Abstract
Con el ritmo de los avances científicos en rápida aceleración, se necesitan nuevos métodos de la neurociencia experimental para manipular rápida y fácilmente la expresión génica en el cerebro del ratón. Aquí se describe una técnica introducida por primera Passini y Wolfe para la entrega intracraneal directa de transgenes codificada por el virus en el cerebro del ratón neonatal. En su forma más básica, el procedimiento sólo requiere un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Sin embargo, el protocolo también se puede adaptar para su uso con los marcos estereotáxica para mejorar la consistencia de investigadores nuevos en la técnica. El método se basa en la capacidad del virus adeno-asociado (AAV) para moverse libremente de los ventrículos cerebrales en el parénquima cerebral, mientras que el revestimiento ependimario es todavía inmaduros durante las primeras 12-24 horas después del nacimiento. La inyección intraventricular de AAV en esta edad los resultados en la transducción generalizada de neuronas en todo el cerebro. Expresión comienza pocos días después de la inyección y persiste durante la lifetime del animal. Título viral se puede ajustar para controlar la densidad de las neuronas transducidas, mientras que la co-expresión de una proteína fluorescente proporciona una etiqueta vital de las células transducidas. Con la creciente disponibilidad de las instalaciones del núcleo viral para proporcionar reactivos tanto off-the-shelf, pre-envasados y preparación personalizada viral, este enfoque ofrece un método oportuno para la manipulación de la expresión génica en el cerebro del ratón que es rápido, fácil y mucho menos costoso que la ingeniería de línea germinal tradicional.
Introduction
Los métodos tradicionales para la modificación de la expresión de genes neuronales requieren tiempo y es costoso manipulaciones de la línea germinal. Alternativa de novo enfoques tales como la electroporación en el útero o la inyección estereotáxica lentiviral producir resultados más rápidos y son menos costosos, pero tienen la desventaja de requerir una intervención quirúrgica compleja 1-3. Además, la expresión transgénica tiene un rango espacial limitada con estos métodos. En este documento, se describe un método rápido, fácil, y económico para la manipulación neuronal generalizada a través de la inyección intraventricular de virus adeno-asociado (AAV) en el cerebro de ratón neonatal. El método fue descrito por primera vez por John Wolfe y Marco Passini en 2001, donde se sugirieron pequeño tamaño de partícula de AAV permitió que se difunda dentro del fluido espinal cerebral a medida que pasa desde los ventrículos laterales a través de la barrera ependimaria inmaduro y en el parénquima cerebral 4, 5. La inyección intraventricular de AAV dentro de la frimero 24 hr después de los rendimientos de nacimiento de transducción viral generalizada de subconjuntos neuronales que abarcan todas las regiones del cerebro, de los bulbos olfativos al tallo cerebral 6,7. Transgenes Virally entregados-se expresan y se activa a los pocos días de la inyección y persisten hasta por un año después de la transducción. Por lo tanto, esta manipulación versátil permite estudios que van desde el desarrollo del cerebro postnatal temprano con el envejecimiento y la degeneración en el adulto.
Al adaptar la técnica a nuestras necesidades experimentales específicos, nos hemos centrado principalmente en AAV8 serotipo debido a que es el más eficiente en la transducción de las neuronas 6. Se demuestra que el título viral se puede diluir para controlar la densidad de las neuronas transducidas para experimentos de prueba consecuencias de células intrínseca de la manipulación genética. Además, se demuestra que dos virus podrían ser co-inyectados para producir patrones de expresión que se polarizan hacia los conjuntos de neuronas distintas o coincidentes, dependiendo de los serotipos elegidas paraembalaje viral. Nuestro trabajo se expande la versatilidad de esta técnica para su uso en una amplia gama de parámetros experimentales neurociencia.
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Protocol
Realice todos los procedimientos y protocolos que involucran animales de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los procedimientos descritos aquí fueron revisados y aprobados por el Colegio Baylor de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
Virus adeno-asociado (AAV) vectores-de replicación incompetente para la entrega transgén en el cerebro de roedores están aprobados para el uso de Bioseguridad Nivel 1. Consulte el sitio web de los CDC para la publicación del Gobierno de Estados Unidos "Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomédicas (bmbl)", que detalla los requisitos específicos relativos a los procedimientos de protección y manejo de virus adecuados. Consulte con el personal local de seguridad veterinaria y ambiental para aprender los requisitos específicos institucionales para los procedimientos que utilizan los virus. Regulaciones con respecto a las salas de procedimientos, cuarentena, y la identificación de las jaulas de riesgo biológico varían a través de las instituciones.
1. Prepare P0 cachorros y madres adoptivas
- Proporcionar alta Chow grasa para todas las mujeres embarazadas y lactantes para apoyar las demandas de energía de la reproducción y la lactancia.
- Por la noche, configure una jaula de cría mediante la adición de una o dos mujeres sanas a la jaula de un solo macho residente. A la mañana siguiente, revise las hembras por un tapón de apareamiento y separar las hembras de los machos si un enchufe está presente.
- Utilice madres adoptivas para elevar cachorros de un fondo genético con características maternas pobres (por ejemplo, C57BL / 6 o C3HeJ). Madres adoptivos aceptan cachorros de otra camada si las crías nacen transferidos dentro de los cuatro días de la propia camada de la madre de crianza.
- Configurar una jaula separada de apareamiento usando ICR hembras o FVB junto a los criadores experimentales de modo que los dos conjuntos de las hembras dan a luz en aproximadamente el mismo tiempo.
- Las hembras se entregarán en 19 ± 1 días de la fecha de enchufe, dependiendo de la cepa de fondo. Tres días antes de la delivery (16 días después de la fecha de enchufe), coloque la mujer embarazada en una jaula limpia con material de nidificación fresco y un refugio cubierto.
- Compruebe si los cachorros recién nacidos dos veces al día a partir 2 días antes de la fecha probable de parto (17 días después de la fecha de enchufe). Examine la jaula con un mínimo de estrés a las madres por leerlo a través de la parte inferior de la presencia de los recién nacidos de color rosa. Los ratones generalmente entregan los cachorros en la mañana, pero en raras ocasiones se entregará en la tarde.
- Planifique para realizar inyecciones tan pronto como los cachorros están amamantando (que será evidente por manchas de leche visibles), o dentro de 6 horas de nacimiento, lo que ocurra primero.
2. preparación del equipo para la inyección
- Preparar una jeringa de inyección de 10 l con una aguja de 32 G para los recién nacidos P0 generales. Si se realiza la inyección estereotáxica, montar la jeringa en el brazo manipulador.
- Si usa un marco estereotáxico para inyecciones, enfriar la etapa neonatal a 4-8 ° C mediante la adición de 100% ethanol y hielo seco para el depósito en el extremo frontal del bloque. Mantener la temperatura por encima de 1 ° C para evitar la congelación de los cachorros.
3. Preparar diluciones virales para inyección
- Preparar una solución de 1% de colorante azul de tripano (20x de stock).
- Preparar 5-25 alícuotas de virus (AAV) stock adeno-asociado dentro de una cabina de bioseguridad de Clase 2. Coloque estas alícuotas a -80 ° C para su uso futuro. Evite los ciclos de congelación-descongelación adicionales ya que esto hace que el virus de perder la eficacia de transducción.
- Retire una parte alícuota de AAV del -80 ° C congelador y colocar en hielo para descongelar.
- Preparar la solución para inyección viral mediante la dilución del virus en solución salina enfriada con hielo 1x tamponada con fosfato (PBS). Comience con una dilución en serie de diez veces (10 10-agosto 10 partículas virales / hemisferio) para la optimización inicial del patrón de transducción.
- Añadir 20x azul de tripano a la solución de AAV a una concentración final de 0,05%.
- Coloque una placa de aluminio pequeña en hielo para enfriar. Depositar una tarea toallita seca en la parte superior de la placa para proteger la piel del cachorro desde el metal frío. Esto sirve como una superficie plana frío para anestesiar y la inyección de los cachorros.
- Preparar una almohadilla de calentamiento adecuado para mantener ratones recién nacidos caliente antes y después de la inyección.
- Una vez que los cachorros recién nacidos han comenzado a enfermera, eliminar aproximadamente la mitad de ellos de la jaula y dejar la otra mitad con su madre. Coloca los cachorros recogidos en la plataforma de calentamiento a la espera de la inyección.
NOTA: Si la madre biológica no se preocupa por los cachorros, retire toda la basura de la jaula de inmediato y colocar a los cachorros sobre un bloque de calentamiento a la espera de la inyección. Esta situación puede darse con la primera camada nacida en C57BL / 6 hembras o con otras cepas puras que tienen características pobres de reproducción. En esta situación, manchas de leche no serán visibles en los cachorros recién nacidos. - Transferir una cría de la almohadilla térmica sobre la placa de metal frío para inducir la anestesia hipotermia. Espere 2-3 minutos para que el cachorro se convierta en totalmente anestesiado. Confirmar anestesia apretando suavemente una pata y supervisar por falta de movimiento o respiración.
5. La inyección de AAV en ratones recién nacidos
- A mano alzada inyección intracraneal de AAV en ratones recién nacidos:
- Cargar 5 l de AAV diluyó con 0,05% de azul de tripano en la jeringa de inyección.
- Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un algodón empapado en alcohol al 70%.
- Identificar los sitios de inyección en 2/5 de la distancia desde la sutura lambda para cada ojo. Un sitio de la inyección alternativa se encuentra a unos 0,8-1 mm lateral de la sutura sagital, a medio camino entre lambda y bregma. Estos puntos de referencia son visibles a través de la piel en P0.
- Marcar el sitio de la inyección con una pluma de laboratorio no tóxico.
- Sostenga la jeringa con la escala visible para moniToring el volumen de solución dispensada.
- Asegúrese de que el pulgar puede llegar a la parte superior del émbolo. A continuación, retire el dedo pulgar del émbolo mientras se coloca la aguja para evitar que accidentalmente distribuir virus.
- Encontrar una posición cómoda para sujetar el brazo para la inyección al poner el codo sobre la mesa y se inclina el brazo en el cubo de hielo.
- Coloque el cachorro en su lado con su cabeza directamente debajo de la jeringa. Gire la cabeza del cachorro para que el lugar de la inyección marcada quede hacia arriba, y con suavidad pero con firmeza mantener esta posición con la mano abierta.
- Mantenga la jeringa perpendicular a la superficie del cráneo y inserte la aguja en el sitio de inyección marcada a una profundidad de aproximadamente 3 mm. Inyectar la aguja hasta que la resistencia disminuye ligeramente, lo que indica que la aguja ha penetrado en el ventrículo lateral. Si se necesita una referencia, marcar 3 mm de la punta de la aguja con el fabricante no tóxico. Ajuste la profundidad de la inyección para el tamaño de las crías y la tensión sobre la base de tinte targeting de los ventrículos.
- Mantenga la jeringa rígida de modo que el émbolo puede ser deprimido sin mover la aguja más lejos en el cerebro. Si la inyección se desplaza hacia el tálamo, la propagación viral se verá gravemente limitada.
- Comenzar a inyectar lentamente virus mientras se monitoriza el volumen dispensado de la jeringa. Administrar un volumen máximo de 2 l en cada ventrículo. Si la aguja está en la posición correcta, el colorante se extiende para llenar el ventrículo.
- Lentamente retire la aguja.
- Deje que el primer lugar de la inyección para cerrar antes de inyectar el otro hemisferio.
NOTA: No inyectar el mismo sitio más de una vez. Volver a insertar el virus fuerzas de aguja que ya ha sido inyectada a filtrarse y causa lesiones o la muerte del cachorro. - Inyectar el ventrículo contralateral usando el mismo procedimiento.
- Inyección estereotáxica de AAV en ratones neonatal:
- Cargar 5 l de AAV se diluyó con 0,05% azul de tripano into la jeringa de inyección en poder del manipulador estereotáxica.
- Coloque suavemente la cabeza del cachorro entre las barras del oído del marco neonatal. Asegúrese de que la cabeza es de nivel en el eje Y (de adelante hacia atrás) comprobando que la línea entre lambda y bregma es paralela a la etapa. Asegúrese de que la cabeza es de nivel en el eje X (lado a lado) comprobando que una línea imaginaria entre las orejas, o una línea entre los ojos, es paralela a la etapa.
- Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un algodón empapado en alcohol al 70%.
- Utilice el manipulador estereotáxica para colocar la jeringa por encima de lambda y luego cero las coordenadas X e Y. Mover los brazos estereotáxica a (X, Y) = (0,8, 1,5) mm para cachorros P0 estándar.
NOTA: El tamaño de las crías y las coordenadas estereotáxica puede variar por la tensión y la edad. Ajuste coordenadas basado en inyecciones de colorante según sea necesario para apuntar a los ventrículos laterales. - Lentamente baje la aguja en el sitio de la inyección. La superficie del cráneo se indent y suelte una vez que la aguja ha penetrado en la piel. Retraer la aguja hasta que el cráneo recupera su forma cóncava normal, pero mantener el bisel de la aguja debajo de la piel. Cero la coordenada Z en este punto.
- Inserte la aguja hasta Z = -1,7 mm y luego retractarse a -1,5 mm.
- Lentamente inyecte el virus. Cada hemisferio puede aceptar hasta 2 l de solución.
- Mantener la jeringa en su lugar durante 30-60 segundos después de completar la inyección y luego retraer la aguja lentamente durante 1-2 min.
- Repita el procedimiento para el hemisferio contralateral, utilizando coordenadas negativas en el eje X para el sitio de la inyección.
NOTA: Las coordenadas alternativos para la inyección son (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm y (1,2, 1,0, -1,5) mm. Realice la primera inyección en (0.8, 2.0), a continuación, pasar a (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) y, finalmente, (1,2, -1,0). Inyectar 1 l de solución en cada sitio, para un total de 2 l por hemisferio. Mueva rápidamente entre las inyecciones para completar el procedimiento en less de 10 min.
6. post-inyección Care
- Después de completar las inyecciones en ambos hemisferios, colocar el cachorro de nuevo en la almohadilla de calentamiento hasta que su temperatura corporal y color de la piel vuelva a la normalidad y el cachorro comienza a moverse.
- Si se utiliza la madre biológica de amamantar a los recién nacidos inyectados, devolver los cachorros inyectados a la madre biológica después de restablecerse el movimiento normal. Coloca los cachorros no inyectados restantes en la plataforma de calentamiento. Repita el procedimiento hasta que se hayan inyectado todos los ratones.
- Si se utiliza una madre adoptiva para amamantar a los recién nacidos inyectados, transferir todos los cachorros inyectados a la madre de acogida para la atención después de que se recuperen el movimiento normal.
- Eliminar la mayor parte o la totalidad de los cachorros que pertenecen a la madre adoptiva de la jaula para asegurar el éxito de los animales inyectados.
- Si cachorros de crianza de la madre y las crías inyectados tienen el mismo ojo y la piel de color, marcar las crías de la madre de acogida con una pluma de laboratorio para que puedan serdistinguido más tarde.
- Coloque las crías de la madre adoptiva y algunos de su ropa de cama junto con los cachorros inyectados. Asegúrese de que los cachorros inyectados adquieren el aroma de su descendencia biológica para mejorar la aceptación de las nuevas crías.
- Coloque sólo los cachorros inyectados de nuevo en la jaula de la madre adoptiva. Cull ningún cachorros restantes de la madre adoptiva.
- Asegúrese de que la madre asiste a la enfermería y los cachorros inyectados dentro de los 10 min de colocarlos en la jaula. Si la madre no recoge las crías dentro de este tiempo, las crías transferir a otra madre adoptiva.
- Etiqueta de la jaula con una tarjeta de peligro biológico para mostrar que contiene los animales inyectados con virus. Casa de la jaula en un área aprobada durante 72 horas.
- Después del período de cuarentena de 72 horas, trasladar a la madre y los cachorros (pero no ropa de cama u otros artículos de la jaula) a una jaula limpia. Lleve a cabo esta transferencia dentro de un gabinete de bioseguridad nivel 2 para evitar la exposición a la ropa de cama de forma viral contaminada. REEncienda la jaula limpia con los animales inyectados a la instalación normal del ratón.
- Coloque la jaula sucia en una bolsa de riesgo biológico, esterilizar en autoclave, y luego regresar a la jaula para el vivero.
7. Cleanup
- Colocar la solución de virus restante a 4 ° C para su uso futuro. El virus mantiene la eficacia de transducción durante al menos 2 meses cuando se almacena a 4 ° C 8.
- Desinfectar la aguja de inyección y una jeringa con 2% de lejía seguido de enjuagues repetidos en agua desionizada.
- Limpiar la zona de trabajo con 2% de lejía seguido de etanol al 70%.
- Recoger todos los artículos desechables que incluyen puntas de pipetas, tubos, mascarilla y guantes en una bolsa de plástico de. Deseche los materiales de desecho como es requerido por las leyes locales y las políticas institucionales (es decir, en autoclave o incinerar).
8. Preparar cerebros de ratón de Imagen
- Publicar un ratón inyectado en una cámara de dióxido de carbono a la eutanasia de 34 semanas después de la inyección. Siga las pautas institucionales para los procedimientos apropiados de eutanasia. No perfundir los animales con paraformaldehído ya que esto saciar la etiqueta de fluorescencia.
- Retire todo el cerebro del cráneo y fijar, por 3-12 horas en paraformaldehído al 4% en PBS a 4 ° C.
- Transferir el cerebro fija al 30% de sacarosa para crioprotección. Incubar a 4 ° C hasta que el cerebro hunde hasta el fondo.
- Recoge un cubo de hielo seco finamente picado. Cortar el cerebro a la mitad hacia abajo de la línea media. Denunciar las mitades del cerebro en el hielo seco para congelar.
- Enfriar la fase microtomo añadiendo hielo seco y etanol al 100%.
- Asegure el cerebro a los escenarios con la línea media hacia abajo con PBS, y dejar que se congele.
- Sección a través del cerebro a 30-45 micras de espesor utilizando un microtomo de congelación-deslizante.
- Se colocan los cortes en placas de 24 pocillos que contenían solución anticongelante (250 ml de glicerol, 300 ml de etileno glicol, 500 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4). Las placas de cubierta wipapel de aluminio ª y almacenar a -20 ° C para su uso futuro.
- Recoge las secciones 1-4 pocillos y lavar 3 veces en PBS.
- Mount secciones en portaobjetos de microscopio y cubreobjetos. Permita que se sequen en un lugar oscuro.
- Diapositivas de imágenes utilizando los filtros adecuados para YFP nativo o tdTomato para comprobar el patrón de transducción de virus.
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Representative Results
El éxito de los rendimientos de inyección viral intraventricular expresión neuronal generalizada y robusto. Aquí evaluamos la transducción viral usando YFP o tdTomato genes fluorescentes bajo el control del promotor de la beta-actina de pollo (promotor CBA). Estas construcciones se empaquetan en AAV8 y se inyectan en los ventrículos laterales del neonatales ratones (P0) ICR. Altos títulos virales (10 10 partículas por hemisferio) resultaron en etiquetado denso del bulbo olfatorio, el cuerpo estriado, corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo (Figura 1A, izquierda). Etiquetado también fue evidente en las neuronas de Purkinje del cerebelo, pero notablemente ausente de las neuronas granulares del cerebelo que todavía no están presentes en grandes cantidades en P0. La inyección de menos partículas virales (7 10) dio como resultado el etiquetado escasa y una menor expresión de intensidad (Figura 1A, derecha). Utilizamos comúnmente AAV8 dentro de un rango de concentración entre 10 7 y 10 10 partículas por hemisferio en su n fácil y de manera fiable para controlar el grado de mosaicismo transgén producido por la inyección (Figura 1B). También hemos adaptado la técnica para expresar varios transgenes por co-inyección de dos o más virus. Co-inyección de dos virus envasados en el mismo serotipo (es decir, tanto AAV8) desvía la transducción resultante de la superposición de poblaciones neuronales, por lo que muchas células expresan ambos transgenes (figura 2A). A concentraciones más bajas, los patrones de expresión se vuelven más independientes, y el porcentaje de células co-marcado se disminuyeron (Figura 2B). Expresión que no se solapan se puede conseguir también por co-inyección de diferentes serotipos de AAV. Co-inyección de AAV1 y AAV8 codifica reporteros fluorescentes distintas produce un patrón en gran medida independiente de doble mosaicismo (Figura 2C).
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Figura 1. título viral se puede utilizar para controlar la densidad de la transducción viral. (A) Una amplia gama de mosaicismo transgén se puede lograr mediante dilución de la solución viral a partir de 10 hasta 10 10 7 partículas / hemisferio. Imágenes representativas de secciones sagitales muestran dos patrones de transducción de distintos basados en el título viral. Las imágenes fueron tomadas a partir de ratones cosechados 3 semanas después de la inyección con AAV8-YFP para entregar 2,0 x 10 10 (izquierda) o 5,0 x 10 7 (derecha) partículas / hemisferio. (B) Imágenes de magnificación más elevada de la corteza (fila superior) y el cerebelo ( fila inferior) muestra el espectro de mosaicismo transgén alcanzado por dilución en serie de AAV8. Transducción se visualizó por fluorescencia nativa YFP. Los tiempos de exposición de imágenes de todo el cerebro se determinaron por la corteza y el hipocampo, que fluorescencia más brillantes, mientras que los tiempos de exposición para los paneles magnificados fueron ajustados para reflejar los patrones dentro de cada región. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Titer y serotipo independientemente controlar el grado de co-expresión viral. Imágenes representativas muestran el patrón de transducción en la corteza cerebral (A, B) y el cerebelo (C) 3 semanas después de la inyección viral. (A) Co-inyección de dos AAV8 los virus que contienen diferentes reporteros fluorescentes (tdTomato o YFP) produjeron extensa transducción de todo el cerebro. La mayoría de las células transducidas expresan ambos transgenes. (B) Co-inyección de los mismos virus a títulos más bajos producidos escasa expresión de cada proteína, en la que menos células fueron transducidas por ambos virus. (C) Co-injection de AAV empaquetados en diferentes serotipos (AAV8 y AAV1), incluso a moderadamente altos títulos, producido en gran medida un patrón que no se solapan de expresión viral. El patrón de cada proteína fluorescente era casi idéntica a su expresión cuando se inyecta solo, lo que indica que la transducción de AAV uno es independiente del otro. TdTomato fluorescencia muestra en rojo, YFP en verde. La transducción es visualizado mediante fluorescencia nativa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un procedimiento versátil para manipular la expresión génica neuronal usando AAV como vehículo para la entrega generalizada en el cerebro de ratón neonatal. En comparación con otros métodos de transgénesis neuronal tales como electroporación en el útero 1 o inyección intracraneal estereotáxico 2,3, inyección viral neonatal es relativamente fácil y simple. El procedimiento básico se puede realizar en minutos con sólo un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Supervivencia óptima y la expresión del transgen se pueden lograr al asistir a algunos detalles técnicos, la más importante es la calidad de las reservas virales, la sincronización y la precisión de la inyección, y la atención postnatal.
La calidad de la preparación viral es crítica para la transducción con éxito. Preparaciones virales Bad disminuirán significativamente la infectividad neuronal y producir transducción astrocítica significativa, posiblemente por la fagocitosis de partículas no infecciosas. Muchas universidadescontar con laboratorios centrales en el sitio que se especializan en empaque viral, y grandes instalaciones en la Universidad de Carolina del Norte y la Universidad de Pennsylvania ofrecer alta calidad de los reactivos fuera de la plataforma en una variedad de serotipos a un costo reducido. Estas instalaciones también proporcionan envases personalizados para los vectores que no están disponibles como acciones pre-envasados. Una vez recibida en el laboratorio, recuerde que las partículas de AAV pueden ser estables durante años a -80 º C, pero son muy sensibles a las fluctuaciones de temperatura. Por esta razón, las alícuotas deben ser almacenados a -80 ° C y no deben volver a congelarse una vez descongelado.
Para obtener la máxima eficacia de transducción, es crítico para inyectar virus tan pronto como sea posible después de cachorros se entregan. En base a los estudios con AAV8 y las de nuestros colaboradores, lo que retrasa las inyecciones no sólo disminuye la propagación del virus desde el ventrículo, pero también va a sesgar la transducción de las neuronas a los astrocitos 6,7. Por lo tanto recomendamos injecting en el día del nacimiento para la expresión neuronal óptima. A esta edad - antes de la barrera de fluido cefalorraquídeo del cerebro ha madurado 9 - partículas víricas inyectadas en el ventrículo lateral se difundirá por todo el sistema ventricular y luego seguir el flujo de líquido cefalorraquídeo en el cerebro 4. En consecuencia, la orientación precisa del ventrículo lateral es crítico para maximizar la propagación viral. Orientación precisa también minimiza el daño tisular de la inyección rápida de un volumen relativamente grande de fluido. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la práctica repetida hasta la orientación de los ventrículos laterales se convierte en fiable y reproducible. Tenga en cuenta que las coordenadas que figuran en este protocolo son apropiados para los cachorros P0 generales y deben ajustarse para la cepa y edad de las crías experimentales. Inicialmente, las inyecciones se deben realizar con soluciones de colorantes, como el azul de tripano o tinta china, por lo que la orientación y la propagación pueden ser visualizados por la recolección del cerebro inmediatamente después de la inyección. If los ventrículos laterales han sido blanco de ataques con éxito, el tinte se extendió por las cámaras ventriculares y ser visible todo el camino desde el bulbo olfatorio al cerebelo. Se recomienda un dispositivo estereotáxico si los ventrículos no pueden ser dirigidos de forma fiable por inyección a mano alzada.
Si las inyecciones se realizan correctamente, la proporción de ratones perdió a la inyección será insignificante. En cambio, la tasa de supervivencia después de la inyección es el más afectado por la atención materna. Comience con animales sanos. La salud de la madre está indicado por su comportamiento y su abrigo. Ella debe estar bien cuidado y limpio. El tamaño de la camada también puede ser una indicación de bienestar. Mujeres jóvenes sanas deben producir camadas de 6-8 crías para C57BL / 6, o 10 a 16 crías de ICR. Cachorros sanos deben ser de color rosa y ondulada. Si los cachorros no se ven bien o no tienen ningún punto de la leche en el vientre, que deben ser transferidos a una nueva hembra de acogida de inmediato. Recomendamos ICR o FVB para fomentar la causaproducen suficiente leche y fácilmente aceptan nuevas crías en su litera. Es imperativo que las interrupciones a la madre se reducen al mínimo, antes y después de las inyecciones como el estrés pueden causar que rechazar o canibalizar las crías. Reducir los factores de estrés mediante la limitación de ruido, la luz, y otros disturbios y mantener la jaula en un lugar tranquilo. Abra la jaula lo menos posible en la comprobación de los cachorros recién nacidos y en los primeros días después de la inyección, aunque es esencial para monitorear la atención de la madre a las crías una vez que sean sustituidos. La madre debe mostrar conductas innatas tales como agrupamiento de las crías en un lugar y se sienta encima de la pila de la descendencia. Si la madre no responde de inmediato cuando los cachorros son devueltos a la jaula, inténtelo de nuevo para mezclar los cachorros con ropa de cama sucia y material de nidificación de su jaula aseguran que han adquirido su olor. Compruebe de nuevo más tarde en el día en que los cachorros todavía tienen manchas de leche en sus estómagos. Si es posible, hacer esto mirando en la jaula dedebajo en lugar de abrir la caja de arriba. Los primeros días son los más críticos para la supervivencia, sino también cuando la hembra serán más sensibles a las perturbaciones.
Cuando se hace con cuidado, la inyección intraventricular AAV proporciona un medio rápido y fácil de la manipulación de la expresión génica neuronal in vivo sin el costo y el tiempo de la transgénesis línea germinal tradicional. El mosaicismo nativa de transducción viral puede ser aprovechada para controlar la densidad de expresión, por lo que es un enfoque ideal para los experimentos para separar las consecuencias de células intrínseca y extrínseca de células de la transgénesis. Además, dos virus pueden ser co-inyecta por lo que es posible expresar múltiples proteínas, ya sea en poblaciones neuronales superpuestas o distintos. Estas manipulaciones destacan la flexibilidad del enfoque, pero creemos que apenas hemos arañado la superficie de su potencial. La creciente disponibilidad de reactivos off-the-shelf, será más fácil para desarrollar viral inyección fo nuevas necesidades experimentales, mientras que la aparición de serotipos híbridos con tropismos distintas puede ampliar el repertorio celular que puede ser objetivo 10,11.
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Disclosures
Autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
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