Intracerebroventrikulär Viral Injektion av neonatal mus hjärnans för långlivade och Utbredd neuronal Transduktion

Abstract

Med takten i vetenskapens framsteg accelererar snabbt, behövs nya metoder för experimentell neurovetenskap för att snabbt och enkelt manipulera genuttrycket i mushjärna. Här beskriver vi en teknik som först introducerades av Passini och Wolfe för direkt intrakraniell leverans av viralt kodade transgener i neonatal mushjärna. I sin mest grundläggande form, kräver förfarandet endast en ice och en mikroliter spruta. Däremot kan protokollet också anpassas för användning med stereotaktiska ramar för att förbättra överensstämmelsen för forskare nya till tekniken. Metoden bygger på förmågan hos adenoassocierat virus (AAV) att röra sig fritt från de cerebrala ventriklarna i hjärnparenkymet medan ependymceller fodret är fortfarande omogen under första 12-24 timmar efter födseln. Intraventrikulär injektion av AAV i denna ålder ger utbredd transduktion av nervceller i hela hjärnan. Expression börjar inom några dagar efter injektionen och kvarstår för lifetime av djuret. Viral titer kan justeras för att styra densiteten hos transducerade neuroner, medan samuttryck av ett fluorescerande protein ger en viktig etikett av transducerade celler. Med den ökande tillgängligheten av virala core faciliteter för att ge både off-the-shelf, färdigförpackade reagenser och anpassade viral förberedelser, ger denna lösning en tid metod för att manipulera genuttrycket i musen hjärnan som är snabbt, enkelt och mycket billigare än traditionell könsceller engineering.

Introduction

Traditionella metoder för att modifiera neurala genuttryck kräver tidskrävande och dyra nedärvda manipulationer. Alternativa de novo lösningar såsom i livmodern elektroporering eller stereotaxisk lentiviral injektion ger snabbare resultat och är billigare, men har nackdelen att de kräver komplicerade kirurgiska ingrepp ^1-3. Dessutom har transgenexpression en begränsad geografisk räckvidd med dessa metoder. Häri beskriver vi en snabb, enkel och ekonomisk metod för omfattande neuronal manipulation via intraventrikulär injektion av adenoassocierat virus (AAV) i neonatal mushjärna. Förfarandet beskrevs först av John Wolfe och Marco Passini i 2001, där de föreslog liten partikelstorlek av AAV tillät den att diffundera inom den cerebrala spinalvätskan då den passerar från de laterala ventriklarna via omogna ependymala barriären och in i hjärnparenkymet ^{4, 5.} Intraventrikulär injektion av AAV inom first 24 h efter födseln utbyten utbredd viral transduktion av neurala delmängder som spänner varje region av hjärnan, från lukt glödlampor till hjärnstammen ^6,7. Viralt levererade transgener uttrycks och aktiv inom några dagar efter injektionen och kvarstår i upp till ett år efter transduktion. Således denna mångsidiga manipulation möjliggör studier som sträcker sig från tidig postnatal hjärnutveckling till åldrande och degeneration i den vuxna.

Vid anpassning av tekniken till våra specifika experimentella behov har vi främst fokuserat på AAV8 serotyp eftersom det är den mest effektiva på att omvandla nervceller ^6. Vi visar att virus titer kan spädas för att kontrollera tätheten av omvandlade nervceller för experiment som testar cell inneboende konsekvenserna av genmanipulation. Dessutom visar vi att två virus kan vara co-injiceras för att producera uttrycksmönster som är inställda distinkta eller överlappande uppsättningar av nervceller, beroende på de serotyper som valts förviral förpackningar. Vårt arbete expanderar den mångsidigheten hos denna teknik för användning i ett brett område av experimentella neuroscience inställningar.

Protocol

Utför alla procedurer och protokoll som rör djur i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. De förfaranden som beskrivs här granskades och godkändes av Baylor College of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén.

Replikationsinkompetent adenoassocierade virus (AAV) vektorer för transgen leverans i gnagare hjärnan är godkända för Biosäkerhetsnivå en användning. Se CDC hemsida för den amerikanska regeringen publikationen "biosäkerhet i mikrobiologi och biomedicinska laboratorier (BMBL)" som specificerar särskilda krav ordentliga skydd och virus hanteringsrutiner. Kontrollera med lokal veterinär och miljösäkerhet personalen att lära sig institutionella krav specifika Förklaring använder virus. Bestämmelser om moment, karantän och identifiering av biohazard burar varierar mellan institutionerna.

1 Prepare P0 Pups och fostermödrar

1. Ge fettrik chow för alla gravida och ammande kvinnor att stödja energi krav uppfödning och amning.
2. På kvällen, skapa en avel bur genom att lägga till en eller två friska honor till buren av ett enda bosatt hane. Följande morgon, kolla honorna för parning plugg och skilja honorna från hanarna, om en propp är närvarande.
   1. Använd fostermödrar för att höja valpar från en genetisk bakgrund med dåliga maternal egenskaper (t.ex. C57BL / 6 eller C3HeJ). Fostermödrar emot valpar från en annan kull, om de överförda valparna föds inom fyra dagar efter det att fostermodern egen kull.
   2. Inrätta en särskild parning bur med hjälp av ICR eller FVB honor vid sidan av de experimentella uppfödare så att de två uppsättningarna av honor leverera vid ungefär samma tidpunkt.
3. Kvinnor kommer att leverera i 19 ± 1 dagar från kontakten dagen, beroende på bakgrundsstammen. Tre dagar före delivery (16 dagar efter kontakten dagen), placera gravida kvinnor i en ren bur med nytt bomaterial och en täckt tak över huvudet.
4. Kontrollera om nyfödda valpar två gånger dagligen med början 2 dagar före den förväntade leveransdatum (17 dagar efter kontakten dagen). Undersök buren med minimal stress för mödrarna genom att kika genom botten för förekomst av rosa nyfödda. Möss levererar vanligtvis valpar på morgonen men i sällsynta fall kommer att leverera i eftermiddag.
5. Planera för att utföra injektioner så snart valparna ammar (vilket kommer att framgå av synliga mjölkfläckar), eller inom 6 h datum, beroende på vilket som inträffar först.

2 Förbered Utrustning för injektion

1. Förbered en 10 l injektionsspruta med en 32 G nål för allmänna P0 nyfödda. Om du utför stereotaktisk injektion, montera sprutan till manipulatorarmen.
2. Om du använder en stereotaktisk ram för injektionsvätskor, kyla neonatalstadiet till 4-8 ° C genom tillsats av 100% ethanol och torris till behållaren vid den främre änden av blocket. Håll temperaturen över 1 ° C för att undvika frostskador av valparna.

3 Förbered Viral Späd för Injection

1. Bered en 1% trypanblått-lösning (20x lager).
2. Förbered 5-25 il alikvoter av adeno-associerat virus (AAV) lager inuti en klass 2 biosäkerhet skåp. Placera dessa alikvoter vid -80 ° C för framtida bruk. Undvik extra frys-tö cykler eftersom detta orsakar viruset att förlora transduktion effektivitet.
3. Ta bort en delmängd av AAV från -80 ° C frys och plats på is för att tina.
4. Förbered virala injektionsvätska, lösning genom att späda viruset i iskallt 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Börja med en tiofaldig serieutspädning ⁽¹⁰ oktober-10 Augusti viruspartiklar / halvklotet) för initial optimering av omvandlingsmönstret.
5. Lägg 20x trypanblått till AAV lösning till en slutlig koncentration av 0,05%.

1. Placera en liten aluminiumplatta på is för att kyla. Placera en torr uppgift torka ovanpå plattan för att skydda valpens hud från den kalla metallen. Detta fungerar som en plan kall yta för anesthetizing och injicera valparna.
2. Förbered en uppvärmning pad som lämpar sig för att hålla nyfödda möss varm före och efter injektionen.
3. När de nyfödda valparna har börjat sjuksköterska, ta bort ungefär hälften av dem från buren och lämna den andra halvan med sin mamma. Placera de insamlade valpar på uppvärmningen pad väntan injektion.
   OBS: Om den biologiska modern inte ta hand om valparna, ta bort hela kullen från buren omedelbart och placera valparna på en värmande dyna att invänta injektion. Denna situation kan uppstå med den första kullen född till C57BL / 6 tikar eller med andra inavlade stammar som har dåliga avelsegenskaper. I denna situation, kommer mjölkfläckar ej vara synliga på nyfödda valpar.
4. Överför en valp från uppvärmningen pad på den kalla metallplattan för att inducera hypotermi anestesi. Vänta 2-3 min för valpen att bli helt sövd. Bekräfta anestesi med mycket försiktigt klämma en tass och övervaka i brist på rörelse eller andning.

5. Injektion av AAV till Neonatal Möss

1. Fri hand intrakraniell injektion av AAV i neonatal möss:
   1. Load 5 pl av utspätt AAV med 0,05% trypanblått i injektionssprutan.
   2. Torka försiktigt huvudet av sövda valp med en bomullstuss indränkt i 70% etanol.
   3. Identifiera injektionsställen vid 2/5 av avståndet från lambda sutur till varje öga. Ett alternativt injektionsstället ligger ca 0.8-1 mm i sidled från sagittal sutur, halvvägs mellan lambda och bregma. Dessa landmärken är synliga genom huden vid P0.
   4. Märk injektionsstället med en giftfri laboratoriepenna.
   5. Håll sprutan med skalan synlig för monivakning volymen av lösningen dispenseras.
   6. Se till att tummen kan nå toppen av kolven. Ta sedan bort tummen från kolven medan nålen för att undvika misstag dispense virus positionering.
   7. Hitta en bekväm ställning för att spänna armen för injektion genom att sätta armbågen på bänken och lutar armen på ishink.
   8. Lägg valpen på sidan med huvudet direkt under sprutan. Vrid valpens huvud så att den markerade injektionsstället är vänd uppåt och försiktigt men bestämt hålla denna position med en öppen hand.
   9. Håll sprutan vinkelrätt mot ytan av skallen och stick in nålen i den markerade injektionsstället till ett djup av ca 3 mm. Spruta in nålen tills motståndet minskar något, vilket tyder på att nålen har trängt in i den laterala ventrikeln. Om det krävs en referens, markera 3 mm från spetsen av nålen med giftfri maker. Justera insprutningsdjupet för pup storlek och påfrestningar utifrån färg targeting av ventriklarna.
   10. Håll sprutan stelt, så att kolven kan vara deprimerad utan att flytta nålen längre in i hjärnan. Om injektionen förskjutes in i talamus, kommer viral spridning vara allvarligt begränsad.
   11. Börja långsamt injicera viruset under övervakning av volymen ut från sprutan. Administrera en maximal volym på 2 pl i varje kammare. Om nålen är i rätt läge, kommer färgen spred fylla ventrikeln.
   12. Långsamt ut kanylen.
   13. Låt den första injektionsstället för att stänga innan du injicerar den andra halvklotet.
       OBS: Injicera inte samma plats mer än en gång. Sätta tillbaka nålen krafter virus som redan har injicerats läcker ut och orsakar skada eller död för valpen.
   14. Injicera den kontra ventrikeln med samma procedur.
2. Stereotaxic injektion av AAV i neonatal möss:
   1. Belastning 5 pl utspätt AAV med 0,05% trypanblått into injektionssprutan hålls av stereotaxic manipulator.
   2. Placera försiktigt valpens huvud mellan örat barer i neonatal ramen. Se till att huvudet är nivån i Y-axeln (framifrån och bakåt) genom att kontrollera att linjen mellan lambda och bregma är parallell med scenen. Kontrollera att huvudet är nivån i X-axeln (sida till sida) genom att kontrollera att en tänkt linje mellan öronen, eller en linje mellan ögonen, är parallell med scenen.
   3. Torka försiktigt av sövda valp huvud med en bomullstuss indränkt i 70% etanol.
   4. Använd stereotaxic manipulatorn för att placera sprutan ovanför lambda och sedan noll X och Y koordinater. Flytta stereotaxic armar till (X, Y) = (0,8, 1,5) mm för standard P0 pups.
      OBS: Pup storlek och stereotaktiska koordinaterna kan variera mellan stam och ålder. Justera koordinater baserade på färgämnes injektioner som behövs för att rikta de laterala ventriklarna.
   5. Sakta sänka nålen in i injektionsstället. Ytan av skallen kommer indent och släpp sedan när nålen har penetrerat huden. Dra tillbaka nålen tills skallen återfår sin normala konkav form, men behåll avfasning av nålen under huden. Noll Z-koordinaten på denna punkt.
   6. För in nålen tills Z = -1,7 mm och sedan dra till -1,5 mm.
   7. Injicera långsamt viruset. Varje hemisfär kan acceptera upp till 2 | il av lösningen.
   8. Förvara sprutan i stället för 30-60 sekunder efter avslutad injektion och sedan långsamt dra in nålen under 1-2 min.
   9. Upprepa för den kontralaterala hemisfären, använda negativa koordinater i X-axeln för injektionsstället.
      OBS: Alternativa koordinaterna för injektion är (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm och (1,2, 1,0, -1,5) mm. Utför den första injektionen (0,8, 2,0), sedan flytta till (0,8, -2,0), (1,2, 1,0) och slutligen (1,2, -1,0). Injicera 1 ìl av lösningen på varje plats, för totalt 2 l per halvklotet. Flytta snabbt mellan injektionerna för att avsluta förfarandet i leser än 10 min.

6. efter injektion Care

1. Efter att ha avslutat injektioner i båda halvkloten, placera valpen tillbaka på uppvärmningen pad tills dess kroppstemperatur och hudfärg återgång till det normala och valpen börjar röra sig.
2. Om du använder den biologiska modern att vårda de injicerade nyfödda, returnera de injicerade valpar till den biologiska mamman efter att de återhämta normal rörlighet. Placera de återstående oinjicerade valpar på uppvärmningen pad. Upprepa proceduren tills alla möss har injicerats.
3. Om du använder en fostermamma för att vårda de injicerade nyfödda, överföra alla injicerade valpar till fostermodern för vård efter att de återhämta normal rörlighet.
   1. Ta bort de flesta eller alla av valparna som hör till fostermor från buren för att säkerställa framgång för de injicerade djuren.
   2. Om foster mors valpar och injicerade valpar har samma ögon och hudfärg, markerar valpar från fostermodern med en laboratorie penna så att de kan varasärskiljas senare.
   3. Placera fostermor valpar och några av deras sängkläder tillsammans med de injicerade avkomman. Se till att de injicerade valparna förvärva doften av hennes biologiska avkomma för att öka acceptansen för de nya valparna.
   4. Placera bara de injicerade valparna tillbaka till fostermodern bur. Slakta alla återstående valpar från fostermodern.
4. Se till att mamman sköter och vårda de injicerade valpar inom 10 min för att placera dem i buren. Om modern inte samla valparna inom denna tid, överför valpar till en annan fostermor.
5. Märk buren med en biologisk fara kortet för att visa att det innehåller viralt-injicerade djur. Hus buren i ett godkänt område för 72 timmar.
6. Efter 72 timmar karantänperioden, överföra mor och valpar (men inga sängkläder eller andra bur objekt) till en ren bur. Utför denna överföring i en nivå 2 biosäkerhet skåp för att undvika exponering för eventuella viralt förorenat strö. RETURN den ren bur med de injicerade djur till den vanliga musen anläggning.
7. Placera smutsig bur i ett biologiskt påse, sterilisera i autoklav, och sedan tillbaka buren till terrariet.

7. Cleanup

1. Placera den återstående viruslösningen vid 4 ° C för framtida bruk. Viruset behåller transduktionseffektiviteten under minst 2 månader vid förvaring vid 4 ° C ^8.
2. Desinficera injektionsnål och spruta med 2% blekmedel, följt av upprepade sköljningar i avjoniserat vatten.
3. Rengör arbetsområdet med 2% blekmedel, följt av 70% etanol.
4. Samla alla engångsartiklar inklusive pipettspetsar, rör, mask och handskar i en plast biologiskt påse. Ta hand om avfall i enlighet med lokala lagar och institutionella politik (dvs. autoklav eller förbränner).

8 Förbered mus Brains för Imaging

1. Placera en injicerad musen till en koldioxid dödshjälp kammare vid 34 veckor efter injektion. Följ institutionens riktlinjer för lämpliga dödshjälp förfaranden. Inte BEGJUTA djur med paraformaldehyd eftersom detta kommer att släcka fluorescensetiketten.
2. Ta bort hela hjärnan från skallen och fastställa till 3-12 timmar i 4% paraformaldehyd i PBS vid 4 ° C.
3. Överför fast hjärnan till 30% sackaros för kryoskydd. Inkubera vid 4 ° C tills hjärnan sjunker till botten.
4. Samla en hink med fint krossad torris. Skär hjärnan i hälften ner mittlinjen. Bury hjärnhalvorna i torris att frysa.
5. Kyl den mikrotom skede genom tillsats av torr is och 100% etanol.
6. Säkra hjärnan till scenen med mittlinjen ner med PBS, och låt frysa.
7. Sektion genom hjärnan vid 30-45 ìm tjocklek med hjälp av en frys glidande mikrotom.
8. Placera sektioner i 24-brunnars plattor innehållande antifryslösning (250 ml glycerol, 300 ml etylenglykol, 500 ml 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4). Täckplåtar with stanniol och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
9. Samla avsnitten 1-4 brunnar och tvätta 3x i PBS.
10. Montera sektionerna på objektglas och täckglas. Låt objektglasen torka på mörk plats.
11. Bild glider med lämpliga filter för infödda YFP eller tdTomato att kontrollera viruset transduktion mönstret.

Representative Results

Framgångsrika intraventrikulär viral injektion ger omfattande och robust neuronal uttryck. Här har vi utvärderat viral transduktion använder YFP eller tdTomato fluorescerande gener under kontroll av kyckling beta aktinpromotor (CBA promotor). Dessa konstruktioner förpackades i AAV8 och injiceras i de laterala ventriklarna av neonatala (P0) ICR-möss. Höga virala titrar (10 ¹⁰ partiklar per hemisfär) resulterade i tät märkning av luktloben, striatum, hjärnbarken, hippocampus och cerebellum (Figur 1A, vänster). Märkning var också tydlig i cerebellära Purkinje nervceller, men särskilt frånvarande från cerebellära granulära neuroner som ännu inte finns i stort antal på P0. Injektion av färre viruspartiklar (10 ⁷⁾ resulterade i gles märkning och lägre intensitet uttryck (Figur 1A, höger). Vi använder ofta AAV8 inom ett koncentrationsintervall mellan 10 ⁷ och 10 ¹⁰ partiklar per halvklotet som en n enkelt och tillförlitligt sätt att kontrollera graden av transgen mosaicism produceras genom injektion (Figur 1B). Vi har också anpassat tekniken för att uttrycka flera transgener genom samtidig injicering två eller flera virus. Samtidig injektion av två virus förpackade i samma serotyp (dvs både AAV8) förspänner resulte transduktion till överlappande neuronala populationer, så att många celler uttrycker båda transgener (Figur 2A). Vid lägre koncentrationer, uttrycksmönstren blir mer självständiga, och den procentuella andelen sam-märkta celler minskar (Figur 2B). Icke överlappande uttryck kan också åstadkommas genom samtidig injicera olika AAV serotyper. Samtidig injektion av AAV1 och AAV8 kodar distinkta fluorescerande reportrar producerar en stor del oberoende mönster av dubbla mosaicism (figur 2C).

ig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1 Viral titer kan användas för att reglera densiteten av viral transduktion. (A) Ett brett utbud av transgen mosaicism kan uppnås genom utspädning av viruslösningen från 10 ¹⁰ ner till 10 ⁷ partiklar / halvklotet. Representativa bilder av sagittal avsnitten visar två distinkta transduktion mönster baserade på viral titer. Bilder togs från möss skördade 3 veckor efter injektion med AAV8-YFP att leverera 2,0 x 10 ¹⁰ (till vänster) eller 5,0 x 10 ⁷ (höger) partiklar / halvklotet. (B) Högre förstoring bilder av cortex (övre raden) och lillhjärnan ( nedre raden) visar det spektrum av transgen mosaicism uppnås genom seriespädning av AAV8. Transduktion visualiseras av infödda YFP fluorescens. Exponeringstider för hela hjärnan bilder bestämdes genom cortex och hippocampus, som fluorescerar mest ljust, medan exponeringstider för det förstorade paneler justerades för att visa mönster inom varje region. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 titer och serotyp självständigt kontrollera graden av viral samuttryckning. Bilderna visar transduktion mönster i hjärnbarken (A, B) och lillhjärnan (C) 3 veckor efter virusinjektion. (A) Samtidig injektion av två AAV8 virus som innehåller olika fluorescerande reportrar (tdTomato eller YFP) producerade omfattande transduktion i hela hjärnan. Majoriteten av omvandlade celler uttryckte båda transgener. (B) Samtidig injektion av samma virus vid lägre titer producerade glesa uttryck av varje protein, där färre celler omvandlade av båda virusen. (C) Co-injection av AAV förpackade i olika serotyper (AAV8 och AAV1), även vid måttligt höga titrar, producerat en stor del icke-överlappande mönster av viral uttryck. Mönstret för varje fluorescerande proteinet var nästan identisk med dess expression när den injiceras enbart, vilket tyder på att transduktion av en AAV är oberoende av den andra. TdTomato fluorescens i rött, YFP i grönt. Transduktion visualiseras av infödda fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi har beskrivit ett mångsidigt förfarande för att manipulera neuronal genuttryck genom att använda AAV som ett medel för utbredd leverans i neonatal mushjärna. Jämfört med andra metoder för neuronal transgenes såsom i livmodern elektroporering ^en eller stereotaxisk intrakraniell injektion ^2,3, är neonatal viral injektion relativt lätt och enkel. Den grundläggande proceduren kan utföras på några minuter med bara en ice och en mikroliter spruta. Optimal överlevnad och transgenexpression kan uppnås genom att delta på några tekniska detaljer, den viktigaste är kvaliteten på virala lager, timing och precision för injektion, och postnatal vård.

Kvaliteten av viral beredning är kritisk för framgångsrik transduktion. Bad virala preparat kommer att avsevärt minska neuronal smittsamhet och producera betydande astrocytisk transduktion, eventuellt genom fagocytos av icke-infektiösa partiklar. Många universitethar kärn laboratorier på plats som är specialiserade på viral förpackningar och stora anläggningar vid University of North Carolina och University of Pennsylvania erbjuder hög kvalitet off-the-shelf reagenser i en mängd olika serotyper till reducerad kostnad. Dessa anläggningar ger också anpassade förpackningar för vektorer som inte är tillgängliga som färdigförpackade bestånd. En gång fick in i laboratoriet, kom ihåg att AAV-partiklar kan vara stabila i flera år vid -80 ° C, men är mycket känsliga för temperatursvängningar. Av denna anledning bör alikvoter förvaras vid -80 ° C och bör inte frysas en gång tinats.

För högsta transduktion effektivitet är det viktigt att injicera viruset så snart som möjligt efter valpar levereras. Utifrån våra studier med AAV8 och de av våra medarbetare, fördröja injektionerna inte bara minskar spridningen av viruset från ventrikeln, men kommer också att förspänna transduktion från nervceller till astrocyter ^6,7. Därför rekommenderar vi injecting på dagen för födelsen för optimal neuronal uttryck. I den här åldern - innan cerebrospinalvätskan-hjärnbarriären har mognat ⁹ - viruspartiklar injiceras i den laterala ventrikeln diffunderar hela kammarsystemet och sedan följa flödet av ryggmärgsvätska i hjärnan ^4. Följaktligen är exakt kalibrering av den laterala ventrikeln avgörande för att maximera viral spridning. Noggrann inriktning minimerar även vävnadsskada från den snabba injektionen av en relativt stor volym av fluid. Därför rekommenderar vi starkt upprepade praktiken tills inriktning på de laterala ventriklarna blir tillförlitlig och reproducerbar. Observera att koordinaterna anges i detta protokoll är lämpliga för allmän P0 valpar och bör justeras för stammen och ålder av experimentella valpar. Initialt bör injektionerna utföras med färgämneslösningar, såsom trypanblått eller tusch, så inriktningen och spridningen kan visualiseras genom att skörda hjärnan omedelbart efter injektion. Jagf de laterala ventriklarna har framgångsrikt riktade, kommer färgen spred sig över hela kammarkamrarna och synas hela vägen från luktbulben till lillhjärnan. En stereotaktisk enhet rekommenderas om kamrarna inte tillförlitligt kan riktas med fri hand injektion.

Om injektionerna utförs korrekt, andelen möss förlorade mot injektion kommer att vara försumbar. Istället är överlevnaden efter injektion mest drabbade av mödravård. Börja med friska djur. Moderns hälsa indikeras av hennes beteende och hennes päls. Hon bör vara välvårdade och ren. Den kullstorlek kan också vara en indikation på välbefinnande. Friska unga kvinnor ska producera kullar med 6-8 valpar till C57BL / 6, eller 10 - 16 valpar för ICR. Friska valpar ska vara rosa och oregelbunden. Om valparna inte ser bra eller inte har någon mjölk fläck på magen, bör de överföras till en ny foster hona omedelbart. Vi rekommenderar ICR eller FVB för att främja eftersomde producerar gott om mjölk och lätt acceptera nya valpar i deras kull. Det är viktigt att störningar mamman minimeras före och efter injektionerna som stress kan orsaka henne att avvisa eller kannibalisera valparna. Minska stressfaktorer genom att begränsa buller, ljus och andra störningar och hålla buren på en lugn plats. Öppna buren så lite som möjligt vid kontroll av nyfödda valpar och i de första dagarna efter injektionen, även om det är viktigt att övervaka moderns uppmärksamhet till valparna när de ersätts. Mamman ska visa medfödda beteenden som bunching valparna på ett ställe och sitter ovanpå högen avkommor. Om modern inte svarar direkt när valparna kommer tillbaka till buren, försök igen att blanda valparna med smutsiga sängkläder och bomaterial från hennes bur se till att de har fått hennes doft. Kontrollera igen senare på dagen att valparna fortfarande mjölk fläckar på magen. Om möjligt, gör detta genom att titta in i buren frånundertill istället för att öppna buren från ovan. De första dagarna är mest kritiska för överlevnad, men också när honan är mest känsliga för störningar.

När du är klar noga, ger intraventrikulär AAV injektion ett snabbt och enkelt sätt att manipulera neuronal genuttryck in vivo utan kostnad och tid för traditionella könsceller transgenes. Personen mosaicism av viral transduktion kan utnyttjas för att styra tätheten av uttrycket, vilket gör det till en idealisk metod för experiment för att åtskilja cell inneboende och cell yttre konsekvenserna av genmodifiering. Dessutom kan två virus vara co-injicerade gör det möjligt att uttrycka flera proteiner i antingen överlappande eller distinkta neuronala populationer. Dessa manipulationer belysa flexibiliteten i strategin, men vi tror att vi har bara skrapat på ytan av sin potential. Den växande tillgången på off-the-shelf reagenser kommer att göra det lättare att utveckla viral injektion feller nya experimentella behov, samtidigt som uppkomsten av hybrid serotyper distinkta tropisms kan expandera den cellulära repertoar som kan riktas ^10,11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal