Abstract
Mit dem Tempo der wissenschaftlichen Fortschritt zu beschleunigen schnell, werden neue Methoden zur experimentellen Neurowissenschaften benötigt, um die Genexpression im Gehirn von Mäusen schnell und einfach zu manipulieren. Hier beschreiben wir eine Technik zuerst von Passini und Wolfe für die direkte Lieferung von intrakraniellen viral-kodierte Transgenen in der Neugeborenen-Gehirn der Maus eingeführt. In seiner einfachsten Form benötigt das Verfahren nur einen Eiskübel und ein Mikroliter-Spritze. Jedoch kann das Protokoll auch für die Verwendung mit der stereotaktischen Rahmen angepasst ist, um Konsistenz für Forscher neu in der Technik zu verbessern. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit des Adeno-assoziierten Virus (AAV), frei von den Hirnkammern bewegen in das Hirnparenchym, während die ependymale Futter ist immer noch in der ersten 12-24 h nach der Geburt unreif. Intraventrikuläre Injektion von AAV in diesem Alter weit verbreitet Ergebnisse Übertragung von Nervenzellen im Gehirn. Ausdruck beginnt innerhalb weniger Tage der Injektion und hält für die lifetime des Tieres. Virustiter eingestellt werden, um die Dichte der transduzierten Neuronen steuern, während die Co-Expression eines fluoreszierenden Proteins ist eine notwendige Beschriftung der transduzierten Zellen werden. Mit der steigenden Verfügbarkeit von viralen Kernanlagen, sowohl off-the-shelf, abgepackte Reagenzien und individuelle Viruspräparat zu schaffen, bietet dieser Ansatz eine zeitnahe Verfahren zur Manipulation der Genexpression im Gehirn der Maus, die schnell, einfach und weit weniger teuer ist als traditionelle Keimbahntherapie.
Introduction
Traditionelle Methoden zur Modifizierung von neuronalen Genexpression erfordern zeitaufwendig und teuer Keimbahnmanipulationen. Alternative de novo-Ansätze wie in utero Elektroporation oder stereotaktische Injektion lentiviralen ergeben schnellere Ergebnisse und sind weniger teuer, haben aber den Nachteil, dass komplexe chirurgische Intervention 1-3. Darüber hinaus hat die Transgen-Expression einen begrenzten räumlichen Bereich mit diesen Methoden. Hier beschreiben wir eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode für die weit verbreiteten neuronalen Manipulation über intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierte Viren (AAV) in der Neugeborenen-Gehirn der Maus. Das Verfahren wurde von John Wolfe und Marco Passini 2001, wo sie vorgeschlagen kleinen Teilchengröße von AAV gestattet es, innerhalb des Rückenmarksflüssigkeit diffundieren, wie es geht aus den lateralen Ventrikel durch die unreifen Ependymzellen Schranke und in das Hirnparenchym 4, 5. Intraventrikuläre Injektion von AAV in der fIRST 24 Stunden nach der Geburt Ausbeuten verbreiteten viralen Transduktion von neuronalen Teilmengen spannt jede Region des Gehirns, von den Riechkolben des Hirnstamms 6,7. Viral geliefert Transgene exprimiert und innerhalb weniger Tage nach Injektion aktiv und bleiben bis zu einem Jahr nach Transduktion. Somit ermöglicht dieses vielseitige Manipulation von Studien der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Alterung und Degeneration in der Erwachsenen.
Bei der Anpassung der Technik für unsere spezielle experimentelle Bedürfnisse wir uns hauptsächlich auf AAV8 Serotyp konzentriert, weil es am effizientesten Wandler Neuronen 6. Wir zeigen, dass virale Titer verdünnt, um die Dichte der transduzierten Neuronen für Experimente Testzellengrenz Folgen genetische Manipulation zu steuern. Darüber hinaus zeigen wir, dass die beiden Viren konnte gemeinsam injiziert, um die Expressionsmuster, die in Richtung unterschiedliche oder überlappende Gruppen von Neuronen vorgespannt sind, zu erzeugen, in Abhängigkeit von den für die gewählte Serotypenvirale Verpackungs. Unsere Arbeit erweitert die Vielseitigkeit dieser Technik zum Einsatz in einem breiten Spektrum von experimentellen Neurowissenschaften-Einstellungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Führen Sie alle Verfahren und Protokolle mit Tieren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die hier beschriebenen Verfahren wurden überprüft und vom Baylor College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
Replikationsinkompetent Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für Trans Lieferung im Gehirn von Nagetieren sind für Biosafety Level 1 zugelassen. Finden Sie auf der CDC-Website für die US-Regierung die Veröffentlichung "Biosafety in Microbiology and Biomedical Laboratories (BMBL)", die besondere Anforderungen an einen angemessenen Schutz und Viren Verfahren für den Umgang Details. Bei den örtlichen Veterinär und Umweltsicherheit Personal an institutionelle spezifischen Anforderungen an Verfahren unter Verwendung von Viren zu lernen. Vorschriften über Verfahren Zimmer, Quarantäne, und die Identifizierung von Biohazard Käfige variieren in Institutionen.
1. Vorauspare P0 Pups und Pflegemütter
- Bieten hohen Fettfutter für alle schwangeren Frauen und still um den Energiebedarf der Zucht und Stillzeit zu unterstützen.
- In den Abend, die Einrichtung eines Zuchtkäfig, indem ein oder zwei gesunde Weibchen in den Käfig eines einzigen Wohnsitz männlich. Am folgenden Morgen, überprüfen Sie die Frauen für einen Gegenstecker, und trennen die Weibchen von den Männchen, wenn ein Stecker vorhanden ist.
- Verwenden Sie Pflegemütter zu Welpen von einem genetischen Hintergrund mit schlechten mütterlichen Eigenschaften (zB C57BL / 6 oder C3HeJ) zu erhöhen. Pflegemütter akzeptieren Welpen aus einem anderen Wurf, wenn die übertragenen Welpen werden innerhalb von vier Tagen von eigenen Wurf der Pflegemutter geboren.
- Eine separate Steck Käfig mit ICR oder FVB Frauen neben den experimentellen Züchter, so dass die beiden Gruppen von Frauen liefern in etwa die gleiche Zeit eingestellt.
- Weibchen werden in 19 ± 1 Tagen ab dem Stecker Termin zu liefern, abhängig von der Hintergrundstamm. Drei Tage vor delivery (16 Tage nach dem Datum Stecker), legen Sie die schwangere Frau in einen sauberen Käfig mit frischem Nistmaterial und eine überdachte Unterstand.
- Überprüfen Sie für neugeborene Welpen zweimal täglich ab 2 Tage vor dem voraussichtlichen Liefertermin (17 Tage nach dem Plug Datum). Untersuchen Sie den Käfig mit Mindest Stress für die Mütter von spähen durch den Boden auf die Anwesenheit von rosa Neugeborenen. Mäuse liefern in der Regel Jungtiere am Morgen, aber in seltenen Fällen wird am Nachmittag zu liefern.
- Planen, Injektionen durchführen, sobald die Welpen Krankenpflege (was sich durch sichtbare Milchflecken sein wird), oder innerhalb von 6 Stunden der Geburt, je nachdem, was zuerst eintritt.
2. Bereiten Sie Material für Injektion
- Bereiten Sie eine 10 ul Injektionsspritze mit einer 32 G-Nadel für allgemeine P0 Neugeborenen. Bei Durchführung stereotaktische Injektion, montieren Sie die Spritze auf die Manipulatorarmes.
- Bei Verwendung eines stereotaktischen Rahmen für Injektionszwecke, kühlen die Neugeborenen-Bühne, um 4-8 ° C durch Zugabe von 100% Ethanol und Trockeneis auf dem Behälter an dem vorderen Ende des Blocks. Die Temperatur über 1 ° C zu halten, um Erfrierungen der Jungtiere zu vermeiden.
3. Bereiten Viral Verdünnungen zur Injektion
- Bereiten Sie eine 1% Trypanblau-Lösung (20x Lager).
- Bereiten 5-25 ul Aliquots Adeno-assoziierte Viren (AAV) stock in einer Klasse 2 Biosicherheitswerkbank. Zeigen diese Aliquots bei -80 ° C für zukünftige Verwendung. Vermeiden Sie zusätzliche Frost-Tau-Zyklen, wie dies bewirkt, dass das Virus auf Übertragung Wirksamkeit zu verlieren.
- Entfernen Sie einen aliquoten Teil AAV aus dem -80 ° C Gefrierschrank und auf Eis zu tauen.
- Vorbereiten des viralen Injektionslösung durch Verdünnen des Virus in eiskaltes 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Beginnen mit einer zehnfachen Verdünnungsreihe (10. Oktober-10. August Viruspartikel / Hemisphäre) für die anfängliche Optimierung des Übertragungsmusters.
- Hinzufügen 20x Trypanblau in die AAV-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,05%.
- Legen Sie eine kleine Aluminiumplatte auf Eis abkühlen. Legen Sie ein trockenes Wischen Aufgabe auf der Platte, um die Haut des Welpen aus dem kalten Metall zu schützen. Dies dient als eine flache kalten Oberfläche für Anästhesie und Einspritzen der Welpen.
- Bereiten Sie eine Erwärmung Pad geeignet für die Aufbewahrung neugeborenen Mäusen warmen vor und nach der Injektion.
- Sobald die neugeborenen Welpen haben, Krankenschwester begonnen, entfernen Sie etwa die Hälfte von ihnen aus dem Käfig und lassen Sie die andere Hälfte bei der Mutter. Legen Sie die gesammelten Welpen auf dem Pad Erwärmung während der Warte Injektion.
HINWEIS: Wenn die biologische Mutter nicht für die Welpen kümmern, entfernen Sie die gesamte Streu aus dem Käfig sofort und setzen die Welpen auf eine Erwärmung Pad der Injektion zu erwarten. Diese Situation kann mit dem ersten Wurf zu C57BL / 6 Weibchen oder mit anderen Inzucht-Stämme, die schlechte Zucht Eigenschaften haben ergeben geboren. In dieser Situation wird Milchflecken nicht neugeborenen Jungen sichtbar. - Übertragen ein Junges von der Erwärmung Pad auf den kalten Metallplatte zu Unterkühlung Anästhesie zu induzieren. Warten Sie 2-3 Minuten für den Welpen voll narkotisierten zu werden. Anästhesie bestätigen sehr leicht zusammendrücken eine Pfote und Monitor für mangelnde Bewegung oder Atmung.
5. Die Injektion von AAV in neugeborenen Mäusen
- Freihand intrakranielle Injektion von AAV in neugeborenen Mäusen:
- Last 5 ul verdünnte AAV mit 0,05% Trypanblau in die Injektionsspritze.
- Wischen Sie den Kopf des narkotisierten Hund mit einem Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt.
- Identifizieren der Einspritzstellen an 2/5 der Abstand von der Lambda-Naht an jedes Auge. Eine Alternative Injektionsstelle befindet sich ca. 0,8-1 mm lateral von der Pfeilnaht, auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma. Diese Landmarken sind durch die Haut bei P0 sichtbar.
- Markieren Sie die Injektionsstelle mit einem nicht-toxischen Labor Stift.
- Halten Sie die Spritze mit der Skala für moni sichtbarchungs das Volumen der Lösung verteilt.
- Sicherzustellen, dass der Daumen die Oberseite des Kolbens zu erreichen. Dann entfernen Sie den Daumen vom Kolben während der Positionierung der Nadel zu vermeiden, versehentlich Abgabe Virus.
- Finden eine bequeme Position, um den Arm für die Injektion, indem Sie den Ellenbogen auf die Bank und lehnte den Arm auf dem Eis Eimer stemmen.
- Legen Sie den Welpen auf seiner Seite mit dem Kopf direkt unter der Spritze. Drehen Sie den Kopf des Welpen, so dass die markierten Injektionsstelle nach oben, und sanft, aber diese Position mit einer offenen Hand fest zu halten.
- Halten Sie die Spritze senkrecht auf der Oberfläche des Schädels und die Nadel an der markierten Injektionsstelle bis zu einer Tiefe von ca. 3 mm. Injizieren der Nadel, bis der Widerstand leicht abnimmt, was anzeigt, dass die Nadel in den lateralen Ventrikel eingedrungen. Wenn ein Referenz benötigt wird, markieren 3 mm von der Spitze der Nadel mit nicht-toxischen ausgestattet. Stellen Sie die Injektionstiefe für Welpen Größe und Belastung auf der Grundlage Farbstoff targeting der Ventrikel.
- Die Spritze fest, so dass der Kolben niedergedrückt wird, ohne den Nadel weiter in das Gehirn. Wenn die Injektion in den Thalamus verschoben wird, wird die Virusausbreitung stark eingeschränkt werden.
- Beginnen Sie langsam injizieren Virus während der Überwachung des Volumens aus der Spritze verzichtet. Verwalten ein Volumen von maximal 2 ul in jede Kammer. Wenn die Nadel in der richtigen Position, wird der Farbstoff zu verbreiten, um die Herzkammer zu füllen.
- Ziehen Sie langsam die Nadel.
- Lassen Sie die erste Injektionsstelle vor der Injektion zu der anderen Hemisphäre zu schließen.
HINWEIS: spritzen nicht der gleichen Stelle mehr als einmal. Wiedereinsetzen der Nadel Kräfte Virus, das bereits eingespritzt wurde austreten und verursacht Verletzungen oder zum Tod des Welpen. - Spritzen Sie die kontralateralen Ventrikel mit dem gleichen Verfahren.
- Stereotaktische Injektion von AAV in neugeborenen Mäusen:
- Last 5 ul verdünnte AAV mit 0,05% Trypanblau into der Injektionsspritze durch den stereotaktischen Manipulator statt.
- Legen sanft den Kopf des Welpen zwischen dem Ohr Bars von der Neugeborenen-Rahmen. Stellen Sie sicher, der Kopf ist Ebene in der Y-Achse (vorne nach hinten) durch Überprüfung, dass die Linie zwischen Lambda und Bregma parallel zur Bühne. Stellen Sie sicher, der Kopf ist in der Ebene X-Achse (Seite zu Seite), indem Sie, dass eine gedachte Linie zwischen den Ohren, oder eine Linie zwischen den Augen, ist parallel zu der Bühne.
- Wischen Sie den Kopf des narkotisierten Welpen mit einem Wattestäbchen in 70% Ethanol getränkt.
- Verwenden Sie den stereotaktischen Manipulator, um die Spritze oben Lambda positionieren und dann die Null X und Y-Koordinaten. Bewegen Sie die Arme, um stereotaktischen (X, Y) = (0,8, 1,5) mm für Standard-P0 Welpen.
HINWEIS: Pup Größe und stereotaktischen Koordinaten können durch den Stamm und Alter variieren. Einzustellen Koordinaten bezogen auf Farbstoff Injektionen benötigt, um die lateralen Ventrikel Ziel. - Langsam senken Sie die Nadel in der Injektionsstelle. Die Oberfläche des Schädels wird indHNO und dann freigeben, sobald die Nadel in die Haut eingedrungen ist. Kanüle zurückziehen, bis der Schädel wieder seine normale konkave Form, aber halten Sie die Abschrägung der Nadel unter die Haut. Null die Z-Koordinate an dieser Stelle.
- Führen Sie die Nadel bis Z = -1.7 mm und dann auf -1,5 mm zurückzuziehen.
- Langsam injizieren das Virus. Jede Hemisphäre bis zu 2 ul der Lösung annehmen.
- Halten Sie die Spritze in Platz für 30-60 Sekunden nach Abschluss der Injektion und dann langsam die Nadel über 1-2 min zurückzuziehen.
- Wiederholen der kontralateralen Hemisphäre mit negativen Koordinaten in der X-Achse für die Injektionsstelle.
HINWEIS: Alternative Koordinaten für die Injektion sind (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm und (1.2, 1.0, -1.5) mm. Führen Sie die erste Injektion bei (0,8, 2,0), dann zu (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) und schließlich (1.2, -1.0) zu bewegen. Injizieren 1 ul Lösung an jedem Ort, für eine Gesamtzahl von 2 ul pro Hemisphäre. Bewegen sich schnell zwischen den Injektionen, um das Verfahren in les vervollständigens als 10 min.
6. Post-Injektion Pflege
- Nach Abschluss Injektionen in beiden Hemisphären, legen Sie den Welpen wieder auf die Erwärmung Pad, bis seine Körpertemperatur und Hautfarbe, den normalen und der Welpe sich zu bewegen beginnt.
- Wenn Sie die biologische Mutter, die injiziert Neugeborenen stillen, kehren die injizierten Welpen auf die biologische Mutter, nachdem sie erholen normale Bewegung. Die restlichen nicht-injizierten Welpen auf die Warmhalteauflage. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Mäuse injiziert wurden.
- Wenn Sie eine Pflegemutter, um die injizierten Neugeborenen stillen, übertragen alle injiziert Welpen auf die Pflegemutter für die Pflege nach der sie sich erholen normale Bewegung.
- Entfernen Sie die meisten oder alle der Welpen, die zu der Pflegemutter aus dem Käfig, um den Erfolg der injizierten Tiere zu gewährleisten.
- Wenn Welpen Pflegemutter und injiziert Welpen haben die gleiche Augen-und Hautfarbe, markieren Welpen von der Pflegemutter mit einem Labor Stift so können siespäter aus.
- Zeigen Welpen der Pflegemutter und einige ihrer Betten zusammen mit den injizierten Welpen. Stellen Sie sicher, dass die eingespritzten Welpen erwerben den Duft ihres biologischen Nachkommen zur Verbesserung der Akzeptanz der neuen Welpen.
- Legen Sie nur die injizierten Welpen zurück in die Pflegemutter in den Käfig. Keulen alle verbleibenden Welpen von der Pflegemutter.
- Stellen Sie sicher, dass die Mutter zu Besuch und Pflege von Jungtieren die injizierten innerhalb von 10 min indem sie in den Käfig. Wenn die Mutter nicht die Welpen in dieser Zeit zu sammeln, zu übertragen Welpen zu einem anderen Pflegemutter.
- Beschriften Sie den Käfig mit einem Biohazard Karte zu zeigen, dass es viral-injizierten Tieren enthält. Haus der Käfig in einem zugelassenen Gebiet für 72 Stunden.
- Nach der Quarantänezeit 72 Stunden, übertragen Sie die Mutter und Welpen (aber kein Bettzeug oder andere Käfig Artikel) in einen sauberen Käfig. Führen Sie diese Übertragung innerhalb einer Ebene 2 Biosicherheitswerkbank, um die Exposition zu jeder viral kontaminierte Bettwäsche zu vermeiden. Return den sauberen Käfig mit den Tieren injiziert, um den normalen Maus Möglichkeiten.
- Legen Sie die schmutzigen Käfig in eine Tasche Biohazard, durch Autoklavieren sterilisieren und dann den Käfig, um das Vivarium.
7. Cleanup
- Die restlichen Virus-Lösung bei 4 ° C für die zukünftige Verwendung. Das Virus behält Transduktionseffizienz für mindestens 2 Monate bei 4 ° C 8 gespeichert.
- Desinfizieren der Injektionsnadel und Spritze mit 2% Bleiche, gefolgt von wiederholten Spülungen mit deionisiertem Wasser.
- Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 2% Bleichmittel, gefolgt von 70% Ethanol.
- Sammeln Sie alle Einwegartikel einschließlich Pipettenspitzen, Rohre, Maske und Handschuhe in einem Kunststoffbeutel Biohazard. Die Entsorgung des geltenden Rechts und institutionelle Politik (dh Autoklaven oder verbrennen) erforderlich.
8. Bereiten Maus Brains for Imaging
- Ein injiziert Maus in einer Kohlendioxid-Euthanasie Kammer bei 34 Wochen nach der Injektion. Folgen institutionellen Richtlinien für die richtige Euthanasie Verfahren. Tiere Perfusion nicht mit Paraformaldehyd, da dies die Fluoreszenzmarkierung zu löschen.
- Entfernen Sie die gesamte Gehirn aus dem Schädel und fixieren für 3-12 h in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die Fest Gehirn zu 30% Saccharose für Gefrierschutz. Inkubieren bei 4 ° C, bis das Gehirn zu Boden sinkt.
- Sammeln Sie einen Eimer mit fein gemahlen Trockeneis. Schneiden Sie das Gehirn in der Hälfte auf der Mittellinie. Begraben die Gehirnhälften in der Trockeneis zu frieren.
- Kühlen Sie die Mikrotom Stufe durch Zugabe von Trockeneis und 100% Ethanol.
- Sichern Sie das Gehirn auf die Bühne mit der Mittellinie nach unten mit PBS und gefrieren lassen.
- Schnitt durch das Gehirn bei 30-45 um Dicke mit einem Gefrierpunkt Schlittenmikrotom.
- Ort Abschnitte in 24-Well-Platten, die Frostschutzmittellösung (250 ml Glycerin, 300 ml Ethylenglykol, 500 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4). Abdeckplatten with Alufolie und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.
- Sammeln Abschnitte 1-4 Brunnen und waschen 3x in PBS.
- Mount-Schnitte auf Objektträger und Deckglas. Die Objektträger dürfen einen dunklen Ort trocknen.
- Bild Folien mit entsprechenden Filtern für native YFP oder tdTomato, um das Virus Übertragungsmuster zu überprüfen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erfolgreiche intraventrikuläre Injektion Virusausbeuten weit verbreitet und robuste neuronale Ausdruck. Hier untersuchten wir die virale Transduktion unter Verwendung von YFP oder tdTomato fluoreszierende Gene unter der Kontrolle von Hühner beta-Aktin-Promotor (CBA-Promotor). Diese Konstrukte wurden in AAV8 verpackt und in die lateralen Ventrikel von neonatalen (P0) ICR-Mäusen injiziert. Hohe virale Titer (10 10 Partikel pro Hemisphäre) ergab dichte Markierung des Riechkolbens, Striatum, Großhirnrinde, Hippocampus und Cerebellum (1A links). Markierung war auch offensichtlich in zerebellären Purkinje-Neuronen, aber von Kleinhirnkörnerzellen, die noch nicht in großen Stückzahlen P0 vorhanden sind vor allem fehlt. Injektion von weniger Viruspartikel (10 7) führte zu spärlich Kennzeichnung und geringere Intensität Ausdruck (1A, rechts). Wir verwenden häufig AAV8 in einem Konzentrationsbereich zwischen 10 7 und 10 10 Teilchen pro Hemisphäre als n einfache und zuverlässige Möglichkeit, den Grad der durch Injektion (Abbildung 1B) hergestellt Transgen Mosaik steuern. Wir haben auch mit Hilfe dieser Technik mehrere Transgene durch Co-Injektion von zwei oder mehr Viren exprimieren. Co-Injektion von zwei Viren in der gleichen Serotyp verpackt (dh sowohl AAV8) spannt die resultierende Übertragungs überlappende neuronale Populationen, so dass viele Zellen exprimieren beide Transgene (2A). Bei geringeren Konzentrationen, die Expressionsmuster werden unabhängiger, und der Anteil der Co-markierten Zellen verringert wird (2B). Nicht überlappende Expression kann auch durch Co-Injektion von unterschiedlichen AAV-Serotypen erreicht werden. Co-Injektion von AAV1 und AAV8 kodiert unterschiedlichen fluoreszierenden Reportern erzeugt eine weitgehend unabhängige Muster von Dual-Mosaik (2C).
ig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Abbildung 1. Virale Titer verwendet werden, um die Dichte der Virusübertragung zu steuern. (A) Eine breite Palette von Transgen-Mosaik kann durch Verdünnung der Viruslösung von 10 10 bis 10 7 Partikel / Hemisphäre erreicht werden. Repräsentative Bilder von Sagittalschnitten zeigen zwei verschiedene Übertragungsmuster basierend auf virale Titer. Bilder wurden von Mäusen geerntet 3 Wochen nach der Injektion mit AAV8-YFP zu liefern genommen 2,0 x 10 10 (links) oder 5,0 x 10 7 (rechts) Partikel / Hemisphäre. (B) Höhere Vergrößerung der Bilder Hirnrinde (obere Reihe) und Kleinhirn ( untere Reihe) zeigen das Spektrum der Trans Mosaik durch serielle Verdünnung von AAV8 erreicht. Transduktion von Mutter YFP-Fluoreszenz sichtbar. Belichtungszeiten für ganze Gehirn Bilder wurden von der Hirnrinde und im Hippocampus, die am hellsten fluoreszieren bestimmt, während Belichtungszeiten für das vergrößerte Platten wurden angepasst, um Muster innerhalb jeder r zeigenegion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Titer und Serotyp unabhängig steuern den Grad der viralen Co-Expression. Repräsentative Bilder zeigen die Übertragungsmuster in Großhirnrinde (A, B) und Kleinhirn (C) 3 Wochen nach der Virusinjektion. (A) Co-Injektion von zwei AAV8 Viren, die verschiedenen fluoreszierenden Reporter (tdTomato oder YFP) hergestellt umfangreiche Übertragung im Gehirn. Die Mehrheit der transduzierten Zellen exprimiert beider Transgene. (B) Co-Injektion der gleichen Viren bei niedrigeren Titern produziert spärlich Expression jedes Proteins, wobei weniger Zellen wurden mit beiden Viren transduziert. (C) Co-einspritzenIon von AAV in verschiedene Serotypen (AAV8 und AAV1) verpackt, auch bei mäßig hohen Titern produziert eine weitgehend nicht-überlappenden Muster der viralen Expressions. Das Muster der einzelnen fluoreszierenden Proteins war fast identisch mit dem Ausdruck, wenn sie allein eingespritzt wird, die anzeigt, dass eine Transduktion von AAV ist unabhängig von der anderen. TdTomato Fluoreszenz in rot, YFP in grün dargestellt. Übertragung wird durch native Fluoreszenz sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben ein vielseitiges Verfahren zum Manipulieren von neuronalen Genexpression unter Verwendung von AAV als Vehikel für die Abgabe in den weit verbreiteten neonatalen Maushirn beschrieben. Im Vergleich zu anderen Methoden der neuronalen Transgenese wie in utero Elektroporation 1 oder stereo intrakranielle Injektion 2,3 ist neonatalen viralen Injektion relativ einfach und unkompliziert. Die grundsätzliche Vorgehensweise ist in wenigen Minuten mit nur einem Eiskübel und ein Mikroliter-Spritze durchgeführt werden. Optimale Überleben und Transgen-Expression kann durch den Besuch auf wenige technische Details erreicht werden kann, die wichtigsten sind die Qualität des viralen Aktien, das Timing und die Genauigkeit der Injektion, und die postnatale Betreuung.
Die Qualität der viralen Vorbereitung ist entscheidend für eine erfolgreiche Transduktion. Bad viralen Vorbereitungen neuronalen Infektiosität deutlich verringern und erzeugen erhebliche Astrozyten Übertragung, möglicherweise durch Phagozytose von nicht-infektiösen Partikeln. Viele Universitätenhaben Kernlabors vor Ort, die in virale Verpackungs spezialisiert und große Einrichtungen an der Universität von North Carolina und der University of Pennsylvania bieten hochwertige off-the-shelf-Reagenzien in einer Vielzahl von Serotypen bei reduzierten Kosten. Diese Einrichtungen bieten auch maßgeschneiderte Verpackungen für Vektoren, die nicht als abgepackte Bestände verfügbar sind. Einmal in das Labor erhalten, denken Sie daran, dass AAV-Partikel können stabil bei -80 ° C betragen seit Jahren, aber sehr empfindlich auf Temperaturschwankungen. Aus diesem Grund sollte Aliquots bei -80 ° C gelagert werden und sollte nicht wieder eingefroren einmal aufgetaut werden.
Für höchste Übertragungseffizienz ist es wichtig, Virus so schnell wie möglich einzuspritzen nach Welpen geliefert werden. Basierend auf unseren Studien mit AAV8 und die unserer Mitarbeiter, verzögern die Injektionen nicht nur vermindert die Ausbreitung des Virus aus der Herzkammer, sondern auch die Weiterleitung von vorspannen Neuronen Astrozyten 6,7. Daher empfehlen wir INJEKTIERTng am Tag der Geburt für eine optimale neuronale Ausdruck. In diesem Alter - Viruspartikel in den lateralen Ventrikel injiziert wird während der ventrikulären System diffundieren und folgen Sie dann den Fluss der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit in das Gehirn 4 - vor den Liquor-Hirn-Schranke hat 9 gereift. Folglich ist eine präzise Ausrichtung der lateralen Ventrikel kritisch für die Virusausbreitung zu maximieren. Genaue Ausrichtung minimiert auch Gewebeschäden von der schnellen Injektion einer relativ großen Flüssigkeitsvolumen. Daher empfehlen wir dringend, wiederholte Praxis, bis die Ziel lateralen Ventrikel wird zuverlässig und reproduzierbar. Beachten Sie, dass die Koordinaten in diesem Protokoll vorgesehen sind für die allgemeine P0 Welpen geeignet und sollte für den Stamm und Alter der Versuchs Welpen angepasst werden. Zunächst sollten die Injektionen mit Farbstofflösungen, wie Trypanblau oder Tusche durchgeführt werden, so dass die Ausrichtung und die Ausbreitung durch Ernten des Gehirns unmittelbar nach der Injektion sichtbar gemacht werden. Ichf Seitenventrikel erfolgreich gezielt wurde, wird der Farbstoff in den ventrikulären Kammern verteilt und werden sichtbar den ganzen Weg von den Riechkolben des Kleinhirns. Eine stereotaktischen Gerät wird empfohlen, wenn die Herzkammern nicht zuverlässig durch Freihandinjektion richtet sein.
Wenn die Injektionen korrekt durchgeführt werden, hat der Anteil an Mäusen Injektion unerheblich. Stattdessen wird die Überlebensrate nach der Injektion am meisten von mütterlicher Fürsorge betroffen. Beginnen Sie mit gesunden Tieren. Gesundheit der Mutter wird von ihrem Verhalten und ihren Mantel angedeutet. Sie sollte gut gepflegt und sauber. Die Wurfgröße kann auch ein Hinweis auf das Wohlbefinden sein. 8 Welpen für C57BL / 6 oder 10 - - 16 Welpen für ICR gesunden jungen Frauen sollte Würfe von 6 zu produzieren. Gesunde Welpen sollte rosa sein und Wackel. Wenn Welpen sehen nicht gut aus oder haben keine Milch Fleck auf dem Bauch, sollten sie zu einer neuen Pflege weiblichen sofort übertragen werden. Wir empfehlen ICR oder FVB für die Förderung, weilsie produzieren viel Milch und ohne neuen Welpen in ihr Wurf zu akzeptieren. Es ist zwingend notwendig, dass Störungen in der Mutter vor minimiert und nach den Injektionen Stress kann dazu führen, sie abzulehnen oder zu kannibalisieren die Welpen. Stressoren zu reduzieren indem Lärm, Licht, und andere Störungen und halten den Käfig in einem ruhigen Ort. Öffnen Sie den Käfig so wenig wie möglich bei der Suche nach neugeborenen Welpen und in den ersten Tagen nach der Injektion, aber es ist wichtig, die Aufmerksamkeit der Mutter auf die Welpen zu überwachen, wenn sie ersetzt werden. Die Mutter sollte angeborenen Verhaltensweisen wie Bündeln die Welpen an einem Ort und sitzt oben auf dem Stapel der Nachkommen anzuzeigen. Wenn die Mutter nicht sofort reagieren, wenn die Welpen in den Käfig zurückkehrte, versuchen Sie erneut, die Welpen mit schmutzigen Bettwäsche und Nestmaterial aus ihrem Käfig mischen sicherstellen, dass sie ihren Duft erworben. Prüfen Sie es später noch einmal am Tag, dass die Welpen noch Milch Flecken auf dem Bauch. Wenn möglich, tun dies, indem Sie in den Käfig ausunter eher als das Öffnen der Käfig von oben. Die ersten Tage am kritischsten für das Überleben, sondern auch, wenn das Weibchen am empfindlichsten auf Störungen sein.
Wenn sorgfältig durchgeführt, bietet intraventrikuläre Injektion AAV Sie schnell und einfach mittels Manipulation der neuronalen Genexpression in vivo, ohne die Kosten und die Zeit der traditionellen Keimbahntransgenese. Der gebürtige Mosaik von Virusübertragung kann genutzt werden, um die Dichte des Ausdrucks zu kontrollieren, ist es ein idealer Ansatz für die Experimente zur Zell-und Zell-Eigen extrinsische Folgen der Transgenese zu trennen. Darüber hinaus können zwei Viren co-injiziert, die es ermöglichen, mehrere Proteine in überlappten oder verschiedene Neuronenpopulationen exprimieren. Diese Manipulationen unterstreichen die Flexibilität des Ansatzes, aber wir glauben, dass wir nur gerade die Oberfläche seines Potenzials zerkratzt. Die zunehmende Verfügbarkeit von off-the-shelf-Reagenzien wird es leichter, um virale Injektion f entwickelnoder neue experimentellen Anforderungen, während das Aufkommen von Hybrid-Serotypen mit ausgeprägten Tropismus kann die zelluläre Repertoire, das gezielt werden können 10,11 erweitern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
