Abstract
वैज्ञानिक उन्नति की गति तेजी में तेजी के साथ, नए तरीकों को जल्दी और आसानी से माउस मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान के लिए आवश्यक हैं. यहाँ हम पहले नवजात माउस मस्तिष्क में virally इनकोडिंग transgenes की प्रत्यक्ष intracranial वितरण के लिए Passini और वोल्फ ने शुरू की एक तकनीक का वर्णन. इसकी सबसे बुनियादी रूप में, प्रक्रिया केवल एक बर्फ बाल्टी और एक microliter सिरिंज की आवश्यकता है. हालांकि, प्रोटोकॉल भी तकनीक के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए स्थिरता में सुधार करने के लिए stereotaxic फ्रेम के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता. विधि ependymal अस्तर अभी भी जन्म के बाद पहले 12-24 घंटे के दौरान अपरिपक्व है, जबकि मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मस्तिष्क निलय से आसानी से ले जाने के लिए एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) की क्षमता पर निर्भर करता है. मस्तिष्क भर में न्यूरॉन्स की व्यापक पारगमन में इस उम्र के परिणाम पर एएवी की intraventricular इंजेक्शन. अभिव्यक्ति इंजेक्शन के दिनों के भीतर शुरू होता है और lifetim के लिए बनी रहती हैपशु की ई. वायरल अनुमापांक एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति transduced कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण लेबल प्रदान करता है, जबकि transduced न्यूरॉन्स के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. दोनों मुस्तैद, पूर्व पैक अभिकर्मकों और कस्टम वायरल तैयारी प्रदान करने के लिए वायरल कोर सुविधाओं की बढ़ती उपलब्धता के साथ, इस दृष्टिकोण, जल्दी आसान है, और अब तक कम महंगा है कि माउस मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक समय पर विधि प्रदान करता है पारंपरिक germline इंजीनियरिंग से.
Introduction
तंत्रिका जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए पारंपरिक तरीकों समय लेने वाली और महंगा germline जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है. नोवो डे वैकल्पिक तेजी से परिणाम और कम महंगे हैं, लेकिन जटिल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप 1-3 की आवश्यकता का नुकसान है utero electroporation या stereotaxic lentiviral इंजेक्शन के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण. इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति इन तरीकों के साथ एक सीमित स्थानिक रेंज है. इस के साथ साथ, हम नवजात माउस मस्तिष्क में एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) की intraventricular इंजेक्शन के माध्यम से बड़े पैमाने पर न्यूरोनल हेरफेर के लिए एक तेज, आसान, और किफायती विधि का वर्णन. विधि प्रथम, एएवी यह अपरिपक्व ependymal बाधा के माध्यम से और मस्तिष्क पैरेन्काइमा 4 में पार्श्व निलय से गुजरता के रूप में यह मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ के भीतर फैलाना करने की अनुमति के वे छोटे कण आकार सुझाव दिया जहां 2001 में जॉन वोल्फ और मार्को Passini द्वारा वर्णित किया गया था 5. च भीतर एएवी की intraventricular इंजेक्शनirst जन्म पैदावार घ्राण बल्ब से ब्रेन स्टेम 6,7 करने के लिए, मस्तिष्क के हर क्षेत्र में फैले तंत्रिका कैंपेन्स के व्यापक वायरल पारगमन के बाद 24 घंटे. Virally दिया transgenes व्यक्त की और इंजेक्शन के दिनों के भीतर सक्रिय और पारगमन के बाद एक साल तक के लिए जारी रहती हैं. इस प्रकार, इस बहुमुखी हेरफेर जल्दी प्रसव के बाद मस्तिष्क के विकास से वयस्क में उम्र बढ़ने और अध: पतन से लेकर पढ़ाई में सक्षम बनाता है.
यह न्यूरॉन्स 6 transducing में सबसे कारगर है क्योंकि हमारे विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के तकनीक आदत डाल में, हम मुख्य रूप से AAV8 सीरोटाइप पर ध्यान केंद्रित किया है. हम वायरल अनुमापांक आनुवंशिक हेरफेर के प्रयोगों का परीक्षण सेल आंतरिक परिणामों के लिए transduced न्यूरॉन्स के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए पतला किया जा सकता है. इसके अलावा, हम दो वायरस के लिए चुना सीरमप्रकारों पर निर्भर करता है, न्यूरॉन्स के विशिष्ट या अतिव्यापी सेट के प्रति पक्षपाती रहे हैं कि अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन करने के लिए सह इंजेक्शन जा सकता है कि दिखानावायरल पैकेजिंग. हमारा काम प्रयोगात्मक न्यूरोसाइंस सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग के लिए इस तकनीक का बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार.
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं और देखभाल और उपयोग प्रयोगशाला पशु के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार जानवरों को शामिल प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना. यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के Baylor कॉलेज द्वारा अनुमोदित किया गया.
कृंतक मस्तिष्क में transgene प्रसव के लिए प्रतिकृति-अक्षम एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर जैव सुरक्षा स्तर 1 उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है. उचित संरक्षण और वायरस से निपटने प्रक्रियाओं के बारे में विशिष्ट आवश्यकताओं के जो विवरण "सूक्ष्म जीव विज्ञान और जैव चिकित्सा लैबोरेटरीज (BMBL) में जैव सुरक्षा" अमेरिकी सरकार ने प्रकाशन के लिए सीडीसी वेबसाइट को देखें. वायरस का उपयोग प्रक्रियाओं के लिए संस्थागत विशिष्ट आवश्यकताओं को जानने के लिए स्थानीय पशु चिकित्सा और पर्यावरण सुरक्षा कर्मचारियों के साथ की जाँच करें. प्रक्रिया कमरे, संगरोध, और Biohazard पिंजरों की पहचान के संबंध में नियमों संस्थानों में बदलती हैं.
1. पूर्वP0 पिल्ले और फोस्टर माताओं छाँटना
- सभी गर्भवती और नर्सिंग महिलाओं के प्रजनन और स्तनपान की ऊर्जा मांग का समर्थन करने के लिए उच्च वसा चाउ प्रदान करें.
- शाम में, एक एकल निवासी पुरुष के पिंजरे में एक या दो स्वस्थ महिलाओं को जोड़कर एक प्रजनन पिंजरे की स्थापना की. अगली सुबह, एक संभोग प्लग के लिए महिलाओं की जाँच करें और एक प्लग मौजूद है तो पुरुषों से महिलाओं के लिए अलग.
- (उदाहरण के लिए, C57BL 6 / या C3HeJ) गरीब मातृ विशेषताओं के साथ एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि से पिल्ले को बढ़ाने के लिए पालक माताओं का प्रयोग करें. तबादला पिल्ले पालक माता का ही कूड़े के चार दिनों के भीतर पैदा कर रहे हैं अगर फोस्टर माताओं एक और कूड़े से पिल्ले स्वीकार करते हैं.
- महिलाओं के दो सेट पर लगभग एक ही समय देने के इतना है कि प्रयोगात्मक प्रजनक के साथ आईसीआर या FVB महिलाओं का उपयोग कर एक अलग संभोग पिंजरे सेट करें.
- महिलाओं पृष्ठभूमि तनाव पर निर्भर करता है, प्लग की तारीख से 19 ± 1 दिन में वितरित करेंगे. तीन दिन पहले विकास के लिए(16 दिन प्लग तारीख के बाद) elivery, ताजा घोंसले के शिकार सामग्री और एक कवर आश्रय के साथ एक साफ पिंजरे में गर्भवती महिला को जगह है.
- दिन में दो बार उम्मीद की डिलीवरी की तारीख करने के लिए 2 दिन पहले (17 दिन प्लग तारीख के बाद) शुरू करने नवजात पिल्ले के लिए जाँच करें. गुलाबी नवजात शिशुओं की उपस्थिति के लिए नीचे के माध्यम से देखना से माताओं के लिए कम से कम तनाव के साथ पिंजरे जांच करते हैं. चूहे आम तौर पर दोपहर में वितरित करेंगे सुबह में लेकिन दुर्लभ अवसरों पर पिल्ले पहुँचा.
- पिल्ले, या जो भी पहले आए जन्म के 6 घंटे के भीतर (दिखाई दूध धब्बे से स्पष्ट हो जाएगा जो) नर्सिंग रहे हैं जैसे ही इंजेक्शन प्रदर्शन की योजना है.
2 इंजेक्शन के लिए उपकरण तैयार
- सामान्य P0 नवजात शिशुओं के लिए एक 32 जी सुई के साथ एक 10 μl इंजेक्शन सिरिंज तैयार करें. Stereotaxic इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं, तो जोड़तोड़ हाथ पर सिरिंज माउंट.
- इंजेक्शन के लिए एक stereotaxic फ्रेम का उपयोग करते हैं, तो 100% एतान जोड़कर 4-8 डिग्री सेल्सियस तक नवजात अवस्था शांतराजभाषा और ब्लॉक के सामने के छोर पर जलाशय के लिए सूखी बर्फ. पिल्ले की शीतदंश से बचने के लिए 1 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान बनाए रखें.
3 इंजेक्शन के लिए वायरल dilutions तैयार
- एक 1% trypan नीले डाई समाधान (20x शेयर) तैयार करें.
- एक कक्षा 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) स्टॉक की 5-25 μl aliquots तैयार करें. भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इन aliquots रखें. इस पारगमन प्रभावकारिता कम करने के लिए वायरस के कारण होता है के रूप में अतिरिक्त फ्रीज पिघलना चक्र से बचें.
- पिघलना करने के लिए बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और जगह से एएवी के एक विभाज्य निकालें.
- ठंडा 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में वायरस गिराए द्वारा इंजेक्शन के लिए वायरल समाधान तैयार है. पारगमन पद्धति का आरंभिक अनुकूलन के लिए एक दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने (10 10 8 10 वायरल कणों / गोलार्द्ध) के साथ शुरू.
- 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता एएवी समाधान के लिए 20x trypan नीले जोड़ें.
- शांत करने के लिए बर्फ पर एक छोटा सा एल्यूमिनियम प्लेट रखें. एक सूखी कार्य ठंड धातु से पिल्ला की त्वचा की रक्षा के लिए थाली के शीर्ष पर पोंछ रखें. इस पिल्ले anesthetizing और इंजेक्शन लगाने के लिए एक फ्लैट ठंड सतह के रूप में कार्य करता है.
- गर्म पहले और इंजेक्शन के बाद नवजात चूहों रखने के लिए उपयुक्त एक वार्मिंग पैड तैयार करें.
- नवजात पिल्ले नर्स शुरू कर दिया है एक बार, पिंजरे से उनमें से लगभग आधे को हटाने और उनकी मां के साथ अन्य आधा छोड़ दें. इंजेक्शन का इंतजार करते हुए वार्मिंग पैड पर एकत्र पिल्ले रखें.
नोट: जैविक मां पिल्ले की परवाह नहीं करता है, तो तुरंत पिंजरे से पूरे कूड़े को हटाने और इंजेक्शन का इंतजार करने के लिए एक वार्मिंग पैड पर पिल्ले जगह है. यह स्थिति C57BL / 6 महिलाओं को या गरीब प्रजनन विशेषताएं हैं कि अन्य जन्मजात उपभेदों के साथ पैदा हुए पहली कूड़े के साथ पैदा हो सकता है. इस स्थिति में, दूध स्पॉट नवजात पिल्ले पर नहीं दिखाई देंगे. - हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए ठंडा धातु की थाली पर वार्मिंग पैड से एक पिल्ला स्थानांतरण. पिल्ला पूरी तरह से anesthetized बनने के लिए 2-3 मिनट रुको. बहुत धीरे एक पंजा फैलाएंगे द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें और आंदोलन या श्वसन की कमी के लिए निगरानी.
नवजात चूहों में एएवी के 5 इंजेक्शन
- फ्री हाथ नवजात चूहों में एएवी के intracranial इंजेक्शन:
- लोड इंजेक्शन सिरिंज में 0.05% trypan नीले रंग के साथ पतला एएवी के 5 μl.
- धीरे 70% इथेनॉल में भिगो एक कपास झाड़ू के साथ anesthetized पिल्ला के सिर पोंछे.
- हर आंख को लैम्ब्डा सिवनी से दूरी की 2/5 पर इंजेक्शन साइटों को पहचानें. एक वैकल्पिक इंजेक्शन साइट लगभग 0.8-1 मिमी आधे रास्ते लैम्ब्डा और शीर्षस्थान बीच, बाण के समान सिवनी से पार्श्व स्थित है. इन स्थलों P0 पर त्वचा के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं.
- एक गैर विषैले प्रयोगशाला कलम के साथ इंजेक्शन साइट निशान.
- मोनी के लिए दिखाई पैमाने के साथ सिरिंज पकड़ोसमाधान की मात्रा toring तिरस्कृत.
- अंगूठे सवार के शीर्ष तक पहुँच सकते हैं कि सुनिश्चित करें. वायरस वितरण गलती से बचने के लिए सुई स्थिति, जबकि तब सवार से अंगूठे को हटा दें.
- बर्फ बाल्टी पर हाथ बेंच पर कोहनी लगा और झुकाव द्वारा इंजेक्शन के लिए हाथ को गले लगा करने के लिए एक आरामदायक स्थिति का पता लगाएं.
- सीधे सिरिंज के तहत अपने सिर के साथ अपने पक्ष पर पिल्ला निर्धारित करना. उल्लेखनीय इंजेक्शन साइट सामना करना पड़ रहा है कि इतनी पिल्ला के सिर बारी, और धीरे लेकिन मजबूती से एक खुले हाथ से इस स्थिति पकड़.
- खोपड़ी की सतह को सीधा सिरिंज पकड़ो और लगभग 3 मिमी की गहराई तक चिह्नित इंजेक्शन स्थल पर सुई डालें. प्रतिरोध सुई पार्श्व वेंट्रिकल में प्रवेश कर गया है कि यह दर्शाता है, थोड़ा कम हो जाती है जब तक सुई इंजेक्षन. एक संदर्भ की जरूरत है, गैर विषैले मेकर के साथ सुई की नोक से 3 मिमी निशान. डाई टी पर आधारित पिल्ला आकार और तनाव के लिए इंजेक्शन गहराई को समायोजितनिलय की argeting.
- सवार मस्तिष्क में आगे सुई चलते बिना उदास हो सकता है कि इतनी सख्ती से सिरिंज पकड़ो. इंजेक्शन थैलेमस में विस्थापित किया जाता है, वायरल फैल गंभीर रूप से सीमित हो जाएगा.
- सिरिंज से तिरस्कृत मात्रा की निगरानी करते हुए धीरे धीरे वायरस इंजेक्शन लगाने शुरू करो. प्रत्येक वेंट्रिकल में 2 μl की अधिकतम मात्रा प्रशासन. सुई सही स्थिति में है, तो डाई निलय भरने के लिए फैल जाएगा.
- धीरे धीरे सुई वापस ले लें.
- पहला इंजेक्शन साइट पर अन्य गोलार्द्ध इंजेक्शन लगाने से पहले बंद करने की अनुमति दें.
नोट: एक बार से एक ही साइट अधिक इंजेक्षन मत करो. पहले से ही बाहर रिसाव को इंजेक्शन और पिल्ला की चोट या मौत का कारण बनता गया है कि सुई बलों वायरस reinserting. - उसी प्रक्रिया का उपयोग कर contralateral वेंट्रिकल इंजेक्षन.
- नवजात चूहों में एएवी की stereotaxic इंजेक्शन:
- 0.05% trypan नीले पूर्णांक से पतला एएवी का लोड 5 μlstereotaxic जोड़तोड़ द्वारा आयोजित इंजेक्शन सिरिंज ओ.
- धीरे नवजात फ्रेम के कान सलाखों के बीच पिल्ला के सिर जगह है. यकीन सिर लैम्ब्डा और शीर्षस्थान के बीच लाइन मंच के समानांतर है कि जाँच से वाई अक्ष में स्तर (वापस करने के लिए सामने) है बनाओ. यकीन सिर कान, या आंखों के बीच एक लाइन के बीच एक कल्पना की लाइन, मंच के समानांतर है कि जाँच से एक्स अक्ष में स्तर (पक्ष की ओर) है बनाओ.
- धीरे 70% इथेनॉल में भिगो एक कपास झाड़ू के साथ anesthetized पिल्ला के सिर पोंछे.
- लैम्ब्डा ऊपर सिरिंज की स्थिति के लिए stereotaxic जोड़तोड़ का प्रयोग करें और फिर एक्स और वाई निर्देशांक शून्य. = (एक्स, वाई) को stereotaxic हथियारों की चाल (0.8, 1.5) मानक P0 पिल्ले के लिए मिमी.
नोट: पिल्ला आकार और stereotaxic निर्देशांक तनाव और उम्र से भिन्न हो सकते हैं. पार्श्व निलय को लक्षित करने की जरूरत के रूप में डाई इंजेक्शन पर आधारित निर्देशांक समायोजित करें. - धीरे धीरे इंजेक्शन साइट में सुई कम है. खोपड़ी की सतह इंडस्ट्रीज़ जाएगासुई त्वचा प्रवेश कर गया है एक बार ईएनटी और फिर रिहाई. खोपड़ी अपनी सामान्य अवतल आकृति ठीक हो जाए जब तक सुई वापस लेना, लेकिन त्वचा के नीचे सुई का उठाव रखना. जेड इस बिंदु पर समन्वय शून्य.
- जेड = -1.7 मिमी तक सुई डालें और फिर -1.5 मिमी वापस लेना.
- धीरे धीरे वायरस इंजेक्षन. प्रत्येक गोलार्द्ध समाधान के 2 μl को स्वीकार कर सकते हैं.
- इंजेक्शन पूरा करने के बाद 30-60 सेकंड के लिए जगह में सिरिंज रखें और फिर धीरे धीरे 1-2 मिनट से अधिक सुई वापस लेना.
- इंजेक्शन साइट के लिए एक्स अक्ष में नकारात्मक निर्देशांक का उपयोग, contralateral गोलार्द्ध के लिए दोहराएँ.
नोट: इंजेक्शन के लिए वैकल्पिक निर्देशांक हैं (एक्स, वाई, जेड) = (0.8, 2.0, -1.5) मिमी और (1.2, 1.0, -1.5) मिमी. (0.8, 2.0) में पहला इंजेक्शन प्रदर्शन, फिर अंत में (0.8, -2.0), (1.2, 1.0) और (1.2, -1.0) करने के लिए कदम. गोलार्द्ध प्रति 2 μl की कुल के लिए, प्रत्येक स्थल पर समाधान के 1 μl इंजेक्षन. लेस प्रक्रिया पूरी करने के लिए इंजेक्शन के बीच जल्दी से स्थानांतरित10 मिनट से अधिक है.
6 के बाद इंजेक्शन केयर
- दोनों गोलार्द्धों में इंजेक्शन पूरा करने के बाद, सामान्य करने के लिए अपने शरीर का तापमान और त्वचा का रंग वापसी तक वार्मिंग पैड पर पिल्ला वापस जगह और पिल्ला स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है.
- इंजेक्शन नवजात शिशुओं को दूध पिलाने के लिए जैविक माता का उपयोग अगर वे सामान्य आंदोलन की वसूली के बाद, जैविक मां को इंजेक्शन पिल्ले वापसी. वार्मिंग पैड पर शेष uninjected पिल्ले रखें. सभी चूहों इंजेक्शन दिया गया है जब तक प्रक्रिया दोहराएँ.
- इंजेक्शन नवजात शिशुओं को दूध पिलाने के लिए एक पालक माँ का उपयोग अगर वे सामान्य आंदोलन की वसूली के बाद, देखभाल के लिए पालक माता को सभी इंजेक्शन पिल्ले हस्तांतरण.
- इंजेक्शन पशुओं की सफलता सुनिश्चित करने के लिए सबसे अधिक या पिंजरे से पालक माता से संबंधित पिल्ले के सभी निकालें.
- पालक माता के पिल्ले और इंजेक्शन पिल्ले एक ही आंख और त्वचा का रंग है, तो वे हो सकता है, ताकि एक प्रयोगशाला कलम के साथ पालक मां से पिल्ले निशानबाद में प्रतिष्ठित किया.
- पालक माता के पिल्ले और इंजेक्शन पिल्ले के साथ साथ उनके बिस्तर के कुछ जगह. इंजेक्शन पिल्ले नए पिल्ले की स्वीकृति में सुधार करने के लिए उसके जैविक वंश की खुशबू अधिग्रहण सुनिश्चित करें.
- वापस पालक माता के पिंजरे में ही इंजेक्शन पिल्ले रखें. पालक मां से किसी भी शेष पिल्ले चुनना.
- मां को भाग लेने और पिंजरे में उन्हें रखने के 10 मिनट के भीतर इंजेक्शन पिल्ले नर्सिंग है कि सुनिश्चित करें. मां इस समय के भीतर पिल्ले जमा नहीं करता है, तो एक और पालक माता को पिल्ले हस्तांतरण.
- यह virally इंजेक्शन पशुओं जिसमें दिखाने के लिए एक Biohazard कार्ड के साथ पिंजरे लेबल. सदन में 72 घंटे के लिए एक अनुमोदित क्षेत्र में पिंजरे.
- 72 घंटा संगरोध अवधि के बाद, एक साफ पिंजरे में मां और पिल्ले (लेकिन कोई बिस्तर या अन्य पिंजरे आइटम) हस्तांतरण. किसी भी virally दूषित बिस्तर के लिए जोखिम से बचने के लिए एक स्तर 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर इस स्थानांतरण को पूरा करें. आरनियमित माउस की सुविधा के लिए इंजेक्शन पशुओं के साथ स्वच्छ पिंजरे eturn.
- एक Biohazard बैग में गंदे पिंजरे रखें autoclaving द्वारा बाँझ, और फिर मछली पालने का बाड़ा को पिंजरे वापसी.
7 सफाई
- भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष वायरस समाधान रखें. 4 डिग्री सेल्सियस 8 पर संग्रहीत जब वायरस कम से कम 2 महीने के लिए पारगमन क्षमता रखता है.
- विआयनीकृत पानी में दोहराया rinses द्वारा पीछा 2% ब्लीच के साथ इंजेक्शन सुई और सिरिंज कीटाणुरहित.
- 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा 2% ब्लीच के साथ काम करने के क्षेत्र को साफ.
- एक प्लास्टिक Biohazard बैग में पिपेट टिप्स, ट्यूब, मास्क, और दस्ताने सहित सभी योग्य वस्तुओं लीजिए. स्थानीय कानून और संस्थागत नीतियों (यानी आटोक्लेव या जला देना) द्वारा अपेक्षित के रूप में अपशिष्ट पदार्थों के निपटान के.
8 इमेजिंग के लिए माउस दिमाग की तैयारी
- 3 में कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु चेंबर में एक इंजेक्शन माउस रखें4 हफ्तों के बाद इंजेक्शन. उचित इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें. इस प्रतिदीप्ति लेबल बुझाना होगा के रूप में paraformaldehyde के साथ जानवरों छिड़कना न करें.
- खोपड़ी से पूरे दिमाग निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde में 3-12 घंटे के लिए तय.
- Cryoprotection के लिए 30% sucrose के लिए तय मस्तिष्क स्थानांतरण. मस्तिष्क तह तक डूब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- सूक्ष्मता कुचल सूखी बर्फ की एक बाल्टी ले लीजिए. Midline नीचे छमाही में मस्तिष्क कट. फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ में मस्तिष्क आधा गाड़.
- सूखी बर्फ और 100% इथेनॉल जोड़कर सूक्ष्म अवस्था कूल.
- पीबीएस का उपयोग कर नीचे midline के साथ मंच पर मस्तिष्क, सुरक्षित और स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक ठंड फिसलने सूक्ष्म उपयोग कर 30-45 माइक्रोन मोटाई में मस्तिष्क के माध्यम से धारा.
- एंटीफ्ऱीज़र समाधान (250 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 300 मिलीलीटर इथाइलीन ग्लाइकॉल, 500 मिलीलीटर 0.1 एम फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच) युक्त 24 अच्छी तरह प्लेटें में प्लेस वर्गों. कवर प्लेटें वाईभविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर वें टिन पन्नी और दुकान.
- 1-4 कुओं से वर्गों लीजिए और पीबीएस में 3x धो लो.
- माइक्रोस्कोप स्लाइड और coverslip पर माउंट वर्गों. स्लाइड एक अंधेरे स्थान में सूखे की अनुमति दें.
- देशी YFP या tdTomato के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर छवि स्लाइड वायरस पारगमन पैटर्न की जांच करने के लिए.
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Representative Results
सफल intraventricular वायरल इंजेक्शन पैदावार व्यापक और मजबूत न्यूरोनल अभिव्यक्ति. यहाँ हम YFP या चिकन बीटा actin के प्रमोटर (CBA प्रमोटर) के नियंत्रण में tdTomato फ्लोरोसेंट जीन का उपयोग वायरल पारगमन का मूल्यांकन किया. इन निर्माणों AAV8 में पैक और नवजात (P0) आईसीआर चूहों के पार्श्व निलय में इंजेक्शन थे. उच्च वायरल titers (गोलार्द्ध प्रति 10 10 कण) (बाएं, चित्रा 1 ए) घने घ्राण बल्ब की लेबलिंग, स्ट्रिएटम, प्रमस्तिष्क प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में हुई. लेबल भी अनुमस्तिष्क Purkinje न्यूरॉन्स में स्पष्ट है, लेकिन अभी तक P0 पर बड़ी संख्या में मौजूद नहीं हैं जो अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स से विशेष रूप से अनुपस्थित था. कम वायरल कणों इंजेक्शन (10 7) (सही, चित्रा 1 ए) विरल लेबलिंग और कम तीव्रता अभिव्यक्ति में हुई. हम आमतौर पर एक के रूप में गोलार्द्ध प्रति 10 7 और 10 10 कणों के बीच एक एकाग्रता सीमा के भीतर AAV8 उपयोग आसान और इंजेक्शन (चित्रा 1 बी) द्वारा उत्पादित transgene mosaicism की डिग्री को नियंत्रित करने के लिए विश्वसनीय तरीका एन. हम भी सह इंजेक्शन दो या अधिक वायरस से कई transgenes व्यक्त करने के लिए तकनीक अनुकूलित है. कई कोशिकाओं (2A चित्रा) दोनों transgenes व्यक्त इतना है कि (यानी दोनों AAV8) एक ही सीरोटाइप में पैक दो वायरस के सह इंजेक्शन, ओवरलैपिंग neuronal आबादी के परिणामस्वरूप पारगमन biases. कम सांद्रता में, अभिव्यक्ति पैटर्न और अधिक स्वतंत्र हो जाते हैं, और सह लेबल कोशिकाओं का प्रतिशत (चित्रा 2B) में कमी आई है. गैर अतिव्यापी अभिव्यक्ति भी सह इंजेक्शन अलग एएवी सीरमप्रकारों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. AAV1 और AAV8 अलग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं एन्कोडिंग के सह इंजेक्शन दोहरे mosaicism (चित्रा -2) के एक काफी हद तक स्वतंत्र पैटर्न का उत्पादन करता है.
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चित्रा 1 वायरल अनुमापांक वायरल पारगमन के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (ए) transgene mosaicism का एक व्यापक रेंज 10 7 कणों / गोलार्द्ध के लिए नीचे 10 10 से वायरल समाधान गिराए द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. बाण के समान वर्गों के प्रतिनिधि छवियों वायरल अनुमापांक के आधार पर दो अलग पारगमन पैटर्न दिखा. चित्र वितरित करने के लिए 3 सप्ताह AAV8-YFP साथ इंजेक्शन के बाद काटा चूहों से लिया गया 2.0 एक्स 10 10 (बाएं) या 5.0 x 10 7 (दाएं) कणों / गोलार्द्ध. (बी) प्रांतस्था (ऊपरी पंक्ति) और सेरिबैलम के हायर बढ़ाई छवियों ( कम पंक्ति) AAV8 के धारावाहिक कमजोर पड़ने से हासिल transgene mosaicism के स्पेक्ट्रम दिखा. पारगमन देशी YFP प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना है. बढ़ाया पैनल के लिए जोखिम बार प्रत्येक आर के भीतर पैटर्न दिखाने के लिए समायोजित किया गया है, जबकि पूरे मस्तिष्क छवियों के लिए जोखिम बार, सबसे चमकीले प्रतिदीप्ति जो प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस, द्वारा निर्धारित किया गया हैegion. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 टिटर और स्वतंत्र रूप से सीरोटाइप वायरल सह अभिव्यक्ति की डिग्री नियंत्रित करते हैं. प्रतिनिधि छवियों सेरेब्रल कॉर्टेक्स (ए, बी) और सेरिबैलम (सी) 3 सप्ताह वायरल इंजेक्शन के बाद में पारगमन पैटर्न दिखा. दो AAV8 (ए) के सह इंजेक्शन विभिन्न फ्लोरोसेंट संवाददाताओं (tdTomato या YFP) युक्त वायरस मस्तिष्क भर में व्यापक पारगमन का उत्पादन किया. दोनों transgenes व्यक्त transduced कोशिकाओं के बहुमत. (बी) कम कोशिकाओं दोनों वायरस से transduced थे जिसमें प्रत्येक प्रोटीन की विरल अभिव्यक्ति का उत्पादन कम titers, पर एक ही वायरस के सह इंजेक्शन. (सी) के सह इंजेक्षनएएवी के आयन भी मध्यम उच्च titers पर, अलग सीरमप्रकारों (AAV8 और AAV1) में पैक, वायरल अभिव्यक्ति के एक बड़े पैमाने पर गैर अतिव्यापी पैटर्न का उत्पादन किया. एक एएवी की कि पारगमन दूसरे से स्वतंत्र है, यह दर्शाता अकेले इंजेक्शन जब प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तर्ज अपनी अभिव्यक्ति के लिए लगभग समान थी. TdTomato प्रतिदीप्ति हरे रंग में लाल, YFP में दिखाया गया है. पारगमन देशी प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
हम नवजात माउस मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर वितरण के लिए एक वाहन के रूप में एएवी का उपयोग neuronal जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक बहुमुखी प्रक्रिया का वर्णन किया है. ऐसे utero electroporation 1 या stereotaxic intracranial इंजेक्शन 2,3 के रूप में न्यूरोनल transgenesis के अन्य तरीकों के साथ तुलना में, नवजात वायरल इंजेक्शन अपेक्षाकृत आसान और सरल है. बुनियादी प्रक्रिया केवल एक बर्फ बाल्टी और एक microliter सिरिंज के साथ मिनट में किया जा सकता है. इष्टतम अस्तित्व और transgene अभिव्यक्ति कुछ तकनीकी जानकारी के लिए भाग लेने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, सबसे महत्वपूर्ण है वायरल स्टॉक, समय और इंजेक्शन की सटीकता, और प्रसवोत्तर देखभाल की गुणवत्ता.
वायरल तैयारी की गुणवत्ता सफल पारगमन के लिए महत्वपूर्ण है. बुरा वायरल तैयारी काफी न्यूरोनल संक्रामकता कम और संभवतः गैर संक्रामक कणों की phagocytosis द्वारा, महत्वपूर्ण astrocytic पारगमन का उत्पादन होगा. कई विश्वविद्यालयोंउत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय और पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय में वायरल पैकेजिंग में विशेषज्ञ है कि साइट पर कोर प्रयोगशालाओं, और बड़ी सुविधा है कम कीमत पर सीरमप्रकारों की एक किस्म में उच्च गुणवत्ता मुस्तैद अभिकर्मकों प्रदान करते हैं. ये सुविधाएं भी पहले से पैक शेयरों के रूप में उपलब्ध नहीं हैं कि वैक्टर के लिए कस्टम पैकेजिंग प्रदान करते हैं. एक बार प्रयोगशाला में प्राप्त, एएवी कणों -80 डिग्री सेल्सियस पर साल के लिए स्थिर हो, लेकिन तापमान के उतार चढ़ाव के प्रति बहुत संवेदनशील हैं कर सकते हैं कि याद है. इस कारण से, aliquots डिग्री सेल्सियस -80 पर संग्रहित किया जाना चाहिए और एक बार thawed refrozen नहीं किया जाना चाहिए.
उच्चतम पारगमन दक्षता के लिए, यह पिल्ले वितरित कर रहे हैं के बाद जितनी जल्दी हो सके वायरस डालने के लिए महत्वपूर्ण है. न केवल निलय से वायरस के प्रसार को कम हो इंजेक्शनों में देरी, AAV8 और हमारे सहयोगियों के लोगों के साथ हमारे अध्ययन पर आधारित है, लेकिन यह भी astrocytes 6,7 करने के न्यूरॉन्स से पारगमन पूर्वाग्रह जाएगा. इसलिए हम injecti की सिफारिशइष्टतम न्यूरोनल अभिव्यक्ति के लिए जन्म दिन पर एनजी. इस उम्र में - निलय प्रणाली भर में फैलाना और फिर मस्तिष्क 4 में मस्तिष्कमेरु द्रव का प्रवाह का पालन करेंगे पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्शन वायरल कणों - मस्तिष्कमेरु द्रव मस्तिष्क बाधा से पहले 9 परिपक्व हो गया है. नतीजतन, पार्श्व वेंट्रिकल की सटीक लक्ष्यीकरण वायरल फैल अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है. सटीक लक्ष्यीकरण भी तरल पदार्थ की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा का तेजी से इंजेक्शन से ऊतकों को नुकसान को कम करता है. पार्श्व निलय को लक्षित विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाता है जब तक इसलिए, हम दृढ़ता से दोहराया अभ्यास की सलाह देते हैं. इस प्रोटोकॉल में प्रदान निर्देशांक सामान्य P0 पिल्ले के लिए उपयुक्त हैं और प्रयोगात्मक पिल्ले के तनाव और उम्र के लिए समायोजित किया जाना चाहिए कि ध्यान दें. प्रारंभ में, इंजेक्शन ऐसे trypan नीले या भारत स्याही के रूप में डाई समाधान के साथ किया जाना चाहिए, ताकि लक्ष्यीकरण और प्रसार इंजेक्शन के बाद तुरंत मस्तिष्क कटाई से देखे जा सकते हैं. मैंपार्श्व ventricles सफलतापूर्वक लक्षित किया गया है च, डाई निलय कक्षों भर में फैले और सेरिबैलम घ्राण बल्ब से सभी तरह दिखाई देगा. निलय मज़बूती से मुक्त हाथ इंजेक्शन द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकता है अगर एक stereotaxic डिवाइस की सिफारिश की है.
इंजेक्शन के सही ढंग से प्रदर्शन कर रहे हैं, चूहों का अनुपात नगण्य हो जाएगा इंजेक्शन के लिए खो दिया. इसके बजाय, इंजेक्शन के बाद जीवित रहने की दर सबसे मातृ देखभाल से प्रभावित है. स्वस्थ पशुओं से शुरू करें. माता का स्वास्थ्य उसके व्यवहार और उसके कोट ने संकेत दिया है. वह अच्छी तरह से तैयार है और साफ होना चाहिए. कूड़े का आकार भी अच्छी तरह से किया जा रहा का एक संकेत हो सकता है. C57BL 6/8 पिल्ले, या 10 - - आईसीआर के लिए 16 पिल्ले स्वस्थ युवा महिलाओं 6 की litters का उत्पादन करना चाहिए. स्वस्थ पिल्ले गुलाबी और wiggly होना चाहिए. पिल्ले अच्छी तरह से देखने या उनके पेट पर कोई दूध स्थान नहीं है, वे तुरंत एक नया पालक महिला को हस्तांतरित किया जाना चाहिए. हम क्योंकि बढ़ावा देने के लिए आईसीआर या FVB की सिफारिशवे पर्याप्त दूध का उत्पादन और आसानी से अपने कूड़े में नए पिल्ले स्वीकार करते हैं. यह मां के अवरोधों से पहले कम से कम कर रहे हैं और तनाव के रूप में इंजेक्शन के बाद उसे अस्वीकार या पिल्ले cannibalize का कारण हो सकता है कि जरूरी है. शोर, प्रकाश, और अन्य गड़बड़ी सीमित और एक शांत जगह में पिंजरे रखने के द्वारा तनाव को कम करें. नवजात पिल्ले के लिए और इंजेक्शन के बाद पहले कुछ दिनों में जाँच जब यह वे प्रतिस्थापित कर रहे हैं एक बार पिल्ले को माँ का सावधानी नजर रखने के लिए आवश्यक है, हालांकि, जितना संभव हो कम पिंजरे खोलें. मां ऐसी एक जगह में पिल्ले गुच्छन और संतानों के ढेर के ऊपर बैठा के रूप में सहज व्यवहार प्रदर्शित करना चाहिए. पिल्ले पिंजरे में लौट रहे हैं जब मां तुरंत जवाब नहीं है, तो वे उसे खुशबू हासिल कर ली है सुनिश्चित उसे पिंजरे से गंदे बिस्तर और घोंसले के शिकार सामग्री के साथ पिल्ले मिश्रण करने के लिए पुन: प्रयास करें. पिल्ले अभी भी उनके पेट पर दूध स्पॉट है कि दिन में बाद में फिर से जाँच करें. यदि संभव हो, से पिंजरे में देख कर ऐसा करते हैंनीचे के बजाय ऊपर से पिंजरे खोलने से. पहले दिन के अस्तित्व के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं, लेकिन यह भी महिला विघटन करने के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होना होगा.
जब ध्यान से किया, intraventricular एएवी इंजेक्शन पारंपरिक germline transgenesis की लागत और समय के बिना विवो में neuronal जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ की एक तेज और आसान साधन प्रदान करता है. वायरल पारगमन की देशी mosaicism यह transgenesis की सेल आंतरिक और सेल बाह्य परिणामों को अलग करने के प्रयोगों के लिए एक आदर्श तरीका है, जिससे अभिव्यक्ति के घनत्व को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, दो वायरस सह इंजेक्शन यह संभव अतिव्यापी या विशिष्ट neuronal आबादी या तो में कई प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कर रही हो सकता है. इन जोड़तोड़ दृष्टिकोण के लचीलेपन पर प्रकाश डाला, लेकिन हम केवल अभी अपनी क्षमता की सतह खरोंच है विश्वास करते हैं. मुस्तैद अभिकर्मकों की बढ़ती उपलब्धता वायरल इंजेक्शन च विकसित करने के लिए यह आसान कर देगाया अलग tropisms साथ संकर सीरमप्रकारों के उद्भव 10,11 लक्षित किया जा सकता है कि सेलुलर प्रदर्शनों की सूची का विस्तार हो सकता है, जबकि नई प्रयोगात्मक जरूरत है,.
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Disclosures
लेखक वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
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