع الأجزاء 1-4 الآبار وغسل 3X في برنامج تلفزيوني.
- جبل المقاطع على الشرائح المجهر وساترة. تسمح الشرائح لتجف في مكان مظلم.
- الشرائح الصورة باستخدام الفلاتر المناسبة لYFP الأصلي أو tdTomato للتحقق من نمط التنبيغ الفيروس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عائدات حقن ناجحة الفيروسي داخل البطين على نطاق واسع وقوي التعبير العصبية. نحن هنا تقييم تنبيغ الفيروسية باستخدام YFP أو tdTomato الجينات الفلورية تحت سيطرة بيتا الدجاج الأكتين المروج (CBA المروج). تم تعبئتها هذه التركيبات في AAV8 وحقنه في البطينات الجانبية من الفئران حديثي الولادة (P0) ICR. أسفرت التتر الفيروسية عالية (10 10 جزيئات في نصف الكرة الأرضية) في وضع العلامات كثيفة من البصلة الشمية، المخطط، قشرة المخ، المخيخ والحصين (الشكل 1A، يسار). كان وضع العلامات وضوحا في الخلايا العصبية العصبية للدماغ، ولكن غائبين من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ والتي ليست موجودة بأعداد كبيرة في P0 بعد أيضا. أدى حقن من الجسيمات الفيروسية أقل (10 7) في وضع العلامات متفرقة وانخفاض كثافة التعبير (الشكل 1A، يمين). نحن عادة استخدام AAV8 ضمن نطاق تركيز ما بين 10 و 10 7 10 الجسيمات في نصف الكرة باعتباره ن السهل وسيلة يمكن الاعتماد عليها للسيطرة على درجة من التحوير الاصباغ التي تنتجها حقن (الشكل 1B). تكيفنا أيضا أسلوب للتعبير عن الجينات المحورة متعددة بواسطة حقن المشارك اثنين أو أكثر من فيروسات. شارك في حقن اثنين من الفيروسات تعبئتها في نفس المصلي (أي كل من AAV8) التحيزات الناتجة تنبيغ إلى تداخل السكان العصبية، حتى أن العديد من الخلايا التعبير عن كل من الجينات المحورة (الشكل 2A). بتركيزات أقل، وأنماط التعبير تصبح أكثر استقلالية، وانخفضت النسبة المئوية للخلايا المسمى المشارك (الشكل 2B). ويمكن أيضا أن يتحقق التعبير غير متداخلة من الأنماط المصلية AAV مختلفة، عن طريق الحقن المشترك. شارك في حقن AAV1 وAAV8 ترميز للصحفيين الفلورسنت تنتج نمطا متميزا مستقلا إلى حد كبير من ثنائي الاصباغ (الشكل 2C).
ig1highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 1. عيار الفيروسية يمكن أن تستخدم للسيطرة على كثافة تنبيغ الفيروسية. (A) مجموعة واسعة من التحوير الاصباغ يمكن أن يتحقق عن طريق تمييع الحل الفيروسي من 10 10 الى 10 7 الجسيمات / نصف الكرة الغربي. صور تمثيلية من أقسام السهمي تظهر نمطين التنبيغ متميزة على أساس عيار الفيروسية. وقد أخذت صور من الفئران تحصد بعد 3 أسابيع مع حقن AAV8-YFP لتقديم 2.0 × 10 10 (يسار) أو 5.0 × 10 7 (يمين) الجسيمات / نصف الكرة الغربي. (B) صور التكبير أعلى من القشرة (الصف العلوي)، والمخيخ ( الصف السفلي) تظهر الطيف من التحوير الاصباغ التي كتبها التخفيف التسلسلي AAV8 تحقيقها. هو تصور تنبيغ بواسطة الأصلي YFP مضان. تم تحديد مرات التعرض لصور الدماغ كلها من القشرة والحصين، الذي يتألق أكثر الزاهية، في حين تم تعديل مرات التعرض لوحات مكبرة لإظهار أنماط داخل كل صegion. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. العيار الحجمي والمصلي مستقل التحكم في درجة الفيروسي شارك في التعبير. صور الممثل تظهر نمط التنبيغ في قشرة الدماغ (A، B)، والمخيخ (C) بعد 3 أسابيع حقن الفيروسي. (A) المشارك حقن اثنين AAV8 الفيروسات التي تحتوي على صحفيين الفلورسنت مختلفة (tdTomato أو YFP) أنتجت التنبيغ واسعة النطاق في جميع أنحاء الدماغ. غالبية الخلايا transduced أعرب كل من الجينات المحورة. (B) المشارك حقن الفيروسات في نفس التتر أقل أنتجت التعبير متفرق من كل من البروتين، والتي تم transduced خلايا أقل من قبل كل من الفيروسات. (C) المشارك حقنايون من AAV تعبئتها في أنماط مصلية مختلفة (AAV8 وAAV1)، حتى في التتر عالية معتدلة، أنتجت نمطا غير متداخلة إلى حد كبير من التعبير الفيروسي. كان نمط من كل بروتين فلوري متطابقة تقريبا تعبيرها عند حقنه وحدها، مشيرا إلى أن تنبيغ AAV واحد مستقل عن الآخر. TdTomato مضان هو مبين في الحمراء، YFP باللون الأخضر. هو تصور تنبيغ بواسطة مضان الأصلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها إجراء تنوعا لمعالجة الخلايا العصبية التعبير الجيني باستخدام AAV كوسيلة للتسليم على نطاق واسع في مخ الفأر حديثي الولادة. بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الجينات العصبية مثل في الرحم Electroporation لل1 أو التجسيمي الحقن داخل الجمجمة 2،3، حقن الفيروسي حديثي الولادة سهلة نسبيا وبسيطة. لا يمكن أن يؤديها الإجراء الأساسي في دقائق فقط مع دلو الجليد وحقنة ميكروليتر. بقاء الأمثل والتحوير التعبير يمكن أن يتحقق من خلال حضور لبعض التفاصيل التقنية، وأهمها نوعية الأسهم الفيروسية، توقيت ودقة الحقن، ورعاية ما بعد الولادة.
نوعية إعداد الفيروسي هو أمر حاسم لنجاح ترنسدوكأيشن. سوف الاستعدادات الفيروسية سيئة تقلل بشكل كبير العدوى العصبية وتنتج التنبيغ نجمي كبير، ربما عن طريق البلعمة من الجسيمات غير المعدية. العديد من الجامعاتلدينا مختبرات الأساسية في الموقع التي تتخصص في التعبئة والتغليف الفيروسي، والمنشآت الكبيرة في جامعة نورث كارولينا وجامعة بنسلفانيا نقدم نوعية عالية قبالة الجاهزة للاستخدام الكواشف في مجموعة متنوعة من الأنماط المصلية بتكلفة مخفضة. كما توفر هذه المرافق تغليف حسب الطلب للناقلات التي لا تتوفر مثل الأسهم قبل تعبئتها. ردت مرة واحدة في المختبر، أن نتذكر أن جزيئات AAV يمكن أن تكون مستقرة لسنوات في -80 درجة مئوية، ولكن حساسة جدا لتقلبات درجة الحرارة. لهذا السبب، يجب أن يتم تخزين aliquots في -80 درجة مئوية، وينبغي ألا refrozen إذابة مرة واحدة.
لأعلى كفاءة ترنسدوكأيشن، فمن الأهمية بمكان لحقن الفيروس في أقرب وقت ممكن بعد تسليم الجراء. بناء على دراساتنا مع AAV8 وأولئك المتعاونين لدينا، وتأخير الحقن يقلل ليس فقط انتشار الفيروس من البطين، ولكن أيضا المنحازة لتنبيغ من الخلايا العصبية إلى الخلايا النجمية 6،7. لذا نوصي injectiنانوغرام في يوم الولادة للتعبير الأمثل العصبية. في هذا العصر - قبل حاجز السائل النخاعي في الدماغ قد نضجت 9 - الجسيمات الفيروسية حقنها في البطين الجانبي سوف تنتشر في جميع أنحاء النظام البطيني ثم اتبع تدفق السائل النخاعي في الدماغ 4. بالتالي استهداف دقيق للبطين الجانبي أمر بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من انتشار الفيروس. يقلل استهداف دقيق أيضا تلف الأنسجة من حقن السريع لحجم كبير نسبيا من السوائل. ولذلك، فإننا نوصي بشدة الممارسة المتكررة حتى استهداف البطينات الجانبية يصبح موثوقة وقابلة للتكرار. لاحظ أن الإحداثيات الواردة في هذا البروتوكول مناسبة لالجراء P0 العامة ولابد من تعديل لسلالة وعمر الجراء التجريبية. في البداية، ينبغي إجراء الحقن مع حلول صبغ، مثل الأزرق التريبان أو الهند الحبر، وبالتالي فإن استهداف وانتشارها يمكن تصور بواسطة حصاد الدماغ مباشرة بعد الحقن. Iو البطينات الجانبية استهدفوا بنجاح، سوف الصبغة ينتشر في جميع أنحاء غرف البطين وتكون مرئية على طول الطريق من البصلة الشمية إلى المخيخ. ينصح جهاز التجسيمي إذا البطينين لا يمكن أن تستهدف بشكل موثوق عن طريق الحقن اليد الحرة.
إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح، فإن نسبة من الفئران فقدت الحقن ستكون ضئيلة. بدلا من ذلك، فإن معدل البقاء على قيد الحياة بعد الحقن هو الأكثر تأثرا رعاية الأمومة. تبدأ مع الحيوانات السليمة. يشار صحة الأم من خلال سلوكها ومعطفها. أنها ينبغي أن تكون اعدادهم جيدا ونظيفة. حجم القمامة يمكن أيضا أن تكون مؤشرا للرفاه. يجب الشابات صحية تنتج الفضلات من 6-8 الجراء لC57BL / 6 أو 10-16 الجراء لمجلس النواب. وينبغي أن تكون الجراء صحية الوردي وبتلو. إذا الجراء لا تبدو جيدا أو يكون لها أي بقعة الحليب على البطن، فإنها يجب تحويلها إلى حاضنة الأنثى الجديدة على الفور. نوصي ICR أو FVB لتعزيز لأنها تنتج الحليب وافرة وبسهولة تقبل الجراء جديدة في القمامة الخاصة بهم. لا بد من أن تعطل للأم يتم الحد قبل وبعد الحقن والإجهاد قد يسبب لها أن ترفض أو تفكيك الجراء. خفض الإجهاد عن طريق الحد من الضوضاء، والضوء، وغيرها من الاضطرابات وحفظ القفص في مكان هادئ. فتح القفص أقل قدر ممكن عند التحقق من الجراء حديثي الولادة وخلال الأيام القليلة الأولى بعد الحقن، على الرغم من أنه من الضروري الانتباه لمراقبة الأم إلى الجراء بمجرد استبدالها. أم يجب عرض السلوكيات الفطرية مثل باسم التجمع الجراء في مكان واحد ويجلس على قمة كومة من النسل. إذا لم يستجب الأم على الفور عندما يتم إرجاع الجراء إلى القفص، حاول مرة أخرى لخلط الجراء مع الفراش قذرة ومواد التعشيش من القفص لها ضمان حصلوا عليها رائحة لها. التحقق مرة أخرى في وقت لاحق اليوم أن الجراء لا تزال لديها بقع الحليب على بطونهم. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بذلك من خلال النظر في قفص منتحت بدلا من فتح القفص من فوق. الأيام الأولى هي الأكثر أهمية من أجل البقاء، ولكن أيضا متى الأنثى يكون أكثر حساسية للاضطراب.
عندما تنتهي من ذلك بعناية، ويوفر حقن AAV داخل البطينات وسيلة سريعة وسهلة لمعالجة التعبير الجيني الخلايا العصبية في الجسم الحي دون تكلفة ووقت نقل الجينات الجرثومية التقليدي. والاصباغ الأصلي من تنبيغ الفيروسية يمكن تسخيرها للسيطرة على كثافة التعبير، مما يجعل من هذا النهج المثالي للتجارب لفصل عواقب خلايا الجوهرية وخلايا خارجي من نقل الجينات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للفيروسين يكون شارك في حقن مما يجعل من الممكن للتعبير عن بروتينات متعددة في أي تداخل أو متميزة السكان العصبية. هذه المناورات تبرز مرونة النهج، لكننا نعتقد أننا قد خدش فقط مجرد سطح إمكاناتها. سوف توفر متزايد من الكواشف قبالة الجاهزة للاستخدام جعلها أسهل لتطوير حقن و الفيروسيةأو احتياجات تجريبية جديدة، في حين أن ظهور الأنماط المصلية الهجينة مع tropisms متميزة قد توسيع ذخيرة الخلوية التي يمكن استهداف 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
