Abstract
במהלך יצירת תאי זרע ביונקים ובmelanogaster דרוזופילה, תאי נבט זכר לפתח בסדרה של תהליכים התפתחותיים חיוניים. זה כולל בידול מאוכלוסיית תאי גזע, הגברה mitotic, ומיוזה. בנוסף, בתאי נבט שלאחר meiotic לעבור תהליך דרמטי מורפולוגיים עיצוב מחדש, כמו גם שינוי תצורה אפיגנטיים גלובלית של הכרומטין-מתג היסטון לprotamine שורת הנבט.
לומד את התפקיד של חלבון בתהליך יצור תאי זרע לאחר meiotic באמצעות mutagenesis או כלים גנטיים אחרים פגע לעתים קרובות על ידי עוברי חיונית, מראש meiotic, או פונקציות meiotic של החלבון הנחקר. פנוטיפ פוסט meiotic של מוטציה של חלבון כזה יכול להיות מוסתר על דרך לחסום התפתחות מוקדמת יותר, או הפרשנות של פנוטיפ יכולה להיות מסובכת. אורגניזם המודל תסיסנית מציע מעקף לבעיה זו: אשכים שלמים ואפילו ציסטות של תאי נבט גזורים מהגלמים מוקדם יכולות לפתח vivo לשעבר במדיום התרבות. תוך שימוש בתרבויות כזה מאפשר הדמיה מיקרוסקופית של תאי חיים נבט באשכים ושל ציסטות נבט אונליין. חשוב לציין, האשכים טיפחו ותאי נבט גם להיות נגישים למעכבים תרופתיים, וכך לאפשר מניפולציה של פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע, ובכלל זה שלבים שלאחר meiotic.
הפרוטוקול המובא מתאר כיצד לנתח ולעבד את האשכים גלמים וציסטות נבט אונליין. מידע על התפתחות אשכים גלמים ותנאי תרבות ניתנת לצד נתוני ההדמיה מיקרוסקופ של אשכים חיים וציסטות נבט אונליין בתרבות. אנו גם מתארים assay תרופתי ללמוד יצירת תאי זרע לאחר meiotic, שהודגם על ידי assay מיקוד מתג היסטון לprotamine באמצעות חומצת anacardic מעכב acetyltransferase היסטון. בעיקרון, שיטת טיפוח זו יכולה להיות מותאמת לתת מענה רב oשאלות מחקר יס ביצירת תאי זרע לפני ואחרי meiotic.
Introduction
הפיתוח של תאי נבט זכר של מינים רבים הוא תהליך רציף. הוא מאופיין על ידי סדרה של אירועים מכריעים שמגיעה לשיאו ביצירת תאי הזרע מורפולוגית וepigenetically מאוד מיוחדים. בmelanogaster דרוזופילה, תאי גזע נבט אונליין בקצה של מתרס האשכים סימטרי להצמיח תאים חדשים גזע וspermatogonium, כלומר, תא הבת שמחויב להתמיינות (ראה איור 1 לסקירה) 1,2 . Spermatogonium עובר ארבעה סבבים של חטיבות המיטוטי ו, עם תחילתה של מיוזה, שלב של צמיחה מרשימה ופעילות תעתיק נקרא שלב spermatocyte. התאים שמקורם spermatogonium אחד להישאר מחוברים זה לזה ולהתפתח כחבילה העטופה מסונכרנת על ידי שני תאים סומטיים מבנה המכונים ציסטה. לאחר השלמת מיוזה, המורפולוגיה של תאי נבט הגבריים לחלוטיןארגון מחדש (מוצג באופן סכמטי באיור 1). בתחילה, spermatids העגול להאריך כדי ליצור את מבנה הראש הידרודינמית, ושוטון מתפתח. סופו של דבר, תאי הזרע מופרדים זה מזה על ידי מנגנון הנקרא אינדיבידואליזציה 3 מורכב, הקשורים לאפופטוזיס - 5.
במינים רבים, כולל melanogaster דרוזופילה ומיני יונקים, השינויים מורפולוגיים של תאי הנבט מלווים בהתארגנות אפיגנטיים מדהימה של הכרומטין נבט אונליין הזכר הפלואידים, נקראים מתג היסטון לprotamine (מתג HP) 6 - 9. אולי כמעט כל היסטון הקנונים ומולקולות היסטון-variant רבים יוסרו DNA ומוחלפים על ידי חלבונים קטנים בסיסיים, protamines, וכתוצאה מכך מבנה nucleoprotamine הקומפקטי מאוד ספציפי להכרומטין זרע בוגר. מאפיינים כלליים של מתג HP הם tהוא ההחלפה של ההיסטונים הקנונית הראשונה לפי חלופות היסטון, לאחר מכן על ידי חלבוני מעבר, ולבסוף על ידי protamines. כל זה מלווה בכמה שינויים לסימנים אפיגנטיים, כגון עלייה ברמות acetylation של H4 היסטון רק לפני הסרת היסטון 7,10 - 12.
רוב, אם לא כולם, של התהליכים הנ"ל הם חיוניים לפיתוח זרע בוגר, פורה באופן מלא. זה נכון לא רק בדרוזופילה, אלא גם בבני אדם, כמו מניות יצירת תאי זרע של יונקים כמות ניכרת של דמיון עם 1,8,9 מערכת חסרת חוליות. לומד פיתוח ניבט תא זכרי הוא הקל מאוד במערכת מודל דרוזופילה. זבובים הם גנטיים נגישים ביותר. הדור של מוטציות, כמו גם את הקמתה של זנים לטוס לבטא גני היתוך או בונה התערבות RNA לוקחת מעט מאמץ. עם זאת, במחקר של יצירת תאי זרע לאחר meiotic, השימוש במוטציותכלים גנטיים פשוטים ד יכולים להגיע גבול. ביצירת תאי זרע דרוזופילה, שעתוק מפסיק כמעט לחלוטין עם כניסתו לחטיבות meiotic. לפיכך, יצירת תאי זרע לאחר meiotic מתבסס בעיקר על mRNAs translationally המודחק ומאוחסן מסונתזים בprophase meiotic מורחב 13 - 16. לכן, כלים כמו התערבות RNA או השימוש במוטציות שאינן מותנות אינם מתאימים ללימוד באופן ספציפי את תפקידי פוסט meiotic של מוצרי גן שגם למלא את הפונקציות חיוניות בהתפתחות תאי נבט מראש meiotic או meiotic.
אחד יתרונות של דרוזופילה שניתן לנצל במקרים כאלה הוא היכולת של אשכים שלמים גזורים ואפילו ציסטות של תאי נבט לפתח vivo לשעבר במדיום תרבות 4,12,17 - 20. הנתיחה וטיפוח אשכים או ציסטות נבט אונליין מאפשר תצפית מיקרוסקופית לא רק של פיתוח נבט תאים בתאים חי, אךסימפוני השימוש במבחנים תרופתיים עם, למשל, מעכבים של אנזים מתחמים כגון acetyltransferases היסטון (כובעים), deacetylases היסטון (HDACs), topoisomerases, או פרוטאזום. לפיכך, ניתן לתפעל פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע לאחר meiotic ולעקוב אחר תוצאות התפתחותיות ללא קשר לפונקציות עובריים, טרום meiotic, או meiotic 4,12.
במבחנים תרופתיים, נתחנו בעבר את לוקליזציה acetylation תלוי של חלבון bromodomain במהלך prophase meiotic כמו גם את הרלוונטיות של רמות acetylation היסטון עבור מתג HP אפיגנטיים ביצירת תאי זרע לאחר meiotic באמצעות מעכבים ספציפיים מיקוד כובעים וHDACs 12,21. מיקוד מתג HP במבחנים אלה התאפשר על ידי שימוש במתח זבוב שמבטא את הגנים ההיתוך histone2AvD-RFP וprotamineB-eGFP 12,22 בדפוסי אנדוגני, והתצפית שspermatids הראשון באשכי גלמים עובר דרך מתג HP בין 24 ו48 שעות 12 APF.
הפרוטוקול המובא מתאר את הנתיחה של אשכים וציסטות מגלמי דרוזופילה, תנאי התרבות, וassay תרופתי עם אשכים גלמים שלמים. לצורך כך, אשכים גלמי בסביבות 24 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) הם גזורים (ראו איורים 1 ו -2). בשלב זה, האשכים לא יצרו קשרים לרקמות אחרות ומוקפים רק מעטפת חיצונית דקה, אשר מאפשרת חדירה טובה יותר על ידי תרכובות מעכב 23,24. האשכים הם איברי bean- או בצורת אגס שניתן לנקוט בקלות לתוך התרבות. אשכים אלה הם גזורים, תרבותיים, ושטופלו במעכבי ספציפיים. בהמשך לכך, ההשפעה של מעכבים מנוטרים באמצעות immunofluorescence ניתוחים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של ביטוי חלבון היתוך, ועל ידי השוואה של morphol הגרעיניogy של תאי הנבט שטופלו לזה של תאי נבט שלא טופלו. התנאים שהוצגו בפרוטוקול זה גם מאפשרים הדמיה חיה של פיתוח אשכים וציסטות נבט אונליין בתרבות.
Protocol
הצהרת אתיקה:
הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה באופן בלעדי כרוכות בעבודה עם melanogaster דרוזופילה ואינן כפופים לחוקים לרווחת בעלי החיים בגרמניה.
.1 הכנת מדיה, כלים, וזבובים
- להכין מדיום שונה זמין מסחרי אבקת M3 צמיחה ללא אשלגן ביקרבונט 17. זהירות: מעצבן לעין ועור. מוסף הבינוני עם 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. השתמש בסרום שור עוברי נבדק חרקי תרבות מומתת חום וקבלת תוצאות הטובות ביותר. סינון הבינוני המלא (המכונה להלן כבינוני) באמצעות יחידת 0.2 מיקרומטר מסנן בקבוק העליון וחנות בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, מסנן (פילטר קצה המזרק 0.2 מיקרומטר) הבינוני שוב כדי להסיר את משקעים.
- הכן פתרונות מניות מעכב למבחנים תרופתיים. Dissolve הכימיקלים בממס המתאים והחנות בaliquots. לדוגמא, להכין פתרון מניות של 28.69 חומצת anacardic מ"מ (זהירות: ממגר את העין ואת העור) בdimethylsulfoxide.
- להכין את הכלים לשיבוש אשכים גלמים גזורים ונתיחה של ציסטות בודדות. השתמש בשתי מחטים חדות ונוקשה, ולא זוג המלקחיים. כוח הנימים המתפתח בין שתי זרועותיו של זוג המלקחיים הופך את הנתיחה של ציסטות בודדות בכמויות קטנות של מדיום קשה מאוד. לדוגמא, השתמש בקצה של סיכת חרקים נירוסטה מוכנסת לתוך מחזיק חיסון לולאה.
- על מנת לקבל את הגלמים כראוי בגיל, בערך זרע 10 בקבוקוני תרבות גדולים (צינורות עם 4 ס"מ קוטר) עם מספר מספיק של זבובים בוגרים (בערך 40-60 זבובים). כדי לנתח את מתג HP, להשתמש זבובים להביע H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP בדפוס אנדוגני 12,16,22. דגירה הבקבוקונים בתנאים סטנדרטיים ב25; מעלות צלזיוס למשך בערך 4-5 ימים עד זחילת זחלי instar השלישי ולהתחיל התגלמות על הקירות של הבקבוקונים 25.
.2 סימון או איסוף לבן טרום גלמים להשיג גלמי 24-HR-ישנים לDissection
- כדי לבדוק את ההשפעה של כימיקלים מסוימים במתג HP, לנתח אשכים גלמים בקירוב 24 APF 12 שעות. כדי להשיג גלמים מבוימים, לקחת את בקבוקוני תרבות זבוב מוכנים עם pupating זחלים (ראה סעיף 1.4) ולזהות מראש גלמים לבנים רבים ככל האפשר. טרום גלמים במהלך השלב הראשון בהתגלמות מופיעים כחסר תנועה, שאינה האכלה, זחלים ולא קיצרו עם spiracles מופנה החוצה וגולם בצבע לבן. הגולם הופך שזוף בצבע חום בתוך 30 עד 60 דקות, דבר שמצביע על השלב הבא של פיתוח גלמי 26.
- סמן את עמדותיהם של טרום הגלמים עם סמן קבוע בצד החיצוני של הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות.
- לחלופין,לבחור מראש גלמים מהצד של צלוחיות עם מברשת קטנה טבולה בPBS חיץ. לאחר מכן להעביר את מראש הגלמים לצד השני של צינור תגובה 50 מ"ל טרי ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות.
.3 Dissection של גלמי אשכים בקירוב 24 שעות לאחר היווצרות הגולם
- להפיץ כמה טיפות (בערך 80 μl כל אחת) של מדיום בתרבית תאי פלסטיק 10 סנטימטר או צלחת פטרי. בעזרת זוג רחב של מלקחיים או מכחול טבול במדיום, לבחור את הגלמים בשלב APF 24 שעות מהבקבוקונים מודגרות (ראה סעיף 2). העבר את הגולם אחד לכל טיפה של מדיום בצלחת.
- לנתיחה, להשתמש סטריאו מיקרוסקופ מצויד בפנס סיבים אופטיים. אין לחמם את האשכים מעל RT במהלך הנתיחה שכן הדבר עלול למנוע התפתחות תקינה בתרבות.
- לנתח גלמים עם שני זוגות של מס '5 מלקחיים. עם זוג אחד, לתפוס את הגולם לכל היותר האחורי שלהחלק (spiracles האחורי) ולהחזיק אותו בעמדה.
- תפוס את spiracles הקדמי עם זוג מלקחיים האחר ולפתוח את operculum גלמים בקצה הקדמי שלה. לקלף את המקרה גלמי לפחות עד חלק של בית החזה חשוף.
- המשך להחזיק את הגולם בעמדה של הקצה האחורי ביותר שלה. כדי לשחרר את הלחץ הפנימי של הגולם, להכניס את שני הידיים של זוג המלקחיים לאזור הראש של הגולם.
- לקרוע את הגולם הפתוח על ידי פתיחת המלקחיים ומרגשים המלקחיים בכיוון הקדמי. ודא כי הפתיחה שנוצרה עם תנועה זו היא גדולה ככל האפשר, בניסיון הראשון. למנוע נזק לגולם בקצה האחורי שלה לפני הלחץ כבר פורסם שכן הדבר עלול לגרום לאשכים נדחפו דרך הפתח הקטן באופן ישיר ולעתים קרובות ביותר ששבשו.
- שים לב שברגע שהגולם נפתח, הלחץ הפנימי שוחרר מהגולם לוחץ את agglomerates של תאי שומן בגוף ורקמות באמצעות laפתיחת rge באזור הראש. בדקו אם האשכים גלמים כבר דחפו מתוך הגולם עם החומר הזה; זה קורה בחלק מהמקרים. האשכים אינם מחוברים לכל רקמה אחרת ב24 APF שעות ולכן עלול להיות מגורש בקלות מהגולם 23.
- הימנע לוחץ גולם עם המלקחיים שכן הדבר עלול לגרום נזק לאשכים אם הם יישארו בגולם. להגדיל את גודל הפתיחה באמצעות זוג אחד של מלקחיים.
- לאחר מכן החזק את הגולם בקצה האחורי ביותר שלה. סגור את הזוג האחר של מלקחיים ובעדינות פס החוצה את התוכן של הגולם מאחורי לקדמי כדי לשחרר את האשכים מהגולם.
- לאסוף את האשכים על ידי משייכתם לקצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך. נסה להעביר רק כמות קטנה מאוד של מדיום כדי להפחית את מספר תאי שומן בגוף הועברו עם האשכים. מניחים את האשכים לתוך מדיום בצלחת תרבות טרי. שטוף את האשכים כמה פעמים עם מדיום עד שרק תא בגוף כמה שומןים יישאר.
- הדמיה חיה, להעביר אשכים למנת תרבות זכוכית תחתונה עם מדיום ולהשתמש מיקרוסקופ הדמיה הפוך. עבור מבחני תרופתיים, להמשיך בשלב 5.
.4 Dissection של ציסטות נבט אונליין זכר והדמית חיה
- העבר את אשך גלמים אחד או יותר למנת תרבות זכוכית התחתונה.
- השתמש סטריאו מיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטית ושתי מחטי נירוסטה (ראה סעיף 1.3) לנתיחה של ציסטות נבט אונליין גבריים.
- עם מחט אחת, לנסות בזהירות כדי להצמיד אשך אחד בקדמי שלה או קצה אחורי. להחזיק אותו בעמדה. הכנס את המחט אחרת לאשך ולשבש את נדן האשך על ידי הזזת המחט לצדדים. רבים מציסטות ישוחררו מהאשך על ידי תנועה זו.
- המשך להחזיק את האשך בעמדה עם מחט אחת. בעדינות פס החוצה ציסטות שנותרו מהאשך עם המחט אחרת.
- ציסטות נפרדות מצטברות או על ידי ג 'נטלמןly נע מחט לצדדים באמצעות המקבץ של ציסטות או על ידי העברת ציסטות לצלחת תרבות טרי עם מדיום באמצעות קצה פיפטה 200 μl.
- הזז את צלחת התרבות למיקרוסקופ הדמיה הפוכה להדמית חיה של ציסטות בודדות. לפזר ציסטות שוב עם מחט במידת צורך.
- זהה את השלב של ציסטות באמצעות שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- להתמקד בציסטה של השלב הרצוי. לאשר מיקוד ומיקום של ציסטה לעתים קרובות במהלך ניסויי הדמיה יותר, כמו ציסטות לא לדבוק בתחתית צלחת התרבות ולכן נוטה לצוף מחוץ לפוקוס.
הערה: ציפוי הצלחת עם פולי-L-ליזין לקיבוע פוגע בהתפתחות של ציסטות נבט אונליין מוקדם. במקום זאת, ניתן לבודד ציסטות בודדות. עם קצת תרגול, זה אפשרי לבודד ציסטה מסוימת על ידי בעדינות דוחף אותו עם המחט. זה יאפשר ההעברה של ציסטות בודדות לכת נפרדתמנות יור עם פיפטה פסטר זכוכית עם קצה מתמשך שנכנס לתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ. ציסטות בודדות לאחר מכן ניתן עברו בקלות במנות התרבות גם לאחר דגירה ארוכת הטווח.
.5 תרופתי Assay עם אשכי גלמים תמים
- ממלא כל גם צלחת תרבית תאי 24 גם עם 500 μl של מדיום לניסוי אחד 12 משכפל. העברת אשך גלמים לכל אחד גם, באמצעות קצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך.
- לבדוק את קיומו של protamines באשכים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. האשכים צריכים להיות חופשיים של אות ProtamineB-eGFP, אשר מציינת כי המתג של HP אינו חל בכל אחד מציסטות. החלף אשכים שכבר מראים ציסטות ProtamineB-eGFP חיוביות.
- ל12 הבארות הראשונות, להוסיף 500 μl של מדיום המכיל תרכובת מעכב מדוללת (חומצת anacardic) כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי(150 מיקרומטר) ב 1 מ"ל של מדיום בכל טוב. השתמש בבארות הנותרות כפקדים שלא טופלו; להוסיף 500 μl של מדיום עם אותה הכמות של ממס המשמשת כעם התרכובות מעכבת. הערה: אם תרכובות שונות וממסים המשמשים, זה יכול להיות יותר יעיל לשימוש לבד בינוני כשליטה ועל מנת לבחון את ההשפעה של הגדלת ריכוזי ממס בניסויים נפרדים.
- דגירה את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בחושך.
- בדוק שוב את קיומו של protamines באשכים מודגרות כפי שתואר לעיל. האשכים השליטה צריכים עכשיו להראות ציסטות אחד או יותר ProtamineB-eGFP חיוביות, המצביעה על מעבר דרך מתג HP.
- בעזרת פיפטה עם טיפ 200 μl, להעביר את האשכים לשקופיות פולי-L-ליזין מצופה, להיערך סקווש וכתם עם נוגדני ניאון מתאימים כפי שתואר במקום אחר 12,27,28.
Representative Results
האשך בזכרים דרוזופילה כבר נוצר בעובר ונמשך בחלל הגוף במהלך שלבי זחל. אשכים מופע זחלים השלישי instar קטנים, עגולים מוקף בשכבה של תאי פיגמנט עתיד ומוטבע ברקמות שומן בגוף (איור 2 א). אשכים בזבובי זכרים בוגרים הם צינורות ארוכים, מפותלים, אשר מכוסים על ידי שכבה של תאי שריר שמקורו מהדיסק באברי המין ושכבת פיגמנט 24. מעניין, אשכים זחל מכילים תאי נבט אונליין בלבד של שלבים טרום meiotic וmeiotic עד שלב spermatocyte העיקרי, אשר תואם את prophase meiotic (ראה גם איור 1) 23. המחזורים הראשונים של תאי נבט זכר לעבור מיוזה במהלך היווצרות גולם. בקירוב 24 APF שעה, שלבים שלאחר meiotic עם שוטונים מוארכים כבר פיתחו, וכל הגרעינים מכילים היסטון H2AvD-RFP (איורים 1 ו -2). אף אחד מspermatids עבר tהוא מתג HP כאין אות ProtamineB-eGFP יכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ג). לעתים קרובות, האשכים גזורים בשלב זה מכילים מבנה אוטומטי ניאון בגודל משתנה מזכיר מצבר של תאי שומן בגוף או אחד לכמה טיפות של שמן (איור 2 ג, ראש חץ). מבנה זה בתוך האשך הוא גם גלוי עם מיקרוסקופ שלב בניגוד. עד כה, לא מצאו שום תיאור של הטבע שלה בספרות. אשכים גזורים ב36 שעה APF מופיעים מוארכים ובחלק מהמקרים כבר מתחילים להסתלסל (איור 2 ד). הם כבר מחוברים לרקמות של מערכת המין צומחת מתוך מהדיסק דמותי באיברי המין 23,24. יתר על כן, לעתים קרובות הם מכילים את spermatids הראשון מעבר למתג HP, כפי שצוין על ידי אות ProtamineB-eGFP (איורים 1 ו 2 ד, חץ). ב48 APF שעה, האשכים יש לי מוארכים יותר וברור להתחיל מסתלסלים בקצה הפרוקסימלי. ציסטות נבט אונליין כמה עם גרעיני protamine חיובי להיות גלוי (איור 2E, חץ).
כאשר האשכים גזורים ב24 שעות APF נשמרים תרבות ל24 שעות, הם לא להאריך כמו בזבוב שלם (השווה איור 2 ד ו2E עם איור 6 א '). זה כנראה בגלל חוסר אותות positional וצמיחה בדרך כלל נשלחו ממערכת המין המתפתחת פנייה האשך בקצה האחורי שלה 23,29. יתר על כן, שכבת השריר של נדן האשך אינה מתפתחת בגלל myotubes המתהווה אינו יכול להעביר מהדיסק באברי המין לאשכים 24. הנדן-באשך המצב הזה אך ורק פיגמנט הדק אין שכבה לא נראה לגדול במידה מספקת בתרבות למעטפת מספר הגדל וההולך של פיתוח תאי נבט בתוך. עם זאת, בתאי נבט לגדול, הפרד, ולהבדיל באופן עצמאי מנדן האשך. מכאן, לאחר יותר מ36 hr בתרבות, האשכים מוקדם לעתים קרובות נפתחו בסערה, ופיתוח נוסף לא נצפה. עם זאת, בטווח זמן קצר יותר, ניתן להקליט זמן לשגות תמונות חיות vivo לשעבר של כל אשכים מתפתחים בתרבות, כפי שמעיד 3A דמויות -3 C (ראה גם וידאו 1 נוסף). אשך גלמים, גזור בקירוב 45 APF שעה, הודגרה במדיום ל6 שעות וצלם כל 5 דקות. בתוך מסגרת זמן זו, כמה ציסטות של spermatids לצאת מהשלב מתג HP ולהראות (איורים 3 א '-3 C, חיצים פתוחים) אות ProtamineB-eGFP בהיר.
כפי שצוין לעיל, בתאי נבט גבריים באשך דרוזופילה להתפתח כחבילות מסונכרנות של תאים מחוברים, ציסטות בשם 1. איור 4 א מציג סקירה של ציסטות גזורים מאשך גלמים בAPF סביב 24 שעות. שלבים טרום meiotic, שלבי meiotic, שלבים שלאחר meiotic המוקדמים, וגם ציסטות בשלב קאנו המוקדם עם גרעינים מוארכים לפני מתג HP ניתן למצוא (איורים 1 ו 4 ב -4 E). ציסטות המבודדות הן מאוד שבירות וצריכים להיות מטופל בזהירות. שני תאים סומטיים שיוצרים מעטפה של ציסטה יכולים להיות מופרים בקלות באופן מכאני. יש לי תאי גזע נבט אונליין היכולת לשרוד ולהמשיך להתחלק לאחר אבלציה הגנטית של התאים סומטיים ציסטה in vivo 30. זה כבר דווח כי במבחנה, בתאי נבט של שלב 16 התאים מופרדים ממעטפה סומטיים להמשיך לפתח ולבדל 19. ואכן, הבחנו במערכת התרבות שלנו שspermatocytes מאוחר ככל הנראה סיימה את חטיבות meiotic עם תאי ציסטה שיבשו, אם כי לעתים רחוקות מאוד. בתדירות הגבוהה ביותר, ציסטות שיבשו אלה חדלו פיתוח. בעקבות הפרוטוקול שהוצג, ציסטות בשלמותה עלול במקרים מסוימים devאלאופ vivo לשעבר בתרבות בינונית לתקופה מקסימלית של 72 שעה. עם זאת, שם לב שמספר סביר של ציסטות לשרוד עד 48 שעות של דגירה. בתוך מסגרת זמן זו, ציסטות בתרבית יכולות לפתח מהשלב spermatocyte העיקרי עד לאחר חטיבות meiotic כמו גם מהשלב הגרעינים העגול עם הכרומטין מבוסס היסטון עד שלב קאנו מאוחר מעבר לHP לעבור 12. זה מאפשר הדמיה חיה של תהליכים חיוניים ביצירת תאי זרע, כמו לדוגמא, spermatocytes כניסת חטיבות meiotic (איור 5 ווידאו נוסף 2). לצורך ניסוי זה, גרסת היסטון מתויג RFP H2AvD שימשה כסמן כרומוזום. שלב spermatocyte העיקרי משתרע על בערך 3 ימים in vivo ביום 31 ב. לכן, על מנת לרשום חטיבות meiotic, בחרנו ציסטות עם spermatocytes שבעליל התחיל עיבוי הכרומטין (איור 5A, אזור 2). חלוקת meiotic מתחילה בspermatocytesבצד אחד של ציסטה ולאחר מכן כדלקמן בגל בspermatocytes הנותר (באיור 5A מאזור 2 לאזור 1, גם לצפות בתוכן נוסף 2). עיבוי של הכרומטין מוביל בקרוב לכרומוזומים הנעים במהירות שנראים ככתמים בהירים (איור 5A, אזור 2). לאחר 30 דקות, spermatocytes הראשון של אזור זה נמצא כבר בtelophase (איור 5 ב, ראשי חץ). הכרומוזומים של האזור הצעיר 1 לסדר בצלחת 20 דקות metaphase מאוחר יותר (איור 5 ג). הם telophase השלם ומוכנים לעבור cytokinesis -15 דקות מאוחר יותר (איור 5D). Anaphase, telophase, וcytokinesis נמשך בערך 10 דקות ב( וידאו משלימה 2) זה הקלטה.
ביונקים, כמו גם בדרוזופילה, עלייה בולטת בacetylation H4 היסטון מסמנת את תחילתה של הסרת היסטון ומתג HP במהלך פוסט meioticיצירת תאי זרע 6,11. זה הוצע כי שינוי אפיגנטיים זו הוא מרכיב חיוני או אפילו הדק של תכנית התפתחותית של HP לעבור 10,32. בעבר, התייחסנו אשכים גלמי דרוזופילה בתרבות עם מעכבי מיקוד כובעים וHDACs להשפיע על רמת acetylation של H4 היסטון בשלבים שלאחר meiotic 12. במבחנים תרופתיים אלה, מצאנו כי acetylation היסטון הוא חיוני להתקדמות של יצירת תאי זרע מהשלבים עם הכרומטין מבוסס היסטון לשלבים עם הכרומטין מבוסס protamine.
איורים 6 ו -7 מראים תוצאות נציג של assay תרופתי באמצעות חומצת anacardic למקד כובעים באשכי גלמים. אשכים ב24 APF שעות נותחו מזן זבוב להביע H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP. חלבון ProtamineB-eGFP נעדר באשכים אלה מוקדם גלמים (איור 6 א 'וב'). לאחר 24 hr בתרבות, האשכים השליטה הראו אותות ProtamineB-eGFP, אשר ציינו כי ציסטות הראשונות שפיתחו מעבר למתג HP (איור 6 א ', ראשי חץ פתוחים). זה לא היה המקרה עם האשכים שטופלו בחומצת anacardic 150 מיקרומטר (איור 6). הכנות סקווש אשכים וניתוחי immunofluorescence מציעים מידע מפורט יותר (איור 7). בקבוצת הביקורת, הגרעינים של spermatocytes העיקרי הגדול יחסית יכולים להיות מוכרים על ידי הדפוס האופייני שלהם משלושה אזורים של DNA העשיר צבעוני, אשר תואמים את הכרומוזומים העיקריים (רמת 4C) של דרוזופילה (איור 7 א, טור 1). Acetylation של H4 היסטון הוא להבחין בבירור בשלב זה (איור 7, טור 1). השלב הראשון לאחר חטיבות meiotic ידוע כשלב Nebenkern ומאופיין בגרעינים גדולים למדי, עגולים (ראה איור 4C, לא מוצג באיור 7). השלב הבא שמוצג באיור 7 מזוהה על ידי צמיחת flagellar והצורה העגולה של גרעין תא חיידק, אשר כבר הרבה יותר קטנים מאשר בשלבים מוקדמים יותר (איור 7 א, עמודה 2) ולהראות נמוכים מאוד לרמות כמעט בלתי ניתנות לגילוי של acetylation H4 היסטון (איור 7, עמודה 2). הצורה העגולה ואז מתארכת (איור 7 א, טור 3), וacetylation של H4 היסטון הוא שוב להבחין בבירור (איור 7, טור 3). Spermatids אז מגיע לשלב צורת קאנו שבמתג HP מתרחש וההיסטונים מוחלפים על ידי protamines (7 א מספרים - 7 C, טורי 4 ו -5). לאחר שלב קאנו, גרעיני protaminated אז להאריך עוד יותר לצורת מחט דקה מאוד בזרע הבוגר (לא מוצג כאן).
הכנות סקווש אשכים של אשכים שטופלו בחומצת anacardic הראו שונה תוצאות (דמויות 7D </ Strong> - 7 F). הכרומטין בתאי נבט שטופלו בחומצת anacardic הופיע יותר מרוכז מזה של קבוצת הביקורת (השווה איור 7D, טופל ו7 א, שליטה). Immunofluorescence הניתוחים גילה כי acetylation של H4 פחת או אפילו נעדר בגרעינים של תאי נבט שטופלו בחומצת anacardic (איור 7E) באופן משמעותי. זה ידוע שההיסטונים acetylated מאוד קשורים לאזורים של הכרומטין הפתוח, בעוד שאזורי הכרומטין שחסרי acetylation היסטון לעתים קרובות להראות מבנה מדכא 33. לכן, אין זה מפתיע כי טיפול בחומצה anacardic השפיע על מבנה הכרומטין של גרעיני תאי נבט שטופלו. חשוב לציין, אין גרעיני protamine החיובי של שלב קאנו מאוחר או מעבר זוהו באשכים שטופלו (איור 7F). לפיכך, הנתונים שלנו עולים בקנה אחד עם הרעיון שפעילות HAT היא חיונית לspermiogenesis להמשיך הלוך ושובמ 'היסטון מבוסס הכרומטין לשלבי הכרומטין מבוסס protamine.
סקירת איור 1 של יצירת תאי זרע דרוזופילה. הלוח השמאלי מציגה את הרצף של שלבים בהתפתחות של תא ניבט מתאי גזע לתאי זרע אישית. ציורים סכמטי להראות המורפולוגיה הגרעינית אופיינית לתאי הנבט. spermatogonium אחד מחלק לייצר 16 spermatocytes המחובר בציסטה אחד. בשלב זה רוב התמלילים דרושים לפיתוח שלאחר meiotic מיוצרים, מודחק translationally, ומאוחסן. את חלק הארי של פעילות תעתיק מסתיים בכניסה לחטיבות meiotic. מתג היסטון לprotamine בהכרומטין מתרחש בין שלב קאנו המוקדם ומאוחר. שלבים עם הכרומטין מבוסס היסטון הם גבוהיםמואר באדום; שלבים עם הכרומטין מבוסס protamine מודגשים בירוק. הברים בלוח הימני מציינים את השלבים של נבט תאים שבדרך כלל ניתן למצוא באשך מתפתח בזחלים, גלמים בקירוב 24 ו36 שעות לאחר היווצרות גולם (APF), וזבובים בוגרים.
איור 2 אשכים דרוזופילה, בשלבים שונים של פיתוח. תמונת שלב ניגודיות של אשך-הר שלם מעט מעוך של זחל שלישי instar-(L3) (). ניתן למצוא שלבים טרום meiotic וmeiotic בלבד. Spermatogonia מוגבל לקצה הקדמי מתחת לאזור המרכז (הכוכבית). האשך הנותר מלא בspermatocytes (חץ פתוח). תמונת שלב ניגודיות של אשך מעט מעוך בקירוב (B) 24 שעות לאחר היווצרות גולם (APF). בנוסף לspermatocytes (חץ פתוח), האשך מכיל spermatids בשלב Nebenkern (ראשי חץ פתוחים), עם גרעינים וspermatids עגולים בהארכת שלבים עם שוטונים גובר (ראש חץ כפול פתוח) (C - E). Whole-Mount אשכים גלמים מבטאים H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP (שכבות של שלב בניגוד וeGFP ותמונות הקרינה RFP). אשך גלמים גזורים בקירוב 24 APF שעה (C). ראש חץ מסמן אוטומטי הקרינה של תאי שומן בגוף משוערים. אשך גלמי D) גזורים בקירוב 36 שעה APF מציג את הציסטה הראשונה ProtamineB-eGFP החיובי (חץ). אשך (E) גלמים בקירוב 48 APF שעות עם קבוצה ציסטות ProtamineB-eGFP חיובי (חץ). בכל חלקי הדמות, כוכביות מצביעות על אזור המרכז. ברים סולם: 100 מיקרומטר.ank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 הדמיה חיה של מתג היסטון לprotamine באשך גלמים הגובר vivo לשעבר. תמונת שלב ניגודיות של אשך גלמים להביע H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP נלקח בתרבות בקירוב 45 שעות לאחר היווצרות גולם (APF) (). שלפוחית הזרע מצויינים על ידי חץ מלא. Paragonium (ראש חץ כפול) נשאר צמוד לאשך. (א ') הקרינה eGFP וRFP של האשך שמוצג ב(). החץ הפתוח מצביע על ציסטה ProtamineB-eGFP החיובי. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר (ב ') לאחר שעה 2 30 דקות בתרבות, כמה ציסטות נוספות (חץ פתוח) לצאת frאום מעבר היסטון לprotamine. (ג) לאחר בערך נוסף 3 שעות בתרבות, כלומר, בסך הכל 5 דקות לשעה 29 בתרבות, קבוצה של ציסטות (חץ פתוח) עם אות ProtamineB-eGFP חזק נראים בקצה הפרוקסימלי של האשך. ראה גם וידאו נוסף 1. בכל חלקי הדמות, כוכביות מצביעות על אזור הטבור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 ציסטות מבודדות של תאי נבט בשלבים שונים של פיתוח. ציסטות () גזורים מאשך בקירוב 24 שעות לאחר היווצרות גולם (APF). כיסוי של שלב בניגוד וקרינת H2AvD-RFP (אדום) תמונות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.(ב - ה) בהגדלה של ציסטות בודדות של שלבים שונים. כיסוי של התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ותמונות הקרינה H2AvD-RFP. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר (ב) ציסטה של 16 spermatocytes ציסטה (C) של 64 spermatids העגול בשלב Nebenkern... מבנה Nebenkern מתפתח ממיטוכונדריה התמזגה וגלוי בתמונות דסק"ש בסמוך לגרעין (ראש החץ פתוח). (D) ציסטה של spermatids עם גרעינים עגול H2AvD-RFP-חיובי ושוטונים מתארכים (ראש החץ פתוח מצביע על מבנה Nebenkern מתארך המלווה את axoneme הולך וגדל). (ה) קצה קודקוד של ציסטה של spermatids בשלב קאנו המוקדם מראה צורה גרעינית מוארכת. שוטונים בהרחבה המוארכים נראים רק באופן חלקי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של f זוigure.
איור 5 הדמיה חיה של ציסטה 16 spermatocyte יחידה שעברה מיוזה אני ex vivo. תמונות הקרינה של ציסטה בתרבות להביע H2AvD-RFP. מתוארים הם שלבים אופייניים מיוזה I. Spermatocytes בציסטה לעבור חטיבות meiotic בצורה גלית. עיבוי כרומוזום () מתחיל בגרעינים בצד אחד של ציסטה (2) ומתקדם דרך ציסטה (כיוון מצויינים על ידי חץ ). גרעינים באזור היריב (1) מייצגים שלב מוקדם יותר של עיבוי הכרומטין, שבו עדיין ניתן להבחין אזורי היסטון הצפוף לציון שלושה כרומוזומים עיקריים. Spermatocytes באזור (2) מכילים כרומוזומים תמצית באופן מלא, נראה כמו כתמים בהירים ניאון. (ב ') לאחר 300; דקות, spermatocytes הראשון באזור (2) נמצאות בtelophase (ראשי חץ פתוחים), תוך עיבוי כרומוזום ממשיך באזור (1) (ג) בspermatocytes האחרון של אזור (1), כרומוזומים (ראשי החץ) מסודרים. בצלחת 20 דקות metaphase מאוחר יותר. (ד ') במסגרת אחרת 15 דקות, spermatocytes האחרון נראה שיש לי הושלם telophase וכעת הם מוכנים לעבור cytokinesis (ראשי חץ פתוחים). ראה גם בר נוסף וידאו 2 סולם:.. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.6 חומצת Anacardic איור מעכבת את מתג היסטון לprotamine באשכי גלמים תרבותיים. אשכים גלמי expressi ng H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP וגזור ב24 שעות לאחר היווצרות גולם (APF) הודגרו ל24 שעות במדיום ללא מעכב (שליטה;, '; DMSO, dimethylsulfoxide) או במדיום בתוספת 150 מיקרומטר חומצת anacardic ( B, B '). אזורי Hub שצוינו על ידי כוכביות. (A, B) ניתן להבחין לא ציסטות ProtamineB-eGFP החיובי לאחר נתיחה. (א ') לאחר 24 שעות של דגירה, כמה ציסטות עברו היסטון לprotamine מתג וProtamineB-eGFP חיובי אשכי ציסטות (ראשי חץ פתוחים) ניתן לצפות. (ב ') שטופלו בחומצת anacardic לא לפתח ציסטות ProtamineB-eGFP חיוביות. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/>
.7 חומצת Anacardic איור משפיעה acetylation H4 היסטון ומבנה הכרומטין של spermatids הכנות סקווש של גרעיני spermatid מאשכי גלמים (24hr APF) להביע ProtamineB-eGFP טופח במשך 24 שעות ללא מעכב (- ג). או עם חומצת anacardic 150 מיקרומטר (ד - ו). DNA מוכתם בצבע Hoechst (וד). acetylation H4 ניתח immunofluorescently (B, E). נוכחות של protamines מעקב עם אות ProtamineB-eGFP (C, F). לאחר טיפול בחומצת anacardic, הכרומטין נראה מאוד דחוס (D) ואת אות acetylation H4 מצטמצמת לחלוטין בכל שלבי spermatid (E). בנוסף, טופלה anacardic החומצהאשכים לא מראים ציסטות של שלב קאנו מאוחר או מעבר ואין אות ProtamineB-eGFP (F). סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
משלימה וידאו 1 הדמית חיה באמצעות eGFP וקרינת RFP של בורר היסטון לprotamine באשך גלמים הגובר vivo לשעבר. וידאו של הדמיה כמובן זמן 6 שעות ממחישה את מעבר היסטון לprotamine על ידי העלייה בשכיחות של ProtamineB- ציסטות eGFP חיוביות. תמונות נרכשו כל 5 דקות. לפרטים, ראה איור 3. (ראה "suppl_video_1.MOV" תחת הורדות).
.2 הדמית חית משלימה וידאו של מיוזה ציסטה עוברת 16 spermatocytes אחד אני ex vivo. דימות פלואורסצנטי זמן לשגות שלציסטה בתרבות להביע H2AvD-RFP במהלך 80 דקות. וידאו מתאר את השלבים האופייניים לתמונות I. מיוזה נרכשו כל 1 דקות. לפרטים, ראה איור 5. (ראה "suppl_video_2.MOV" תחת הורדות).
Discussion
הפרוטוקול המובא מתאר שני יישומים שונים המבוססים הן על היכולת לנתח אשכים דרוזופילה וציסטות ניבט שורה אחת בשלב התפתחותי נתון ועל פיתוח vivo לשעבר של תאים ורקמות אלה בצלחת תרבות. יישום אחד הוא המניפולציה התרופתית של תהליכים חיוניים בהתפתחות זרע. חשוב לציין, זה מאפשר גישה ליצירת תאי זרע לאחר meiotic שאינו בקלות צבר באמצעות ניתוחים תפקודיים המבוססים על גנטיקה זבוב. היישום האחר הוא ההתבוננות המיקרוסקופית של חיים ופיתוח תאי נבט ואשכים. במיוחד יתרונות יישום זה מיכולתם של תאי דרוזופילה ואיברים בתרבות לשרוד ולהתפתח בRT ותחת אווירה רגילה. לפיכך, מיקרוסקופ הדמיה הפוך מצוידים בבמה מחוממת (חימום לטמפרטורת גידול סטנדרטי של 25 ° C) הוא מספיק כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים חי הדמיה. נוסףיותר, זני זבוב מהונדסים רבים לבטא חלבונים מתויג חלבון פלואורסצנטי עבור הדמיה חיה קיימות או ניתן להקים בקלות.
כדי להשיג אשכים או ציסטות נבט אונליין גלמים של שלב התפתחותי מסוים, זה קריטי, כי אחד הוא מכיר את עיתוי פיתוח דרוזופילה. העיתוי המדויק לכל שלב עשוי להשתנות בין מעבדות, תנאי תרבות, ולעוף זנים ויש לקבוע באופן אמפירי. כפי שתואר לעיל, זה חשוב במיוחד עבור מבחני תרופתיים ש, למשל, לכוון את מתג HP. בניסויים כאלה, כדאי תמיד לבדוק לspermatids עם אות ProtamineB-eGFP לפני בדיקת המעכב בפועל משום שהעיתוי יכול להשתנות מעט אפילו בתוך אוכלוסייה אחת.
בעקבות הפרוטוקול הנ"ל צריך לאפשר הנסיין לנתח אשכים משלבי גלמים כבר באיברים שלמים חופשיים של רקמת שומן בגוף מצורף. אשכים אלה ועוד יותר מכך, מבודדים geציסטות rm-line הן מאוד שבירות. לפיכך, חשוב לפתח את המיומנות הידנית וניסיון דרוש לטיפול והעברת אשכים וציסטות באמצעות מלקחיים, מחטים, וטפטפות. במיוחד מחקרי מיקוד פיתוח של תא ניבט שלאחר meiotic meiotic ותחילת ירוויחו מזה. אמנם קל יחסית לנתח ציסטות של spermatids מאוחר עם שוטונים ארוכים מאשכים מבוגרים, שקשה להשיג שלבים מוקדמים יותר. לנתח ציסטות אלה מאשכי גלמים מוקדמים בעקבות פרוטוקול זה הוא הרבה יותר יעיל. זכור כי בזן זבוב רגיל, רק בערך 50% מהגלמים יהיו זכר. לכן, להכין לנתח לפחות כפליים גלמים כמספר האשכים הנדרשים. לחלופין, ניתן לזהות זחלי L3 גבריים באמצעות סטריאו מיקרוסקופ, כפי שניתן זיהו את האשכים איברים עגולים שקופים כמוטבעים ברקמות שומן בגוף לרוחב של הזחל שלם 23,34, ולאסוף אותם בצלוחיות תרבות טריות ש יכוללשמש כדי לבחור מראש גלמים לבימוי וניתוחים. כמו כן ניתן לזהות זכר מראש גלמים 35.
שם לב ששני ציסטות נבט אונליין מבודדים ואשכי גלמים שלמים בתרבות רגישות לאור, כפי שכבר דווח בעבר גם 18. רגישות לאור זה עשויה גם להחזיק לכמה תרכובות כימיות המשמשות במבחנים תרופתיים. לכן, דרך טובה ביותר הוא לשמור על מנות התרבות של assay בחושך במהלך דגירה. כמו כן, בעת תכנון ניסויי הדמיה הזמן לשגות עם אשכים פיתוח ו, במיוחד, ציסטות בודדות, יש לזכור כי זמני חשיפה ארוכים מדי ו / או שיעורי דגימה גבוהים מדי עלולים לעכב התפתחות ex vivo. קצב הדגימה המתאים צריך להיקבע באופן ניסיוני.
זיהום חיידקים ו / או פטרייתי ועל הצמיחה במנות התרבות מהווה בעיה חמורה. מנות תרבות נגועות בחיידקים רבים מדי אינן תומכות vivo לשעבר development של האשכים וציסטות. לכן, מדיום התרבות המתוארת מכיל פניצילין וסטרפטומיצין (ראה שלב 1.1), אבל במהלך דגירה ארוכת טווח, האנטיביוטיקה הללו עשויים להיפגע ופעילותם משום הפחתה. זה יכול להיות אחת הסיבות לזמן המוגבל של הישרדות (מקסימום. 72 hr) של ציסטות בתרבית שנצפו בעת השימוש בפרוטוקול לעיל. עם זאת, מסגרת זמן זה לא יכול להיות מורחב על ידי החלפה קבועה של מדיום התרבות במנות. אנו מסיקים כי גורמים אחרים עשויים להשפיע על ההישרדות בתרבות, כגון חוסר אותות צמיחה מרקמות אחרות של מערכת המין. מצד השני, התפתחות שלאחר meiotic היא מהירה יותר בדרוזופילה מאשר ביונקים. בדרוזופילה, spermiogenesis לוקח כ 90 שעה, ומתג HP מתרחש בין 50 ו60 שעות לאחר מיוזה 9,12. לפיכך, זמן ההישרדות הרגיל של כ 48 שעות הושגו עם פרוטוקול זה הוא גם מתאים למעקב תהליכים התפתחותיים מרכזיים בSPErmatogenesis, כגון חטיבות meiotic או מתג HP. למרות שניתן להימנע מזיהום חיידקים או פטרייתי על ידי שימוש בכלים ובתקשורת נקיים, הפרוטוקול המובא אינו עושה שימוש בתנאי עבודה סטריליים לחלוטין בגלל זבובים ולעוף אשכים כבר להכיל חיידקים כאשר העלו בתנאים סטנדרטיים. עם זאת, חלק מהיישומים של טכניקת תרבות זו עשויות להפיק תועלת מהזבובים גזורים או אפילו העלו בתנאים בקטריאלית (לפרוטוקולים, לראות 17,36,37).
מבחני תרופתיים תלויים בשימוש בתרכובות כימיות הפועלות כמעכבים או מפעילים של אנזימים שונים. התרכובות נפוצות בניסויים כאלה לעתים קרובות שונים באופן נרחב ביעד הספציפי שלהם. כיתרון, זה מציע את הפוטנציאל למקד כיתות אנזים שלמות, למשל, עם p300 חומצת anacardic עיכוב / CBP, PCAF, וחברים של כובעים 38 משפחת MYST. החסרון של זה יכול להיות פוטנציאל מחוץ יעד או השפעות רעילות inducאד על ידי תרכובות כגון. לכן, בכל מתחם ששימש בassay עם אשכים או ציסטות גלמים צריך להיבדק לרעיל שלה והשפעה ספציפית בריכוזים שונים. יתר על כן, שינויים קלים בתנאי התרבות, ריכוז תרכובת או פעילות, ושינויים בחדירות התא עלולים להוביל לשונות של תופעות הנגרמים. לכן, יש צורך לפקח על ההצלחה של הטיפול בכל ניסוי. לדוגמא, כאשר אנו משמשים חומצת anacardic ב150 מיקרומטר, צפינו שונות קלות בכוחו של פנוטיפ עיבוי הכרומטין בין ולפעמים בתוך כמה אשכים, ואילו acetylation של H4 היסטון ירד באופן עקבי.
מבחני תרופתיים עם האשכים דרוזופילה בתרבות היו בשימוש כדי לנתח מנגנונים של לפני ואחרי meiotic יצירת תאי הזרע 4,12,14,21. מאחר וקשה לגישה יצירת תאי זרע לאחר meiotic עם כלים גנטיים למקד שחקנים עם Essentiaפונקציות l מראש meiotic וmeiotic, גישה זו vivo לשעבר מהווה תחליף. יתר על כן, באופן עקרוני, השיטה יכולה להיות מותאמת לדופק מרדף ניסויים כדי לעקוב אחר ההתפתחות של תאי נבט שטופלו לאורך זמן. עם זאת, אנחנו עדיין לא נבדקו אפשרות זו. תוך שימוש באשכי גלמים מוקדמים הוא יתרון במבחנים תרופתיים. ראשית, המעטפת החיצונית הדק של האשכים גלמים הצעירים (בסביבות 24 שעות APF) עלולה לאפשר חדירות משופרות של תרכובות כימיות. שנית, כאשר לומדים את מתג HP שלאחר meiotic, האשכים גלמים גזורים ב24 APF שעה מקו זבוב protamine-להביע GFP מאפשרים קריאה ישירה של אם מתג HP הושפע או לא.
נכון להיום, כמה פרוטוקולים לגידול vivo לשעבר של איברי דרוזופילה ורקמות כולל אשכים וציסטות נבט אונליין פותחו (למשל, לראות 4,14,17,20,39,40). מדיום הגידול ותנאים הכלליים המשמשיםבפרוטוקול המובא כאן הוקמו בשנת 1979 17. מערכת התרבות מאוחר יותר מותאמת להדמית in vivo של מנגנון אינדיבידואליזציה בציסטות לאחר meiotic מאוחר מבודדות מאשכים בוגרים 4. בעבר, יש לנו דיווח כי תנאים אלה תומכים גם בהישרדות ובידול של meiotic ותאי נבט שלאחר meiotic בשלב מוקדם בציסטות שלהם במשך כ 48 12 שעות. בניגוד למערכות תרבות אחרות 19 העיתוי ההתפתחותי שנצפה בתרבויות אלה היה כ בקנה אחד עם העיתוי שנקבע מדגימות קבועות (לפרטים, ראה 12). אותות הקרינה H2AvD-RFP וprotamine-GFP יכולים לשמש כדי לחזות את הרכב המורפולוגיה והכרומטין הגרעיני של תאי הנבט בתרבות. מצאנו כי לזיהוי ברור של שלבי התפתחות בתרבות, זה יש יתרון על פני קריטריונים אחרים, כגון התפתלות של ציסטות. חשוב לציין, בפרוטוקול שהוצג אינו כרוך בתוספת של שלוחה זבובגורמי גדילת ract או אחרים מלבד סרום שור העובר. יתר על כן, אנו מציגים כאן, כי התנאים בקנה אחד עם ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חטיבות meiotic vivo לשעבר בתרבות. ניתן להשיג תמונות ברזולוציה סבירה במדיום קל לשימוש שתומך בפיתוח לטווח ארוך. זאת בניגוד לפרוטוקולים המאפשרים לטווח קצר (בערך 3 שעות) תצפיות בשמן Voltalef 41,42.
הנהלים שתוארו לעיל לטיפוח וטיפול תרופתי של אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין זכר יחידים הם להתאמה בקלות לרבה גנטית, אפיגנטיים, תא ביולוגי, או שאלות התפתחותיות שניתן לחקור ביצירת תאי זרע דרוזופילה. זה כולל במיוחד מחקר מתמקד בתאי גזע נבט אונליין. הוכח כי פיתוח תאי גזע יכול להיות מלווה הדמיה חיה של מבוגר מתורבת אשכי 20,43. עם זאת, תנועת הנפיחה של האשך הבוגר sheath מפריע לרכישת תמונה. לכן, גם הדמיה נעשה שימוש באשכים מקוטעים 43 או מספר ניסויי הדמיה שבוצעו יש להגדיל לדין וחשבון על מערכי נתונים איבדו 20. אשכים מוקדם גלמים (APF 24hr) עדיין לא סגורים עם תאי שריר. אפילו מעט אשכים מבוגרים (APF 36-45 hr) מופיעים כדי להראות כמה תנועות peristaltic (השוו איור 3 ווידאו נוסף 1). לכן, טיפוח אשכים גלמים צעירים כאיברים שלמים יכול לשמש כחלופה.
יתר על כן, שולט פעם אחת, את היכולת לנתח אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין מבודד סופו של דבר תאפשר ליישומים נוספים באמצעות ציסטות בודדות כמקור הומוגנית, אם כי אוכלוסייה קטנה, תא. לדוגמא, זה ובכך ניתן לבצע RT-qPCR לנתח את הרגולציה תעתיק של גנים ספציפיים בשלבים מוגדרים של יצירת תאי זרע, כפי שכבר הוכיחו
Disclosures
אי לנו אינטרסים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
- Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
- Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
- Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
- Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
- Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
- Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
- Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
- Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
- Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
- Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
- Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
- Rebollo, E., González, C. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson, D. S. , Humana Press. 77-87 (2004).
- Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
- Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
- Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , Wiley and Sons. 275-367 (1950).
- Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
- Ashburner, M., Roote, J., et al. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 585-599 (2000).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
- Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., et al. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. W, S. ullivan, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
- Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
- Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
- Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
- Demerec, M., Kaufmann, B. P. Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1996).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
- Meynadier, G. Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. Vago, C. 1, Academic Press. New York. (1971).
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
- Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).
