Abstract
Avec le rythme des progrès scientifiques accélérer rapidement, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour neurosciences expérimentales de manipuler rapidement et facilement l'expression des gènes dans le cerveau de la souris. Nous décrivons ici une technique introduite par Passini et Wolfe pour la livraison intracrânienne directe des transgènes d'origine virale codée dans le cerveau de souris nouveau-né. Dans sa forme la plus simple, la procédure exige seulement un seau à glace et une seringue microlitre. Toutefois, le protocole peut également être adapté pour une utilisation avec des cadres stéréotaxiques d'améliorer la cohérence de nouveaux chercheurs de la technique. Le procédé repose sur la capacité des virus adéno-associé (AAV) de se déplacer librement dans les ventricules cérébraux dans le parenchyme du cerveau tandis que le revêtement épendymaire est encore immature au cours de la première de 12 à 24 heures après la naissance. Injection intraventriculaire de l'AAV à cet âge, les résultats dans la transduction généralisée des neurones dans le cerveau. Expression commence dans les jours suivant l'injection et persiste pendant la lifetime de l'animal. Titre viral peut être réglé pour contrôler la densité de neurones transduites, tandis que la co-expression d'une protéine fluorescente fournit une étiquette vital de cellules transduites. Avec la disponibilité croissante des installations de base virales pour fournir des réactifs à la fois hors-the-shelf, pré-emballés et préparation virale coutume, cette approche offre une méthode opportune pour la manipulation de l'expression des gènes dans le cerveau de la souris qui est rapide, facile et beaucoup moins coûteux d'ingénierie traditionnel de la lignée germinale.
Introduction
Les méthodes traditionnelles pour modifier l'expression des gènes de neurones ont besoin de temps et les manipulations de la lignée germinale coûteux. Alternative de novo approches comme dans l'électroporation in utero ou injection stéréotaxique lentiviral donner des résultats plus rapides et moins coûteuses mais présentent l'inconvénient de nécessiter une intervention chirurgicale complexe 1-3. En outre, l'expression du transgène a une portée spatiale limitée avec ces méthodes. Ici, nous décrivons une méthode rapide, simple et économique pour la manipulation neuronale généralisée par injection intraventriculaire de virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau de souris nouveau-nés. La méthode a été décrite par John Wolfe et Marco Passini en 2001, où ils ont suggéré petite taille de particule d'AAV a permis de se diffuser dans le liquide céphalo-rachidien qui passe à partir des ventricules latéraux à travers la barrière épendymaire immatures et dans le parenchyme cérébral 4, 5. L'injection intraventriculaire de l'AAV à l'intérieur de la fIRST 24 h après la naissance des rendements de transduction virale généralisée des sous-ensembles de neurones couvrant toutes les régions du cerveau, des bulbes olfactifs de tronc cérébral 6,7. Transgènes d'origine virale livrés sont exprimés et active dans les jours suivant l'injection et persistent jusqu'à un an après la transduction. Ainsi, cette manipulation polyvalent permet des études allant du développement du cerveau postnatal précoce de vieillissement et la dégénérescence chez l'adulte.
En adaptant la technique à nos besoins expérimentaux spécifiques, nous avons mis l'accent principalement sur AAV8 sérotype car elle est la plus efficace pour transduire des neurones 6. Nous montrons que le titre viral peut être dilué pour contrôler la densité de neurones transduites pour essai de conséquences expériences cellulaires intrinsèques de manipulation génétique. De plus, nous démontrons que les deux virus peuvent être co-injectés pour produire des profils d'expression qui sont sollicités vers des ensembles distincts de neurones ou qui se chevauchent, en fonction des sérotypes choisis pourencapsidation virale. Notre travail se développe la polyvalence de cette technique pour une utilisation dans un large éventail de paramètres de neurosciences expérimentales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Effectuer toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été examinés et approuvés par le Baylor College of Medicine institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.
virus adéno-associé (AAV) vecteurs de réplication incompétent pour la livraison du transgène dans le cerveau de rongeurs sont approuvés pour le niveau de biosécurité 1 utilisation. Consultez le site Web CDC pour la publication du gouvernement américain "prévention des risques biotechnologiques en microbiologie et biomédicales Laboratories (BMBL)" qui détaille les exigences spécifiques concernant les procédures de protection et de transport de virus appropriés. Vérifiez auprès du personnel de sécurité vétérinaire et environnementale locale pour connaître les exigences spécifiques de procédures institutionnelles pour utilisant des virus. Règlement concernant les pièces de la procédure, la quarantaine, et l'identification des cages de risque biologique varient selon les institutions.
1. Prépare P0 chiots et Foster mères
- Fournir haute chow de graisse pour toutes les femmes enceintes et allaitantes de soutenir les besoins énergétiques de la reproduction et la lactation.
- Dans la soirée, mettre en place une cage d'élevage en ajoutant une ou deux femelles en bonne santé à la cage d'un mâle résident unique. Le lendemain matin, vérifiez les femmes pour une prise d'accouplement et de séparer les femmes des hommes, si une prise est présente.
- Utilisez mères adoptives pour élever les petits à partir d'un fond génétique avec les caractéristiques maternelles pauvres (par exemple, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mères adoptives acceptent chiots d'une autre portée si les chiots sont nés transférés dans les quatre jours de la litière propre de la mère nourricière.
- Mettre en place une cage d'accouplement séparé à l'aide ICR femelles ou FVB à côté des éleveurs expérimentaux, afin que les deux groupes de femmes accouchent à peu près au même moment.
- Les femelles livrer dans 19 ± 1 jours à compter de la date de la prise, en fonction de la souche de fond. Trois jours avant dIVRAISON (16 jours après la date de prise), placer la femme enceinte dans une cage propre avec du matériel de nidification frais et un abri couvert.
- Vérifiez nouveaux-nés deux fois par jour à partir 2 jours avant la date prévue de l'accouchement (17 jours après la date de prise). Examinez la cage avec un minimum de stress pour les mères en regardant à travers le fond de la présence de nouveau-nés roses. Souris délivrent des petits le matin, mais en de rares occasions prononcera dans l'après-midi.
- Planifiez à pratiquer des injections dès que les chiots sont allaitent (qui sera évident par les taches de lait visibles), ou dans les 6 heures de la naissance, selon la première éventualité.
2 Préparer l'équipement pour injection
- Préparer une seringue d'injection de 10 pi avec une aiguille de 32 G pour les nouveau-nés généraux P0. Si vous effectuez injection stéréotaxique, monter la seringue dans le bras manipulateur.
- Si vous utilisez un cadre stéréotaxique pour préparations injectables, refroidir le stade néonatal à 4-8 ° C en ajoutant 100% ethanet d'utilisation de la neige carbonique dans le réservoir à l'extrémité avant du bloc. Maintenir la température au-dessus de 1 ° C pour éviter les gelures des chiots.
3 Préparer les dilutions virales pour injection
- Préparer un trypan solution de colorant bleu de 1% (20x stock).
- Préparer des aliquotes 5-25 ul de virus adéno-associé (AAV) de bouillon dans une enceinte de sécurité biologique de classe 2. Placez ces aliquotes à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Eviter les cycles de congélation-décongélation supplémentaires que cela entraîne la transduction du virus à perdre leur efficacité.
- Retirer une aliquote de l'AAV de -80 ° C congélateur et placer sur la glace à dégeler.
- Préparation de la solution pour injection virale par le virus de dilution dans une solution saline de phosphate de 1x glacée tamponnée (PBS). Commencer avec une dilution en série de dix fois (10 oct-10 août particules virales / hémisphère) pour l'optimisation de la configuration initiale de transduction.
- Ajouter 20x bleu trypan à la solution de l'AAV à une concentration finale de 0,05%.
- Placer une petite plaque d'aluminium sur la glace pour refroidir. Placer une tâche chiffon sec sur le dessus de la plaque pour protéger la peau du chiot à partir du métal froid. Cela sert comme une surface froide plat pour anesthésier et injecter les chiots.
- Préparer un coussin chauffant approprié pour garder souriceaux nouveau-nés au chaud avant et après l'injection.
- Une fois que les nouveau-nés ont commencé à infirmière, d'éliminer environ la moitié d'entre eux de la cage et laisser l'autre moitié avec leur mère. Placez les petits recueillies sur le coussin chauffant en attendant injection.
REMARQUE: Si la mère biologique ne se soucie pas pour les chiots, retirez la litière de la cage immédiatement et placer les chiots sur un coussin chauffant à attendre injection. Cette situation peut se produire avec la première portée née à C57BL / 6 femelles ou avec d'autres souches consanguines qui ont des caractéristiques de reproduction pauvres. Dans cette situation, les taches de lait ne seront pas visibles sur nouveau-nés. - Transférer un chiot de la coussin chauffant sur la plaque de métal froid pour induire une hypothermie anesthésie. Attendez 2-3 min pour le chiot à devenir pleinement anesthésiés. Confirmez l'anesthésie en pressant très doucement une patte et surveiller l'absence de mouvement ou la respiration.
5. injection de l'AAV à des souris nouveau-né
- Gratuit main d'injection intracrânienne de l'AAV à des souris nouveau-né:
- Charge 5 ul de AAV dilué avec 0,05% de bleu trypan dans la seringue d'injection.
- Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d'éthanol à 70%.
- Identifier les points d'injection à 5.2 de la distance à partir de la suture lambda à chaque oeil. Site d'injection de remplacement est située à environ 0,8 à 1 mm latéralement à partir de la suture sagittale, à mi-chemin entre le bregma et lambda. Ces points de repère sont visibles à travers la peau à P0.
- Marquer le point d'injection avec un stylo de laboratoire non-toxique.
- Tenez la seringue avec l'échelle visible pour moniveillance le volume de solution distribuée.
- Assurez-vous que le pouce puisse atteindre le haut du piston. Ensuite, retirer le pouce du piston tout en positionnant l'aiguille pour éviter accidentellement distribution virus.
- Trouver une position confortable pour caler le bras pour injection en plaçant le coude sur le banc et se penchant sur le bras le seau à glace.
- Placez le chiot sur le côté avec la tête directement sous la seringue. Tournez la tête du chiot afin que le site d'injection marquée vers le haut, et doucement mais fermement tenir cette position avec une main ouverte.
- En tenant la seringue perpendiculaire à la surface du crâne et introduire l'aiguille au niveau du site d'injection marqué jusqu'à une profondeur d'environ 3 mm. Injecter l'aiguille jusqu'à ce que la résistance diminue légèrement, ce qui indique que l'aiguille a pénétré dans le ventricule latéral. Si l'on avait besoin d'une référence, marquer 3 mm de la pointe de l'aiguille avec machine non-toxique. Régler la profondeur d'injection pour la taille de chiot et de la souche sur la base de colorant targeting des ventricules.
- En tenant la seringue de façon rigide de sorte que le plongeur peut être enfoncé sans déplacer l'aiguille plus loin dans le cerveau. Si l'injection est déplacé dans le thalamus, la propagation virale sera sévèrement limitée.
- Commencer l'injection de virus lentement tout en surveillant le volume distribué à partir de la seringue. L'administration d'un volume maximal de 2 ul dans chaque ventricule. Si l'aiguille est dans la position correcte, le colorant se propage à remplir le ventricule.
- Retirer lentement l'aiguille.
- Laisser le premier site d'injection avant l'injection pour fermer l'autre hémisphère.
NOTE: Ne pas injecter le même site plus d'une fois. Réinsérer le virus des forces de l'aiguille qui a déjà été injecté à s'échapper et cause un préjudice ou la mort du chiot. - Injecter le ventricule controlatéral en utilisant la même procédure.
- Injection stéréotaxique de l'AAV à des souris nouveau-né:
- Charge 5 pi d'AAV dilué avec 0,05% trypan int bleuo la seringue d'injection a eu lieu par le manipulateur stéréotaxique.
- Placez délicatement la tête du chiot entre les barres d'oreilles de la trame du nouveau-né. Assurez-vous que la tête est au niveau de l'axe Y (avant vers l'arrière) en vérifiant que la ligne entre lambda et bregma est parallèle à la scène. Assurez-vous que la tête est au niveau de l'axe des X (côté à l'autre) en vérifiant que une ligne imaginaire entre les oreilles, ou une ligne entre les deux yeux, est parallèle à la scène.
- Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d'éthanol à 70%.
- Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue au-dessus de lambda, puis zéro les coordonnées X et Y. Déplacez les bras stéréotaxiques à (X, Y) = (0,8, 1,5) mm pour bébés P0 standard.
NOTE: taille de chiot et coordonnées stéréotaxiques peuvent varier selon la souche et l'âge. Réglez coordonnées basé sur des injections de colorants nécessaires pour cibler les ventricules latéraux. - Abaissez lentement l'aiguille dans le site d'injection. La surface du crâne sera indent puis relâchez une fois l'aiguille a pénétré dans la peau. Rétracter l'aiguille jusqu'à ce que le crâne retrouve sa forme concave normale, mais garder le biseau de l'aiguille sous la peau. Zéro la coordonnée Z à ce point.
- Insérer l'aiguille jusqu'à Z = -1,7 mm et puis se rétractent à -1,5 mm.
- Lentement injecter le virus. Chaque hémisphère peut accepter jusqu'à 2 pi de solution.
- Conserver la seringue en place pendant 30-60 secondes après la fin de l'injection, puis retirer lentement l'aiguille sur 1-2 min.
- Répétez l'opération pour l'hémisphère controlatéral, à l'aide des coordonnées négatives sur l'axe X pour le site d'injection.
REMARQUE: coordonnées alternatifs pour l'injection sont (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm et (1.2, 1.0, -1.5) mm. Effectuer la première injection à (0,8, 2,0), puis passer à (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) et enfin (1.2, -1.0). Injecter 1 pl de solution sur chaque site, pour un total de 2 pi par hémisphère. Déplacez-vous rapidement entre les injections pour terminer la procédure dans less à 10 min.
6. post-injection de soins
- Après avoir terminé les injections dans les deux hémisphères, placez le chiot de retour sur le coussin chauffant jusqu'à son retour de la couleur de la température du corps et de la peau à la normale et le chiot commence à se déplacer.
- Si vous utilisez la mère biologique pour soigner les nouveau-nés injectés, retourner les chiots injecté à la mère biologique après qu'ils récupèrent le mouvement normal. Placez les petits non-injecté restant sur le coussin chauffant. Répétez la procédure jusqu'à ce que toutes les souris ont été injectées.
- Si vous utilisez une mère d'accueil pour soigner les nouveau-nés injectés, transférer tous les petits injecté à la mère d'accueil pour les soins après qu'ils récupèrent le mouvement normal.
- Enlever la plupart ou la totalité des chiots appartenant à la mère nourricière de la cage pour assurer le succès des animaux injectés.
- Si les chiots de la mère adoptive et chiots injectés ont la même couleur de peau et des yeux, marquer chiots de la mère d'accueil avec un stylo de laboratoire afin qu'ils puissent êtredistinguer par la suite.
- Placez les chiots de la mère nourricière et une partie de leur literie avec les chiots injectés. Veiller à ce que les chiots injectés acquérir l'odeur de sa progéniture biologique afin d'améliorer l'acceptation des nouveaux chiots.
- Placez seulement les chiots réinjecté dans la cage de la mère nourricière. Abattre des petits restants de la mère nourricière.
- Assurez-vous que la mère assiste à nourrir leurs petits et injectés dans les 10 min de les placer dans la cage. Si la mère ne recueille pas les chiots dans ce délai, le transfert à un autre chiots mère adoptive.
- Étiqueter la cage avec une carte de risque biologique pour montrer qu'il contient des animaux d'origine virale injectés. Maison de la cage dans un endroit approuvé pour 72 heures.
- Après la période de quarantaine de 72 heures, transférer la mère et les petits (mais pas de literie ou d'autres articles de la cage) à une cage propre. Effectuez ce transfert dans une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 pour éviter l'exposition à toute la literie contaminés par un virus. ReTurn la cage propre avec les animaux injectés à l'établissement régulier de la souris.
- Placez la cage sale dans un sac de risque biologique, stériliser à l'autoclave, puis retourner la cage pour le vivarium.
7 Nettoyage
- Placer la solution de virus restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Le virus conserve l'efficacité de transduction pendant au moins 2 mois lorsqu'elle est stockée à 4 ° C 8.
- Désinfecter l'aiguille d'injection et une seringue avec 2% d'agents blanchissants, suivi par des rinçages répétés dans de l'eau désionisée.
- Nettoyer la zone de travail avec 2% de l'eau de Javel suivie par 70% d'éthanol.
- Collecter tous les objets jetables, y compris les embouts de pipette, tubes, masque et des gants dans un sac en plastique risque biologique. Éliminer les déchets conformément à la loi locale et les politiques institutionnelles (c.-à-autoclave ou incinérer).
8 Préparer cerveaux de souris pour l'imagerie
- Passer une souris injectée dans une chambre de l'euthanasie de dioxyde de carbone à 34 semaines après l'injection. Suivez les directives institutionnelles pour les procédures d'euthanasie appropriées. Ne pas perfuser les animaux avec du paraformaldéhyde comme cela éteindre l'étiquette de fluorescence.
- Retirer l'ensemble des cerveaux de crâne et de fixer pour 3-12 heures dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 4 ° C.
- Transférer le cerveau fixe à 30% de saccharose pour la cryoconservation. Incuber à 4 ° C jusqu'à ce que le cerveau coule au fond.
- Recueillir un seau de glace sèche finement broyée. Couper le cerveau en deux en bas de la ligne médiane. Enterrez les moitiés du cerveau dans la glace sèche à geler.
- Refroidir le stade de microtome en ajoutant de la neige carbonique et de l'éthanol à 100%.
- Fixez le cerveau de la scène avec la ligne médiane vers le bas à l'aide de PBS, et le gel.
- Section à travers le cerveau à 30-45 um d'épaisseur à l'aide d'un microtome de congélation coulissant.
- Placer les articles dans des plaques à 24 puits contenant une solution d'antigel (250 ml de glycerol, 300 ml d'éthylène glycol, 500 ml de 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4). plaques de couverture wie papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour une utilisation future.
- Recueillir sections de 1-4 puits et laver 3x PBS.
- Sections de montage sur des lames de microscope et lamelle. Laisser les lames sécher dans un endroit sombre.
- Les diapositives d'images à l'aide de filtres appropriés pour YFP natif ou tdTomato pour vérifier le motif de transduction du virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le succès d'injection intraventriculaire rendement viral d'expression généralisée et robuste neuronale. Ici, nous avons évalué la transduction virale utilisant YFP ou tdTomato gènes fluorescents sous le contrôle du promoteur de la bêta de poulet de l'actine (promoteur de l'ABC). Ces constructions ont été emballés dans AAV8 et injecté dans les ventricules latéraux de souris (P0) ICR néonatales. Titres viraux élevés (10 à 10 particules par hémisphère) ont donné lieu à l'étiquetage dense du bulbe olfactif, le striatum, le cortex cérébral, l'hippocampe et le cervelet (Figure 1A, à gauche). Étiquetage est également apparu dans les neurones de Purkinje du cervelet, mais les grands absents de neurones granulaires du cervelet qui ne sont pas encore présents en grand nombre à P0. Injection de moins de particules virales (10 7) a donné lieu à l'étiquetage rares et d'expression de plus faible intensité (figure 1A, à droite). Nous utilisons couramment AAV8 dans une gamme de concentration comprise entre 10 7 et 10 10 particules par un hémisphère n facile et fiable pour contrôler le degré de transgène mosaïque réalisée par injection (figure 1B). Nous avons également adapté la technique pour exprimer des transgènes multiples par deux ou plusieurs virus de la co-injection. Co-injection de deux virus emballés dans le même sérotype (c'est à dire aussi bien AAV8) sollicite la transduction résultant de populations neuronales qui se chevauchent, de sorte que de nombreuses cellules expriment les deux transgènes (figure 2A). Aux concentrations plus faibles, les profils d'expression sont plus indépendants, et le pourcentage de cellules co-marqué est diminuée (Figure 2B). Expression non-chevauchement peut également être réalisée par différents sérotypes d'AAV de co-injection. Co-injection de AAV1 et AAV8 rapporteurs fluorescents distincts codant pour un motif produit en grande partie indépendant des deux mosaïques (figure 2C).
ig1highres.jpg "width =" 600 "/>
La figure 1 du titre viral peut être utilisée pour contrôler la densité de la transduction virale. (A) Une large gamme de mosaïcisme transgène peut être obtenue par dilution de la solution virale de 10 à 10 jusqu'à 10 7 particules / hémisphère. Des images représentatives de coupes sagittales montrent deux modes distincts de transduction sur la base de titre viral. Les images ont été prises à partir de souris récoltées trois semaines après l'injection de AAV8-YFP à livrer 2,0 x 10 10 (à gauche) ou 5,0 x 10 7 (à droite) des particules / hémisphère. (B) images de grossissement supérieur du cortex (rangée du haut) et le cervelet ( rangée inférieure) montrent le spectre de transgène mosaïque réalisée par dilution en série de AAV8. Transduction est visualisé par fluorescence native YFP. Les temps d'exposition pour des images du cerveau entiers ont été déterminés par le cortex et l'hippocampe, qui fluorescence les plus vives, tandis que les temps d'exposition pour les panneaux agrandies ont été ajustés pour montrer les modèles au sein de chaque région. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 Titer sérotype et contrôler indépendamment le degré de co-expression virale. Images représentatives montrent le motif de transduction dans le cortex cérébral (A, B) et le cervelet (C) 3 semaines après l'injection virale. (A) co-injection de deux AAV8 virus contenant différents rapporteurs fluorescents (tdTomato ou YFP) produit une vaste transduction dans le cerveau. La majorité des cellules transduites exprimées deux transgènes. (B) Co-injection des mêmes virus à des titres de moindre qualité rare expression de chaque protéine, dans lequel moins de cellules ont été transduites par les deux virus. (C) Co-injectionion de l'AAV emballé dans différents sérotypes (AAV8 et AAV1), même modérément élevés titres, produit un motif en grande partie non-cumul de l'expression virale. Le motif de chaque protéine fluorescente était presque identique à son expression lorsqu'elle est injectée seule, ce qui indique que la transduction d'un AAV est indépendante de l'autre. TdTomato fluorescence affichée en rouge, en vert YFP. Transduction est visualisé par fluorescence native. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons décrit un procédé polyvalent pour la manipulation de l'expression génique en utilisant des neurones AAV comme vecteur de livraison répandu dans le cerveau de souris nouveau-nés. Comparé à d'autres méthodes de transgénèse neuronale tels que électroporation in utero ou une injection intracrânienne stéréotaxique 2,3, injection virale néonatale est relativement facile et simple. La procédure de base peut être réalisé en quelques minutes seulement avec un seau à glace et une seringue microlitre. Survie optimale et l'expression du transgène peuvent être atteints en assistant à quelques détails techniques, le plus important étant la qualité des stocks de virus, le timing et la précision de l'injection, et les soins post-natals.
La qualité de la préparation virale est essentielle pour la transduction réussie. Préparations virales Bad diminuent de façon significative l'infectivité des neurones et des astrocytes produire transduction importante, peut-être par la phagocytose de particules non infectieuses. Beaucoup d'universitésavoir laboratoires base sur place qui se spécialisent dans l'emballage virale, et les grandes installations à l'Université de Caroline du Nord et de l'Université de Pennsylvanie offrir réactifs hors-the-shelf de haute qualité dans une variété de sérotypes à un coût réduit. Ces établissements offrent également des emballages personnalisés pour les vecteurs qui ne sont pas disponibles en stocks de pré-emballés. Une fois reçu dans le laboratoire, rappelez-vous que les particules d'AAV peuvent être stables pendant des années à -80 ° C, mais sont très sensibles aux variations de température. Pour cette raison, des parties aliquotes doivent être conservés à -80 ° C et ne doivent pas être recongelé une fois décongelé.
Pour plus d'efficacité de transduction, il est essentiel d'injecter le virus dès que possible après chiots sont livrés. Sur la base de nos études avec AAV8 et ceux de nos collaborateurs, ce qui retarde les injections non seulement diminue la propagation du virus du ventricule, mais aussi biaiser la transduction des neurones à 6,7 astrocytes. C'est pourquoi nous recommandons INJECTIng sur le jour de la naissance à l'expression neuronale optimale. A cet âge, - avant la barrière de liquide céphalo-rachidien du cerveau a mûri 9 - particules virales injectées dans le ventricule latéral se diffuse à travers le système ventriculaire et ensuite suivre l'écoulement du liquide céphalo-rachidien dans le cerveau 4. Par conséquent, le ciblage précis du ventricule latéral est essentiel pour optimiser la propagation virale. Un ciblage précis minimise également des dommages aux tissus de l'injection rapide d'un volume relativement important de fluide. Par conséquent, nous recommandons fortement la pratique répétée jusqu'à ce que le ciblage des ventricules latéraux devient fiable et reproductible. Notez que les coordonnées fournies dans le présent protocole sont appropriés pour les petits généraux P0 et doivent être ajustées pour la souche et l'âge des chiots expérimentales. Initialement, les injections doivent être effectuées avec des solutions de colorants, comme le bleu trypan ou encre de Chine, de sorte que le ciblage et la diffusion peuvent être visualisées en récoltant le cerveau immédiatement après l'injection. Jef ventricules latéraux ont été ciblées avec succès, le colorant se propage à travers les chambres ventriculaires et visible tout le chemin depuis le bulbe olfactif au cervelet. Un dispositif stéréotaxique est recommandée si les ventricules ne peuvent pas être fiable pour cible par injection à main levée.
Si les injections sont effectuées correctement, la proportion de souris perdu à injection sera négligeable. Au lieu de cela, le taux de survie après l'injection est la plus touchée par les soins maternels. Commencez avec des animaux sains. La santé de la mère est indiqué par son comportement et son manteau. Elle doit être bien entretenue et propre. La taille de la portée peut également être une indication de bien-être. Jeunes femmes en bonne santé devraient produire des portées de 6 - 8 chiots pour C57BL / 6 ou 10 - 16 chiots pour IC. Chiots sains doivent être roses et ondulée. Si les chiots ne regarde pas bien ou n'ont pas de lieu de lait sur leur ventre, ils devraient être transférés à une nouvelle nourricier femelle immédiatement. Nous vous recommandons ICR ou FVB pour favoriser carils produisent suffisamment de lait et acceptent volontiers de nouveaux chiots dans leur litière. Il est impératif que les perturbations de la mère sont réduits au minimum avant et après les injections que le stress peut provoquer la rejeter ou cannibaliser les chiots. Réduire les facteurs de stress en limitant le bruit, la lumière, et d'autres perturbations et de garder la cage dans un endroit calme. Ouvrez la cage aussi peu que possible lors de la vérification des nouveau-nés et dans les premiers jours après l'injection, mais il est essentiel de surveiller l'attention de la mère aux chiots une fois qu'ils sont remplacés. La mère devrait afficher des comportements innés tels que groupage les chiots dans un endroit et assis au sommet de la pile de la progéniture. Si la mère ne répond pas immédiatement lorsque les chiots sont retournés à la cage, essayez de nouveau pour bien mélanger les petits avec une literie sale et matériaux de nidification de sa cage de s'assurer qu'ils ont acquis son parfum. Vérifiez à nouveau plus tard dans la journée que les chiots ont encore des taches de lait sur leurs ventres. Si possible, faire en regardant dans la cage desous plutôt que d'ouvrir la cage d'en haut. Les premiers jours sont les plus critiques pour la survie, mais aussi quand la femelle sera plus sensible aux perturbations.
Bien fait, l'injection intraventriculaire AAV fournit un moyen rapide et facile de manipuler l'expression des gènes neuronale in vivo sans le coût et le temps de la transgénèse germinale traditionnelle. La mosaïque originaire de transduction virale peut être exploitée pour contrôler la densité d'expression, ce qui en fait une approche idéale pour des expériences pour séparer les conséquences cellulaires intrinsèque et extrinsèque cellules de la transgénèse. En outre, deux virus peuvent être co-injectée qui permet d'exprimer plusieurs protéines que ce soit dans des populations neuronales qui se chevauchent ou distinctes. Ces manipulations mettent en évidence la souplesse de l'approche, mais nous croyons que nous avons juste gratté la surface de son potentiel. La disponibilité croissante de hors-the-shelf réactifs, il sera plus facile de développer virale injection fou de nouveaux besoins expérimentaux, tandis que l'émergence de sérotypes hybrides avec tropismes distincts peut élargir le répertoire cellulaire qui peuvent être ciblés 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
