Abstract
Med tempoet i den vitenskapelige framgang akselererer raskt, er nye metoder som trengs for eksperimentell nevrovitenskap å raskt og enkelt manipulere genuttrykket i musen hjernen. Her beskriver vi en teknikk først introdusert av Passini og Wolfe for direkte intrakraniell levering av viralt-kodede transgener inn i neonatal mus hjernen. I sin mest grunnleggende form, fremgangsmåten krever bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Imidlertid kan protokollen også tilpasses for bruk med stereotaksiske rammer for å forbedre konsistens for forskere nye å teknikken. Metoden er avhengig av evnen av adenoassosiert virus (AAV) til å bevege seg fritt fra cerebral ventrikkel inn i hjernen parenchyma mens ependymal foring fremdeles er umoden under den første 12-24 timer etter fødselen. Intraventrikulært injeksjon av AAV i denne alderen fører til utbredt transduksjon av nerveceller i hele hjernen. Expression begynner innen dager etter injeksjon og vedvarer for lifetime av dyret. Viral titer kan justeres for å kontrollere tettheten av transduserte neuroner, mens ko-ekspresjon av et fluorescerende protein gir en viktig etikett av transduserte celler. Med den økende tilgjengeligheten av viruskjernefasiliteter for å gi både off-the-sokkel, pre-pakket reagenser og tilpassede viral forberedelse, denne tilnærmingen gir en betimelig metode for å manipulere genuttrykket i musen hjernen som er rask, enkel og langt rimeligere enn tradisjonelle germline engineering.
Introduction
Tradisjonelle metoder for å endre nevrale genuttrykk krever tidkrevende og dyre germline manipulasjoner. Alternativt de novo tilnærminger, for eksempel in utero elektroporering eller stereotaksisk injeksjon lentiviral gi raskere resultater og er mindre kostbare, men har den ulempe at det krever kompliserte kirurgiske inngrep 1-3. Videre er transgene ekspresjon en begrenset romlig rekkevidde med disse metodene. Heri beskriver vi en rask, enkel og økonomisk metode for utbredt neuronal manipulasjon via intraventrikulært injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) i neonatal mus hjernen. Metoden ble først beskrevet av John Wolfe og Marco Passini i 2001, der de foreslo liten partikkelstørrelse på AAV latt det diffuse i cerebrospinalvæsken når den passerer fra sideventriklene gjennom umoden ependymal barriere og inn i hjernen parenchyma 4, 5. Intraventrikulær injeksjon av AAV i first 24 timer etter fødselen avkastning utbredt viral transduksjon av nevrale undergrupper spenner hver region av hjernen, fra olfactory pærer til hjernestammen 6,7. Viralt-levert transgener uttrykkes og aktiv innen dager etter injeksjon og vare i opptil et år etter transduksjon. Dermed gjør denne allsidige manipulasjon studier som spenner fra tidlig postnatal utvikling av hjernen til aldring og degenerasjon i den voksne.
I å tilpasse teknikken til våre spesifikke eksperimentelle behov, har vi fokusert primært på AAV8 serotype fordi det er den mest effektive på transducing nevroner seks. Vi viser at viral titer kan fortynnes for å styre tettheten av transduserte neuroner for eksperimenter testcelle iboende konsekvenser av genetisk manipulering. I tillegg, viser vi at to virusene kan bli ko-injiseres for å oppnå uttrykk mønstre som er forutinntatt mot distinkte eller overlappende sett av nevroner, avhengig av serotypene som er valgt forviral emballasje. Vårt arbeid utvider allsidigheten til denne teknikken til bruk i et bredt spekter av eksperimentelle nevrovitenskap innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utfør alle prosedyrer og protokoller som involverer dyr i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Prosedyrene som beskrives her ble gjennomgått og godkjent av Baylor College of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité.
Replication-inkompetent adenoassosiert virus (AAV) vektorer for transgenet levering i gnager hjernen er godkjent for biosikkerhet Level 1 bruk. Referere til CDC nettsted for den amerikanske regjeringen publikasjonen "biosikkerhet i mikrobiologi og Biomedical Laboratories (BMBL)" hvilke detaljer spesifikke krav til riktig beskyttelse og virus håndteringsprosedyrer. Sjekk med lokal veterinær og miljømessig sikkerhet ansatte til å lære institusjonelle spesifikke krav til prosedyrer ved hjelp av virus. Forskrift om prosedyre rom, karantene, og identifisering av biohazard bur varierer på tvers av institusjoner.
1. PrePare P0 Pups og Foster Mothers
- Gi høy fett chow for alle gravide og ammende kvinner å støtte energibehov av avl og amming.
- På kvelden satt opp en avl bur ved å legge til en eller to friske kvinner til buret av en enkelt beboer hann. Følgende morgen, sjekk hunnene for en parring pluggen og skille kvinner fra menn hvis en plugg er til stede.
- Bruk fosterbarn mødre å heve valper fra en genetisk bakgrunn med dårlige morsegenskaper (for eksempel C57BL / 6 eller C3HeJ). Foster mødre godta valper fra et annet kull hvis de overførte valpene er født innen fire dager etter fostermor egen søppel.
- Sett opp en egen parring bur ved hjelp av ICR eller FVB hunner sammen med de eksperimentelle oppdrettere slik at de to settene med hunner levere omtrent på samme tid.
- Hunner vil levere på 19 ± 1 dager fra pluggen dato, avhengig av bakgrunns belastning. Tre dager før delivery (16 dager etter at pluggen dato), plasser den gravide kvinne i en ren bur med frisk reirmateriale og en overbygd ly.
- Sjekk for nyfødte valper to ganger daglig med start to dager før forventet leveringsdato (17 dager etter at pluggen dato). Undersøk bur med minimum stress til mødrene ved å kikke gjennom bunnen for tilstedeværelse av rosa nyfødte. Mus generelt levere unger i morgen, men i sjeldne tilfeller vil levere i ettermiddag.
- Planlegg å utføre injeksjonene så snart valpene er sykepleier (som vil være tydelig med synlige melk flekker), eller innen seks timer av fødselen, avhengig av hva som kommer først.
2. Klargjør utstyr for injeksjon
- Forbered en 10 mL sprøyte med en 32 G nål for generelle P0 nyfødte. Hvis du utfører stereotaxic injeksjon, montere sprøyten på manipulator arm.
- Hvis du bruker en stereotaxic ramme for injeksjoner, kjøle nyfødtstadiet til 4-8 ° C ved å legge 100% ethanol og tørris til reservoaret ved den fremre ende av blokken. Oppretthold temperaturen over 1 ° C for å unngå frostskade på avkommet.
3. Forbered Viral Fortynninger for injeksjon
- Forbered en 1% trypanblått fargeløsning (20x lager).
- Forbered 5-25 mL porsjoner av adenoassosiert virus (AAV) lager inne i en klasse 2 biosikkerhet kabinett. Plasser disse alikvoter ved -80 ° C for senere bruk. Unngå flere fryse-tine-sykluser, da dette fører til at viruset til å miste transduksjon effekt.
- Fjern en delmengde av AAV fra -80 ° C fryser og legg på is å tine.
- Klargjør viral injeksjonsvæske ved fortynning av viruset inn i is-kald 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Begynn med en ti gangers seriell fortynning (oktober 10 til august 10 viruspartikler / halvkule) for innledende optimalisering av transduksjon mønster.
- Legg 20x trypan blått til AAV-løsning til en sluttkonsentrasjon på 0,05%.
- Plasser en liten aluminiumsplate på is for å kjøle. Plasser en tørr oppgave å tørke på toppen av platen for å beskytte pup hud fra den kalde metall. Dette fungerer som en flat kald overflate for bedøvelse og injisere valpene.
- Forbered en oppvarming pad egnet for å holde neonatal mus varm før og etter injeksjon.
- Når de nyfødte valpene har begynt å amme, fjerne om lag halvparten av dem fra buret og la den andre halvparten med sin mor. Plasser de innsamlede valpene på varmepute i påvente injeksjon.
MERK: Hvis den biologiske moren har ikke omsorg for valpene, fjerne hele kullet fra buret umiddelbart og plassere valpene på en varmepute for å avvente injeksjon. Denne situasjonen kan oppstå med den første kull født til C57BL / 6 tisper eller med andre innavlede stammer som har dårlig avl egenskaper. I denne situasjonen, vil melk flekker ikke være synlig på nyfødte valper. - Overfør en valp fra oppvarming pad på den kalde metallplate for å indusere hypotermi anestesi. Vent 2-3 min for valpen å bli helt bedøvet. Bekreft anestesi ved svært forsiktig klemme en labb og overvåke for manglende bevegelse eller åndedrett.
5. Injeksjon av AAV inn Neonatal Mus
- Frihånd intrakranielle injeksjon av AAV inn neonatal mus:
- Laste 5 pl av fortynnet AAV med 0,05% trypan blå opp i injeksjonssprøyten.
- Tørk forsiktig hodet på bedøvet valp med en bomullsdott dyppet i 70% etanol.
- Identifiser injeksjonssteder på 2/5 av avstanden fra lambda sutur til hvert øye. Et alternativ injeksjonsstedet ligger ca 0,8-1 mm lateral fra sagittal sutur, halvveis mellom lambda og bregma. Disse landemerkene er synlige gjennom huden på P0.
- Marker injeksjonsstedet med en ikke-giftig laboratorium penn.
- Hold sprøyten med skalaen synlig for monikings volumet av løsningen utleveres.
- Kontroller at tommelen kan nå toppen av stempelet. Deretter fjerner tommelen fra stempelet samtidig posisjonerer nålen for å unngå utilsiktet utlevering av virus.
- Finn en behagelig stilling å spenne armen for injeksjon ved å sette albuen på benken og lener armen på isen bøtte.
- Legge valpen på sin side med hodet rett under sprøyten. Slå valpen hode slik at den merkede injeksjonsstedet vender opp, og forsiktig, men bestemt holde denne posisjonen med en åpen hånd.
- Hold sprøyten vinkelrett på overflaten av skallen og sett inn kanylen i den merkede injeksjonsstedet til en dybde på omtrent 3 mm. Injiser nålen inntil motstanden avtar litt, noe som indikerer at nålen har trengt inn i den laterale ventrikkel. Hvis en referanse er nødvendig, merke 3 mm fra spissen av nålen med ikke-toksiske trakter. Juster injeksjonsdybde for valpen størrelse og belastning basert på dye targeting av ventriklene.
- Hold sprøyten stivt, slik at stempelet kan bli trykket ned uten å bevege nålen lenger inn i hjernen. Hvis injeksjonen blir forskjøvet inn i thalamus, viral spredning vil bli sterkt begrenset.
- Begynner langsomt å injisere virus mens overvåking av volumet utlevert fra sprøyten. Administrer et maksimalt volum på 2 pl i hver ventrikkel. Hvis nålen er i riktig posisjon, vil fargestoff spre å fylle ventrikkel.
- Sakte trekke nålen.
- La første injeksjonsstedet for å lukke før injisere den andre halvkule.
MERK: Du må ikke injisere samme sted mer enn en gang. Sette inn nål krefter virus som allerede har blitt injisert å lekke ut og forårsaker skade eller død valp. - Injisere kontralateral ventrikkel ved hjelp av samme prosedyre.
- Stereotaksisk injeksjon av AAV inn neonatal mus:
- Laste 5 ul av fortynnet AAV med 0,05% trypan blå into injeksjonssprøyten holdt av stereotaxic manipulator.
- Forsiktig plassere valpen hode mellom øret barer av nyfødt rammen. Pass på at hodet er nivået i Y-aksen (foran til bak) ved å sjekke at linjen mellom lambda og bregma er parallell til scenen. Pass på at hodet er nivået i X-aksen (side til side) ved å kontrollere at en tenkt linje mellom ørene, eller en linje mellom øynene, er parallell til scenen.
- Tørk bedøvet valp hode forsiktig med en bomullsdott dyppet i 70% etanol.
- Bruk stereotaksisk manipulator for å plassere sprøyten ovenfor lambda og deretter nullstille X-og Y-koordinater. Flytt stereotaksiske armene til (X, Y) = (0,8, 1,5) mm for standard P0 valper.
MERK: Pup størrelse og stereotaksiske koordinatene kan variere fra belastning og alder. Juster koordinater basert på fargestoff injeksjoner som nødvendig for å målrette de laterale ventrikler. - Sakte senke nålen inn i injeksjonsstedet. Overflaten av hodeskallen vil indent og slipp når nålen har trengt inn i huden. Trekke nålen inntil skallen gjenvinner sin normale konkav form, men beholde skråkant av nålen under huden. Null Z koordinat på dette punktet.
- Sett nålen helt Z = -1.7 mm og deretter trekke til -1,5 mm.
- Sakte injisere viruset. Hver halvkule kan akseptere opp til 2 ul av løsningen.
- Oppbevar sprøyten i stedet for 30-60 sek etter fullført injeksjon og deretter sakte trekke nålen over 1-2 min.
- Gjenta for den kontralaterale halvkule, bruke negative koordinater i X-aksen for injeksjonsstedet.
MERK: Alternative koordinatene for injeksjon er (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm og (1.2, 1.0, -1.5) mm. Utfør første injeksjon på (0.8, 2.0), og deretter flytte til (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) og til slutt (1,2, -1,0). Injiser 1 ul oppløsning på hvert sted, for totalt 2 mL pr halvkule. Bevege seg raskt mellom injeksjoner for å fullføre prosedyren i less enn 10 min.
6. Post-injeksjon Care
- Etter å ha fullført injeksjoner i begge halvkuler, plasserer valpen tilbake på varmepute til sin kroppstemperatur og hudfarge tilbake til normal og valpen begynner å bevege seg.
- Hvis du bruker den biologiske moren å amme de injiserte nyfødte, returnere de injiserte valpene til den biologiske moren etter at de gjenopprette normal bevegelse. Plasser de rester uninjected unger på oppvarming pad. Gjenta prosedyren til alle mus har blitt injisert.
- Hvis du bruker et foster mor å amme de injiserte nyfødte, overføre alle injisert valper til fostermor for pleie etter at de gjenopprette normal bevegelse.
- Fjern mesteparten av eller alle de pups tilhører fostermor fra buret for å sikre suksess for de injiserte dyr.
- Hvis fostermorens valper og injisert valpene har det samme øyet og hudfarge, markere valper fra fostermor med et laboratorium penn slik at de kan væreskilles senere.
- Plasser fostermorens unger og noen av deres sengetøy sammen med de injiserte valper. Sørg for at de injiserte valpene skaffe duften av hennes biologiske avkom å forbedre aksept av de nye valpene.
- Plasser bare de injiserte valpene tilbake til fostermor bur. Innhente eventuelle gjenværende unger fra fostermor.
- Sørg for at mor skal behandle og pleie av injisert valpene innen 10 min for å plassere dem inn i buret. Hvis mor ikke henter valpene innen denne tiden, overføre valper til en annen fostermor.
- Merke bur med en biologisk-kort for å vise at den inneholder viralt-injisert dyr. Hus buret i et godkjent område for 72 timer.
- Etter 72 timer karantene periode, overføre mor og unger (men ikke sengetøy eller andre bur varer) til et rent bur. Utfør denne overføringen inne i en Nivå 2 biosikkerhet kabinett å unngå eksponering for noen viralt-forurenset sengetøy. Return den rene bur med de injiserte dyr til vanlig mus anlegget.
- Plasser skitne bur til et biologisk bag, sterilisere ved autoklavering, og deretter tilbake i buret til vivarium.
7. Cleanup
- Plasser gjenværende virus løsning ved 4 ° C for fremtidig bruk. Viruset beholder transduksjon effektivitet på minst 2 måneder når den lagres ved 4 ° C. 8..
- Desinfiser kanyle og sprøyte med 2% blekemiddel etterfulgt av gjentatte skyllinger i avionisert vann.
- Rengjør arbeidsområde med 2% blekemiddel etterfulgt av 70% etanol.
- Samle alle engangsartikler inkludert pipetter, rør, maske og hansker i en plast biohazard bag. Kvitt deg med avfall som kreves av lokal lovgivning og institusjonelle politikk (dvs. autoklav eller brennes).
8. Forbered Muse Brains for Imaging
- Plassere en mus injisert inn i en karbondioksid eutanasi kammer ved 3-4 uker etter injeksjon. Følg institusjonelle retningslinjer for korrekt eutanasi prosedyrer. Ikke perfuse dyr med paraformaldehyd, da dette vil slukke fluorescensen etiketten.
- Fjern Hjernene fra skallen og fikse for 3-12 timer i 4% paraformaldehyde i PBS ved 4 ° C.
- Overfør den faste hjerne til 30% sukrose for kryobeskyttelse. Inkuber ved 4 ° C frem til hjernen synker til bunns.
- Samle en bøtte med fint knust tørris. Skjær hjernen i halv ned midtlinjen. Bury hjernehalvdelene i tørris å fryse.
- Avkjøl mikrotom scenen ved å legge tørris og 100% etanol.
- Fest hjernen til scenen med midtlinjen ned ved hjelp av PBS, og la det fryse.
- Snitt gjennom hjernen på 30-45 mikrometer tykkelse ved hjelp av et fryse skyve mikrotom.
- Plasser seksjoner inn i 24-brønners plater inneholdende frostoppløsning (250 ml glyserol, 300 ml etylenglykol, 500 ml 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4). Gerikter with tinn folie og oppbevares ved -20 ° C for senere bruk.
- Samle seksjoner 1-4 brønner og vaske 3x i PBS.
- Mount seksjoner bort på objektglass og dekkglass. Tillat lysbilder til tørk på et mørkt sted.
- Bilde lysbilder ved hjelp av egnede filtre for native YFP eller tdTomato å kontrollere viruset transduksjon mønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket intraventrikulære viral injeksjon avkastning utbredt og robust neuronal uttrykk. Her har vi evaluert viral transduksjon bruker YFP eller tdTomato fluorescerende gener under kontroll av kylling beta aktin promoter (CBA promoter). Disse konstruksjonene ble pakket inn AAV8 og injiseres i sideventriklene av neonatal (P0) ICR mus. Høye virale titre (10 10 partikler per halvkule) resulterte i tett merking av luktelappen, striatum, cerebral cortex, hippocampus og lillehjernen (Figur 1a, til venstre). Merking var også tydelig i lillehjernen Purkinje nevroner, men spesielt fraværende fra lillehjernen granule nevroner som ennå ikke er til stede i stort antall på P0. Injeksjon av færre viruspartikler (10 7) resulterte i sparsom merking og lavere intensitet uttrykket (figur 1A, høyre). Vi bruker vanligvis AAV8 innenfor et konsentrasjonsområde på mellom 10 7 og 10 10 partikler per halvkule som en n enkel og pålitelig måte å styre graden av transgenet mosaicism produsert ved injeksjon (figur 1B). Vi har også tilpasset teknikken til å uttrykke flere transgener ved samtidig injisere to eller flere virus. Samtidig injeksjon av to virus pakket inn i den samme serotype (dvs. både AAV8) forspenner den resulterende transduksjon til overlappende neuronale populasjoner, slik at mange celler uttrykker begge transgener (figur 2A). Ved lavere konsentrasjoner, de uttrykk mønstre blir mer uavhengig, og andelen av co-merkede celler blir redusert (figur 2B). Ikke-overlappende uttrykk kan også oppnås ved co-injisere ulike AAV serotyper. Co-injeksjon av AAV1 og AAV8 koding forskjellige fluorescerende journalister produserer en stor del uavhengig mønster av dual-mosaikk (figur 2C).
ig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1. viral titer kan bli brukt til å kontrollere tettheten av viral transduksjon. (A) Et bredt spekter av transgenet mosaicism kan oppnås ved fortynning av den virale løsning fra 10 10 ned til 10 7 partikler / halvkule. Representative bilder av sagittal avsnittene viser to forskjellige transduksjon mønstre basert på viral titer. Bilder ble tatt fra mus høstet tre uker etter injeksjon med AAV8-YFP å levere 2,0 x 10 10 (venstre) eller 5,0 x 10 7 (høyre) partikler / halvkule. (B) høyere forstørrelse bilder av cortex (øverste rad) og lillehjernen ( nederste rad) viser spekteret av transgenet mosaicism oppnås ved seriell fortynning av AAV8. Transduksjon er visualisert av innfødte YFP fluorescens. Eksponeringstiden for hele hjernen bildene ble bestemt av cortex og hippocampus, som fluoresce kraftigst, mens eksponeringstider for de forstørrede panelene ble justert for å vise mønstre innenfor hvert region. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Titer og serotype uavhengig kontrollere graden av viral ko-ekspresjon. Representative bildene viser transduksjon mønster i cerebral cortex (A, B) og cerebellum (C) 3 uker etter virusinjeksjon. (A) Samtidig injeksjon av to AAV8 virus som inneholder ulike fluorescerende journalister (tdTomato eller YFP) produsert omfattende transduksjon hele hjernen. Flertallet av transduserte celler uttrykt både transgener. (B) Co-injeksjon av samme virus ved lavere titere fremstilt sparsom ekspresjon av hvert protein, der færre celler ble transdusert av begge virus. (C) co-injisereion av AAV pakket inn i forskjellige serotyper (AAV8 og AAV1), selv ved moderat høye titere, produserte et stort sett ikke-overlappende mønster av viral ekspresjon. Mønsteret av hver fluorescerende protein var nesten identisk til sitt uttrykk når injisert alene, noe som indikerer at transduksjon av en AAV er uavhengig av den andre. TdTomato fluorescens vises i rødt, YFP i grønt. Transduksjon er visualisert av innfødte fluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en allsidig fremgangsmåte for manipulering av neuronal genekspresjon ved å bruke AAV som et redskap for utbredt levering inn i den neonatale mus hjernen. Sammenlignet med andre fremgangsmåter for neuronal transgenesis som in utero elektroporering eller en stereotaksisk intrakranial injeksjon 2,3, er forholdsvis lett og enkelt viral neonatal injeksjon. Den grunnleggende fremgangsmåten kan utføres i løpet av minutter med bare en is bøtte og en mikroliter sprøyte. Optimal overlevelse og transgene uttrykk kan oppnås ved å delta på noen tekniske detaljer, det viktigste er kvaliteten på viral aksjer, timingen og nøyaktigheten av injeksjon, og post-natal omsorg.
Kvaliteten av viral preparatet er kritisk for vellykket transduksjon. Bad virale preparater vil i betydelig grad redusere neuronal infektivitet og produsere betydelige astrocytic transduksjon, muligens ved fagocytose av ikke-infeksiøse partikler. Mange universiteterhar kjerne laboratorier på stedet som spesialiserer seg på viral emballasje, og store anlegg ved University of North Carolina og University of Pennsylvania tilbyr høy kvalitet off-the-sokkel reagenser i en rekke serotyper til reduserte kostnader. Disse anleggene også gi tilpasset emballasje for vektorer som ikke er tilgjengelig som pre-pakket aksjer. Når mottatt i laboratoriet, husk at AAV partikler kan være stabil i mange år ved -80 º C, men er svært følsomme for temperatursvingninger. Av denne grunn bør alikvoter lagret ved -80 ° C og bør ikke fryses på nytt igjen etter tining.
For høyeste transduksjon effektivitet, er det avgjørende å injisere viruset så snart som mulig etter at valpene er levert. Basert på våre studier med AAV8 og de av våre samarbeidspartnere, som forsinket injeksjoner ikke bare reduserer spredningen av virus fra ventrikkelen, men vil også skjevhet transduksjon fra nerveceller til astrocytter 6,7. Derfor anbefaler vi injecting på dagen av fødselen for optimal nevronale uttrykk. I denne alderen - før cerebrospinal fluid-hjerne barrieren har modnet 9 - viruspartikler injiseres inn i den laterale ventrikkel vil diffundere gjennom den ventrikulære systemet og deretter følge med strømmen av spinalfluid inn i hjernen 4. Følgelig er nøyaktig målretting av den laterale ventrikkel kritisk for å maksimere viral spredning. Nøyaktig målretting også minimaliserer vevsskade fra hurtig injeksjon av et relativt stort volum av væske. Derfor anbefaler vi sterkt gjentatte praksis til målretting sideventriklene blir pålitelig og reproduserbar. Merk at koordinatene i denne protokollen er aktuelle for generelle P0 valper og bør justeres for belastningen og alder eksperimentelle valper. I første omgang skal injeksjonene utføres med fargestoff-løsninger, slik som trypan blå eller tusj, slik målretting og spredningen kan visualiseres ved å høste hjernen umiddelbart etter injeksjon. Jegf sideventriklene har blitt rettet, vil fargestoff spredt over hele ventrikkelkamrene og være synlig hele veien fra luktelappen til lillehjernen. En stereotaxic enhet anbefales hvis ventriklene ikke kan bli pålitelig målrettet av frihånds injeksjon.
Hvis injeksjonene utføres på riktig måte, mistet andelen av mus til injeksjon vil være ubetydelig. I stedet er overlevelsesraten etter injeksjon mest påvirket av mors omsorg. Begynn med friske dyr. Mors helse er angitt med hennes oppførsel og kåpen. Hun bør være godt preparerte og ren. Den kullstørrelse kan også være en indikasjon på trivsel. Friske unge kvinner skal produsere kull på 6 - 8 valper for C57BL / 6, eller 10 - 16 valper for ICR. Sunne valper bør være rosa og uregelmessige. Dersom valpene ikke ser godt eller har ingen melk flekk på magen sin, bør de bli overført til et nytt fosterhjem kvinnelige umiddelbart. Vi anbefaler ICR eller FVB for å fremme fordide produserer rikelig melk og lett akseptere nye valper i deres søppel. Det er viktig at forstyrrelser for moren er minimert før og etter injeksjoner som stress kan føre henne til å avvise eller kannibaliserer valpene. Redusere stressfaktorer ved å begrense støy, lys og andre forstyrrelser og holde buret i et rolig sted. Åpne buret så lite som mulig når du sjekker for nyfødte valper og i de første dagene etter injeksjon, selv om det er viktig å overvåke morens oppmerksomhet til valpene når de er erstattet. Moren skal vise medfødte atferd som bunching valpene på ett sted og sitter oppå haug av avkom. Hvis mor ikke reagerer umiddelbart når valpene er tilbake til buret, prøv igjen å blande unger med skitne sengetøy og reirmateriale fra buret hennes sikre at de har tilegnet hennes duft. Sjekk igjen senere på dagen at valpene har fortsatt melk flekker på buken. Hvis det er mulig, gjør dette ved å se inn i buret fraunder stedet for å åpne buret ovenfra. De første dagene er mest kritisk for å overleve, men også når den kvinnelige vil være mest følsomme for avbrudd.
Når gjort nøye, gir intraventricular AAV injeksjon en rask og enkel måte å manipulere neuronal genekspresjon in vivo uten kostnader og tid for tradisjonell germline transgenesis. De innfødte mosaicism av viral transduksjon kan bli brukt til å kontrollere tettheten av uttrykket, noe som gjør det til et ideelt tilnærming for eksperimenter for å skille celle-egenverdi og celle ytre konsekvenser av transgenesis. I tillegg kan to virus være ko-injisert som gjør det mulig å uttrykke flere proteiner i enten overlappende eller adskilte neuronale populasjoner. Disse manipulasjoner markere fleksibiliteten i tilnærmingen, men vi tror vi har bare skrapet overflaten av sitt potensial. Den økende tilgjengeligheten av off-the-sokkel reagenser vil gjøre det enklere å utvikle viral injeksjon feller nye eksperimentelle behov, mens fremveksten av hybrid serotyper med forskjellige tropisms kan utvide mobil repertoar som kan være målrettet 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
