Abstract
Au cours de la spermatogenèse chez les mammifères et chez Drosophila melanogaster, les cellules germinales mâles développent dans une série de processus de développement essentiels. Cela comprend la différenciation d'une population de cellules souches, l'amplification mitotique et la méiose. En outre, les cellules germinales post-méiotiques sont soumis à un procédé de déformation morphologique ainsi que dramatique une reconfiguration globale épigénétique de la chromatine, le commutateur histone-à-protamine lignée germinale.
Etudier le rôle d'une protéine dans la spermatogenèse post-méiotique par mutagenèse ou d'autres outils génétiques est souvent entravée par embryonnaire essentiel, pré-méiotique, ou des fonctions de la méiose de la protéine à l'étude. Le phénotype post-méiotique d'un mutant d'une telle protéine peut être masquée par un bloc plus tôt de développement, ou de l'interprétation du phénotype pourrait être compliqué. L'organisme modèle Drosophila melanogaster offre une voie de contournement à ce problème: les testicules intacts etmême kystes de cellules germinales disséqués à partir de nymphes précoce sont capables de développer ex vivo dans du milieu de culture. Faisant usage de ces cultures permet l'imagerie microscopique des cellules germinales dans les testicules vivre et de kystes de la lignée germinale. Fait important, les testicules cultivées et des cellules germinales deviennent également accessibles aux inhibiteurs pharmacologiques, ce qui permet la manipulation des fonctions enzymatiques au cours de la spermatogenèse, y compris les étapes de post-méiotique.
Le protocole présenté décrit comment disséquer et de cultiver les testicules des pupes et des kystes de la lignée germinale. Informations sur le développement des testicules des pupes et des conditions de culture sont prévues parallèlement aux données d'imagerie de microscope de testicules en direct et les kystes de la lignée germinale dans la culture. Nous décrivons également un test pharmacologique pour étudier la spermatogenèse post-méiotique, illustrée par un essai ciblant le commutateur histone-à-protamine en utilisant l'acide anacardique inhibiteur d'histone acétyltransférase. En principe, cette méthode de culture peut être adapté pour répondre à de nombreux oquestions de recherche utres de la spermatogenèse avant et après la méiose.
Introduction
Le développement des cellules germinales mâles de nombreuses espèces est un processus séquentiel. Il est caractérisé par une série d'événements cruciaux qui culmine dans la formation des spermatozoïdes morphologiquement et épigénétique hautement spécialisé. Dans Drosophila melanogaster, les cellules souches de germes de ligne à la pointe de la fracture du testicule asymétrique pour donner naissance à une nouvelle cellule souche et la spermatogonies, c'est à dire, la cellule fille qui se consacre à la différenciation (voir la figure 1 pour un aperçu) 1,2 . Le spermatogonium subit quatre séries de divisions mitotiques et, avec le début de la méiose, une phase de croissance impressionnante et l'activité transcriptionnelle appelé le stade de spermatocytes. Les cellules provenant d'une spermatogonie restent reliés les uns aux autres et se développent sous forme de faisceau synchronisée enveloppé par deux cellules somatiques a la structure dénommée un kyste. Après l'achèvement de la méiose, la morphologie des cellules germinales mâles est tout à faitrénovée (représenté schématiquement sur la figure 1). Dans un premier temps, les spermatides ronds allongés pour former la structure hydrodynamique de la tête, et le flagelle se développe. Finalement, les spermatozoïdes sont séparés l'un de l'autre par un mécanisme complexe, lié à l'apoptose appelé individualisation 3-5.
Chez de nombreuses espèces, y compris Drosophila melanogaster et espèces de mammifères, les changements morphologiques des cellules germinales sont accompagnés par un réarrangement épigénétique remarquable de l'homme de la chromatine des cellules germinales haploïdes, appelé le commutateur histone-à-protamine (commutateur HP) 6 - 9. Peut-être la quasi-totalité de l'histone canonique et de nombreuses molécules d'histone-variantes sont supprimés à partir de l'ADN et sont remplacées par de petites protéines basiques, les protamines, résultant en la structure de nucleoprotamine très compact spécifique de la chromatine de spermatozoïdes matures. Caractéristiques générales du commutateur HP sont til remplacement des histones canoniques première par des variants d'histones, puis par les protéines de transition, et, enfin, par des protamines. Tout cela est accompagné par plusieurs changements à des marques épigénétiques, comme une augmentation des niveaux de l'histone H4 d'acétylation juste avant le retrait de l'histone 7,10 - 12.
La plupart, sinon la totalité, des procédés mentionnés ci-dessus sont essentiels pour le développement du sperme mûr, entièrement fertiles. Cela est vrai non seulement chez la drosophile, mais aussi chez les humains, que les actions de la spermatogenèse mammifères une quantité considérable de similitude avec le 1,8,9 système invertébrés. L'étude du développement des cellules germinales mâles est grandement facilitée dans le système de modèle de Drosophila. Les mouches sont génétiquement très accessible. La génération de mutants, ainsi que la création de souches de mouches exprimant des gènes de fusion ou des constructions d'interférence de l'ARN prend peu d'effort. Cependant, dans l'étude de la spermatogenèse post-méiotique, l'utilisation de mutants d'd outils génétiques simples pourraient atteindre une limite. Chez la drosophile spermatogenèse, la transcription cesse presque complètement à l'entrée dans les divisions de la méiose. Ainsi, la spermatogenèse post-méiotique est basée principalement sur des ARNm translation refoulées et stockées synthétisés dans un la méiose prolongée de 13 à 16. Par conséquent, des outils tels que l'interférence ARN ou l'utilisation de mutants non-conditionnelles ne sont pas adaptés pour étudier spécifiquement les rôles post-méiotiques de produits de gènes qui remplissent également des fonctions essentielles dans le développement des cellules germinales pré-méiose ou de la méiose.
Un avantage de la drosophile qui peut être exploitée dans un tel cas, c'est la capacité de testicules intacts disséqués et même des kystes de cellules germinales à développer ex vivo dans un milieu de culture 4,12,17 - 20. La dissection et la culture des testicules ou des kystes lignée germinale permet non seulement l'observation microscopique du développement des cellules germinales dans les cellules vivantes, mais unLSO l'utilisation d'essais pharmacologiques, par exemple, des inhibiteurs de complexes enzymatiques tels que histones acétyltransférases (HAT), les histone désacétylases (HDAC), ou les topoisomérases, le protéasome. Ainsi, il est possible de manipuler les fonctions enzymatiques cours de la spermatogenèse post-méiotique et de suivre les résultats du développement, indépendamment des fonctions embryonnaires, pré-méiotiques, ou la méiose 4,12.
Dans des essais pharmacologiques, nous avons analysé précédemment la localisation d'acétylation dépendante d'une protéine de bromodomain pendant la méiose ainsi que la pertinence des niveaux d'histone acétylation pour le commutateur HP épigénétique de la spermatogenèse post-méiotique en utilisant des inhibiteurs spécifiques ciblant les chapeaux et les HDAC 12,21. Cibler le commutateur HP dans ces essais a été rendu possible en utilisant une souche de mouche qui exprime les gènes de fusion histone2AvD-DP et protamineB-eGFP 12,22 dans les modèles endogènes, et l'observation queles premiers spermatides dans les testicules des pupes passent par le commutateur HP entre 24 et 48 h 12 APF.
Le protocole présenté décrit la dissection des testicules et des kystes de la drosophile pupes, les conditions de culture, et un test pharmacologique avec les testicules de nymphe intactes. A cet effet, les testicules de nymphe à environ 24 h après la formation du puparium (CSA) sont disséqués (voir les figures 1 et 2). A ce moment, les testicules ont pas fait des connexions à d'autres tissus et sont entourés par une gaine extérieure seulement mince, ce qui permet une meilleure pénétration des composés inhibiteurs 23,24. Les testicules sont les organes de haricot ou en forme de poire qui peuvent être facilement pris en culture. Ces testicules sont disséquées, cultivées et traitées avec des inhibiteurs spécifiques. Par la suite, les effets des inhibiteurs sont surveillés à l'aide d'analyses par immunofluorescence et microscopie de fluorescence de l'expression de la protéine de fusion, et par comparaison de la MORPHOL nucléairegie des cellules germinales traitées à celui des cellules germinales non traités. Les conditions présentés dans ce protocole permettent également imagerie en temps réel de développer des testicules et des kystes de la lignée germinale dans la culture.
Protocol
Déclaration éthique:
Les procédures expérimentales décrites dans le présent protocole impliquent travaillent exclusivement avec Drosophila melanogaster et ne sont pas soumis aux lois de protection des animaux en Allemagne.
1 Préparation des médias, outils et mouches
- Préparer le milieu de croissance modifié disponible dans le commerce en poudre M3 sans bicarbonate de potassium 17. ATTENTION: Irritant pour les yeux et la peau. Compléter le milieu avec du sérum de veau fœtal à 10%, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Utilisez sérum de veau foetal inactivé par la chaleur et les insectes-culture-testé pour de meilleurs résultats. Filtrer le milieu complet (ci-après dénommés moyenne) à travers une unité bouteille-haut filtre de 0,2 um et stocker à -20 ° C. Avant utilisation, le filtre (0,2 um bout filtre de la seringue), le milieu nouveau pour enlever précipités.
- Préparer des solutions inhibiteur d'achat d'actions pour les essais pharmacologiques. Dissolve les produits chimiques dans le solvant et magasin approprié en aliquotes. Par exemple, préparer une solution mère d'acide anacardique mM 28.69 (ATTENTION: Irritant pour les yeux et la peau) dans le diméthylsulfoxyde.
- Préparer les outils de la perturbation des testicules pupes disséqués et dissection de kystes simples. Utilisez deux aiguilles pointues et rigides, plutôt que d'une paire de pinces. La force capillaire qui se développe entre les deux bras d'une paire de pinces permet la dissection de kystes simples dans de petites quantités de milieu très difficile. Par exemple, utiliser la pointe d'une épingle de l'insecte en acier inoxydable inséré dans un support de boucle d'inoculation.
- Afin d'obtenir des pupes appropriée ans, graine environ 10 grands flacons de culture (tubes avec 4 cm de diamètre) avec un nombre suffisant de mouches adultes (environ 40-60 mouches). Pour analyser le commutateur HP, utilisez les mouches exprimant H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP dans leur modèle endogène 12,16,22. Incuber les flacons dans des conditions normales à 25; ° C pendant environ 4-5 jours jusqu'à ce troisième stade larvaire crawl et commencer la nymphose sur les parois des flacons 25.
2 Marquage ou collecte blanc pré-nymphes pour obtenir 24 h âgé de pupes pour dissection
- Pour tester l'influence de certains produits chimiques sur le commutateur HP, disséquer les testicules de nymphe à environ 24 h 12 APF. Pour obtenir pupes mise en scène, de prendre les flacons de culture préparés à la mouche avec pupifier larves (voir section 1.4) et d'identifier le plus grand nombre de pré-pupes blanc que possible. Pré-nymphes au cours de la toute première étape de la nymphose semble immobile, non-alimentation, les larves plutôt raccourci avec stigmates éversées et pupe de couleur blanche. La pupe devient beige brun dans 30 à 60 min, ce qui indique la prochaine étape de développement de pupe 26.
- Marquer les positions de la pré-pupes avec un marqueur permanent à l'extérieur des flacons. Incuber les tubes à 25 ° C pendant environ 24 heures.
- Alternativement,choisir le pré-pupes du côté des flacons avec un petit pinceau humidifié avec du tampon PBS. Puis transférer le pré-nymphes sur le côté d'un nouveau tube de 50 ml de réaction et incuber à 25 ° C pendant environ 24 heures.
3. Dissection de la nymphe testicules à environ 24 heures après la formation Puparium
- Distribuer quelques gouttes (environ 80 pi) de chaque support 10 cm sur une culture cellulaire en plastique ou une boîte de Petri. L'utilisation d'un large paire de pinces ou un pinceau humidifié avec le milieu, ramasser les nymphes au stade de l'APF de 24 heures à partir des flacons incubés (voir section 2). Transférer un nymphe à chaque goutte de milieu sur le plat.
- Pour la dissection, en utilisant un stéréomicroscope équipé d'un illuminateur à fibre optique. Ne pas chauffer les testicules dessus RT lors de la dissection, cela pourrait empêcher le bon développement de la culture.
- Disséquer les nymphes avec deux paires de n ° 5 forceps. Avec une paire, prenez la nymphe à sa plus postérieurepartie (les stigmates postérieurs) et maintenez-le en position.
- Prenez les stigmates antérieurs avec l'autre paire de pinces et d'ouvrir l'opercule de chrysalide à son extrémité antérieure. Décoller la coque de nymphose jusqu'à au moins une partie du thorax est exposé.
- Maintenez la chrysalide en position par son extrémité la plus postérieure. Pour relâcher la pression interne de la nymphe, insérer les deux bras d'une paire de pinces dans la région de la tête de la nymphe.
- Rip la nymphe ouverte en ouvrant la pince et le déplacement de la pince dans la direction antérieure. S'assurer que l'ouverture produite par ce mouvement est aussi grande que possible dans la première tentative. Éviter d'endommager la nymphe à son extrémité postérieure avant que la pression a été libérée, car cela pourrait entraîner dans les testicules poussés directement par la petite ouverture et le plus souvent perturbées.
- Remarquez que lorsque la nymphe est ouvert, la pression interne publié de la nymphe appuie sur des agglomérats de cellules de graisse corporelle et de tissus à travers le large ouverture dans la région de la tête. Vérifiez si les testicules des pupes ont déjà été poussé hors de la nymphe avec ce matériel; cela se produit dans certains cas. Les testicules ne sont pas connectés à tout autre tissu à 24 h APF et donc pourraient être expulsés facilement de la pupe 23.
- Éviter de serrer la nymphe avec la pince, car cela pourrait endommager les testicules si elles restent dans la pupe. Augmenter la taille de l'ouverture à l'aide d'une paire de pinces.
- Ensuite, maintenez la nymphe à son extrémité la plus postérieure. Fermez l'autre paire de pinces et doucement série sur le contenu de la chrysalide d'arrière en avant pour libérer les testicules de la pupe.
- Recueillir les testicules en les tirant dans une pipette 200 ul prédécoupé. Essayer de transférer seulement une très petite quantité de fluide pour réduire le nombre de cellules du corps gras transférées avec les testicules. Placez les testicules en moyenne dans une boîte de culture frais. Laver les testicules plusieurs fois avec du milieu jusqu'à ce que la cellule de corps peu de graisses restent.
- Pour l'imagerie en direct, transférer les testicules à une boîte de culture à fond de verre avec le milieu et utiliser une imagerie microscope inversé. Pour les essais pharmacologiques, passez à l'étape 5.
4. Dissection de kystes sur la lignée germinale mâle et d'imagerie en direct
- Transférer un ou plusieurs testicule des pupes à une boîte de culture à fond de verre.
- Utilisez un stéréo-microscope avec fibre optique éclairage et deux aiguilles en acier inoxydable (voir section 1.3) pour la dissection de kystes mâles de la lignée germinale.
- Avec une aiguille, essayez avec soin pour cerner un testicule à sa antérieure ou postérieure fin. Le maintenir en position. Insérez l'autre aiguille dans le testicule et perturber la gaine du testicule en déplaçant l'aiguille sur le côté. Beaucoup de kystes seront libérés à partir du testicule par ce mouvement.
- Continuez à maintenir le testicule en position avec une aiguille. Série délicatement les kystes restants du testicule avec l'autre aiguille.
- Kystes agrégés séparés soit par gentment le déplacement d'une aiguille latéralement à travers la grappe de kystes ou en transférant les kystes à une boîte de culture frais avec le milieu à l'aide d'une pipette de 200 pi.
- Déplacer la boîte de culture à un microscope inversé d'imagerie pour l'imagerie en direct de kystes simples. Disperser kystes à nouveau avec une aiguille si nécessaire.
- Identifier la phase des kystes à l'aide de contraste de phase et par microscopie de fluorescence.
- Focus sur un kyste de la scène souhaitée. Confirmez accent et la position du kyste fréquemment pendant plus des expériences d'imagerie, comme les kystes ne se conforment pas au fond de la boîte de culture et ont donc tendance à flotter hors de discussion.
REMARQUE: revêtement du plat avec de la poly-L-lysine pour l'immobilisation est préjudiciable au développement des premiers kystes de la lignée germinale. Au lieu de cela, les kystes individuels peuvent être isolés. Avec un peu de pratique, il est possible de distinguer un kyste particulier en poussant très doucement avec l'aiguille. Cela permettra le transfert des kystes simples de culte séparéure plats avec une pipette Pasteur en verre avec une pointe haleine qui s'insère dans le champ de vision du microscope. Les kystes isolés peuvent ensuite être facilement transférés dans des boîtes de culture, même après incubation à long terme.
5. pharmacologique analyse avec Intact testicules pupes
- Remplir chaque puits d'une plaque à 24 puits de culture de cellules avec 500 ul de milieu pour une expérience de 12 répétitions. Transfert d'une pupe testicule dans chaque puits, à l'aide d'une pipette 200 ul prédécoupé.
- Vérifier la présence des protamines dans les testicules isolées en utilisant un microscope inversé à fluorescence. Les testicules doivent être exempts de signaux ProtamineB-eGFP, qui indique que le commutateur HP n'a pas eu lieu dans l'une des kystes. Remplacer les testicules qui montrent déjà des kystes ProtamineB-eGFP-positifs.
- Pour les 12 premiers puits, ajouter 500 ul de milieu contenant le composé d'inhibiteur dilué (acide anacardique) pour atteindre la concentration finale souhaitée(150 uM) dans 1 ml de milieu par puits. Utilisez les puits restants comme témoins non traités; ajouter 500 ul de milieu avec la même quantité de solvant utilisée comme avec les composés inhibiteurs. Remarque: Si de nombreux composés différents et des solvants sont utilisés, il peut être plus efficace d'utiliser en tant que seul moyen de contrôle et de tester l'influence de l'augmentation des concentrations de solvant dans des expériences séparées.
- Incuber la plaque à 25 ° C pendant 24 heures dans l'obscurité.
- Vérifier à nouveau la présence de protamines dans les testicules incubées comme décrit ci-dessus. Les testicules de contrôle doivent maintenant montrer un ou plusieurs kystes ProtamineB-eGFP-positifs, ce qui indique transition à travers le commutateur HP.
- En utilisant une pipette avec une pointe de 200 pi, transférer les testicules à lames recouvertes de poly-L-lysine, faire des préparatifs de squash et tache avec des anticorps fluorescents appropriés comme décrit par ailleurs 12,27,28.
Representative Results
Le testicule chez les mâles de Drosophila est déjà formé dans l'embryon et persiste dans la cavité du corps pendant les stades larvaires. Troisième stade larvaire montrent de petits testicules rondes entourées d'une couche de futures cellules pigmentaires et intégrés dans le tissu de graisse corporelle (figure 2A). Les testicules chez les mouches mâles sont longs, des tubes enroulés, qui sont couvertes par une couche de cellules musculaires provenant du disque génital et une couche de pigment 24. Fait intéressant, les testicules larvaires ne contiennent que des cellules germinales de stades pré-méiotiques et méiose jusqu'au stade de spermatocytes primaires, ce qui correspond à la méiose (voir aussi la figure 1) 23. Les premières cohortes de cellules germinales mâles passent à travers la méiose pendant la formation du puparium. À environ 24 h APF, les étapes post-méiotiques avec flagelles allongée ont déjà mis au point, et tous les noyaux contenir histone H2AvD-DP (figures 1 et 2B). Aucun des spermatides ont subi til HP Commutateur aucun signal ProtamineB-eGFP peut être détecté par microscopie à fluorescence (figure 2C). Fréquemment, les testicules disséqués à ce stade contiennent une structure auto-fluorescent de taille variable qui rappelle un agglomérat de cellules du corps gras ou un de plusieurs gouttes d'huile (Figure 2C, tête de flèche). Cette structure à l'intérieur du testicule est également visible au microscope à contraste de phase. À ce jour, nous n'avons pas trouvé de description de la nature dans la littérature. Testicules disséqués à 36 h CSA apparaissent allongées et, dans certains cas commencent déjà à se courber (figure 2D). Ils ont déjà fixé aux tissus du tractus génital croissant à partir du disque imaginai 23,24 génitales. En outre, ils contiennent souvent les premières spermatides au-delà de l'interrupteur HP, comme indiqué par le signal ProtamineB-eGFP (figures 1 et 2D, flèche). A 48 heures CSA, les testicules ont encore allongé et clairement commencent curling à l'extrémité proximale. Plusieurs kystes lignée germinale avec des noyaux de protamine positif deviennent visibles (Figure 2E, flèche).
Lorsque les testicules disséqués à 24 h APF sont maintenues en culture pendant 24 heures, ils ne s'allongent pas comme dans la mouche intact (comparer la figure 2D et 2E à la figure 6A). Ceci est probablement dû à un manque de signaux de position et de croissance normalement envoyées par l'appareil génital développement mise en contact du testicule à son extrémité postérieure 23,29. En outre, la couche musculaire de la gaine de testicules ne se développe pas parce que les myotubes naissants peuvent pas migrer à partir du disque génitale au testicule 24. La gaine dans cette situation testicule uniquement le pigment mince couche-ne semble pas se développer suffisamment dans la culture de l'enveloppe le nombre croissant de développer des cellules germinales au sein. Cependant, les cellules germinales croissent, se divisent, se différencient et indépendamment de la gaine du testicule. Ainsi, après plus de 36 hr dans la culture, au début des testicules sera souvent éclater, et le développement n'est pas observé. Cependant, dans un laps de temps plus court, il est possible d'enregistrer time-lapse ex vivo des images en direct de testicules entiers développement de la culture, comme en témoignent les figures 3A -3 C (voir également la vidéo supplémentaire 1). Un testicule pupe, disséqués à environ 45 h APF, a été incubé dans un milieu pendant 6 heures et imagée à toutes les 5 min. Dans ce laps de temps, plusieurs kystes de spermatides émergent de la scène de commutateurs HP et montrent un (3A Figures '-3 C, flèches ouvertes) lumineux signaux ProtamineB-eGFP.
Comme mentionné ci-dessus, les cellules germinales mâles dans les testicules Drosophila développent comme des faisceaux synchronisés de cellules interconnectées, kystes nommés 1. Figure 4A montre un aperçu des kystes disséqués à partir d'un testicule de chrysalide à environ 24 h APF. Stades pré-méiotiques, Les étapes de la méiose, premiers stades post-méiotiques, et kystes aussi dans le stade précoce de canoë avec des noyaux allongés avant le commutateur HP peut être trouvé (figures 1 et 4B -4 E). Les kystes isolés sont très fragiles et doivent être manipulés avec précaution. Les deux cellules somatiques qui forment l'enveloppe du kyste peuvent être facilement perturbé mécaniquement. Les cellules souches de lignée germinale ont la capacité de survivre et de poursuivre la division après ablation génétique des cellules somatiques de kystes dans 30 vivo. Il a été rapporté que in vitro, les cellules germinales de l'étape 16 cellules séparées de leur enveloppe somatique développer et de se différencier de plus de 19. En effet, nous avons remarqué dans notre système de culture qui spermatocytes probablement fin complétées divisions méiotiques avec des cellules de kyste perturbé, bien que très rarement. Le plus souvent, ces kystes perturbé cessé développement. En suivant le protocole présenté, kystes intacts pourrait dans certains cas devElop ex vivo dans un milieu de culture pour un maximum de 72 heures. Cependant, nous avons observé qu'un nombre raisonnable de kystes survivre jusqu'à 48 heures d'incubation. Dans ce laps de temps, les kystes de culture sont capables de se développer à partir du stade de spermatocytes primaires qu'après divisions méiotiques ainsi que de la scène ronde de noyaux à chromatine base histone-jusqu'à la fin du stade de canoë-delà de la HP passer 12. Cela permet l'imagerie en direct des processus vitaux de la spermatogenèse, comme par exemple, les spermatocytes entrer divisions méiotiques (Figure 5 et vidéo supplémentaire 2). Pour cette expérience, le variant d'histone-DP H2AvD étiqueté a été utilisée comme marqueur chromosomique. Le stade de spermatocytes primaires s'étend sur env 3 jours in vivo 31. Par conséquent, afin d'enregistrer les divisions de la méiose, nous avons choisi des kystes avec spermatocytes qui avait visiblement ouvertes condensation de la chromatine (figure 5A, la région 2). Division de la méiose commence en spermatocytessur un côté du kyste et suit une vague dans les spermatocytes restants alors (figure 5A de la région 2 à la zone 1, voir aussi la vidéo supplémentaire 2). La condensation de la chromatine a tôt fait de chromosomes rapides qui sont visibles sous forme de taches lumineuses (figure 5A, la région 2). Après 30 min, les premiers spermatocytes de cette région sont déjà en telophase (Figure 5B, des pointes de flèches). Les chromosomes de la jeune une région à organiser la plaque métaphasique 20 min plus tard (Figure 5C). Ils télophase complète et sont prêts à subir la cytokinèse environ 15 minutes plus tard (Figure 5D). Anaphase, télophase et cytokinèse a duré environ 10 minutes dans cet enregistrement (vidéo supplémentaire 2).
Chez les mammifères, ainsi que chez la drosophile, une augmentation prononcée de l'histone H4 acétylation marque le début de l'enlèvement de l'histone et le commutateur HP au cours de post-méiotiquespermatogenèse 6,11. Il a été proposé que cette modification épigénétique est une composante essentielle, voire le déclenchement du programme de développement de la HP basculer 10,32. Auparavant, nous avons traité de drosophile testicules de pupes dans la culture avec des inhibiteurs ciblant HAT et HDAC pour influer sur le niveau de l'histone H4 d'acétylation pendant les phases post-méiotiques 12. Dans ces essais pharmacologiques, nous avons trouvé que l'acétylation des histones est essentiel pour la progression de la spermatogenèse étapes de base de la chromatine avec l'histone-étapes de base de la chromatine avec la protamine.
Les figures 6 et 7 montrent des résultats représentatifs d'un essai pharmacologique utilisant de l'acide anacardique de cibler HAT dans les testicules des pupes. Testicules à 24 h APF ont été disséqués à partir d'une souche de mouche exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP. Protéine ProtamineB-eGFP était absent dans ces testicules pupes début (figure 6A et B). Après 24 hr dans la culture, les testicules de contrôle a montré des signaux ProtamineB-eGFP, ce qui indique que les premiers kystes étaient apparus au-delà du commutateur HP (figure 6A ', pointes de flèches ouvertes). Ce n'était pas le cas avec les testicules traités avec 150 pM d'acide anacardique (Figure 6B). Testicules préparations de squash et des analyses d'immunofluorescence offrent des informations plus détaillées (figure 7). Dans le témoin non traité, les noyaux des spermatocytes primaires relativement grandes peuvent être reconnus par leur aspect caractéristique des trois régions de l'ADN richement coloré, qui correspondent aux grands chromosomes (niveau 4C) de Drosophila (Figure 7A, colonne 1). L'acétylation de l'histone H4 est clairement détectable à ce stade (figure 7B, colonne 1). La première étape après les divisions de la méiose est connu comme le stade Nebenkern et se caractérise par des rondeurs, des noyaux ronde (voir la figure 4C, non représenté sur la figure 7). L'étape suivante montre la figure 7 est identifié par la croissance flagelle et la forme ronde des noyaux des cellules germinales, qui sont déjà beaucoup plus faible que dans les premiers stades (figure 7A, colonne 2) et montrent très faible à des niveaux presque indétectables de l'histone H4 acétylation (Figure 7B, colonne 2). La forme ronde s'allonge alors (figure 7A, colonne 3), et l'acétylation de l'histone H4 est à nouveau clairement détectable (figure 7B, colonne 3). Les spermatides gagnent alors la scène en forme de canot dans lequel le commutateur HP a lieu et les histones sont remplacés par les protamines (figures 7A - 7 C, colonnes 4 et 5). Après l'étape de canoë, les noyaux protaminated alors allongé plus loin dans une forme d'aiguille très fine dans la maturation des spermatozoïdes (non représenté ici).
Préparations testicule de squash de testicules traités avec de l'acide anacardique ont montré différents résultats (figures 7D </ Strong> - 7 F). La chromatine dans les cellules germinales traitées avec de l'acide anacardique est apparu plus condensé que celui des témoins non traités (cf. Figure 7D, on traite et 7A, contrôle). Immunofluorescence Les analyses ont révélé que l'acétylation de H4 est fortement diminuée ou même absente dans les noyaux des cellules germinales traitées avec de l'acide anacardique (Figure 7E). Il est connu que les histones acétylées hautement sont associés à des régions de chromatine ouverte, tandis que les régions qui n'ont pas la chromatine acétylation des histones présentent souvent une structure répressive 33. Par conséquent, il n'est pas surprenant que le traitement avec de l'acide anacardique influencé la structure de la chromatine des noyaux des cellules germinales traitées. Surtout, pas de noyaux de protamine-positif de stade tardif de canoë ou au-delà ont été identifiés dans les testicules traités (figure 7F). Ainsi, nos données sont compatibles avec l'idée que l'activité de la HAT est essentiel pour la spermiogenèse de procéder vientm histone-base de la chromatine à des étapes de la chromatine en fonction de la protamine.
Figure 1: Vue d'ensemble de la drosophile spermatogenèse. Le panneau de gauche affiche la séquence des étapes dans le développement des cellules germinales à partir d'une cellule souche de sperme individualisé. Dessins schématiques montrent la morphologie nucléaire caractéristique des cellules germinales. Un spermatogonies se divise pour produire 16 spermatocytes interconnectés dans un kyste. Au cours de cette étape la plupart des transcriptions nécessaires au développement post-méiotique sont produites, en translation réprimée, et stockés. La majeure partie de l'activité transcriptionnelle se termine avec l'entrée dans les divisions de la méiose. Le commutateur histone-à-protamine dans la chromatine a lieu entre le stade de canoë précoce et tardive. Étapes avec une chromatine base histone-sont élevéséclairée en rouge; étapes avec une chromatine base protamine sont surlignés en vert. Les barres dans le panneau de droite indiquent les étapes de cellules germinales qui peuvent normalement être trouvés dans les testicules développement des larves, pupes à environ 24 et 36 heures après la formation du puparium (APF), et les mouches adultes.
Figure 2 testicules drosophile à différents stades de développement. (A) de l'image en contraste de phase de l'ensemble du montage d'un testicule légèrement écrasé d'une larve de troisième stade (L3). Seuls les stades pré-méiotiques et méiotiques peuvent être trouvés. Les spermatogonies sont limités à la pointe antérieure sous la zone du moyeu (astérisque). Le testicule restant est rempli de spermatocytes (flèche ouverte). (B) de l'image en contraste de phase d'un testicule légèrement écrasé à environ 24 heures après la formation du puparium (APF). En plus de spermatocytes (flèche ouverte), le testicule contient spermatides au stade Nebenkern (têtes de flèches ouvertes), avec des noyaux ronds et spermatides en élongation étapes avec flagelles croissance (double flèche ouverte) (C - E). L'ensemble du montage testicules pupes exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP (superpositions de contraste de phase et eGFP et images de fluorescence de la DP). (C) du testicule chrysalide disséqués à environ 24 h APF. Arrowhead marque auto-fluorescence des putatifs cellules du corps de graisse. D) chrysalide testicules disséqués à environ 36 h APF affiche la première kyste ProtamineB-eGFP-positif (flèche). (E) la nymphe testicule à environ 48 h APF avec un groupe de kystes ProtamineB-eGFP-positifs (flèches). Dans toutes les parties de figure, les astérisques indiquent la région de moyeu. Les barres d'échelle: 100 um.ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Imagerie en temps réel de l'interrupteur histone-à-protamine dans un testicule des pupes de plus en plus ex vivo. (A) de l'image en contraste de phase d'un testicule pupe exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP pris en culture à environ 45 h après la formation du puparium (APF). La vésicule séminale est indiqué par une flèche remplie. Un paragonium (double-flèche) reste attaché au testicule. (A ') et eGFP DP fluorescence du testicule représenté en (A). La flèche indique ouvert un kyste ProtamineB-eGFP-positif. Barre d'échelle:. 100 um (B) Après 2 h 30 min dans la culture, plusieurs autres kystes (flèche ouverte) émerger from la transition histone-à-protamine. (C) Après une ca. supplémentaires 3 h dans la culture, soit un total de 5 h 29 min dans la culture, un groupe de kystes (flèche ouverte) avec un signal fort ProtamineB-eGFP est visible à l'extrémité proximale du testicule. Voir aussi la vidéo supplémentaire 1. Dans toutes les parties de figure, les astérisques indiquent la zone du moyeu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. kystes isolés de cellules germinales à différents stades de développement. (A) Les kystes disséqués à partir d'un testicule à environ 24 heures après la formation du puparium (APF). Superposition de contraste de phase et H2AvD-DP fluorescence (rouge) des images. Barre d'échelle: 100 um.Les grossissements de kystes simples de différentes étapes - (E B). Superposition de contraste d'interférence différentiel (DIC) et des images de fluorescence H2AvD-DP. Barre d'échelle:. 20 pm (B) à kyste de 16 spermatocytes (C) kyste de 64 spermatides rondes au stade Nebenkern.. La structure Nebenkern développe à partir de mitochondries fusionnées et est visible dans les images DIC à côté du noyau (tête de flèche ouverte). (D) kyste de spermatides à noyaux ronde H2AvD-DP-positif et flagelles élongation (flèche vide indique une structure Nebenkern élongation qui accompagne le axonème croissance). (E) de la pointe d'un kyste apical des spermatides au stade de canoë début montrant une forme allongée nucléaire. Les flagelles largement allongée ne sont que partiellement visible. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 images en direct d'un seul kyste de 16 spermatocytes méiose I ex vivo. Des images de fluorescence d'une kyste dans la culture exprimant H2AvD-DP. Représentés sont des étapes caractéristiques de la méiose I. spermatocytes dans le kyste passer par les divisions de la méiose d'une manière comme une vague. (A) La condensation des chromosomes commence dans les noyaux d'un côté du kyste (2) et progresse dans le kyste (direction indiquée par la flèche ). Noyaux dans la région opposée (1) représente un stade plus précoce de la condensation de la chromatine, où des régions d'histone-dense marquant les trois grands chromosomes peuvent encore être discernés. Spermatocytes dans la région (2) contiennent des chromosomes parfaitement résumés, visible sous forme de taches fluorescentes vives. (B) Après le 300; min, les premiers spermatocytes dans la région (2) sont en télophase (têtes de flèches ouvertes), tandis que la condensation des chromosomes continue dans la région (1) (C) Dans les dernières spermatocytes de la région (1), les chromosomes (pointes de flèche) sont disposés. à la métaphase plaque 20 min plus tard. (D) Dans un autre 15 minutes, les dernières spermatocytes semblent avoir achevé la télophase et sont maintenant prêts à subir la cytokinèse (flèches ouvertes). Voir aussi complémentaire vidéo 2 Barre d'échelle:.. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 acide anacardique inhibe l'interrupteur histone-à-protamine dans les testicules des pupes de culture. Testicules pupes expressi ng H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP et disséqués à 24 h après la formation du puparium (APF) ont été incubées pendant 24 heures dans un milieu sans inhibiteur (contrôle, A, A '; DMSO, diméthylsulfoxyde) ou dans un milieu supplémenté avec 150 uM acide anacardique ( B, B '). régions Hub indiquées par des astérisques. (A, B) Pas de kystes ProtamineB-eGFP positives peuvent être observées après dissection. (A ') Après 24 heures d'incubation, certains kystes ont subi l'histone-à-protamine interrupteur et ProtamineB-eGFP-positif kystes (têtes de flèche vides) peuvent être observés. (B ') des testicules traités avec de l'acide anacardique ne développent pas de kystes ProtamineB-eGFP-positifs. Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 7 acide anacardique affecte l'histone H4 acétylation et la structure de la chromatine des spermatides préparations de squash de noyaux spermatides de testicules de nymphose (24 h APF) exprimant ProtamineB-eGFP incubé pendant 24 heures sans inhibiteur (A - C). Ou 150 uM acide anacardique (D - F). ADN coloré avec le colorant Hoechst (A et D). Acétylation H4 analysée par immunofluorescence (B et E). Présence de protamines surveillées avec le signal ProtamineB-eGFP (C et F). Après traitement avec de l'acide anacardique, la chromatine apparaît fortement compacté (D) et le signal d'acétylation H4 est complètement réduite dans toutes les étapes (E) spermatides. En outre, l'acide anacardique-traitéetesticules ne présentent pas de kystes de l'étape de canoë fin ou au-delà et aucun signal ProtamineB-eGFP (F). Barre d'échelle: 10. Pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Supplémentaire Vidéo 1. imagerie en direct via eGFP et DP fluorescence de l'interrupteur histone-à-protamine dans un testicule pupe ex vivo. Vidéo de 6 h imagerie en fonction du temps de plus en plus illustre la transition histone-à-protamine par l'augmentation de la prévalence de ProtamineB- kystes eGFP-positifs. Les images ont été acquises toutes les 5 min. Pour plus de détails, voir la figure 3. (Voir "suppl_video_1.MOV" sous Downloads).
Supplémentaire Vidéo 2 Imagerie en temps réel d'un seul kyste méiose 16 spermatocytes I ex vivo. Time-lapse fluorescent imagerie d'unkyste dans la culture exprimant H2AvD-DP au cours de 80 min. Cette vidéo montre les étapes caractéristiques de la méiose I. Les images ont été acquises chaque 1 min. Pour plus de détails, voir la Figure 5. (Voir "suppl_video_2.MOV" sous Downloads).
Discussion
Le protocole présenté décrit deux applications différentes en fonction à la fois de la capacité à disséquer les testicules chez la drosophile et les kystes seule lignée germinale à un stade de développement donné et sur le développement ex vivo de ces cellules et de tissus dans une boîte de culture. Une application est la manipulation pharmacologique des processus vitaux au cours du développement des spermatozoïdes. Surtout, ce qui permet l'accès à la spermatogenèse post-méiotique qui n'est pas facilement acquise en utilisant des analyses fonctionnelles basées sur la génétique de la mouche. L'autre application est l'observation microscopique de la vie et le développement des cellules germinales et les testicules. En particulier, cette application bénéficie de l'aptitude des cellules de Drosophila et des organes en culture pour survivre et se développer à la température ambiante et sous atmosphère normale. Par conséquent, un microscope d'imagerie inversé équipé d'une platine chauffée (chauffage à la température de reproduction standard de 25 ° C) est suffisante pour obtenir des résultats significatifs dans des expériences d'imagerie en temps réel. Plusplus, de nombreuses souches de mouches transgéniques exprimant des protéines de protéines étiquetées fluorescentes pour l'imagerie en direct existent ou peuvent être facilement établis.
Pour obtenir les testicules des pupes ou des kystes de la lignée germinale d'un stade de développement spécifique, il est crucial que l'on est familier avec le calendrier de développement de la drosophile. Le moment exact de chaque étape peut varier entre les laboratoires, les conditions de culture, et de voler souches et doit être établie de manière empirique. Comme indiqué plus haut, ce qui est particulièrement important pour les essais pharmacologiques, par exemple, ciblent le commutateur HP. Pour ces expériences, il est conseillé de toujours vérifier spermatides avec un signal ProtamineB-eGFP avant le test inhibiteur réelle parce que le timing peut varier légèrement, même dans une seule population.
En suivant le protocole ci-dessus devraient permettre à l'expérimentateur de disséquer les testicules de pupes début comme organes intacts libres de tissu de corps gras ci-joint. Ces testicules et, plus encore, isolés gekystes rm-ligne sont très fragiles. Par conséquent, il est crucial de développer la dextérité manuelle et l'expérience nécessaires pour le traitement et le transfert des testicules et des kystes à l'aide des pinces, aiguilles et les pipettes. Surtout études visant le développement des cellules germinales post-méiotique de la méiose et au début profiteraient de cette situation. Bien qu'il soit relativement facile à disséquer les kystes de spermatides fin ayant une longue flagelles de testicules adultes, il est difficile d'obtenir des stades antérieurs. Dissection ces kystes de testicules de nymphe début suivant ce protocole est beaucoup plus efficace. Gardez à l'esprit que dans une souche de mouche d'habitude, seulement environ 50% des pupes sera mâle. Par conséquent, pour préparer disséquer au moins deux fois plus nombreux que le nombre de nymphes des testicules requises. En variante, il est possible d'identifier mâle larves L3 au moyen d'un stéréo-microscope, comme les testicules peuvent être identifiés organes ronds translucides incorporés dans les tissus latérales du corps en matière grasse de la larve intact 23,34, et pour les recueillir dans des flacons de culture fraîches que boîteêtre utilisées pour enlever pré-pupes pour la mise en scène et des dissections. Il est également possible d'identifier des pré-nymphes mâle 35.
Nous avons remarqué que les deux kystes lignée germinale isolés et les testicules des pupes intactes en culture sont sensibles à la lumière, comme cela a été indiqué précédemment 18. Cette sensibilité à la lumière pourrait également contenir certains composés chimiques utilisés dans les essais pharmacologiques. Par conséquent, il est préférable de conserver les boîtes de culture d'un test dans l'obscurité pendant l'incubation. De même, lors de la planification time-lapse expériences d'imagerie avec testicules en développement et, en particulier, les kystes isolés, gardez à l'esprit que le temps d'exposition trop longues et / ou des taux d'échantillonnage trop élevées peuvent inhiber ex vivo développement. Le taux d'échantillonnage appropriée doit être déterminée expérimentalement.
L'infection bactérienne et / ou fongique et la sur-croissance dans des boîtes de culture pose un problème grave. Des boîtes de culture infectés par le trop grand nombre de bactéries ne supportent pas ex vivo développement des testicules et de kystes. Par conséquent, le milieu de culture décrit contient de la pénicilline et de la streptomycine (voir étape 1.1), mais lors de l'incubation de longue durée, ces antibiotiques peuvent être dégradées et peuvent réduire leur activité. Cela pourrait être une des raisons pour le peu de temps de survie (max. 72 h) des kystes de culture observés lors de l'utilisation du protocole ci-dessus. Pourtant, ce délai ne peut être prolongé par le remplacement régulier du milieu de culture dans les plats. Nous concluons que d'autres facteurs pourraient influer sur la survie de la culture, tels que le manque de signaux provenant d'autres tissus de l'appareil génital de croissance. D'autre part, le développement post-méiotique est plus rapide chez la drosophile que chez les mammifères. Chez la drosophile, la spermiogenèse prend environ 90 heures, et le commutateur HP a lieu entre 50 et 60 heures après la méiose 9,12. Ainsi, le temps de survie d'habitude de l'ordre de 48 heures obtenue avec ce protocole est bien adapté pour suivre les processus de développement pivots dans SPErmatogenesis, telles que les divisions de la méiose ou le commutateur HP. Bien que la contamination bactérienne ou fongique peut être évité en utilisant des outils propres et des médias, le protocole présenté ne fait pas usage de conditions de travail strictement stériles car les mouches voler et testicules contiennent déjà des bactéries lorsqu'ils sont élevés dans des conditions standard. Néanmoins, certaines applications de cette technique de culture pourraient bénéficier de mouches disséquées ou même élevé dans des conditions aseptiques (pour les protocoles, voir 17,36,37).
Dosages pharmacologiques dépendent de l'utilisation de composés chimiques qui agissent comme des inhibiteurs ou des activateurs de divers enzymes. Les composés couramment utilisés dans de telles expériences diffèrent souvent considérablement dans leur spécificité de la cible. Comme un avantage, ce qui offre la possibilité de cibler les classes d'enzymes entières, par exemple, avec de l'acide anacardique inhibant p300 / CBP, PCAF, et les membres de la famille MYST de chapeaux 38. L'inconvénient de ce potentiel pourrait être hors cible ou l 'induction des effets cytotoxiquesé par ces composés. Par conséquent, chaque composé utilisé dans un essai avec des testicules ou des kystes de nymphose doit être testé pour sa cytotoxicité spécifique et l'effet de différentes concentrations. En outre, de légères variations dans les conditions de culture, la concentration ou l'activité composé, et les variations de la perméabilité de la cellule pourraient conduire à la variabilité des effets induits. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller le succès du traitement dans chaque expérience. Par exemple, lorsque nous avons utilisé l'acide anacardique à 150 uM, nous avons observé une légère variabilité dans la force du phénotype de la condensation de la chromatine et entre parfois dans certains testicules, tandis que l'acétylation de l'histone H4 été constamment diminué.
Essais pharmacologiques avec les testicules de drosophile en culture ont été utilisées pour analyser les mécanismes pré-et post-méiotiques de la spermatogenèse 4,12,14,21. Comme il est difficile d'accéder à la spermatogenèse post-méiotique avec des outils génétiques pour cibler des joueurs avec essential fonctions pré-méiotiques et de la méiose, cette approche ex vivo constitue une alternative. Par ailleurs, en principe, la méthode peut être adaptée à pulse-chase expériences pour suivre le développement de cellules germinales traitées au cours du temps. Cependant, nous n'avons pas encore testé cette possibilité. Faisant usage de début testicules pupe est un avantage dans les essais pharmacologiques. Tout d'abord, la gaine externe mince des jeunes testicules pupes (autour de 24 h APF) pourrait permettre une meilleure perméabilité des composés chimiques. Deuxièmement, lorsque l'on étudie le commutateur HP post-méiotique, les testicules des pupes disséqués à 24 h APF de la ligne de mouche protamine-exprimant la GFP permet une lecture directe de savoir si le commutateur HP a été affectée ou non.
À ce jour, plusieurs protocoles de culture ex vivo d'organes et de tissus, y compris les testicules et les kystes de la lignée germinale chez la drosophile ont été développés (par exemple, voir 4,14,17,20,39,40). Le milieu de culture et les conditions générales utiliséesdans le protocole présenté ici ont été établies en 1979 17. Le système de culture a ensuite été adapté à l'imagerie in vivo du mécanisme de l'individualisation de la fin des kystes post-méiotiques isolées à partir de testicules adultes 4. Précédemment, nous avons indiqué que ces conditions supportent également la survie et la différenciation de la méiose et de cellules germinales post-méiotiques au début de leur kystes pendant environ 48 h 12. Contrairement à d'autres systèmes de culture 19 le calendrier de développement observé dans ces cultures était d'environ compatible avec le calendrier déterminé à partir d'échantillons fixes (pour plus de détails, voir 12). Signaux de fluorescence H2AvD-DP et de protamine-GFP peut être utilisée pour visualiser la morphologie et la composition de la chromatine nucléaire des cellules germinales en culture. Nous avons constaté que pour une identification claire des stades de développement de la culture, ce qui est avantageux sur d'autres critères, tels que l'enroulement des kystes. Surtout, le protocole présenté n'implique pas plus de mouche postefacteurs RACT ou autres croissance autres que le sérum fœtal bovin. En outre, nous montrons ici que ces conditions soient compatibles avec l'imagerie par microscopie à fluorescence de divisions méiotiques ex vivo dans la culture. Les images peuvent être obtenues avec une résolution raisonnable dans un milieu facile à utiliser qui prend en charge le développement à long terme. Ceci est en contraste aux protocoles permettant à court terme (environ 3 h) des observations dans l'huile Voltalef 41,42.
Les procédures décrites ci-dessus pour la culture et le traitement pharmacologique des testicules des pupes et des kystes germe de ligne de célibataires de sexe masculin sont facilement adaptables aux nombreux génétique, épigénétique, biologie cellulaire, ou des questions de développement qui peut être étudié chez la drosophile spermatogenèse. Cela inclut en particulier la recherche en mettant l'accent sur les cellules souches de la lignée germinale. Il a été démontré que le développement de cellules souches peut être suivie par l'imagerie en temps réel des testicules adultes cultivés 20,43. Cependant, le mouvement péristaltique des testicules matures gaineh interfère avec l'acquisition d'image. Par conséquent, soit l'imagerie est effectuée en utilisant les testicules fragmentés 43 ou le nombre d'expériences d'imagerie effectuées doit être augmentée pour tenir compte des ensembles de données perdues 20. Testicules pupes début (24 h de l'APF) ne sont pas encore joints à cellules musculaires. Même légèrement plus âgés (36-45 testicules h de l'APF) semblent montrer quelques mouvements péristaltiques (comparer la figure 3 et vidéo supplémentaire 1). Par conséquent, la culture des jeunes testicules pupes que les organes intacts pourrait servir d'alternative.
En outre, une fois maîtrisé, la capacité à disséquer les testicules de nymphe et éventuellement isolées kystes lignée germinale se permettre de nouvelles applications à l'aide des kystes simples comme une source de homogène, bien que petite, la population cellulaire. Par exemple, il est ainsi possible d'effectuer une RT-PCR quantitative à analyser la régulation de la transcription de gènes spécifiques au cours de la spermatogenèse étapes définies, comme cela a déjà été démontré
Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
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