Abstract
Met het tempo van de wetenschappelijke vooruitgang snel te accelereren, zijn nieuwe methoden nodig voor experimentele neurowetenschappen om snel en eenvoudig te manipuleren genexpressie in de hersenen van muizen. Hier beschrijven we een techniek voor het eerst geïntroduceerd door Passini en Wolfe voor directe intracraniële levering van viraal gecodeerde transgenen in de neonatale hersenen van muizen. In zijn meest elementaire vorm, de procedure vereist slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Echter, kan het protocol ook worden aangepast voor gebruik met stereotaxisch frames om consistentie voor onderzoekers nieuwe om de techniek te verbeteren. De werkwijze berust op het vermogen van adeno-geassocieerd virus (AAV) vrij van de cerebrale ventrikels in het hersenparenchym bewegen terwijl het ependymale bekleding nog onrijpe tijdens de eerste 12-24 uur na de geboorte. Intraventriculaire injectie van AAV op deze leeftijd resultaten wijdverspreide transductie van neuronen in de gehele hersenen. Expressie begint binnen enkele dagen na de injectie en blijft voor de lifetime van het dier. Virale titer kan worden aangepast aan de dichtheid van getransduceerde neuronen controle, terwijl co-expressie van een fluorescent proteïne een onmisbare label van getransduceerde cellen. Met de stijgende beschikbaarheid van virale kern faciliteiten voor zowel off-the-shelf, voorverpakte reagentia en aangepaste virale voorbereiding te bieden, biedt deze aanpak een tijdige methode voor het manipuleren van genexpressie in de hersenen van muizen, dat is snel, gemakkelijk, en veel minder duur dan traditionele kiembaan engineering.
Introduction
Traditionele methoden voor het wijzigen van neurale genexpressie vereisen tijdrovende en dure kiembaan manipulaties. Alternative de novo benaderingen zoals in utero elektroporatie of lentivirale stereotaxische injectie geven snellere resultaten en minder duur maar heeft het nadeel dat complexe chirurgische ingreep 1-3. Verder transgenexpressie een beperkt ruimtelijk bereik van deze methodes. Hierin beschrijven we een snelle, gemakkelijke en economische methode voor grootschalige neuronale manipulatie via intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) in de neonatale hersenen van muizen. De werkwijze werd eerst beschreven door John Wolfe en Marco Passini in 2001, waar ze voorgesteld kleine deeltjesgrootte van AAV stond het diffunderen in de cerebrospinale vloeistof bij het passeren van de laterale ventrikels via onrijpe ependymale barrière en in het hersenparenchym 4, 5. Intraventriculaire injectie van AAV in de ferste 24 uur na de geboorte opbrengsten wijdverspreide virale transductie van neurale subsets verspreid over elk gebied van de hersenen, van de reukkwabben de hersenstam 6,7. Viraal afgeleverd transgenen tot expressie worden gebracht en actief binnen dagen na injectie en aanhouden tot een jaar na transductie. Zo, dit veelzijdige manipulatie maakt studies variërend van vroege postnatale ontwikkeling van de hersenen tegen veroudering en degeneratie in de volwassene.
Bij de aanpassing van de techniek om onze specifieke experimentele behoeften, hebben we vooral gericht op AAV8 serotype want het is de meest efficiënte transductie neuronen 6. We zien dat de virale titer kan worden verdund tot de dichtheid van getransduceerde neuronen voor experimenten testen cel-intrinsieke gevolgen van genetische manipulatie controleren. Daarnaast hebben we aangetoond dat twee virussen kunnen worden gecoördineerd geïnjecteerd om expressiepatronen die eenzijdig gericht afzonderlijke of overlappende sets van neuronen produceren, afhankelijk van de gekozen serotypenvirale verpakking. Ons werk vergroot de veelzijdigheid van deze techniek voor gebruik in een groot aantal experimentele neurologie instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voer alle procedures en protocollen met betrekking tot dieren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De hier beschreven procedures zijn beoordeeld en door het Baylor College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite.
Replicatie-incompetent adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren voor transgene levering in het knaagdierhersenen zijn goedgekeurd voor Biosafety Level 1 gebruik. Raadpleeg de CDC website voor de publicatie Amerikaanse overheid "Bioveiligheid in microbiologie en Biomedische Laboratories (BMBL)" welke specifieke eisen met betrekking tot de juiste bescherming en virus handling procedures Gegevens. Neem contact op met de plaatselijke veterinaire veiligheid en milieuveiligheid personeel om institutionele specifieke eisen voor de procedures met behulp van virussen te leren. Regelgeving met betrekking tot de procedure kamers, quarantaine, en de identificatie van biologisch kooien variëren tussen instellingen.
1 Prepare P0 Pups en pleegmoeders
- Zorg voor een hoge vet voer voor alle zwangere en zogende vrouwen aan de energiebehoefte van de fokkerij en het geven van borstvoeding te ondersteunen.
- In de avond, het opzetten van een fokprogramma kooi door het toevoegen van een of twee gezonde vrouwtjes naar de kooi van een enkele bewoner mannelijke. De volgende ochtend, controleer dan de vrouwtjes voor een dekking plug en scheiden de vrouwtjes van de mannetjes als een stekker aanwezig is.
- Gebruik pleegmoeders om pups te verhogen van een genetische achtergrond met slechte maternale kenmerken (bijvoorbeeld C57BL / 6 of C3HeJ). Pleegmoeders accepteren pups uit een ander nest, indien de overgedragen pups worden geboren binnen vier dagen van het eigen nest de pleegmoeder.
- Een afzonderlijke paring kooi met ICR of FVB vrouwtjes langs de experimentele fokkers zodat de twee vrouwtjes leveren op ongeveer dezelfde tijd.
- Vrouwtjes zullen leveren in 19 ± 1 dagen vanaf de datum stekker, afhankelijk van de achtergrond stam. Drie dagen voor delivery (16 dagen na de datum stekker), plaats de zwangere vrouw in een schone kooi met vers nestmateriaal en een overdekte schuilplaats.
- Controleer voor pasgeboren pups twee keer per dag te beginnen 2 dagen voor de verwachte datum van levering (17 dagen na de datum stekker). Onderzoek de kooi met minimale belasting van de moeder door gluren door de bodem op de aanwezigheid van roze pasgeborenen. Muizen in het algemeen leveren pups in de ochtend, maar in zeldzame gevallen zal leveren in de middag.
- Plan om injecties uit te voeren zodra de pups verpleging (die duidelijk door zichtbare melk plekken zullen zijn), of binnen 6 uur van de geboorte, wat het eerst komt.
2 Bereid Apparatuur voor Injectie
- Bereid een 10 ul injectie spuit met een 32 G naald voor algemene P0 neonaten. Als het uitvoeren van stereotactische injectie, monteer de spuit op de manipulator arm.
- Bij gebruik van een stereotaxisch frame voor injecties, het koelen van de neonatale fase tot 4-8 ° C met toevoeging van 100% ethanol en droog ijs tot het reservoir aan de voorkant van het blok. Houd de temperatuur boven de 1 ° C tot bevriezing van de pups te voorkomen.
3 Bereid Virale Verdunningen voor Injectie
- Bereid een 1% trypanblauw kleurstof oplossing (20x voorraad).
- Bereid 5-25 pi fracties van adeno-geassocieerde virus (AAV) voorraad in een klasse 2 bioveiligheid kast. Plaats deze fracties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Vermijd extra vries-dooi cycli dit veroorzaakt het virus transductie efficiëntie verliezen.
- Verwijder een hoeveelheid van AAV uit de -80 ° C vriezer en plaats op ijs te ontdooien.
- Bereid de virale oplossing voor injectie door verdunning van het virus in ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Begin met een tien-voudige seriële verdunning (10 oktober - 10 augustus virale deeltjes / halfrond) voor de eerste optimalisatie van de transductie patroon.
- Voeg 20x trypan blauw aan de AAV oplossing tot een eindconcentratie van 0,05%.
- Plaats een klein aluminium plaatje op het ijs om af te koelen. Plaats een droge taak doekje op de plaat de huid van de pup beschermen tegen de kou metaal. Dit dient als een vlakke koud oppervlak voor verlamming en het injecteren van de pups.
- Bereid een warming pad geschikt voor het houden van neonatale muizen warm voor en na de injectie.
- Zodra de pasgeboren pups zijn begonnen met verpleegkundige, verwijder ongeveer de helft van hen uit de kooi en laat de andere helft met hun moeder. Plaats de verzamelde pups op de opwarming pad in afwachting van injectie.
OPMERKING: Als de biologische moeder niet de zorg voor de pups, verwijder het hele nest uit de kooi onmiddellijk en plaats de pups op een opwarming pad om injectie te wachten. Deze situatie kan zich voordoen met het eerste nest geboren C57BL / 6 vrouwtjes of met andere inteeltstammen dat arme fokkerij kenmerken hebben. In deze situatie zal melkvlekken niet zichtbaar pasgeboren pups worden. - Transfer een pup van de opwarming pad op de koude metalen plaat om onderkoeling anesthesie. Wacht 2-3 minuten voor de pup volledig verdoofd worden. Bevestig verdoving door heel zachtjes knijpen in een poot en monitor voor het gebrek aan beweging of ademhaling.
5 Injectie van AAV in Neonatale Muizen
- Vrije hand intracraniële injectie van AAV in neonatale muizen:
- Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blauw in de injectiespuit.
- Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol.
- Identificeer de injectieplaatsen bij 2/5 van de afstand van de lambda hechting aan elk oog. Een alternatief op de injectieplaats is gelegen op ongeveer 0,8-1 mm lateraal van de pijlnaad, halverwege tussen lambda en bregma. Deze monumenten zijn zichtbaar door de huid op P0.
- Markeer de injectieplaats met een niet-giftige laboratorium pen.
- Houd de spuit met de schaal toegankelijk voor monitoring het volume van de oplossing afgegeven.
- Zorg ervoor dat de duim de bovenkant van de zuiger kan bereiken. Verwijder vervolgens de duim van de zuiger, terwijl het plaatsen van de naald, zodat niet onbedoeld doseren virus.
- Zoek een comfortabele positie om de arm voor injectie brace door de invoering van de elleboog op de bank en leunt de arm op de ijsemmer.
- Leg de pup op zijn kant met zijn kop direct onder de spuit. Draai de kop van de pup, zodat de gemarkeerde plaats van injectie naar boven is gericht en voorzichtig maar stevig deze positie met een open hand te houden.
- Houd de injectiespuit loodrecht op het oppervlak van de schedel en de naald op de gemarkeerde injectieplaats tot een diepte van ongeveer 3 mm. Injecteer de naald totdat de weerstand daalt lichtjes, wat aangeeft dat de naald is doorgedrongen in de laterale ventrikel. Als een verwijzing nodig is, markeer 3 mm van het uiteinde van de naald met een niet-giftige maker. Pas de injectie diepte voor pup grootte en spanning op basis van kleurstof targeting van de ventrikels.
- Houd de spuit vast zodat de zuiger ingedrukt zonder dat de naald verder in de hersenen kan zijn. Als de injectie verplaatst in de thalamus, zal virusverspreiding ernstig beperkt.
- Begin langzaam te injecteren virus, terwijl het toezicht op de gedoseerde volume van de spuit. Dien een maximaal volume van 2 pi in elk ventrikel. Als de naald in de juiste positie, wordt de kleurstof verspreid naar het ventrikel vullen.
- Trek langzaam de naald.
- Laat de eerste injectie te sluiten vóór het injecteren van het andere halfrond.
OPMERKING: Niet injecteren dezelfde plaats meer dan eens. Terugplaatsen van de naald krachten virus dat al is geïnjecteerd te lekken en veroorzaakt letsel of de dood van de pup. - Injecteer de contralaterale ventrikel volgens dezelfde procedure.
- Stereotactische injectie van AAV in neonatale muizen:
- Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blue into de injectie spuit in handen van de stereotaxische manipulator.
- Plaats voorzichtig de kop van de pup tussen het oor bars van de neonatale frame. Controleer de kop waterpas in de Y-as (voor naar achter) door te controleren dat de lijn tussen lambda en bregma parallel aan het podium. Controleer het hoofd niveau in de X-as (links naar rechts) door te controleren dat een denkbeeldige lijn tussen de oren of tussen de ogen, parallel aan de fase is.
- Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol.
- Gebruik de stereotaxische manipulator aan de spuit bovengenoemde lambda positioneren en nul de X en Y coördinaten. Verplaats de stereotaxische armen (X, Y) = (0.8, 1.5) mm voor standaard P0 pups.
OPMERKING: Pup grootte en stereotactische coördinaten kan per stam en leeftijd. Coördinaten op basis van kleurstof injecties past indien nodig de laterale ventrikels richten. - Langzaam de naald in de injectieplaats. Het oppervlak van de schedel zal indent en dan los zodra de naald de huid is doorgedrongen. Trek de naald tot de schedel herstelt de normale concave vorm, maar houd de schuine kant van de naald onder de huid. Nul de Z-coördinaat op dit punt.
- Steek de naald tot Z = -1.7 mm en vervolgens terug te trekken tot -1.5 mm.
- Injecteer langzaam het virus. Elk halfrond kunnen tot 2 pi van de oplossing.
- Houd de spuit in de plaats voor 30-60 sec na het voltooien van de injectie en dan langzaam terug te trekken van de naald dan 1-2 minuten.
- Herhaal de contralaterale hemisfeer, met negatieve coördinaten in de X-as voor de injectie.
OPMERKING: Alternative coördinaten voor injectie zijn (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm en (1.2, 1.0, -1.5) mm. Voer de eerste injectie (0.8, 2.0), dan naar (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) en tenslotte (1.2 -1.0). Injecteer 1 ul van de oplossing op elke locatie, voor een totaal van 2 pl per halfrond. Beweeg snel tussen de injecties om de procedure in de les te voltooiens dan 10 minuten.
6 Post-injectie Care
- Na het voltooien van injecties in beide hersenhelften, plaats de pup terug op de opwarming pad totdat de lichaamstemperatuur en huidskleur terug te keren naar de normale en de pup begint te bewegen.
- Bij gebruik van de biologische moeder om de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de terugkeer van de geïnjecteerde pups naar de biologische moeder nadat ze herstellen de normale beweging. Leg de resterende uninjected pups op de opwarming pad. Herhaal deze procedure totdat alle muizen werden geïnjecteerd.
- Bij gebruik van een pleegmoeder voor de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de overdracht van alle geïnjecteerde pups aan de pleegmoeder voor zorg na ze herstellen de normale beweging.
- Verwijder meeste of alle pups die tot de pleegmoeder van de kooi tot het succes van de geïnjecteerde dieren.
- Als pups pleegmoeder en geïnjecteerd pups hebben dezelfde ogen en huidskleur, markeer pups van de pleegmoeder met een laboratorium pen, zodat ze kunnen wordenlater onderscheiden.
- Plaats pups de pleegmoeder en een aantal van hun beddengoed samen met de geïnjecteerde pups. Zorg ervoor dat de geïnjecteerde pups verwerven van de geur van haar biologische nakomelingen te verbeteren acceptatie van de nieuwe pups.
- Plaats alleen de geïnjecteerde pups terug in de kooi van de pleegmoeder. Ruimen eventuele resterende pups van de pleegmoeder.
- Zorg ervoor dat de moeder is het bijwonen van en verpleging de geïnjecteerde pups binnen 10 minuten van het plaatsen van hen in de kooi. Als de moeder niet de pups binnen deze tijd heeft te verzamelen, overdragen pups naar een andere pleegmoeder.
- Label de kooi met een biohazard-kaart te laten zien dat het bevat viraal-geïnjecteerde dieren. Het huis van de kooi in een goedgekeurd gebied voor 72 uur.
- Na de 72 uur quarantaineperiode, de overdracht van de moeder en de pups (maar geen beddengoed of andere kooi items) om een schone kooi. Uitvoeren van deze overdracht in een Level 2 bioveiligheid kast om de blootstelling aan een viraal besmette beddengoed te voorkomen. Return de schone kooi met de geïnjecteerde dieren naar de gewone muis faciliteit.
- Plaats de vuile kooi in een biohazard zak, steriliseren in een autoclaaf, en dan terug de kooi naar het vivarium.
7 Cleanup
- Overgebleven virus oplossing bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Het virus blijft transductie ten minste 2 maanden bij opslag bij 4 ° C 8.
- Ontsmet de injectienaald en spuit met 2% bleekmiddel, gevolgd door herhaalde spoelingen in gedeïoniseerd water.
- Reinig de werkruimte met 2% bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol.
- Verzamel alle disposable artikelen waaronder pipet tips, tubes, masker en handschoenen in een plastic zak biologisch gevaarlijk. Afvoeren van afvalstoffen, zoals vereist door de lokale wetgeving en institutionele beleid (dwz autoclaaf of verbranden).
8 Bereid Mouse Brains for Imaging
- Plaats een geïnjecteerde muis in een kooldioxide euthanasie kamer bij 34 weken na injectie. Volg de institutionele richtlijnen voor een correcte euthanasie procedures. Geen dieren perfuse met paraformaldehyde als dit de fluorescentie label zal uitdoven.
- Verwijder de gehele hersenen van de schedel en bevestig 3-12 uur in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C.
- Breng de vaste hersenen tot 30% sucrose voor cryoprotection. Incubeer bij 4 ° C totdat de hersenen naar de bodem zinkt.
- Verzamel een emmer uit fijngemalen droog ijs. Snijd de hersenen in de helft beneden de middellijn. Begraaf de hersenhelften in het droogijs te bevriezen.
- Koel de microtoom fase door toevoeging van droog ijs en 100% ethanol.
- Bevestig de hersenen naar het podium met de middellijn naar beneden met behulp van PBS, en laten bevriezen.
- Doorsnede van de hersenen op 30-45 micrometer dikte met behulp van een bevriezing sledemicrotoom.
- Plaats gedeelten in 24-well platen bevattende antivries-oplossing (250 ml glycerol, 300 ml ethyleenglycol, 500 ml 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4). Afdekplaten with aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
- Verzamel secties 1-4 putjes en spoel 3x in PBS.
- Mount secties op objectglaasjes en dekglaasje. Laat dia's om te drogen op een donkere plaats.
- Afbeelding dia's met behulp van geschikte filters voor inheemse YFP of tdTomato om het virus transductie patroon controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle intraventriculaire virale injectie opbrengsten wijdverspreid en robuuste neuronale expressie. Hier virale transductie evalueerden we gebruik YFP- of tdTomato fluorescerende genen onder de controle van de kip beta actinepromoter (CBA promotor). Deze constructen werden verpakt in AAV8 en geïnjecteerd in de laterale ventrikels van neonatale (P0) ICR-muizen. Hoge virale titers (10 10 deeltjes per halfrond) resulteerde in dichte etikettering van de olfactorische bulb, striatum, de cerebrale cortex, hippocampus en het cerebellum (Figuur 1A, links). Etikettering bleek ook in cerebellaire Purkinje neuronen, maar vooral afwezig in cerebellaire korrel neuronen die nog niet in grote getale aanwezig bij P0. Injectie van minder virusdeeltjes (10 7) resulteerde in verspreide etikettering en lagere intensiteit expressie (Figuur 1A, rechts). We gebruiken vaak AAV8 binnen een concentratiegebied tussen 10 7 en 10 10 deeltjes per halfrond als een n eenvoudige en betrouwbare manier om de mate van transgene mosaicism die door injectie (Figuur 1B) gebruikt. We hebben ook aangepast de techniek om meerdere transgenen tot expressie door co-injecteren van twee of meer virussen. Co-injectie van twee virussen verpakt in hetzelfde serotype (dwz zowel AAV8) spant de resulterende transductie overlappende neuronale populaties, zodat veel cellen tot expressie beide transgenen (Figuur 2A). Bij lagere concentraties, de expressiepatronen onafhankelijker en het percentage co gemerkte cellen wordt verlaagd (Figuur 2B). Niet-overlappende expressie kan ook worden bereikt door co-injectie verschillende AAV serotypes. Co-injectie van AAV1 en AAV8 coderen verschillende fluorescerende verslaggevers produceert een grotendeels onafhankelijk patroon van dual-mosaicism (figuur 2C).
ig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 1 virale titer kan worden gebruikt om de dichtheid van virale transductie controleren. (A) Een groot aantal transgene mosaicism kan plaatsvinden na verdunning de virale oplossing van 10 10 tot 10 7 deeltjes / halfrond. Representatieve beelden van sagittale secties tonen twee verschillende transductie patronen gebaseerd op virale titer. Beelden werden genomen uit muizen geoogst 3 dagen na injectie met AAV8-YFP leveren 2,0 x 10 10 (links) of 5,0 x 10 7 (rechts) deeltjes / halfrond. (B) Een hogere vergroting van cortex (bovenste rij) en cerebellum ( onderste rij) tonen het spectrum van transgene mosaicism bereikt door seriële verdunning van AAV8. Transductie wordt gevisualiseerd door native YFP fluorescentie. De belichtingstijden voor hele brein beelden werden bepaald door de cortex en de hippocampus, die het meest helder fluoresceren, terwijl belichtingstijden voor het vergrote panelen werden aangepast om patronen tonen binnen elke region. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Titer en serotype onafhankelijk regelen van de mate van virale co-expressie. Representatieve beelden tonen de transductie patroon van de cerebrale cortex (A, B) en cerebellum (C) 3 weken na virale injectie. (A) Co-injectie van twee AAV8 virussen met verschillende fluorescente reporters (tdTomato of YFP) geproduceerd uitgebreide transductie gehele hersenen. De meeste getransduceerde cellen brachten beide transgenen. (B) Co-injectie van dezelfde virussen lagere titers geproduceerd dun expressie van elk eiwit, waarbij minder cellen werden getransduceerd door beide virussen. (C) Co-injection van AAV verpakt in verschillende serotypes (AAV8 en AAV1), zelfs bij redelijk hoge titers, produceerde een grotendeels niet-overlappend patroon van virale expressie. Het patroon van elk fluorescent proteïne was bijna identiek aan zijn expressie wanneer alleen geïnjecteerd, wat aangeeft dat transductie van een AAV is onafhankelijk van de andere. TdTomato fluorescentie in rood weergegeven, YFP in groen. Transductie wordt gevisualiseerd door native fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een veelzijdige werkwijze beschreven voor het manipuleren neuronale genexpressie middels AAV als middel voor grootschalige plaatsing in de neonatale muizenhersenen. Vergeleken met andere vormen van neuronale transgenese zoals in utero elektroporatie 1 of stereotaxische intracraniale injectie 2,3, neonatale virale injectie is relatief eenvoudig. De basis procedure kan worden uitgevoerd in een paar minuten met slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Optimale overleving en transgene expressie kan worden bereikt door het volgen van een paar technische details, waarvan de belangrijkste zijn de kwaliteit van de virale voorraden, de timing en de nauwkeurigheid van de injectie, en de postnatale zorg.
De kwaliteit van virale preparaat essentieel voor een succesvolle transductie. Bad virale voorbereidingen zal aanzienlijk verminderen neuronale besmettelijkheid en produceren aanzienlijk astrocytaire transductie, eventueel door fagocytose van niet-infectieuze deeltjes. Veel universiteitenhebben kern laboratoria op het terrein die zijn gespecialiseerd in virale verpakking, en grote installaties aan de Universiteit van North Carolina en de Universiteit van Pennsylvania bieden hoge kwaliteit off-the-shelf reagentia in verschillende serotypen tegen lagere kosten. Deze faciliteiten bieden ook aangepaste verpakkingen voor vectoren die niet beschikbaar zijn als pre-verpakte voorraden zijn. Na ontvangst in het laboratorium, bedenk dan dat AAV deeltjes stabiel kan zijn voor de komende jaren bij -80 ° C, maar zijn erg gevoelig voor temperatuurschommelingen. Daarom moet porties bewaard bij -80 ° C en mag niet worden ingevroren eenmaal ontdooid.
Voor de hoogste transductie efficiëntie, is het essentieel om virus injecteren zodra mogelijk na pups worden geleverd. Op basis van onze studies met AAV8 en die van onze medewerkers, het uitstellen van de injecties niet alleen vermindert de verspreiding van het virus van het ventrikel, maar zal ook vertekening van de transductie van neuronen tot astrocyten 6,7. Daarom raden we injecting op de dag van de geboorte voor een optimale neuronale expressie. Op deze leeftijd - voor de cerebrospinale vloeistof-hersenbarrière gerijpt 9 - virusdeeltjes geïnjecteerd in het laterale ventrikel diffunderen gedurende het ventriculaire systeem en volg de stroming van cerebrospinale vloeistof in de hersenen dan 4. Bijgevolg doelgerichtheid van de laterale ventrikel is kritisch voor virale verspreiding maximaliseren. Accurate targeting minimaliseert ook weefselbeschadiging van de snelle injectie van een relatief grote hoeveelheid vloeistof. Daarom raden we herhaalde de praktijk tot gericht op de laterale ventrikels betrouwbaar en reproduceerbaar wordt. Merk op dat de coördinaten die in dit protocol zijn geschikt voor algemene P0 pups en moet worden aangepast aan de stam en leeftijd van de experimentele pups. Aanvankelijk moeten injecties worden uitgevoerd met kleurstof oplossingen, zoals trypan blauw of India inkt, zodat de targeting en verspreiding kan worden gevisualiseerd door het oogsten van de hersenen onmiddellijk na injectie. If de laterale ventrikels met succes zijn gericht, zal de kleurstof verspreid over de ventriculaire kamers en zichtbaar zijn helemaal uit het reukorgaan van de kleine hersenen. Een stereotaxisch apparaat wordt aanbevolen als de ventrikels niet betrouwbaar kan worden gericht op de vrije hand injectie.
Indien de injecties kunnen worden uitgevoerd, het aantal muizen afgedroogd injectie verwaarloosbaar zal zijn. In plaats daarvan wordt de overlevingskans na de injectie het meest getroffen door de moederlijke zorg. Begin met gezonde dieren. Gezondheid van de moeder wordt aangegeven door haar gedrag en haar jas. Ze moeten goed verzorgd en schoon. De worpgrootte kan ook een indicatie van welzijn. 8 pups voor C57BL / 6 of 10 - - 16 pups voor ICR gezonde, jonge vrouwen moeten nesten van 6 produceren. Gezonde pups moeten roze en wiggly zijn. Als pups niet goed uit of hebben geen melk vlek op hun buik, moeten ze worden overgebracht naar een nieuw pleeggezin vrouwelijke onmiddellijk. Wij raden ICR of FVB voor het bevorderen, omdatze produceren voldoende melk en gemakkelijk te aanvaarden nieuwe pups in hun nest. Het is noodzakelijk dat verstoringen van de moeder voor een minimum worden beperkt en na de injecties en stress kan veroorzaken haar te verwerpen of kannibaliseren de pups. Verminder stressoren door het beperken van geluid, licht, en andere storingen en het houden van de kooi op een rustige plek. Open de kooi zo min mogelijk bij het controleren voor pasgeboren pups en in de eerste paar dagen na de injectie, maar het is essentieel om aandacht van de moeder te volgen naar de pups als ze eenmaal zijn vervangen. De moeder moet aangeboren gedrag, zoals bundelen de pups op een plaats en zit bovenop de stapel van de nakomelingen te geven. Als de moeder niet onmiddellijk reageert als de pups worden teruggegeven aan de kooi, probeer het opnieuw om de pups met vuile beddengoed en nestmateriaal uit haar kooi te mengen zodat ze hebben haar geur verworven. Controleer later nog eens op de dag dat de pups nog steeds melk vlekken op hun buik. Als het mogelijk is, doe dit door te kijken naar de kooi vanonder in plaats van opening van de kooi van boven. De eerste dagen belangrijkst zijn voor overleving, maar ook bij het vrouwtje meest gevoelig ontwrichting.
Indien goed gedaan AAV intraventriculaire injectie verschaft een gemakkelijk middel manipuleren neuronale genexpressie in vivo zonder de kosten en tijd van traditionele kiembaan transgenese. De inheemse mosaïcisme van virale transductie kan worden aangewend om de dichtheid van meningsuiting te controleren, waardoor het een ideale aanpak voor experimenten naar cel-intrinsieke en cel-extrinsieke gevolgen van transgenese scheiden. Bovendien kunnen twee virussen co-geïnjecteerd waardoor meerdere eiwitten in ofwel overlappen of verschillende neuronale populaties tot expressie worden. Deze manipulaties benadrukken de flexibiliteit van de aanpak, maar we geloven dat we nog maar net gekrast de oppervlakte van zijn potentieel. De toenemende beschikbaarheid van off-the-shelf reagentia zal het gemakkelijker maken om virale injectie f ontwikkelenof nieuwe experimentele behoeften, terwijl de opkomst van hybride serotypen met verschillende tropismen de cellulaire repertoire dat kan worden gericht 10,11 kunnen uitbreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0.375" | 32 G, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
